הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכברוש ער של שבץ איסכימי עם סיבוכים נוירופסיכיאטריים במהלך תצפית שנמשכה שבעה ימים

318 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69194

⸱

19 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Branch of the Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Russian Federation, 2Pushchino Branch of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education, Russian Biotechnological University (BIOTECH University), 3Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

במאמר זה

סיכום

מוצע מודל חדש של שבץ איסכמי מוקד בעכברים ערים. זה הושג על ידי הזרקת תסחיף אוויר לעורק התרדמה הפנימי של חולדות. התפתחות שבץ איסכמי מוקדי אושרה על ידי צביעת מוח עם כלוריד טריפנילטרזוליום, בדיקות פונקציונליות והערכת פרמטרים פיזיולוגיים.

תקציר

המודל התרגומי של שבץ ניסיוני בעכברים שנגרם על ידי תסחיף גז נוצר כדי להבהיר את מאפייני התפתחות שבץ ולבחון את ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית של תרופות חדשות ותרופות מוכחות. הפרוטוקול שדורש זמן ובעבודה מתונה מאפשר לצפות בדינמיקה של מוות מהיר של נוירונים בבעלי חיים ערים, ומספק הזדמנות ייחודית להעריך את השלב החריף של השבץ, כולל דליריום, וכן לעקוב אחר הפרעות אוטונומיות כגון שינויים בלחץ הדם, טמפרטורת הגוף ונפח הנשימה הקטן. אוויר אטמוספרי (100 מיקרוליטר) הועבר באמצעות עירוי דרך קטטר וסקולרי שהונח רטרוגרדית לעורק הקרוטיד הנפוץ דרך העורק הקרוטידי החיצוני, באמצעות משאבת עירוי. עשרים וארבע שעות לאחר האמבוליזציה, בעלי החיים מציגים פגמים סטריאוטיפיים בהתנהגות, במוטוריקה ובהבדלים היסטופתולוגיים. עד היום השביעי לניסוי נצפתה שיפור משמעותי במצב הנוירולוגי, והתוצאות במבחני התנהגות התקרבו לאלו של ערכי הביקורת. במקביל, נצפה מעבר מחדירת נויטרופילים לחדירת מקרופאגים בנגע האיסכמי. המודל המוצע יכול לשמש במחקרים פרה-קליניים, שכן הוא משחזר את הסיבוכים הנוירופסיכיאטריים של התקופה שלאחר השבץ, יחד עם השינויים הפיזיולוגיים, התפקודיים וההיסטופתולוגיים הנלווים.

מבוא

מטרת המחקר הייתה לפתח מודל של שבץ איסכמי מוקדי מוחי בעכברים ערים ולהשיג את הקירוב הקרוב ביותר להיבטים הקליניים של שבץ איסכמי בבני אדם. כפי שהודגם במחקר של Söyland ואחרים, 62.6% מהמטופלים הראו תסמינים משמעותיים של שבץ איסכמי במצב ערות, בעוד שרק 19% חוו שבץ התעוררות1. כתוצאה מכך, הופעת מצב ערות במהלך אמבוליזציה של עורקי מוח בבעלי חיים היא בעלת עניין רב. המודלים הקלאסיים המשמשים לחקר שבץ איסכמי מוקדי מוחי כוללים: חסימה טרנס-גולגולתית, סיבה אנדווסקולרית של העורק המוחי האמצעי, חסימה אמבולית, חסימת אנדותלין-1, ומודל פוטוטרומבוזיס2. שיטות מידול קלאסיות חושפות בעלי חיים להשפעות ההרדמה, שעלולות לגרום לעיוות נקודות הקצה במודל הקו האיסכמי. איזופלוראן משמש רבות בניתוחי חסימה כשיטה המהירה ביותר להרדמה גזית 3,4,5. עם זאת, מידת הפגיעה המוחית לאחר חסימת העורק המוחי האמצעי (MCAO) לאחר 24 שעות נמצאה כפרופורציונלית הפוכה למשך ההרדמה האיזופלורנית בבעלי חיים. הוכח כי איזופלוראן משפיע על יותר מ-1,000 גנים מבוטאים באופן שונה הקשורים לאיסכמיה – ביטוי6, גורם שעשוי להוביל למודל שבץ איסכמי שאינו אמין לחלוטין.

אחת השיטודולוגיות של מידול שבץ איסכמי בחולדות היא הזרקת קריש הדם לעורק הקרוטיד הפנימי7. עם זאת, השראת שבץ איסכמי במודל זה בוצעה שעה לאחר הקטטריזציה עם איזופלורן. ניתן להעריך שקדם-התניה זו הפריעה להתפתחות ההשלכות הנוירולוגיות והפיזיולוגיות של מתן קרישי דם.

מוצעת שיטה חלופית למידול שבץ איסכמי על ידי אמבוליזציה של עורק התרדמה הפנימי בעכברים ערים, ואחריו נזק מוקדי מוחי באגן העורק המוחי האמצעי. הקטטריזציה בוצעה 24 שעות לפני מידול השבץ האיסכמי. דבר זה הבטיח שההשפעות של מתן התסחיף לא יושפעו מההרדמה.

המודל המוצע אינו עושה שימוש באנדותלין-18, פילמנט9 או פיגמנטקרישי 10 לטיפול באיסכמיה. בחירת החומר שייתן לעכברים באמצעות קטטר התבססה על ההנחה ששיטה זו תהיה ישימה, ובכך בוטלה הצורך לקבע את החיה במסגרת סטריאוטקסית ולהרדימו 8,10.

יתרה מזאת, המודל מאפשר תצפית על פרמטרים פיזיולוגיים ונוירולוגיים בבעלי חיים מיד לאחר האמבוליזציה; שיטות חלופיות למידול שבץ איסכמי נראות כבלתי תואמות לכך. בספרות, נקודות הסיום של נזק מוחי ופגיעה נוירולוגית לאחר מודלים של שבץ איסכמי נבדקות לרוב 24 שעות לאחר החסימה 11,12,13,14.

השימוש בעכברים ערים במידול שבץ איסכמי עשוי לשמש כתוספת או חלופה למודל הקלאסי הרווח של שבץ איסכמי מוקד. גישה זו מאפשרת חקירה מעמיקה יותר של הפוטנציאל הנוירו-מגן של תרופות רשומות או מתפתחות לטיפול בשבץ איסכמי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר נערך בהתאם לנהלי הפעולה הסטנדרטיים של המעבדה ואושר על ידי ועדת הביואתיקה של ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית של סניף מכון שמיאקין-אובצ'יניקוב לכימיה ביואורגנית של האקדמיה הרוסית למדעים (פרוטוקול מס' 1016/25, מיום 17 בינואר 2025). במחקר זה השתמשו ב-28 זכרים של Sprague-Dawley (SD), בגילאי 10-12 שבועות, עם משקל גוף ממוצע של 301 גרם וסטטוס מיקרוביולוגי של SPF ללא פתוגן ספציפי. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. השתמש ב-28 זכרים של חולדות SD, בגילאי 10-12 שבועות, עם מעמד SPF. השתמשו ב-12 בעלי חיים לקבוצת השמה, וב-16 בעלי חיים למידול שבץ איסכמי עם תסחיף גז עורקי מוחי (CAE).
  2. חטא את כל המכשירים במשך 24 שעות בתמיסת החיטוי (0.5% כלורהקסידין ביגלוקונאט ב-70% אתנול).
  3. הרדמו חולדות באמצעות הזרקה תוך-שרירית בתערובת של טילטמין 15 מ"ג/ק"ג וזולזפאם 15 מ"ג/ק"ג + זילזין הידרוכלוריד 10 מ"ג/ק"ג (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו מוסדית).
  4. ודאו שהשלב הכירורגי של ההרדמה הושג: נגעו בפינת העין של בעל החיים, צבוטו את קצה הזנב של בעל החיים.
    הערה: החיה נחשבת כהרדמה כאשר לא נצפים רפלקסים לאחר המניפולציות הללו.
  5. תלש את שדה הניתוח באזור הצוואר הגחני.
  6. מקבע את החיה על שולחן הניתוח על ידי קיבוע הגפיים והחותכות העליונות עם חוסמי עורקים רכים.
  7. חתכו צינורות פוליאתילן בקוטר 0.8 מ"מ לצינורות באורך 10 ס"מ, ואז סובבו ספירלה מייצבת ברוחב של כ-5 מ"מ בקצה על ידי הברגה של קצה צינור הפוליאתילן לצינור מתכת וטבילתו במים חמים (90 מעלות צלזיוס). מלאו את הצינור בהפארין (50 ME). סגור את הקצה הנגדי של הספירלה עם פקק עשוי מחכה של חוט דיג.
    הערה: הקטטר עשוי מצינורות פוליאתילן רפואיים. הימנעו מכיווץ או צביטה על הקטטר בעת הטיפול בו.

2. קטטריזציה לעורק הקרוטיד

  1. בצע חתך באורך של כ-5 מ"מ בצד הגחוני של צוואר החיה.
  2. נתח את שריר הצוואר באמצעות מלקחיים. פתח את האזור שבו עורק התרדמה מתפצל לעורקי הקרוטיד החיצוניים והפנימיים.
  3. מצא את העורק העובר לאורך קנה הנשימה. שחרר אותו בזהירות עם מלקחיים מעטפת רקמת החיבור מבלי לגעת בעצב הוואגוס העובר לאורך העורק.
  4. השתמשו במלקחיים כדי לבודד קטע מהעורק הקרוטידי החיצוני.
  5. הניחו רצועת זנב זמנית בקוטר 3-5 מ"מ לביפרציה בעורק הקרוטיד המשותף.
  6. הניחו שתי רצועות על העורק הקרוטידי החיצוני, אחד מיד לאחר הפיצול ואחד במרחק 4 מ"מ מהפיצול.
    הערה: החדרת קטטר תתבצע בין שתי הקשורות הללו. הקשורה שמונחת מיד לאחר הפיצול תקבע את הקטטר בכלי הדם.
  7. על עורק הקרוטיד הפנימי, יש להניח קשירה זמנית אחת בגולגולת על הפיצול של עורק הקרוטיד המשותף.
  8. יש להניח רצועה על עורק הפטריגופלטינה לאחר הפיצול.
    הערה: בעת יישום הקשורים בשלבים 2.7 ו-2.8, ייתכן שדימום ייגרם בשל נוכחות גווים חיצוניים המוסתרים מאחורי הגזע הראשי של עורק הקרוטיד המשותף. במקרה כזה, יש לקשר אותם.
  9. בצע חתך בעורק הקרוטיד החיצוני בין הקשורות באמצעות מספריים. מכניסים את הקטטר המוכן (שלב 1.7) לחור שנוצר בכלי הדם, ומכוונים אותו לעבר עורק התרדמה המשותף.
  10. שחרר את הליגטורה הדיסטלית ודחף את הקטטר עמוק יותר לאורך כלי הדם עד שהוא נכנס לעורק התרדמה המשותף. קשור בזהירות שני קשירים על קטע העורק הקרוטידי החיצוני כשהקטטר בפנים. הניחו את הקשורה השלישית לפני הקטטר, וקשורים אותה גם כן.
    1. מקבע את הקטטר עם קשירים לטבעת הריפוד. הסר את הקשורים מהעורקים הקרוטידיים והחיצוניים.
      הערה: כאשר דוחפים את הקטטר, דם עלול לדלוף מהכלי.
  11. במקרה של דליפת דם מהכלי, יש להניח קשירים כפולים בין החור בכלי הדם לבין הקשורה השלישית.
  12. הכוון את הקטטר הקבוע לשרירים עם מזרם מחט מחורץ.
  13. תפר את הפצע הגחוני עם חומר תפר 4.0. השתמש בתפר רציף.
  14. תפרו את הצד הגבי של העור עם חומר תפר 4.0 היטב סביב הקטטר. השתמש בתפר רציף. חבר חתיכת טיח דביק לחלק החיצוני של הקטטר וקשור אותו לתפר לקיבוע בטוח יותר.
  15. נתן את האנטיביוטיקה ציפרופלוקסצין במינון של 5 מ"ג/ק"ג בתוך השריר.

3. מידול איסכמיה מוחית מוקדית בבעלי חיים מקבוצת CAE

  1. עשרים וארבע שעות לאחר הקטטריזציה של העכברוש, יש להכניס את החיה למצב ער במכשיר המשתק של המעבדה כדי שיהיה ניתן לגשת לקטטר המונח על הקיצוניים.
  2. הכניסו מזרק מלא בתמיסת מלח של 0.5 מ"ל (0.9% NaCl) עם מחט של 30 גרם במשאבת ההזלפות.
  3. חבר את מחט המזרק לקטטר פוליאתילן ריק (קיבולת של 100 מיקרוליטר). חבר את הקצה השני של קטטר הפוליאתילן לקטטר המושתל באמצעות מתאם.
    הערה: ההשתלה הנכונה של הקטטר והיעדר קרישת דם מוכחים כאשר הפארין מהקטטר המושתל מועבר אל הקטטר המכיל אוויר, מה שגורם ללחץ קל של האוויר. הסיבה לכך היא שלחץ הדם של העכברוש עולה על לחץ האוויר בקטטר המחובר.
  4. קבע את קצב ההזרקה במשאבת ההזלפה ל-10 מיקרוליטר לדקה. הגדר את נפח ההזרקה במשאבת ההזלפה ל-120 מיקרוליטר.
  5. תפעיל את משאבת העירוי. הזריק 100 מיקרוליטר אוויר מהקטטר הפוליאתילן ו-20 מיקרוליטר תמיסת מלח (0.9% NaCl).
    הערה: ההזרקה היא תהליך של 10 דקות. בשלב זה, התבונן בבעל החיים. במהלך ההזרקה, החיה יכולה להוציא קולות, לנשנש או לחפור את המשתק.
  6. תוציא את החיה מהמשתק.
  7. הערכו מיד את מצבו הנוירולוגי של בעל החיים באמצעות סולם של 0-5 נקודות: 0 = ללא ליקוי נוירולוגי, 1 = חוסר יכולת ליישר את הגפה הקדמית במלואה, 2 = סיבוב, 3 = אובדן תמיכה בגפיים, 4 = ללא הליכה ספונטנית עם רמת מודעות מדוכאת, ו-5 = מוות.
    הערה: לתיאור מפורט יותר, עיינו במקור15. ייתכן שבעל חיים לא יראה פגיעה נוירולוגית מיד לאחר מתן האוויר. דבר זה מצביע על כך שהחסימה לא התרחשה בשל תכונות אנטומיות של בעל החיים או לחץ דם מוגבר.
  8. להוציא את החיה מהניסוי בהיעדר תסמינים נוירולוגיים.
    הערה: חולדות עם CAE מראות 1-4 נקודות בסולם החסר הנוירולוגי. ברוב המקרים, זה אובדן תמיכה בגפיים, או חוסר הליכה ספונטנית עם רמת מודעות מדוכאת.
  9. נתן את האנטיביוטיקה ציפרופלוקסצין במינון של 5 מ"ג/ק"ג בתוך השריר.

4. הערכת פרמטרים פיזיולוגיים

  1. שעה לאחר CAE, העריך את מצבו הנוירולוגי של בעל החיים באמצעות סולם של 0-5 נקודות: 0 = ללא ליקוי נוירולוגי, 1 = חוסר יכולת ליישר את הגפה הקדמית במלואה, 2 = סיבוב, 3 = אובדן תמיכה בגפיים, 4 = ללא הליכה ספונטנית עם רמת מודעות מדוכאת, ו-5 = מוות15.
    הערה: לאחר שעה, ייתכן שהחיה לא תראה תסמינים בגלל שבועת האוויר נספגת מחדש במהירות, מה שמעיד שהאמבוליזציה העורקית לא הייתה מספקת.
  2. להוציא את בעל החיים מהניסוי בהיעדר תסמינים נוירולוגיים שעה לאחר CAE (חולדות עם 0 נקודות בסולם החסר הנוירולוגי15).
  3. נתנו את האנטיביוטיקה ציפרופלוקסצין במינון של 5 מ"ג/ק"ג באופן תוך-שרירי ב-24 שעות ו-48 שעות לאחר ה-CAE.
  4. אקראיים בעלי חיים מקבוצת המזויפים וקבוצת CAE להערכת פרמטרים פיזיולוגיים.
  5. שקלו בעלי חיים מיד לפני CAE, ו-3 שעות, 24 שעות, 4 ימים ו-7 ימים לאחר CAE בסולם Sartorius בדיוק גרם.
  6. מדדו את טמפרטורת הגוף הרקטלית של חולדות מיד לפני ה-CAE, ו-3 שעות, 24 שעות, 4 ימים ו-7 ימים לאחר ה-CAE באמצעות מדחום דיגיטלי בטווח פעולה של 32 מעלות צלזיוס עד 42 מעלות צלזיוס.
  7. מדדו לחץ דם וסיסטולי וקצב לב באופן לא פולשני מיד לפני ה-CAE, ו-3 שעות, 24 שעות, 4 ימים ו-7 ימים לאחר ה-CAE באמצעות אזן זנב במערכת ממוחשבת לרישום לחץ דם ופרמטרים נשימתיים.
    1. הפעל את כרית החימום וחמם אותה לטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
    2. הניחו את החיה במכשיר הקיבוע ומקמו אותו על כרית החימום. תן לחיה להירגע ל-3-5 דקות.
    3. לאחר מכן, יש להניח אזיק עם חיישן למדידת פרמטרים קרדיווסקולריים בזנב של בעל החיים, במרחק של 2-3 ס"מ מבסיס הזנב.
    4. כוון את מיקום הטרנסדוסר ישירות מתחת לעורק הזנב התחתון.
    5. ודא שהאות יציב ושהדופק מוצג בתוכנית. תתחיל להקליט את האות.
    6. הדליקו את הצטברות הלחץ בשרוול.
    7. רשמו את הדופק ואת לחץ הדם הסיסטולי עד שלחץ השרוול משתחרר לחלוטין.
    8. ודא ששיקום אות הדופק של החיה מוצג בבירור.
    9. חזור על שלבים 4.4.3-4.4.5. עוד פעמיים ושחרר את החיה מהמשתק של החיה.
    10. חשב את הדופק הממוצע ולחץ הדם הסיסטולי משלוש מדידות.
  8. מדדו את קצב הנשימה ונפח הנשימה מיד לפני ה-CAE, ו-3 שעות, 24 שעות, 4 ימים ו-7 ימים לאחר ה-CAE באמצעות מערכת ממוחשבת לרישום לחץ דם ופרמטרים נשימתיים.
    1. אבטח את החיה ביד אחת במצב טבעי עבורו.
    2. הנח מסכה עם צינור שמחובר לאף של החיה.
      הערה: ייקח זמן עד שהחיה תתרגל לנשום לתוך המסכה.
    3. ודא שהחיה רגועה.
    4. רשם נפח נשימה וקצב נשימה במשך 10 שניות.
    5. ודאו שהחיה לא נאנחה או בלעה במהלך ההקלטה.
    6. חזור על צעדים 4.5.2-4.5.3 עוד פעמיים.
    7. חשב את נפח הנשימה הממוצע וקצב הנשימה משלוש מדידות.
    8. חשב את נפח הדקות הנשימתיות באמצעות הנוסחה:
      נפח נשימתי זעיר = קצב נשימה × נפח נשימה.

5. הערכת פרמטרים פונקציונליים והתנהגותיים

  1. העריך את מצבו הנוירולוגי של בעל החיים באמצעות סולם של 0-5 נקודות: 0 = ללא חסר נוירולוגי, 1 = חוסר יכולת ליישר את הגפה הקדמית במלואה, 2 = סיבוב, 3 = אובדן תמיכה בגפיים, 4 = אין הליכה ספונטנית עם רמת מודעות מדוכאת, ו-5 = מוות15.
  2. העריכו תפקוד מוטורי ותיאום ברוטה-רוד מיד לפני ה-CAE, ו-3 שעות, 24 שעות, 4 ימים ו-7 ימים לאחר ה-CAE.
    1. לאמן את החיות לניסויים על מכשיר Rota Rod.
      1. הנח את החיה על מוט נייח למשך 5-30 שניות.
      2. בעלי חיים שמסוגלים להחזיק מוט נייח לפחות 10 שניות, מפעילים אותם על מוט שמסתובב עם תאוצה מינימלית במשך כ-30 שניות.
      3. המשך לאמן את החיות עד שיוכלו לעמוד בחופשיות על מוט שמסתובב בתאוצה מתאימה.
    2. הניחו את בעלי החיים על מוט אופקי מסתובב בקוטר 7 ס"מ במהירות מינימלית של 1 סל"ד.
    3. האצה התחלתית של 1 סל"ד כל 10 שניות עד למהירות מקסימלית של 60 סל"ד.
    4. רשמו את הזמן שבו העכברוש היה על המוט המסתובב.
  3. הערך את פעילות התנועה של העכברים מיד לפני ה-CAE, ו-3 שעות, 24 שעות, 4 ימים ו-7 ימים לאחר ה-CAE באמצעות מערכת ממוחשבת.
    1. מניחים את החיה במרכז שדה פתוח ורשמו במשך 5 דקות את המרחק שעבר ואת זמן הפעילות של העכברוש.
  4. הערך את חוזק האחיזה של הגפה הקדמית 3 שעות, 24 שעות, 4 ימים ו-7 ימים לאחר CAE במדד כוח האחיזה.
    1. החזק את הזנב של החיה ואפשר לו לאחוז בסורגים עם הגפיים הקדמיות.
    2. משוך את החיה במקביל לסורג עד שהעכברוש משחרר את הסורג.
    3. בצע שלוש פעמים ניסיון ובחר את התוצאה הגבוהה ביותר.

6. הערכת רמת חלבון B (S100b) הקשור לסידן ב-S100

  1. מדוד את רמות S100b בסרום בעכברים לפני מודל CAE, 24 שעות ו-7 ימים לאחר ה-CAE.
    1. שים את החיה במעבדה של המשתק.
    2. הפעל את כרית החימום וחמם אותה לטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
    3. מקם את החיה במכשיר המשתק של המעבדה על כרית החימום. המתינו 5 דקות כדי לאפשר לבעל החיים להירגע.
    4. הנח את החיה על צידה.
      הערה: הווריד הזנבי צריך להיות גלוי בזנב.
    5. הכנס קטטר תוך-ורידי לווריד הזנב.
    6. משוך 1 מ"ל דם לצינור של 1.5 מ"ל.
    7. תן לדם לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות.
    8. צנטריפוגה את דגימת הדם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בעוצמה של 1500 x גרם.
    9. אסוף את הסרום עם פיפטה אוטומטית לצינור נפרד בנפח 1.5 מ"ל.
      הערה: הסרום חייב להיות שקוף ונקי, ללא תערובת אדומה של אריתרוציטים.
    10. נתחו את הסרום באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזימים (ELISA) באמצעות ערכת ELISA מתאימה.

7. הסרת קטטר

  1. בצע את הליך הסרת הקטטר 24 שעות לאחר ה-CAE, לאחר בדיקות בשלב 5.
    1. הניחו את בעלי החיים בתא השאיפה עם מערכת הרדמה גזית מחוברת ומרכז חמצן למשך 1-2 דקות, עם אספקת איזופלוראן בתא בנפח של 2.5%-3.5% עם קצב אספקת חמצן של 3 ליטר לדקה.
    2. העבר את בעל החיים לכרית חימום (37.5 מעלות צלזיוס) עם אספקת גז מסכה במצב מינון איזופלוראן 2%-3% עם קצב זרימת חמצן של 1.0-2.0 ליטר לדקה.
    3. לחתוך את הדגל מבלי לחתוך את התפר הפצע או לפגוע בקטטר.
    4. נקה את הקצה החיצוני של הקטטר, טפל בתמיסת חיטוי (0.5% כלורהקסידין ביגלוקונאט ב-70% אתנול).
    5. הסר את התפר מהניתוח הקודם מהצד הגחוני של הצוואר. דרך החתך, השתמשו במלקחיים כדי לבודד בעדינות את סליל הקטטר.
    6. משוך החוצה את הקצה הארוך של הקטטר דרך החתך הגחוני.
    7. הניחו רצועת קשר עם קשר, ללא הידוק, על העורק התרדמי החיצוני בין הפיצול לאתר הכנסת הקטטר.
    8. חתכו בזהירות את הקשרים שמקשרים את הקטטר, משכו את הקטטר עם מלקחיים, הדקו את הקשר על הכלי וקושרים מחדש.
    9. גזום את קצות הקשורה ותפר את הפצע. השתמש בתפר רציף.

8. הערכת צביעת כלוריד טריפנילטרזוליום

  1. מתן הרדמה סופית ל-6 בעלי חיים מקבוצת המזויף ו-6 בעלי חיים מקבוצת CAE 24 שעות לאחר החסימה, ול-6 בעלי חיים מקבוצת המזויף ו-10 בעלי חיים מקבוצת CAE ביום השביעי לאחר ה-CAE באמצעות הזרקה תוך-שרירית של טילטמין 15 מ"ג/ק"ג וזולזפאם 15 מ"ג/ק"ג + זילזין הידרוכלוריד 10 מ"ג/ק"ג.
  2. ודאו שהשלב הכירורגי של ההרדמה הושג כפי שמתואר בשלב 1.3.
  3. בצע דגימת דם כוללת מהווריד הנבוב הזנב עם מזרק של 2 מ"ל ומחט של 24 גרון.
  4. פתח את הקמרון הגבי של הגולגולת מבלי לפגוע ברקמת המוח.
  5. בדוק את הדורה מאטר.
  6. חתכו את המוח עם להב מיקרוטום לפרוסות פרונטליות בעובי 2 מ"מ שמתחילות מהאונה המצחית.
  7. הנח את החלקים על שקף מיקרוסקופ.
  8. הניחו את הפרוסות בתמיסת טריפנילטראזוליום כלוריד (TTC) של 1% והניחו אותן בתרמוסטט בטמפרטורה של 37°C למשך 10-12 דקות.
  9. בדוק את כל חלקי המוח. שימו לב לשינוי בצבע של הכתמים המנסים להיראות.
    הערה: רקמה לא פגועה תצבע בוורוד בוהק, בעוד רקמה עם נגעים תצבע בוורוד בהיר.
  10. צלם את הפרוסות משני הצדדים.
  11. מקבע את הפרוסות בתמיסת פורמלין ניטרלית 10%.
  12. הערכו את שטח הנגע המוקדי בתוכנה לניתוח תמונה מדעי.

9. הערכת צביעת המטוקסילין ואאוזין

  1. ייבוש פרוסות מוח קבועות בסוללה עולה של אתנול (70%, 80%, 100%).
  2. השרו פרוסות מיובשות בפרפין וצרו פרוסות בעובי 7 מ"מ.
  3. צבעו את החלקים בהמטוקסילין ואאוזין.
  4. לבצע ניתוח מיקרוסקופי של חתכים באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר.

10. ניתוח סטטיסטי

  1. לבצע ניתוח סטטיסטי בתוכנית הסטטיסטית.
  2. יישם סטטיסטיקה תיאורית (מחשב ממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע), וליצור גרפים כדי להמחיש את התוצאות.
  3. לאחר בדיקת הנורמליות של כל קבוצה, בצע השוואות מרובות באמצעות קריטריון הדירוג של דאנקן.
  4. קבעו הבדלים ברמת המובהקות של 5%.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הישרדות ומצב כללי
מיד לאחר מתן בועת האוויר, כל העכברים הראו מצב מופרע ורעד בולט למשך מספר שניות, ואחריו הפסקה של כל פעילות מוטורית ואובדן הכרה למשך 1-2 דקות. חלק מהחיות איבדו תמיכה בכפות הרגל למשך 10-15 דקות לאחר שהתעוררו.

שיעור ההישרדות של בעלי חיים 3 שעות לאחר CAE היה 100%, אך לאחר 24 שעות שיעור ההישרדות ירד ל-80%,וביום השלישי עמד על 60%. במעקב אחרי בעלי חיים עד 7 ימים לאחר האמבוליזציה, לא נצפה מוות חדש (אי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

MCAO היא שיטה נפוצה למידול שבץ איסכמי מוקדי בעכברים, המתבצע באמצעות היווצרות קרישי דם, עווית מקומית בעורק המוחי האמצעי, וחסימה זמנית על ידי חוט2. מטרת מודלים אלו היא (1) להשיג אפופטוזיס מוקד של רקמת המוח העצבית16 עם נפח ונגע סטנדרטייםושטח 17, (2) לנטר את המחסור הנוירולוגי של בעלי חיים במשך 2-7 ימים18.

בחירת קצב ונפח מתן האוויר נקבעה אמפירית. פרסום קודם עסק בבחירת קצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע הרוסית, פרויקט מס' 25-15-00037.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק תלת-רכיבי עם מחט של 2 מ"ל  לייקו52322223G
משאבת עירוי בודדת אלאדיןוורלד פרסיז'ן אינסטרומנטסAL-1000
ציפרופלוקסציןפארמבט3897744תמיסה של 5% ציפרופלוקסצין
מערכת ממוחשבת PowerLab 8/35 תוספות3508-1090
דזיןApteka.ru0.5% כלורהקסידין ביגלוקונאט ב-70% אתנול
מדחום דיגיטליB.Well Swiss AGפריט 0413
מד כוח אחיזה של דינמומטר אלקטרוניBioMed Easy Technologies007231024415MC01
ערכת ELISA לחלבון קושר סידן S100 B (S100B)קלאוד-קלון קורפ. (CCC)SEA567Ra48T
חוט דיגקוטר 0.9 מ"מ
מערכת הרדמה גזיתUGO BASILE 21100
תוכנת סטטיסטיקה של GraphPadפריזמהכרך 10
מנהל מחט חריץפישר סיינטיפיקקטלוג מס' 11-0012.7 ס"מ
הפאריןאנדופארם. המפעל האנדוקריני של מוסקבה30122
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות והמעבדה למכשור אופטי וחישובי
מזרק אינסוליןמוצרי בית החולים של SFM1603030.5 מ"ל, U-100, 30G
קטטר תוך-ורידיKD MedicalG24
איזופלורין (איזופלורין)וטרפמה100 מ"ל, 1000 מ"ג/ק"ג
מנטר חיות מעבדה לבעלי חיים במעבדהמדע פתוחAE1001-R1
מיקרוסקופ אורצייסAxio Scope.A1
שקופיות מיקרוסקופיות אורתרמו-סיינטיפיק15442933
מיקרו-צינורות פוליאתילן רפואייםScientific Commodities Inc.BB31695-PE/4קוטר פנימי 0.76 מ"מ
מגבוני גזה סטריליים רפואייםחיים חדשים  45x29 ס"מ
צינור מיקרוSARSEDT AG & פלוגה KGS0443781.5 מ"ל
מחקר מיקרופיפט אפנדורף פלוסאפנדורף200 ומיקרו; L
שקופיות מיקרוסקופפישר סיינטיפיק11562203
מלקחיים מיקרוכירורגיים (מעוקלים)מפעל כלי הרפואה בקאזאןF0106
מלקחיים מיקרוכירורגיים (ישרים)RWD מדעי החייםF11029-11
להבי מיקרוטוםתרמו-סיינטיפיק3052835MX35 פרמייר+
מערכת מולטי-קונגנציהמערכות TSE131202-10
פורמלין עם מאגר נייטרליהם,1072024pH 6,8-7,2 
תפר כירורגי לא-נספג Lavsanלינטקס2022-01
מספריים עיניים לכריתת קשתCM אינסטרומנטהAJ-410-05
מרוכז חמצןחמושיםYYT327009607F-3L
בופר פוספטאמרסקו2120C462
טיפים של פיפטהסרוויסביו200 ומיקרו; L
עכבריםהושג ממשתלת בעלי החיים במעבדה " פושצ'ינו" (www.spf-animals.ru), מכון שמיאקין-אובצ'יניקוב לכימיה ביואורגנית של האקדמיה הרוסית למדעים.
צנטריפוגה רב-תכליתית במעבדה מקוררתאפנדורף5804 R
רוטה-רוד רוטמקס-5 קולומבוס אינסטרומנטס210426
Scissors METZENBAUM מדסטנדארט-אינסטרומנטMT-H-256
חומר התפר הכירורגיREPROMED114/0042011124Kaproag 4/0
שולחן ניתוחיםVetKormTorgVETBOT STL-1, TD00472
טלאזולזואטיס67291350 מ"ג/מ"ל טילטמין ו-50 מ"ג/מ"ל זולאזפאם ב-5 מ"ל
טריפנילטרזוליום כלורידDia-MTTC1809
זילזיןניטה-פארם1512% זילזין הידרוכלוריד ב-50 מ"ל

מקורות

  1. Søyland, M. H., Tveiten, A., Eltoft, A., Øygarden, H., Varmdal, T., Indredavik, B., et al. Wake-up stroke and unknown-onset stroke: Occurrence and characteristics from the nationwide Norwegian Stroke Register. Eur Stroke J. 7 (2), 143-150 (2022).
  2. Li, Y., Zhang, J. Animal models of stroke. Animal Model Exp Med. 4 (3), 204-219 (2021).
  3. Brunner, C., Korostelev, M., Raja, S., Montaldo, G., Urban, A., Baron, J. C. Evidence from functional ultrasound imaging of enhanced contralesional microvascular response to somatosensory stimulation in acute middle cerebral artery occlusion/reperfusion in rats: A marker of ultra-early network reorganization. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1690-1700 (2018).
  4. Buetefisch, C. M., Wei, L., Gu, X., Epstein, C. M., Yu, S. P. Neuroprotection of low-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation after ischemic stroke in rats. Ann Neurol. 93 (2), 336-347 (2023).
  5. Jin, R., Zhu, X., Li, G. Embolic middle cerebral artery occlusion (MCAO) for ischemic stroke with homologous blood clots in rats. J Vis Exp. (91), e51956(2014).
  6. Shpetko, Y. Y., Filippenkov, I. B., Denisova, A. E., Stavchansky, V. V., Gubsky, L. V., Limborska, S. A., et al. Isoflurane anesthesia's impact on gene expression patterns of rat brains in an ischemic stroke model. Genes. 14 (7), 1448(2023).
  7. Toung, T. J. K., Mehr, N., Mirski, M., Koehler, R. C. Embolic occlusion of internal carotid artery in conscious rats: Immediate effects of cerebral ischemia. Physiol Rep. 11 (4), e15613(2023).
  8. Yan, J., Liu, Y., Zheng, F., Lv, D., Jin, D. Environmental enrichment enhanced neurogenesis and behavioral recovery after stroke in aged rats. Aging-US. 15 (18), 9453-9463 (2023).
  9. Jin, X., Morais, A., Imai, T., Lamb, J., Nagarkatti, K., Boisserand, L. Determinants of outcome after endovascular middle cerebral artery occlusion in rats in the SPAN trial. Stroke. 56 (9), 2734-2747 (2025).
  10. Feng, Y., et al. Activation of testosterone-androgen receptor mediates cerebrovascular protection by photobiomodulation treatment in photothrombosis-induced stroke rats. CNS Neurosci Ther. 30 (2), e14574(2024).
  11. Gubskiy, I. L., et al. MRI guiding of the middle cerebral artery occlusion in rats aimed to improve stroke modeling. Transl Stroke Res. 9 (4), 417-425 (2018).
  12. Gupta, S., Sharma, U., Jagannathan, N. R., Gupta, Y. K. Neuroprotective effect of lercanidipine in middle cerebral artery occlusion model of stroke in rats. Exp Neurol. 288, 25-37 (2017).
  13. Gupta, Y. K., Sinha, K., Chaudhary, G. Transient focal ischemia induces motor deficit but does not impair the cognitive function in middle cerebral artery occlusion model of stroke in rats. J Neurol Sci. 203-204, 267-271 (2002).
  14. Shukla, P. K., et al. Neuroprotective effect of Acorus calamus against middle cerebral artery occlusion-induced ischaemia in rat. Hum Exp Toxicol. 25 (4), 187-194 (2006).
  15. Schäbitz, W. R., et al. Synergistic effects of a combination of low-dose basic fibroblast growth factor and citicoline after temporary experimental focal ischemia. Stroke. 30 (2), 427-432 (1999).
  16. Tang, H., et al. Delayed recanalization after MCAO ameliorates ischemic stroke by inhibiting apoptosis via HGF/c-Met/STAT3/Bcl-2 pathway in rats. Exp Neurol. 330, 113359(2020).
  17. Lee, K. Y., Bae, O. N., Weinstock, S., Kassab, M., Majid, A. K. Neuroprotective effect of asiatic acid in rat model of focal embolic stroke. Biol Pharm Bull. 37 (8), 1397-1401 (2014).
  18. Li, L., Rong, W., Ke, W., Hu, Z., Yip, S. P., Tong, K. Y. Muscle activation changes during body weight support treadmill training after focal cortical ischemia: A rat hindlimb model. J Electromyogr Kinesiol. 21 (2), 318-326 (2011).
  19. Palikov, V. A., et al. Experimental model of cerebral arterial air embolism in conscious rats. Bull Exp Biol Med. 177 (5), 668-672 (2024).
  20. Kusuda, K., Ibayashi, S., Sadoshima, S., Ishitsuka, T., Fujishima, M. Brain ischemia following bilateral carotid occlusion during development of hypertension in young spontaneously hypertensive rats--importance of morphologic changes of the arteries of the circle of Willis. Angiology. 47 (5), 455-465 (1996).
  21. Webster, J., Osborne, S., Rickard, C. M., Marsh, N. Clinically-indicated replacement versus routine replacement of peripheral venous catheters. Cochrane Database Syst Rev. 1 (1), CD007798(2019).
  22. Okuyama, S., et al. The arterial circle of Willis of the mouse helps to decipher secrets of cerebral vascular accidents in the human. Med Hypotheses. 63 (6), 997-1009 (2004).
  23. Mamo, Y. A. Cerebrovascular effects of vasoactive drugs: in vitro, in vivo and clinical investigations. Medicine. , 73874537(2015).
  24. Stangeland, H., Orgeta, V., Bell, V. Poststroke psychosis: A systematic review. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 89 (8), 879-885 (2018).
  25. Mercier, E., et al. Predictive value of S-100β protein for prognosis in patients with moderate and severe traumatic brain injury: Systematic review and meta-analysis. Br Med J (Clin Res Ed). 346, f1757(2013).
  26. Baig, M. U., Bodle, J. Thrombolytic Therapy. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2025).
  27. Murphy, R. P., Donnellan, J. A High-pressure solution for a high-pressure situation: Management of cerebral air embolism with hyperbaric oxygen therapy. Cureus. 11 (9), e5559(2019).
  28. Heinrichs, S. C., Koob, G. F. Application of experimental stressors in laboratory rodents. Curr Proto. Neurosci. Chapter 8 (Unit 8.4), (2006).
  29. Emms, H., Lewis, G. P. Sex and hormonal influences on platelet sensitivity and coagulation in the rat. Br J Pharmacol. 86 (3), 557-563 (1985).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.