Method Article

הליך דגימה מבוסס חוט אדום פנול לליפידומיקה של נוזל דמעות לא ממוקד בגילוי סמנים ביולוגיים

DOI:

10.3791/69474

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול קליני ייחודי לאיסוף דגימות נוזלי דמעות אנושיות באמצעות חוטי פנולים אדומים ותהליך עבודה מבוסס כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS) לגילוי פרופיל הליפידומי של הקרע. שיטת ההפרדה הדו-פאזית של מתיל טרט-בוטיל (MTBE)/מתנול מאפשרת חילוץ מהיר מליפידים מדרע עם התאוששות גבוהה לגילוי סמן ביולוגי של דמעות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שומנים קרעים חיוניים ליציבות שכבת הדמעות ולבריאות פני העין. שינויים בהרכב הדמעות עשויים להיות קשורים למחלות עיניים ומערכתיות כגון תפקוד לקוי של בלוטות מייבומיאן ודיסליפידמיה. פרופילינג של שומנים מדמעים עשוי לסייע בגילוי סמנים ביולוגיים לאבחון וניהול מחלה. עם זאת, שיטות דגימת דמעות נפוצות מציגות מגבלות ברורות: רצועות שירמר גורמות לעיתים קרובות לגירוי ואי נוחות עיניים בשל שטח המגע הגדול שלהן עם פני העין, בעוד שאיסוף צינורות מיקרו-קפילריים עלול להניב שחזוריות נמוכה בשל שונות המפעיל, במיוחד כאשר מתבצעת על ידי צוות אחר. מגבלות אלו עלולות לפגוע בדיוק ובעקביות של נתוני הליפידום. מחקר זה מציג שיטת דגימה זעיר-פולשנית מבוססת חוט פנול אדום (PRT) המותאמת לליפידומיקה של דמעות. המבנה הדק של ה-PRT מפחית את הסיכון לגירוי עיני ומאפשר איסוף דמעות מהיר ועדין. שיטה ידידותית למשתמש וקלה זו מתאימה לנבדקים עם נפח קרע מופחת או סבילות נמוכה יותר לתחושת גופים זרים, ומאפשרת איסוף דגימות שכפול יותר על ידי הפחתת שונות תלויה במפעיל. שומנים דמעים שנאספו על ידי PRT הופקו באמצעות פרוטוקול הפרדת פאזה מיטבי של מתנול/מתיל טרט-בוטיל אתר (MTBE) ונותחו באמצעות LC-Orbitrap-IQX MS/MS ברזולוציה גבוהה עם תוכנת LipidSearch. תהליך העבודה זיהה יותר מ-700 מיני שומנים ייחודיים של דמעות, שכל אחד מהם מאופיין ביוני מוצר ספציפיים שמקורם בחומצה שומנית. תוצאות אלו מצביעות על כך שדגימה מבוססת PRT מספקת התאוששות שומנים חזקה לניתוח ליפידומי של דמעות. גישה זעיר-פולשנית זו וניתנת לשחזור מספקת פלטפורמה מעשית למחקר קליני וניסוי של שומן דמעות. בסופו של דבר, זה יכול גם לסייע בגילוי סמנים ביולוגיים ובמעקב אחר מחלות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שכבת דמעות היא המחסום החיצוני ביותר שמגן על פני השטח העין מפני פתוגנים ושומר על הומאוסטזיס עיני 1,2, בעוד שכבת השומנים בשכבת הדמעות היא המרכיב המרכזי למניעת אידוי קרע ולשמירה על יציבות שכבת הדמעות 3,4. חוסר ויסות של הרכב שומן הדמעות נקשר למחלות עיניים שונות, כולל יובש בעיניים (DED), תפקוד לקוי של בלוטות המיבומיאן (MGD) ודלקת לחמית אלרגית 5,6,7,8. כתוצאה מכך, אפיון מפורט של ליפידומיקס דמעות הפך לכיוון מחקר קריטי ומגמה להבנה מקיפה יותר של הפתולוגיות המולקולריות שמאחורימצבים עיניים אלו.

בעוד שגישת הליפידום של הדמעות היא בעלת חשיבות קלינית רבה, אתגר קריטי בליפידומיקה של דמעות הוא הקמת תהליך איסוף וניתוח סטנדרטי וניתן לשחזור. שיטות דגימת קרע עכשוויות, רצועות שירמר וצינור מיקרו-קפילרי, כל אחת מהן מציגה מגבלות ייחודיות. לרצועות של שירמר יש שטח מגע גדול עם פני השטח העין, מה שגורם לעיתים קרובות לגירוי עיני ולקריעת רפלקסים 9,10. בהשוואה לכך, איסוף צינורות מיקרו-קפילריים תלוי מאוד בטכניקת המפעיל ויכול להניב תוצאות לא עקביות כאשר מבוצעעל ידי אנשי צוות שונים. בנוסף, שימוש לא נכון בכלי הדגימה הללו עלול גם הוא להוביל לסיכון לפגיעת פני העיניים. מגבלות אלו עלולות לפגוע בדיוק וביכולת השחזור של הנתונים במורד הזרם12,13. יתרה מזאת, שיטות איסוף קרעים הדורשות נהלי טיפול מורכבים עלולות להגביל את הנגישות והסטנדרטיזציה שלהן במעבדות ובסביבות קליניות שונות. לכן, יש צורך דחוף להקים תהליך איסוף ועיבוד דמעות לא פולשני, חזק וניתן לשחזור, שיכול לשמר את פרופיל השומן הטבעי של הדמעה.

מחקרים אחרונים הדגישו את התועלת של חוט פנול אדום (PRT) לניתוחי זרימות עבודה של LC-MS/MS במורד הזרם ביישומים פרוטאומיים ומטבולומיים14,15. PRT מציע יתרונות מובנים ככלי לאיסוף דמעות. המבנה הדק שלה, אופיו המינימלי פולשני ותהליך הדגימה הפשוט יכולים למזער מורכבות טכנית ולהפחית שונות תלויה במפעיל, תוך סבלנות טובה על ידי רוב הנבדקים14,16. עם זאת, עדיין לא הוקמה זרימת עבודה סטנדרטית המיועדת לניתוח ליפידומי דמעות מבוסס PRT.

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה משולבת לליפידומיקה של קרעים שניתן לשחזור: שיטת איסוף קרעים מבוססת PRT ידידותית למשתמש מותאמת לניתוח שומנים, פרוטוקול מיקוד ליפידים של מתיל טרט-בוטיל (MTBE)/מתנול אופטימלי עם יחסי ממס לדגימה ובקרות אחסוןמוגדרות 17,18, ושיטת זיהוי שומנים מותאמת באמצעות LC-MS/MS ברזולוציה גבוהה. גישה סטנדרטית זו מאפשרת פרופיל ליפידומי עקבי של דמעות לגילוי סמנים ביולוגיים ואפיון מחלה במורד הזרם. כמו כן, הוא מתאים במיוחד לנבדקים עם נפח קרע נמוך או סבילות מופחתת לתחושת גופים זרים (איור 1).

figure-introduction-1
איור 1: סקירה סכמטית של תהליך העבודה המבוסס על Phenol Red Thread (PRT) לליפידומיקה של דמעות אנושיות. נוזל הדמעות נאסף מנבדקים המשתמשים בשיטת PRT, שמאפשרת איסוף דגימות עקבי עם מינימום אי נוחות. עיבוד הדגימה כולל חילוץ דו-פאזי של MTBE/מתנול ברצף, ריכוז מתווך SpeedVac, ועיצוב מחדש של תמציות שומן דמעות לצורך ספקטרומטריית מסה בצורת כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS). פרופילים ליפידומיים נרכשים לאחר מכן דרך LC-MS/MS ועוברים להערות וזיהוי באמצעות תוכנת LipidSearch. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של אוניברסיטת הפוליטכניקה של הונג קונג. הנבדקים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לפני השתתפותם במחקר. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. איסוף נוזלי דמעות אנושי מבוסס חוט אדום פנול (PRT)

  1. לבשו כפפות וחיטו את תחנת העבודה כדי למנוע זיהום דגימה.
  2. ודא שהחבילה של ה-PRT אטומה ולא פג תוקף לפני שפותחים אותה.
  3. החזק את החוט בקצה מול הקרס המעוקל. תמיד הימנע מלגעת בחצי הקרס המעוקל של ה-PRT.
  4. בקש מהנבדק לבדוק את כיוון האף העליון.
  5. משכו בעדינות את עפעף התחתון של הנבדק והכניסו את ה-PRT עם הקרס המעוקל הממוקם בלחמית הטמפורלית התחתונה, סמוך לקנתוס החיצוני של עין הנבדק (איור 2).

figure-protocol-1
איור 2: מיקום חוט הפנול האדום במהלך איסוף הקרעים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

  1. בקש מהנבדק לעצום עיניים בעדינות ולהטות את ראשו מעט קדימה כדי למנוע מה-PRT לגעת בעור פניו.
    הערה: קרע שנספג יגרום בהדרגה לחזית צבע אדומה, מה שמעיד על אזור הדגימה של ה-PRT בשל הפנול האדום הרגיש ל-pH. כדי להבטיח מספיק נוזל דמעות לניתוח ליפידומי, עדיף לאסוף נפח קרע השווה ל-50 מ"מ של PRT, בדרך כלל תוך 2 דקות.
  2. משכו בעדינות את העפעף התחתון של הנבדק ושלפו את ה-PRT שנדגם. הימנע מלגעת באזור שנדגם.
  3. רשמו את אורך האזור שנלקח ב-PRT והעבירו את ה-PRT לצינור דגימה חדש בעזרת מלקחיים סטריליים.
    הערה: אם אורך ה-PRT שנדגם הוא <50 מ"מ, אנא בקש מהנבדק לנוח 1-3 דקות ולחזור על האיסוף באותה עין. העבר כל PRT שנדגם לצינור דגימה נפרד.
  4. תייג ומכסה את צינורות הדגימה כמו שצריך.
  5. נקה היטב את הכפפות והמלקחיים עם מתנול ונקה מגבוני נייר כדי להסיר שאריות קרע או מזהמים, ואז תן להם להתייבש.
  6. חזור על השלבים 1.2-1.10 לעין השנייה.
  7. אטום את צינורות הדגימה בפארפילם ואחסן מיד את הדגימה בטמפרטורה של -20°C לאחסון זמני או -80°C לאחסון ארוך טווח. הימנעו ממחזורי הקפאה והפשרה מיותרים והגנו על ה-PRT שנדגמו מהאור.

2. עיבוד PRT שנדגם

  1. שטוף מראש את המספריים המיקרו עם מתנול לפני עיבוד ה-PRT.
  2. השליכו את קצה הקרס המעוקל (כלומר, 3 מ"מ ראשונים) של ה-PRT (איור 3).

figure-protocol-2
איור 3: מראה פיזי של חוט פנול אדום (PRT). (א) PRT לא בשימוש עם קצה קרס מעוקם. (ב) השתמשו ב-PRT עם החתך המומלץ שנחתך ונאסף לצורך חילוץ שומן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

  1. חתוך את האזור שנדגם ב-PRT (כלומר, האזור מעל חזית צבע הפנול האדום) לחתיכות של 2 מ"מ והעבר את החלקים הללו לצינור מיקרוצנטריפוגה אורגני נקי בנפח 1.5 מ"ל עמיד לממסים.

3. הפרדה דו-פאזית בין MTBE/מתנול להפקת שומנים מ-PRT שנמדם

זהירות: MTBE ומתנול דליקים ונדיפים. שימוש באזור מאוורר היטב או במכסה אדים. הימנע מלהבות פתוחות וניצוצות. תלבש כפפות וחלוק מעבדה. שטוף ידיים אחרי הטיפול.

  1. שים את הדגימות על הקרח.
  2. הוסף 232 מיקרוליטר של מתנול קר (דרגת MS) לכל דגימה ומערבולת למשך 15 שניות.
  3. סוניקציה של הדגימות בחומר ניקוי אולטרסוני מקורר מראש למשך 15 דקות.
  4. הוסיפו 774 מיקרוליטר MTBE (דרגת HPLC) ו-194 מיקרוליטר מים דה-יוניים לכל דגימה ומערבולת למשך 15 שניות. יחס הנפח המתקבל של MTBE:methanol:מים בדגימה צריך להיות 4:1.2:1 (v/v/v).
  5. סוניקציה נוספת של הדגימות בניקוי אולטרסוני מקורר מראש למשך 15 דקות.
  6. דגרו את הדגימה בתרמומיקסר למשך 8 שעות בטמפרטורה של 4°C, עם ניעור ב-1,200 סל"ד.
  7. תן לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  8. צנטריפוגה את התערובות המתקבלות ב-10,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  9. לאחר הצנטריפוגה, התערובות מופרדות לשתי פאזות (איור 4).
    הערה: עם סיום הפרדת הפאזה, יש לבדוק את הדגימה לשתי שכבות מובחנות: הפאזה האורגנית העליונה (עשירה ב-MTBE) צריכה להיראות שקופה עם אטימות חלבית קלה, בעוד שהפאזה המימית התחתונה מציגה צבע צהוב הנובע מנוכחות אינדיקטור פנול אדום. יש להמשיך רק אם נצפו מאפייני פאזה אלו, כפי שמוצג באיור 4.

figure-protocol-3
איור 4: הפרדה פאזית של הפקת שומנים באמצעות MTBE-methanol-water: פאזה אורגנית עליונה ופאזה מימית תחתונה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

  1. אסוף בזהירות 700 מיקרוליטר מהחלק האורגני העליון המכיל ליפידים והעבר לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש מקורר מראש בנפח 1.5 מ"ל.
  2. יש להשליך את הפאזה המימית התחתונה המכילה שאריית MTBE ומתנול כפסולת כימית מסוכנת. אספו פסולת במיכלים מסומנים ואטומים והשליכו אותה בהתאם לפרוטוקולי פסולת מסוכנת מוסדיים ולתקנות מקומיות. אל תשפוך ממסים לניקוז.
  3. ייבשו את תמציות השומן באמצעות מרוכז SpeedVac מקורר למשך 4 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי להבטיח ייבוש מלא, יש לבדוק מדי פעם את יובש הדגימה החל מ-2 שעות. האריך את זמן הייבוש לפי הצורך עד שהדגימות ייבשו לחלוטין.
  4. אחסן את תמציות השומן היבשות בטמפרטורה של -20°C לאחסון קצר טווח או ב-80- מעלות לאחסון ארוך טווח.

4. שיקום של שומן הדמעות שהופק לניתוח LC-MS/MS

  1. משחזר את תמציות השומן היבשות עם 50 מיקרוליטר של תערובת מתנול קר (דרגת MS)/כלורופורם (דרגת HPLC) (1:1, v/v) כממס (1 מיקרוליטר ממס לכל 1 מ"מ PRT בשימוש) ואחריו סוניקציה בניקוי אולטרסוני מקורר מראש למשך 15 דקות.
  2. צנטריפוגה את תמציות השומן המחודשות ב-14,000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. העבר בזהירות 40 מיקרוליטר מהסופרנטנט לבקבוקון זכוכית אוטוסמפלר עם תוספת זכוכית מותקנת.
  4. סגור היטב את הבקבוקון עם פקק פתוח ללא מחיצה ולהיות מוכן לניתוח LC-MS/MS.

5. איסוף דגימות על ידי LC-MS/MS

  1. בכרומטוגרפיה נוזלית, יש להגדיר את טמפרטורת תא העמודה והדגימה ל-50 מעלות צלזיוס ו-4 מעלות צלזיוס, בהתאמה.
  2. לכל הזרקה, מעמיסים 5 מיקרוליטר מהדגימה על עמודת LC הפוכית (C18; 1.7 מיקרון, 100 מ"מ × 2.1 מ"מ) ומפרקים את הליפידים בקצב זרימה של 0.3 מ"ל/דקה בגרדיאנט הפרדה של 24 דקות.
    1. השתמש בפאזה ניידת A הכוללת תערובת של 60:40 אצטוניטריל (דרגת MS):מים (v/v) עם פורמט אמוניום של 5 מ"מ (דרגת MS) וחומצה פורמית של 0.1% (v/v) (דרגת MS) ושלב B נייד המכיל איזופרופנול 90:10 (דרגת MS):אצטוניטריל (v/v) עם פורמט אמוניום של 5 מ"מ ו-0.1% (v/v) חומצה פורמית.
    2. השתמשו בגרדיאנט הבא: 0-2 דקות: 40% B; 2-2.5 דקות: 40% B; 2.5-3 דקות: 58% B; 3-18 דקות: 99% B; 18-20 דקות: 99% B; 20-20.1 דקות: 40% B; 20.1-24 דקות: 40% B.
  3. עבור ספקטרומטר המסה Orbitrap, הגדר את מתח הריסוס ל-+3.5 kV למצב חיובי או -2.5 kV למצב שלילי.
  4. כוון את קצב זרימת הגז של המעטפת ל-45 ארב ואת קצב זרימת הגז העזר ל-10 ארב.
  5. הגדר את קצב זרימת הגז לסוויפ ל-2 ארב.
  6. כוון את טמפרטורת צינור העברת היונים ל-300 מעלות צלזיוס ואת טמפרטורת המאדה ל-320 מעלות צלזיוס.
  7. השתמש במצב רכישת נתונים תלויה (DDA).
  8. עבור MS1, הגדר את הרזולוציה ל-120,000, טווח סריקה ל-100-2000 מ'/z, יעד AGC סטנדרטי, זמן הזרקה אוטומטית, הדרה דינמית ל-6 שניות, וסף עוצמה ב-5.0e4.
  9. ב-MS2, הגדר את הרזולוציה ל-15,000, טווח סריקה אוטומטית, יעד AGC סטנדרטי, זמן הזרקה דינמית, חלון בידוד ב-1.6 מ"/z, סוג אנרגיית ההתנגשות כהפרדה התנגשויות באנרגיה גבוהה (HCD), ואנרגיית התנגשות מנורמלת (NCE) לערכים מדורגים של 15, 30 ו-40.
  10. נתחו נתונים גולמיים באמצעות תוכנת LipidSearch או פלטפורמות תואמות אחרות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות קרע מורכבות נאספו מ-16 מתנדבים בריאים בשלושה ביקורים עצמאיים במרווח של שבועיים (R1, האצווה הוותיקה ביותר; R2, R3 נאספו ברצף שבועיים אחרי כל אחד). באמצעות LipidSearch עם קריטריונים מחמירים (כלומר, יחס אות לרעש ≥100, דרגה C ומעלה, ועוצמת יונים ≥30,000), זיהינו 773, 890 ו-1,025 מיני ליפידים ייחודיים ב-R1-R3, בהתאמה (איור 5A). מצב יוני חיובי זיהה 1,302 מיני שומנים עם דרגה A של 26.0% (כלומר, גם מחלקת השומנים וגם כל שרשראות חומצות השומן השייכות לליפיד מסוים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יתרונות דגימת קרעים מבוססת PRT וחילוץ שומנים
תהליך הליפידום של דמעות מבוסס PRT המוצג כאן מספק שיטת דגימה מעשית וזעיר-פולשנית לפרופילינג מקיף של שומן דמעות. בהשוואה לרצועות שירמר, שדורשות מגע ממושך ונפחי דגימות גדולים יותר, דגימת PRT מהירה, ניתנת להשלמה תוך 2 דקות, נסבלת היטב על ידי אוכלוסיות מגוונות, כולל כאלה עם נפח דמעות מופחת או רגישות עינית מוגברת, ומניבה דגימות קרע התואמות לליפידומיקה ברזולוציה גבוהה של LC-MS14,20

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי יוזמת InnoHK וממשלת האזור המנהלי המיוחד של הונג קונג ומרכז המחקר לחזון SHARP באוניברסיטת הפוליטכניקה של הונג קונג. המחברים גם מודים בהכרת תודה על התמיכה הטכנית של מתקן המחקר האוניברסיטאי בניתוח כימי וסביבתי (UCEA) וממתקן המחקר האוניברסיטאי למדעי החיים (ULS) של אוניברסיטת הפוליטכניקה של הונג קונג.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אצטוניטריל (ACN), דרגת LC-MSRCI LabscanLM1005
עמוד ACQUITY UPLC CSH C18תאגיד ווטרס186005297130Å, 1.7 &מיקרו; מטר, 2.1 מ"מ X 100 מ"מ
פורמט אמוניום, דרגת LC-MSסיגמא-אלדריץ'55674
בקבוקון זכוכית אוטוסמפלרוול ריץ' סיינטי2ML-9-V10022 מ"ל זכוכית שקופה 12*32 מ"מ בסיס שטוח 9-425 בקבוקון ברג עם תווית (עם משטח כתיבה)
9-425 כחול עם מכסה בורג פתוח עם ריבוץ וול ריץ' סיינטי9-SP1003עם 9 מ"מ, PTFE לבן/סיליקון אדום ספטה 1 מ"מ
כלורופורם, דרגת HPLCריאגנטים דוקסן1271
צינורות נעילה בטוחים של אפנדורף, 1.5 מ"לאפנדורף30120086
חומצה פורמית (FA),  דרגת LC-MSתרמופישר סיינטיפיקA117-50
מיקרו-אינסרט מזכוכיתוול ריץ' סיינטי2ML-N2002250 ומיקרו; הכנסת L, זכוכית שקופה, בסיס חרוטי עם קפיצים פוליקפריים, גודל: 5.8*28.5 מ"מ
איזופרופנול, דרגת LC-MSRCI LabscanLM1162
תוכנת LipidSearchתרמופישר סיינטיפיקOPTON-30879גרסה 5
מתנול,  דרגת LC-MSRCI LabscanLM1115
חוט פנול אדום  (PRT)חברת פיתוח טכנולוגיה חדשה של טיאנג'ין ג'ינגמינג בע"מ20192160086
צנטריפוגה מקוררתתרמופישר סיינטיפיק75007200
מרוכז צנטריפוגלי מקורר של CentriVap ומלכודות קירור של CentriVapלאבקונקו16108335
מיקרו צינורות עם מכסה בורגתרמופישר סיינטיפיק3488
אתר טרט-בוטיל מתיל (MTBE), דרגת HPLCריאגנטים דוקסן1070
Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLCתרמופישר סיינטיפיקULTIM3000RSLCNANO
Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid MSתרמופישר סיינטיפיקFSN05-10001
תרמומיקסר Cאפנדורף5382000015
מנקה אולטרסוניקרסט אולטרסוניקP500D-45
מערבל מערבולתציון דרךBV1003

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esam, S., Singh, S., Konda, N., Gandhi, R., Vemuganti, G. K. Tear film lipid layer thickness: Measurement techniques, normative values and alteration in ocular surface diseases. Curr Eye Res. , (2025).
  2. Ambaw, Y. A., et al. Profile of tear lipid mediator as a biomarker of inflammation for meibomian gland dysfunction and ocular surface diseases: Standard operating procedures. Ocul Surf. 26, 318-327 (2022).
  3. Sheppard, J. D., Nichols, K. K. Dry eye disease associated with meibomian gland dysfunction: Focus on tear film characteristics and the therapeutic landscape. Ophthalmol Ther. 12 (3), 1397-1418 (2023).
  4. Lam, S. M., et al. Lipidomic analysis of human tear fluid reveals structure-specific lipid alterations in dry eye syndrome. J Lipid Res. 55 (2), 299-306 (2014).
  5. Borchman, D., Ramakrishnan, V., Henry, C., Ramasubramanian, A. Differences in meibum and tear lipid composition and conformation. Cornea. 39 (1), 122-128 (2020).
  6. Miyamoto, M., Sassa, T., Sawai, M., Kihara, A. Lipid polarity gradient formed by ω-hydroxy lipids in tear film prevents dry eye disease. eLife. 9, 53582(2020).
  7. Zhao, H., et al. Lipidomics profiles revealed alterations in patients with meibomian gland dysfunction after exposure to intense pulsed light. Front Neurol. 13, 827544(2022).
  8. Bland, H. C., Moilanen, J. A., Ekholm, F. S., Paananen, R. O. Investigating the role of specific tear film lipids connected to dry eye syndrome: A study on o-acyl-ω-hydroxy fatty acids and diesters. Langmuir. 35 (9), 3545-3552 (2019).
  9. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  10. Winiarczyk, M., Biela, K., Michalak, K., Winiarczyk, D., Mackiewicz, J. Changes in tear proteomic profile in ocular diseases. Int J Environ Res Public Health. 19 (20), 13341(2022).
  11. Bertram, M., et al. Influence of Schirmer strip wetness on volume absorbed, volume recovered, and total protein content in canine tears. Vet Ophthalmol. 24 (4), 425-428 (2021).
  12. Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3p medicine. EPMA J. 12 (4), 449-475 (2021).
  13. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  14. Kecskeméti, G., Tóth-Molnár, E., Janáky, T., Szabó, Z. An extensive study of phenol red thread as a novel non-invasive tear sampling technique for proteomics studies: Comparison with two commonly used methods. Int J Mol Sci. 23 (15), 8647(2022).
  15. Barmada, A., Shippy, S. A. Quantifying sample collection and processing impacts on fiber-based tear fluid chemical analysis. Transl Vis Sci Technol. 9 (10), 23(2020).
  16. Hao, Y., et al. Validation of the phenol red thread test in a Chinese population. BMC Ophthalmol. 23 (1), 498(2023).
  17. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. J Lipid Res. 49 (5), 1137-1146 (2008).
  18. Ulmer, C. Z., Jones, C. M., Yost, R. A., Garrett, T. J., Bowden, J. A. Optimization of Folch, Bligh-Dyer, and Matyash sample-to-extraction solvent ratios for human plasma-based lipidomics studies. Anal Chim Acta. 1037, 351-357 (2018).
  19. Lam, S. M., et al. Extensive characterization of human tear fluid collected using different techniques unravels the presence of novel lipid amphiphiles. J Lipid Res. 55 (2), 289-298 (2014).
  20. Quah, J. H., Tong, L., Barbier, S. Patient acceptability of tear collection in the primary healthcare setting. Optom Vis Sci. 91 (4), 452-458 (2014).
  21. Saini, R. K., Prasad, P., Shang, X., Keum, Y. S. Advances in lipid extraction methods-a review. Int J Mol Sci. 22 (24), 13643(2021).
  22. Chen, J., Nichols, K. K., Wilson, L., Barnes, S., Nichols, J. J. Untargeted lipidomic analysis of human tears: A new approach for quantification of o-acyl-omega hydroxy fatty acids. Ocul Surf. 17 (2), 347-355 (2019).
  23. Köfeler, H. C., et al. Recommendations for good practice in MS-based lipidomics. J Lipid Res. 62, 100138(2021).
  24. Ulmer, C. Z., et al. A review of efforts to improve lipid stability during sample preparation and standardization efforts to ensure accuracy in the reporting of lipid measurements. Lipids. 56 (1), 3-16 (2021).
  25. Sens, A., et al. Pre-analytical sample handling standardization for reliable measurement of metabolites and lipids in LC-MS-based clinical research. J Mass Spectrom Adv Clin Lab. 28, 35-46 (2023).
  26. Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A simple fractionated extraction method for the comprehensive analysis of metabolites, lipids, and proteins from a single sample. J Vis Exp. (124), e55802(2017).
  27. Fong, P. Y., et al. Role of tear film biomarkers in the diagnosis and management of dry eye disease. Taiwan J Ophthalmol. 9 (3), 150-159 (2019).
  28. Sanroque-Muñoz, M., et al. Tear-derived extracellular vesicles as diagnostic biomarkers for ocular and neurodegenerative diseases: Opportunities and challenges. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 6 (3), 609-625 (2025).
  29. Vera-Montecinos, A., et al. High throughput tear proteomics with data independent acquisition enables biomarker discovery in allergic conditions. Sci Rep. 15 (1), 31181(2025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tear LipidomicsPhenol Red ThreadTear Fluid SamplingLipid BiomarkersOcular Surface HealthMethanol MTBE ExtractionLC MS Lipid AnalysisTear Film StabilityMinimally Invasive SamplingLipid Species Identification

Related Articles