Method Article

הליך דגימה מבוסס חוט אדום פנול לליפידומיקה של נוזל דמעות לא ממוקד בגילוי סמנים ביולוגיים

DOI:

10.3791/69474

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול קליני ייחודי לאיסוף דגימות נוזלי דמעות אנושיות באמצעות חוטי פנולים אדומים ותהליך עבודה מבוסס כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS) לגילוי פרופיל הליפידומי של הקרע. שיטת ההפרדה הדו-פאזית של מתיל טרט-בוטיל (MTBE)/מתנול מאפשרת חילוץ מהיר מליפידים מדרע עם התאוששות גבוהה לגילוי סמן ביולוגי של דמעות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שומנים קרעים חיוניים ליציבות שכבת הדמעות ולבריאות פני העין. שינויים בהרכב הדמעות עשויים להיות קשורים למחלות עיניים ומערכתיות כגון תפקוד לקוי של בלוטות מייבומיאן ודיסליפידמיה. פרופילינג של שומנים מדמעים עשוי לסייע בגילוי סמנים ביולוגיים לאבחון וניהול מחלה. עם זאת, שיטות דגימת דמעות נפוצות מציגות מגבלות ברורות: רצועות שירמר גורמות לעיתים קרובות לגירוי ואי נוחות עיניים בשל שטח המגע הגדול שלהן עם פני העין, בעוד שאיסוף צינורות מיקרו-קפילריים עלול להניב שחזוריות נמוכה בשל שונות המפעיל, במיוחד כאשר מתבצעת על ידי צוות אחר. מגבלות אלו עלולות לפגוע בדיוק ובעקביות של נתוני הליפידום. מחקר זה מציג שיטת דגימה זעיר-פולשנית מבוססת חוט פנול אדום (PRT) המותאמת לליפידומיקה של דמעות. המבנה הדק של ה-PRT מפחית את הסיכון לגירוי עיני ומאפשר איסוף דמעות מהיר ועדין. שיטה ידידותית למשתמש וקלה זו מתאימה לנבדקים עם נפח קרע מופחת או סבילות נמוכה יותר לתחושת גופים זרים, ומאפשרת איסוף דגימות שכפול יותר על ידי הפחתת שונות תלויה במפעיל. שומנים דמעים שנאספו על ידי PRT הופקו באמצעות פרוטוקול הפרדת פאזה מיטבי של מתנול/מתיל טרט-בוטיל אתר (MTBE) ונותחו באמצעות LC-Orbitrap-IQX MS/MS ברזולוציה גבוהה עם תוכנת LipidSearch. תהליך העבודה זיהה יותר מ-700 מיני שומנים ייחודיים של דמעות, שכל אחד מהם מאופיין ביוני מוצר ספציפיים שמקורם בחומצה שומנית. תוצאות אלו מצביעות על כך שדגימה מבוססת PRT מספקת התאוששות שומנים חזקה לניתוח ליפידומי של דמעות. גישה זעיר-פולשנית זו וניתנת לשחזור מספקת פלטפורמה מעשית למחקר קליני וניסוי של שומן דמעות. בסופו של דבר, זה יכול גם לסייע בגילוי סמנים ביולוגיים ובמעקב אחר מחלות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שכבת דמעות היא המחסום החיצוני ביותר שמגן על פני השטח העין מפני פתוגנים ושומר על הומאוסטזיס עיני 1,2, בעוד שכבת השומנים בשכבת הדמעות היא המרכיב המרכזי למניעת אידוי קרע ולשמירה על יציבות שכבת הדמעות 3,4. חוסר ויסות של הרכב שומן הדמעות נקשר למחלות עיניים שונות, כולל יובש בעיניים (DED), תפקוד לקוי של בלוטות המיבומיאן (MGD) ודלקת לחמית אלרגית 5,6,7,8. כתוצאה מכך, אפיון מפורט של ליפידומיקס דמעות הפ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של אוניברסיטת הפוליטכניקה של הונג קונג. הנבדקים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לפני השתתפותם במחקר. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. איסוף נוזלי דמעות אנושי מבוסס חוט אדום פנול (PRT)

  1. לבשו כפפות וחיטו את תחנת העבודה כדי למנוע זיהום דגימה.
  2. ודא שהחבילה של ה-PRT אטומה ולא פג תוקף לפני שפותחים אותה.
  3. החזק את החוט בקצה מול הקרס המעוקל. תמיד הימנע מלגעת בחצי הקרס המעוקל של ה-PRT.
  4. בקש מהנבדק לבדוק את כיוון האף העליון.
  5. משכו בעדינות את עפעף התחתון של הנבדק והכניסו את ה-PRT עם ה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות קרע מורכבות נאספו מ-16 מתנדבים בריאים בשלושה ביקורים עצמאיים במרווח של שבועיים (R1, האצווה הוותיקה ביותר; R2, R3 נאספו ברצף שבועיים אחרי כל אחד). באמצעות LipidSearch עם קריטריונים מחמירים (כלומר, יחס אות לרעש ≥100, דרגה C ומעלה, ועוצמת יונים ≥30,000), זיהינו 773, 890 ו-1,025 מיני ליפידים ייחודיים ב-R1-R3, בהתאמה (איור 5A). מצב יוני חיובי זיהה 1,302 מיני שומנים עם דרגה A של 26.0% (כלומר, גם מחלקת השומנים וגם כל שרשראות חומצות השומן השייכות לליפיד מסוים.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יתרונות דגימת קרעים מבוססת PRT וחילוץ שומנים
תהליך הליפידום של דמעות מבוסס PRT המוצג כאן מספק שיטת דגימה מעשית וזעיר-פולשנית לפרופילינג מקיף של שומן דמעות. בהשוואה לרצועות שירמר, שדורשות מגע ממושך ונפחי דגימות גדולים יותר, דגימת PRT מהירה, ניתנת להשלמה תוך 2 דקות, נסבלת היטב על ידי אוכלוסיות מגוונות, כולל כאלה עם נפח דמעות מופחת או רגישות עינית מוגברת, ומניבה דגימות קרע התואמות לליפידומיקה ברזולוציה גבוהה של LC-MS14,20

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי יוזמת InnoHK וממשלת האזור המנהלי המיוחד של הונג קונג ומרכז המחקר לחזון SHARP באוניברסיטת הפוליטכניקה של הונג קונג. המחברים גם מודים בהכרת תודה על התמיכה הטכנית של מתקן המחקר האוניברסיטאי בניתוח כימי וסביבתי (UCEA) וממתקן המחקר האוניברסיטאי למדעי החיים (ULS) של אוניברסיטת הפוליטכניקה של הונג קונג.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אצטוניטריל (ACN), דרגת LC-MSRCI LabscanLM1005
עמוד ACQUITY UPLC CSH C18תאגיד ווטרס186005297130Å, 1.7 &מיקרו; מטר, 2.1 מ"מ X 100 מ"מ
פורמט אמוניום, דרגת LC-MSסיגמא-אלדריץ'55674
בקבוקון זכוכית אוטוסמפלרוול ריץ' סיינטי2ML-9-V10022 מ"ל זכוכית שקופה 12*32 מ"מ בסיס שטוח 9-425 בקבוקון ברג עם תווית (עם משטח כתיבה)
9-425 כחול עם מכסה בורג פתוח עם ריבוץ וול ריץ' סיינטי9-SP1003עם 9 מ"מ, PTFE לבן/סיליקון אדום ספטה 1 מ"מ
כלורופורם, דרגת HPLCריאגנטים דוקסן1271
צינורות נעילה בטוחים של אפנדורף, 1.5 מ"לאפנדורף30120086
חומצה פורמית (FA),  דרגת LC-MSתרמופישר סיינטיפיקA117-50
מיקרו-אינסרט מזכוכיתוול ריץ' סיינטי2ML-N2002250 ומיקרו; הכנסת L, זכוכית שקופה, בסיס חרוטי עם קפיצים פוליקפריים, גודל: 5.8*28.5 מ"מ
איזופרופנול, דרגת LC-MSRCI LabscanLM1162
תוכנת LipidSearchתרמופישר סיינטיפיקOPTON-30879גרסה 5
מתנול,  דרגת LC-MSRCI LabscanLM1115
חוט פנול אדום  (PRT)חברת פיתוח טכנולוגיה חדשה של טיאנג'ין ג'ינגמינג בע"מ20192160086
צנטריפוגה מקוררתתרמופישר סיינטיפיק75007200
מרוכז צנטריפוגלי מקורר של CentriVap ומלכודות קירור של CentriVapלאבקונקו16108335
מיקרו צינורות עם מכסה בורגתרמופישר סיינטיפיק3488
אתר טרט-בוטיל מתיל (MTBE), דרגת HPLCריאגנטים דוקסן1070
Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLCתרמופישר סיינטיפיקULTIM3000RSLCNANO
Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid MSתרמופישר סיינטיפיקFSN05-10001
תרמומיקסר Cאפנדורף5382000015
מנקה אולטרסוניקרסט אולטרסוניקP500D-45
מערבל מערבולתציון דרךBV1003

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esam, S., Singh, S., Konda, N., Gandhi, R., Vemuganti, G. K. Tear film lipid layer thickness: Measurement techniques, normative values and alteration in ocular surface diseases. Curr Eye Res. , (2025).
  2. Ambaw, Y. A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tear LipidomicsPhenol Red ThreadTear Fluid SamplingLipid BiomarkersOcular Surface HealthMethanol MTBE ExtractionLC MS Lipid AnalysisTear Film StabilityMinimally Invasive SamplingLipid Species Identification

Related Articles