מאמר שיטה

הדמיית תאים חיים של חדירת הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס

DOI:

10.3791/69495

⸱

14 בנובמבר 2025

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Heart Institute, Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה של תאים חיים לניטור חדירות הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס, תוך שימוש בבדיקות פלואורסצנטיות המזהות שינויים בשלמות הממברנה הליזוזומלית והחמצתה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נקרופטוזיס, סוג של נמק מוסדר, מגיע לשיאו בקרע בקרום התא. המעבדה שלנו ואחרים גילו כי חדירת הממברנה הליזוזומלית (LMP) היא אירוע מוקדם ומכריע בתהליך זה, לפני קרע בממברנה. LMP מהיר משחרר אנזימים ליזוזומליים חזקים, במיוחד פרוטאזות, לתוך הציטוזול, ומקדם באופן פעיל את מוות התאים. הדמיית תאים חיים מספקת כלי רב ערך לזיהוי LMP במהלך נקרופטוזיס בזמן אמת. מספר צבעים פלואורסצנטיים יעילים ביותר: (1) צבעי LysoTracker רגישים ל-pH עוקבים אחר שינויים ב-pH הליזוזומלי. ירידה באות הקרינה מצביעה על אובדן שיפוע ה-pH הליזוזומלי, סימן ראשוני לתפקוד לקוי של הליזוזומלי, שעשוי להיות מבשר או תוצאה ישירה של LMP. (2) חרוזי דקסטרן המסומנים בפלואורסצאין מופנמים ומצטברים בליזוזומים. שחרורם לציטוזול מאותת על LMP מלא ודליפת מטען. כאן, ראינו אובדן מתקדם של פלואורסצנטיות Lysotracker, עם פלואורסצנציה מפוזרת של דקסטרן לתוך הציטוזול לאחר אינדוקציה של נקרופטוזיס. לפיכך, מתודולוגיית הדמיית תאים חיים מאפשרת לחוקרים לעקוב במדויק אחר התזמון וההיקף של תפקוד לקוי של ליזוזומלי, ותורמת להבנה מקיפה יותר של מנגנוני הנקרופטוזיס ומאירה התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נקרופטוזיס היא צורה בלתי תלויה בקספאז של מוות תאי מווסת המעורב במחלות דלקתיות רבות, הפרעות ניווניות, מחלות ריאה, כבד ולב 1,2,3. מסלול זה מתווך על ידי מפל מורכב של תגובות ששיאן בהפעלת חלבון קינאז 1 (RIPK1), המקיים אינטראקציה עם חלבון קינאז 3 (RIPK3) באמצעות תחומי מוטיב האינטראקציה ההומוטיפיים של RIP (RHIM) 4,5,6. RIPK3, בתורו, מגייס חלבון דמוי קינאז מעורב (MLKL) ליצירת הנקרוזום 7,8. זרחון של MLKL על ידי RIPK3 מוביל לאוליגומריזציה שלו ולפילמור שלאחר מכן. פולימרי MLKL עוברים לאחר מכן לממברנות התא, מה שמוביל בסופו של דבר לקרע בקרום התא ולמוות תאים 9,10,11. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם פולימרי MLKL עוברים לתאי הממברנה וגורמים לשיבוש הממברנה אינם מובנים במלואם.

ליזוזומים הם אברונים האחראים לפירוק ומיחזור של חומרים תאיים. בלומן שלו ישנם פרוטאזות, ליפאזות, נוקלאזות והידרולזים האחראים על עיכול מקרומולקולות, ובכך שומרים על הומאוסטזיס תאי12,13. לכן, שמירה על שלמות הליזוזומלית ותפקוד תקין חיונית להבטחת פינוי תאים יעיל, הסתגלות ללחץ והישרדות תאים כללית 14,15,16. מחקרים אחרונים מצביעים על קשר בין נקרופטוזיס לחדירת ממברנה ליזוזומלית (LMP)17,18,19.

התצפיות האחרונות שלנו הראו כי LMP הוא אירוע מוקדם ומשמעותי בתהליך הנקרופטוזיס, שקדם לקרע הסופי של קרום התא19. באופן ספציפי, פילמור MLKL על הממברנה הליזוזומלית גורם ל-LMP מהיר לשחרר אנזימים ליזוזומליים חזקים, במיוחד פרוטאזות, כולל קטפסין B, לתוך הציטוזול. לאחר מכן, פרוטאזות אלה מבקעות חלבונים חיוניים כדי לקדם מוות תאי. חשוב לציין, עיכוב פעילות CTSB מגן חזק מפני מוות תאים19,20. נתונים אלה מצביעים על כך ש-LMP הוא מודולטור מכריע של מסלול הנקרופטוזיס. לכן, ניטור התזמון של LMP במהלך נקרופטוזיס חיוני להבנת המנגנונים המולקולריים וזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות.

שיטות זיהוי LMP קונבנציונליות רבות, כגון צביעה חיסונית, מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) או ציטומטריית זרימה, דורשות דגימות קבועות או מספקות רק מידע על נקודות קצה 21,22,23, ואינן מצליחות ללכוד את התהליך הדינמי של הפרעה ליזוזומלית, במיוחד בהקשר של התקדמות מהירה של נקרופטוזיס. לעומת זאת, שיטת הדמיית התאים החיים מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה בזמן אמת של LMP במהלך נקרופטוזיס. בפרוטוקול זה, שילבנו שני סמנים ליזוזומליים משלימים וגרמנו נקרופטוזיס בתאי HT-29 כדי לנתח את שלמות הממברנה הליזוזומלית בזמן אמת19. טכניקה זו מספקת פלטפורמה חזקה וניתנת להתאמה לחקר LMP לא רק בנקרופטוזיס אלא גם בצורות אחרות של עקה תאית בהן השלמות הליזוזומלית נפגעת, במיוחד בהקשר של מחלות או שימוש בטיפולים מכווני ליזוזום 24,25,26.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים - יום 0

  1. צלחת 5,000 תאים ב-2 מ"ל של DMEM (מדיום הנשר המותאם של Dulbecco) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין וסטרפטומיצין (P/S) בצלחת סטרילית עם תחתית זכוכית.
  2. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך הלילה.

2. טעינת חרוזי דקסטרן - יום 1

  1. יש לדלל חרוזים ירוקים דקסטרן ל-25 מיקרוגרם/מ"ל ב-DMEM טרי בתוספת 10% FBS ו-1% P/S על ידי הוספת 20 מיקרוליטר מתמיסת המלאי של 2.5 מ"ג/מ"ל.
  2. הסר את המדיום הישן והחלף אותו ב-2 מ"ל של DMEM המכיל חרוזים בתוספת 10% FBS ו-1% P/S.
  3. דגרו את התא למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 כדי לאפשר הפנמה של חרוזים לליזוזומים.

3. צביעת Lysotracker - יום 2 (יום הניסוי)

  1. הכן את מדיום הצביעה על ידי הוספת 2 מיקרוליטר של תמיסת מלאי Lysotracker של 1 מ"מ ל-2 מ"ל של DMEM טרי בתוספת 10% FBS ו-1% P/S כדי לקבל ריכוז סופי של 1 מיקרומטר.
  2. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך שעתיים, בהתאם לזמן הדגירה המומלץ (30 דקות עד שעתיים) המפורט בהנחיות לשימוש מבדיקות מולקולריות על ידי Life Technologies27. בניסויים שלנו, שעתיים של דגירה בתאי HT-29 הביאו לצביעה חזקה של פונקטה עם קולוקליזציה חזקה עם חרוזי דקסטרן, מה שמעיד על פלואורסצנטיות צבע יציבה.
    הערה: הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי 30 דקות לפני הדמיית תאים חיים.

4. הגדרת מיקרוסקופ קונפוקלי

  1. הפעל את רכיבי המערכת הקונפוקלית בסדר הבא: מיקרוסקופ מחשב; כוח סורק; כוח לייזר; פליטת לייזר; כוח לייקה.
  2. הפעל את הבקרות הסביבתיות: הקובייה - בקר טמפרטורה; בקר מערבל הגז Brick - CO2 . פתח את אספקת CO2 ו-O2 .
  3. הגדר פרמטרי גז:
    1. הגדר את בקר הטמפרטורה (הקובייה) ל-37 מעלות צלזיוס.
    2. הגדר את בקר הגז והלחות (הלבנה) ל-5% CO2 ו-95% לחות.
  4. הרכיבו את תא ההדמיה כפי שמוצג באיור 1.
  5. הגדר את המטרה הקונפוקלית:
    1. השתמש ביעד טבילת שמן 63x/1.40 NA.
    2. הגדר את לייזרי העירור ל-488 ננומטר (פלואורופור ירוק) ו-555 ננומטר (פלואורופור אדום).
    3. עבור לייזר 488 ננומטר, בחר גלאי היברידי (HyD), ועבור לייזר 555 ננומטר, בחר גלאי PMT.
      הערה: הצלבה פלואורסצנטית צומצמה על ידי שימוש בשערים מוגדרים מראש בתוכנה הקונפוקלית, שאישרה שאין דיבור צולב בין הערוצים.

5. הכנה לאחר צביעה (לאחר דגירה של LysoTracker)

  1. שוטפים את התאים בזהירות שלוש פעמים עם 2 מ"ל PBS.
  2. הוסף 2 מ"ל של DMEM טרי בתוספת 10% FBS ו-1% P/S.
  3. מרחו טיפה אחת של שמן טבילה על עדשת המטרה לפני ההדמיה.
  4. הרכיב את המנה על במת המיקרוסקופ.
  5. התאם את עוצמת הלייזר והרקע.
    1. כוונן את עוצמת הלייזר עד 3%, אך לא יותר מ-5%.
    2. התאם את רווח הגלאי בתוכנת המיקרוסקופ כדי לייעל את האות.
    3. כדי למזער את הרקע, התאם את סרגל הניגודיות.
  6. רכוש תמונות בסיס של תאים לא מטופלים (לפני הוספת T/S/Z), המשמשות כתנאי הבקרה.
  7. החזר את הצלחת למכסה הזרימה הלמינרי והוסף 1 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% P/S, המכיל 100 ננוגרם/מ"ל של TNF-α (T), 500 ננומטר של חיקוי SMAC (S) ו-100 מיקרומטר של Z-VAD-FMK (Z).
  8. המשך הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי.
    הערה: T/S/Z נוספו בכוונה בריכוזים גבוהים יותר מהפרוטוקולים הסטנדרטיים. בחירה זו נעשתה כדי להאיץ LMP ומוות תאי, מה שמאפשר ללכוד אירועים מוקדמים בצורה אמינה יותר בהדמיה בזמן אמת.

6. הגדרות רכישת תמונות

  1. בתוכנת הרכישה, הגדר פרמטרים כדלקמן: מצב: xyt; פורמט: 512 x 512; מהירות: 400; זום: 3; ממוצע קו: 1; הצטברות שורה: 3; הצטברות מסגרת: 1; מרווח זמן: 3 דקות; משך: 8 שעות; הפעל מיקוד אוטומטי.
  2. לחץ על התחל כדי להתחיל ברכישת קיטועי זמן.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה מאפשרים רכישת תמונות תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לניטור LMP בזמן אמת. איור 1 ממחיש ייצוג סכמטי של פרוטוקול הניסוי, מציפוי תאים ועד רכישת תמונה. ביום 0, 5,000 תאי HT-29 צופו והודגרו במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. לאחר 24 שעות (יום 1), התאים הודגרו עם חרוזי דקסטרן עם תווית פלואורסצאין (25 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 24 שעות נוספות באותם תנאים. חרוזים אלה מופנמים על ידי אנדוציטוזיס ותנועה לליזוזומים, שם הם מצטברים ומופיעים כפונקטה בהירה. ביום השני (יום הניסוי), התאים טופלו בצבע LysoTracker רגיש ל-pH (1 מיקרומטר) למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. LysoTracker מתרכז ומציג פלואורסצנטיות חזקה בתוך תאים חומציים, כגון אנדוזומים מאוחרים וליזוזומים. שלושים דקות לפני ההדמיה, מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלי הופעלה ויוצבה, כולל בקרי טמפרטורה, גז ולחות, כמתואר בשלב 4 של הפרוטוקול. תא ההדמיה הורכב, כפי שמודגם באיור 2. נעשה שימוש בלייזרים של 488 ננומטר (ירוק) ו-555 ננומטר (אדום).

לאחר הדגירה עם LysoTracker, התאים נשטפו בזהירות שלוש פעמים עם PBS, ונוספו 2 מ"ל של DMEM טרי בתוספת 10% FBS ו-1% P/S. הצלחת הועברה למיקרוסקופ, וטיפה אחת של שמן טבילה נמרחה על מטרת טבילת השמן 63x/1.40 NA. לאחר מכן הותאמו עוצמת הלייזר ורמות הרקע כדי לייעל את תנאי ההדמיה, כמתואר בשלב 5.5. של הפרוטוקול. התמונות הראשוניות שלנו אישרו את נוכחותם של פונקטה יציבה של Lysotracker ושל דקסטרן המסומן על ידי פלואורסצאין, מה שמעיד על ליזוזומים שלמים (איור 3). התמונות הבסיסיות נרכשו לפני T/S/Z ושימשו כבקרה. לא הופעל רכב.

לאחר קביעת הגדרות ההדמיה והמיקרוסקופיה הראשוניות, הצלחת הוחזרה למכסה הזרימה הלמינרית, ונוספה 1 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% P/S, המכילים 100 ננוגרם/מ"ל TNF-α (T), 500 ננומטר SMAC חיקוי (S) ו-100 מיקרומטר Z-VAD-FMK (Z). ההדמיה המשיכה במיקרוסקופ הקונפוקלי באמצעות פרמטר רכישת ההדמיה המתואר בשלב 6 של הפרוטוקול. כפי שמוצג באיור 3, בסרט המשלים S1 ובסרט המשלים S2, הירידה המתקדמת בפלואורסצנטיות LysoTracker בתאים שטופלו ב-T/S/Z שימשה כאינדיקטור מוקדם לשינוי ליזוזומלי. אובדן זה לווה ולעיתים התרחש במקביל לשטף של דקסטרן המסומן בפלואורסצאין מהליזוזומים לתוך הציטוזול (הסטה מנוקבת למפוזרת), המצביעה על LMP. לאחר 8 שעות, כמעט כל אות Lysotracker נעלם, עם זאת, תאים רבים עדיין שמרו על פונקטה ירוקה עם אות ירוק ציטוזולי, מה שמרמז על אובדן שיפוע pH ליזוזומלי לפני LMP מלא ושחרור מטען.

איור 1
איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול הניסוי. (נוצר ב-BioRender.com) בתחילה, 5,000 תאים צופו (0 שעות) והודגרו במשך 24 שעות; לאחר מכן, נוספו חרוזי דקסטרן (25 מיקרוגרם/מ"ל) והודגרו למשך 24 שעות נוספות. לאחר 48 שעות, LysoTracker (1 מיקרומטר) נוסף והודגר למשך שעתיים. התאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS (שלב 1), ולאחר מכן נוספו 2 מ"ל של DMEM טרי בתוספת 10% FBS ו-1% P/S (שלב 2). הגדרות המיקרוסקופיה הותאמו (שלב 3), והתאים טופלו ב-TNF-α (T), חיקוי SMAC (S) ומעכב פאן-קספאז Z-VAD-FMZ (Z) (שלב 4), לפני רכישת תמונה של תאים חיים (שלב 5). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2
איור 2: דיאגרמה של מערך תא ההדמיה. (A) מחזיק הדגימה, (B) תא הדגירה של הגז, ו-(C) המכסה העליון. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3
איור 3: תמונות מייצגות של תאי HT29 לפני ואחרי טיפול ב-T/S/Z. התאים נצבעו בחרוזים אדומים של Lysotracker וירוק דקסטרן וטופלו ב-TNF-α (T), חיקוי SMAC (S) ומעכב פאן-קספאז Z-VAD-FMZ (Z). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

סרטון משלים S1: קיטועי זמן של תאי HT29 שהודגרו עם חרוזים ירוקים של דקסטרן וטופלו ב-T/S/Z. התאים נוטרו במשך יותר מ-6 שעות כדי להעריך את התגובה התאית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרטון משלים S2: קיטועי זמן של תאי HT29 שהודגרו באדום LysoTracker וטופלו ב-T/S/Z. התאים נוטרו במשך יותר מ-6 שעות כדי להעריך את התגובה התאית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה הראה כי השילוב של LysoTracker וחרוזי דקסטרן עם תווית פלואורסצאין מאפשר ניטור סימולטני של ה-pH הליזוזומלי ושחרור המטען בזמן אמת. התוצאות המייצגות (איור 3, סרט משלים S1 וסרט משלים S2) מאשרות שתאים לא מטופלים שומרים על אות פונקטה יציב עבור שני הסמנים. לעומת זאת, טיפול T/S/Z מצביע על אובדן מתקדם של עוצמת Lysotracker ומעבר של דקסטרן מפונקטה להתפלגות ציטוזולית מפוזרת, בהתאם ל-LMP.

צעד ראשון קריטי בפרוטוקול זה הוא בחירת התאים לרכישת תמונה. הנתונים הקודמים שלנו מראים שטיפול ב-T/S/Z גורם למוות של כ-80% מתאי HT-29 תוך 24 שעות, כאשר 20% הנותרים שורדים19. מכיוון ש-LMP אינו קיים בתחילת הניסוי, התאים נבחרים בתחילה על סמך מורפולוגיה והאות החיובי הכפול שלהם הן עבור חרוזי LysoTracker והן עבור חרוזי Dextran. למרות ששיטה זו אינה יכולה לחזות אילו תאים ספציפיים יעברו LMP, ראינו בעקביות שכ-60% מהאוכלוסייה המנוטרת מציגה בסופו של דבר LMP במהלך תקופת ההדמיה של 8 שעות. אתגר נוסף נובע מהאופי המובנה של הדמיה רציפה. סחיפה קלה במיקום ה-Z של התא, המתרחשת במהלך קליטת תמונה כל 3 דקות, מונעת מעקב רציף אחר אותו אות פונקטה לאורך כל הניסוי. בנוסף, התאים נודדים ועוברים שינויים מורפולוגיים בתגובה לטיפול T/S/Z28. כתוצאה מכך, אי אפשר לעקוב אחר הדינמיקה של ליזוזומים בודדים לאורך כל תקופת ההדמיה. בהדמיה ארוכת טווח של תאים חיים, התרומה הפוטנציאלית של פוטוטוקסיות כמתווך למוות תאי היא שיקול חשוב. עירור מתמשך במהלך מפגשים ממושכים יכול ליצור מיני חמצן תגובתיים ולפגוע בכדאיות התא29, מה שעלול להפריע לתגובה הנקרופטוטית האמיתית. כדי למזער את האפקט הזה, השתמשנו בעוצמת לייזר נמוכה וזמני חשיפה קצרים. בנוסף, ניתן ריכוז של T/S/Z פי חמש כדי להאיץ את תהליך המוות התאי. עם זאת, איננו יכולים לשלול לחלוטין את התרומה של לחץ המושרה על ידי אור לשינויים הליזוזומליים שנצפו.

יתרון חשוב של פרוטוקול הדמיה של תאים חיים זה הוא יכולתו לנטר את שינוי ה-pH הליזוזומלי ואת ה-LMP בזמן אמת, וללכוד אירועים דינמיים שהוחמצו על ידי ניתוחי נקודות קצה, כגון TEM, ציטומטריית זרימה וצביעה חיסונית. בעוד ש-TEM מציע תובנה מבנית ברזולוציה גבוהה, הוא אינו יכול ללכוד את ההתקדמות הזמנית של LMP. שיטות חלופיות של תאים חיים, כגון מבחני העתקת תפוז אקרידין30 או היווצרות גלקטין-פונקטה31, הן גם כלים חשובים לניטור שלמות הליזוזומלית, אך לכל אחת מהן יש מגבלות כאשר משתמשים בהן בבידוד. בדיקת כתום האקרידין מדווחת על חלוקה מחדש של צבע מאברונים חומציים לציטוזול, המושפע הן משינויי pH ליזוזומליים והן מחדירת הממברנה, ולכן אינו מתאם ישירות עם שחרור מטען. באופן דומה, היווצרות גלקטין-פונקטה משקפת את החשיפה של גליקנים לומינליים לציטוזול ובכך מסמנת נזק לממברנה הליזוזומלית31,32, אך היא אינה מבחינה בין חדירות חלקית לקרע ליזוזומלי מלא.

חוזק הליבה של פרוטוקול זה טמון בשילוב LysoTracker וחרוזי דקסטרן, המאפשר חקירה בו זמנית של החמצה ליזוזומלית ודליפת מטען. זה מספק קריאה ייחודית וכפולה הן על הפונקציונליות הליזוזומלית והן על השלמות המבנית. דהיית LysoTracker פועלת כאינדיקטור לשינוי ב-pH הליזוזומלי, בעוד ששחרור דקסטרן מדווח ישירות על דליפה פיזית של תוכן ליזוזומלי. על ידי שימוש בשני הסמנים הללו יחד, אנו משפרים משמעותית את הזיהוי של LMP חלקי ומלא. לכן, אסטרטגיית הדמיה זו של תאים חיים ישימה באופן נרחב. חוקרים יכולים להתאים אותו לשימוש עם סוגי תאים אחרים ובדיקות פלואורסצנטיות שונות כדי לחקור את השלמות הליזוזומלית בתנאי ניסוי שונים, כולל הפרעות פרמקולוגיות או גנטיות. יכולת זו היא המפתח לקידום ההבנה שלנו לגבי מנגנוני נקרופטוזיס וזיהוי התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר במעבדתו של ד"ר ז'יגאו וואנג נתמך על ידי מענקי NIH R35GM158455 ו-R01GM147474.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי HT-29ATCCHTB-38תאי סרטן המעי הגס
צלחת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מחברת MatTekP35G-1.5-14-C-GRD
חממת CO2PHCBIMCO-170AICUVL
מיקרוסקופ קונפוקלילייקהSP8WLL
חרוזים ירוקים דקסטרןתרמופישרD1820דקסטרן, פלואורסציין, 10,000 מגה-וואט, אניוני, ליזין ניתן לתיקון
ה-Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbeccoקורנינג 10-013-CV
סרום בקר עוברי (FBS)Cytiva SH30910.03
LysoTracker אדום DND-99InvitrogenL7528
סוג טבילה בשמן HFמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים16915-01
פניצילין וסטרפטומיצין (P/S) סיגמא-אלדריץ'P4333
מלח זרחן (PBS)קורנינג21-040-CV
סמאק מימטי (S)BV6, ApexBio, קטלוגB4653ריכוז סופי, 1 מ"מ
The Brick שירותי הדמיית חיים13685בקר CO2 למיקסר גז
הקובייהשירותי הדמיית חייםCBO2Aמיקרוסקופים של תא בקרת טמפרטורה
פקטור נמק הגידול אלפא (TNF-α - T)פפרוטק30001A100UGריכוז סופי, 20 ng/ml
z-VAD-FMK (Z)ApexBioA1902ריכוז סופי, 20 מ"מ

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. Necroptosis in development and diseases. Genes Dev. 32, 327-340 (2018).
  2. Kang, K., Park, C., Chan, F. K. Necroptosis at a glance. J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).
  3. Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death. Mol Cell. 84, 170-179 (2024).
  4. Zhang, D. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325, 332-336 (2009).
  5. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  6. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  7. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  8. Zhao, J., et al. Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).
  9. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).
  10. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).
  11. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).
  12. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).
  13. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).
  14. Aits, S., Jaattela, M. Lysosomal cell death at a glance. J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).
  15. Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges. Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).
  16. Alu, A., et al. The role of lysosome in regulated necrosis. Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).
  17. Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).
  18. Vanden Berghe, T., et al. Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features. Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).
  19. Liu, S., et al. MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis. Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).
  20. Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications. Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).
  21. Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death. Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).
  22. Barral, D. C., et al. Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function. Traffic. 23, 238-269 (2022).
  23. Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines. STAR Protoc. 5, 103309(2024).
  24. Ferrari, V., et al. Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases. Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).
  25. Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions. Biomedicines. 13, (2025).
  26. Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications. Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).
  27. Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).
  28. Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways. Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).
  29. Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity. J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).
  30. Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange. Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).
  31. Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).
  32. Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes. Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Necroptosis MechanismsLysosomal DysfunctionFluorescent ProbesLysoTracker DyesDextran BeadsConfocal MicroscopyTime Lapse ImagingCell Death Induction

מאמרים קשורים