הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

גרנול גאנז'ירונג מעכב גלוקונאוגנזה כבדית דרך ציר SIRT3-MPC1-PC/PDH בסוכרת סוג 2

419 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69500

⸱

12 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Research Center of Chinese Traditional Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 4Preventive Treatment Center, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

מחקר זה בדק האם גרנול גנז'ירונג משפר את ההיפרגליקמיה בסוכרת סוג 2 על ידי עיכוב גלוקונאוגנזה כבדית דרך ציר SIRT3-MPC1-PC/PDH.

תקציר

סוכרת סוג 2 (T2DM) היא הפרעה מטבולית עולמית המתאפיינת בעמידות לאינסולין כבדי ובגלוקונאוגנזה מופרזת. גרנול גנז'ירונג (GZRG), נוסחה לרפואה סינית מסורתית, הראתה פוטנציאל בניהול סוכרת סוג 2, אך המנגנונים הבסיסיים שלה, במיוחד בנוגע לגלוקונאוגנזה בכבד, נותרו לא ברורים. מחקר זה בדק האם GZRG משפר את ההיפרגליקמיה על ידי ויסות מסלול האיתות המתווך על ידי SIRT3. ההשפעות האנטי-סוכרתיות של GZRG הוערכו בעכברים עם T2DM המושרה על ידי תזונה עתירת שומן (HFD) ובתאי HepG2 עמידים לאינסולין על ידי חומצות שומן חופשיות (FFA). הוערכו פרמטרים מטבוליים, סבילות לגלוקוז ולפירובטים, רגישות לאינסולין ופרופילי שומן. מנגנונים מולקולריים נחקרו באמצעות ביטוי יתר והפחתת SIRT3, תוך בחינת הביטוי של חלבונים מרכזיים (SIRT3, MPC1, PC, PDH-E2, PCK1 ו-G6Pase) במסלול הגלוקונוגני. טיפול ב-GZRG שיפר משמעותית את ההיפרגליקמיה, שיפר את רגישות האינסולין ושיפר את חילוף החומרים של השומנים בעכברים עם T2DM והן בתאי HepG2 עמידים לאינסולין (IR). הוא הפחית את הרעב הכבדי ודיכא את הגלוקונאוגנזה. מבחינה מכנית, GZRG הוריד את ביטוי SIRT3, מה שהוביל לירידות נלוות ברמות MPC1 ו-PC ולעלייה ב-PDH-E2. שינוי זה בביטוי החלבונים הסיט את חילוף החומרים של הפירובטים הרחק מגלוקונאוגנזה. ביטוי יתר של SIRT3 הפך את ההשפעות המדכאות של GZRG על גלוקונאוגנזה, בעוד ש-SIRT3 נוקדאון סינרגנה עם GZRG. GZRG מקל על T2DM על ידי עיכוב גלוקונאוגנזה כבדית דרך ציר SIRT3-MPC1-PC/PDH. ממצאים אלו מבהירים מנגנון מולקולרי חדש של GZRG ומדגישים את SIRT3 כמטרה טיפולית פוטנציאלית לניהול סוכרת סוג 2.

מבוא

סוכרת סוג 2 (T2DM) הפכה לאחת ההפרעות המטבוליות הכרוניות הנפוצות והמחלישות ביותר בעולם, ומציבה נטל משמעותי על בריאות הציבור והכלכלה 1,2. מאופיין בהתנגדות לאינסולין (IR) ותפקוד לקוי מתקדם של תאי β בלבלב, T2DM מונע בעיקר על ידי פגיעה בהומאוסטזיס של גלוקוז ושומן 3,4. מבין האיברים הרבים המעורבים בוויסות הגלוקוז, הכבד ממלא תפקיד מרכזי בשליטה על ייצור הגלוקוז האנדוגני באמצעות גליקוגנוליזה וגלוקונאוגנזה. גלוקונאוגנזה כבדית מופרזת היא גורם מרכזי להיפרגליקמיה בצום, סימן היכר של הפתופיזיולוגיה של סוכרת סוג 2 (T2DM), ומהווה מטרה טיפולית קריטית לשיקום איזון הגלוקוז6.

סוכנים היפוגליקמיים קיימים – כולל מטפורמין7, תיאזולידינדיונים8, אגוניסטים לקולטני GLP-19, ומעכבי SGLT210 – משיגים שליטה גליקמית באמצעות מנגנונים שונים, אך השימוש ארוך הטווח בהם מוגבל לעיתים קרובות על ידי תופעות לוואי, ירידה ביעילות או אי סבילות לטיפול. כתוצאה מכך, יש עניין גובר בגישות טיפוליות משלימות או אלטרנטיביות שיכולות למקד בבטחה וביעילות מסלולי מטבוליזם מרובים. הרפואה הסינית המסורתית (TCM), המתאפיינת בתכונותיה הפרמקולוגיות הרב-רכיביות והרב-מטריות, מציעה הזדמנויות מבטיחות לניהול מחלות מטבוליות מורכבות כגון T2DM 11,12,13,14,15. מספר נוסחאות קלאסיות ל-TCM דווחו כמפחיתות עמידות לאינסולין, משפרות את מטבוליזם השומנים ומדכאות גלוקונאוגנזה כבדית באמצעות מנגנוני ויסות משולבים16,17.

גרנולה גנז'ירונג (GZRG) היא נוסחה סטנדרטית ל-TCM עם היסטוריה של שימוש קליני בניהול הפרעות מטבוליות. GZRG הוא פורמולה צמחית המורכבת משמונה עשבי מרפא. בהתבסס על מחקרים פיטוכימיים ופרמקולוגיים קודמים שלנו, זוהו מגוון תרכובות ביואקטיביות ב-GZRG, כולל אך לא מוגבל לחומצה סלביאנואלית B, D-סטאקיוז, פרואנתוציאנידינים, חומצה אוקסלית סגולה, חומצה סלביאנולית A, חומצה סלביאנואלית C, קליקוזין 7 גלוקוזיד, 3′-מתוקסיפואררין, 3′-הידרוקסי פואררין, אפיגנין-7-או-בטא-ד-פירנו, אמודין-8-O-β-D-גלוקוז, כריזופנול-1-O-גלוקוזיד, כריזופנול-8-O-גלוקוזיד, פוארין, חומצה רוזמרינית, קריפטו-טנשינון, קטצ'ין, פורט-ניפלבין, קליקוזין, ריין, גואנוזין, חומצה אולאית, אמודין אלוורה, פורמונטין, חומצה פלמיטית, כריזופנול, D-טריפטופן, דנשנסו, חומצה פרולית, מניטול, חומצה גאלית ו-L-פנילאלנין. יתרון יסודי של הרפואה הסינית המסורתית (TCM) בניהול סוכרת סוג 2 טמון בפעולות הסינרגטיות הרב-מרכיביות ורב-המטריות שלה. עשרות המרכיבים הפעילים הכלולים ב-GZRG צפויים לקיים אינטראקציה עם תהליכים ביולוגיים רבים – כגון מסלולי איתות אינסולין, מטבוליזם של גליקוגן ותגובות דלקתיות – ובכך יוצרים אפקט רשת משולב שלא ניתן לשחזר כראוי על ידי תרכובת מטוהרת בודדת18. מחקרים קודמים הראו ש-GZRG מפעיל השפעות חיוביות על הגלוקוז והמטבוליזם של שומנים במודלים סוכרתיים19; עם זאת, המנגנונים המולקולריים המדויקים שעומדים מאחורי השפעות אלו אינם ברורים. בפרט, עדיין לא הובהר האם GZRG מפעיל את פעולותיו האנטי-סוכרתיות על ידי ויסות איתות גלוקונוגני כבדי.

סירטואין 3 (SIRT3), דאצטילאז התלוי ב-NAD⁺ המיטוכונדריאלי, הוא רגולטור מרכזי של הומאוסטזיס אנרגיה תאית20. על ידי דה-אצטילציה והפעלה של אנזימים מטבוליים מרכזיים, SIRT3 משפיע על פוספורילציה חמצונית מיטוכונדריאלית, חמצון חומצות שומן וגלוקונאוגנזה21. ביטוי חריג של SIRT3 נקשר לפתוגנזה של עמידות לאינסולין, כבד שומני ו-T2DM 22,23. הראיות מצביעות על כך שביטוי יתר של SIRT3 בכבד מגביר את שטף הגלוקונוגני על ידי ויסות אנזימים כגון נושא פירובט מיטוכונדריאלי 1 (MPC1)24, פירובט קרבוקסילאז (PC)25, פירובט דה-הידרוגנאז (PDH)26, פוספונולפירובט קרבוקסיקינאז (PCK1)27, וגלוקוז-6-פוספטאז (G6Pase)28. לכן, שליטה מתווכת SIRT3 במטבוליזם פירובטים מייצגת צומת קריטית המקשר בין תפקוד המיטוכונדריה לתפוקת הגלוקוז בכבד, מה שהופך את SIRT3 למטרה אטרקטיבית להתערבות טיפולית בסוכרת סוג 2.

בהינתן ההשפעות המטבוליות המוכחות של רכיבים ביואקטיביים ב-GZRG, יחד עם התפקיד המרכזי של SIRT3 בהומאוסטזיס הגלוקוז בכבד, הועלה השערה כי GZRG משפר היפרגליקמיה ב-T2DM באמצעות מודולציה של מסלול הגלוקונאזני המתווך על ידי SIRT3. כדי להעריך השערה זו, הוערכו השפעות GZRG על מטבוליזם של גלוקוז וליפידים בעכברים עם T2DM המושרה על ידי תזונה עתירת שומן (HFD) ותאי HepG2 עמידים לאינסולין על ידי חומצות שומן חופשיות (FFA). חקירה נוספת בחנה את מעורבות ציר האיתות SIRT3-MPC1-PC/PDH בתיווך ההשפעה המדכאת של GZRG על גלוקונאוגנזה כבדית. מחקר זה שואף להבהיר את המנגנונים המולקולריים התומכים ביתרונות המטבוליים של GZRG ולספק ראיות ניסיוניות התומכות בפוטנציאל הטיפולי שלו כמודולטור רב-מטרתי לניהול סוכרת סוג 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול מחקר בעלי החיים אושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית של אוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית (אישור מס' 2024396). כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הלאומיות ולחוקים הלאומיים הרלוונטיים להגנת בעלי חיים.

תרופות ניסיוניות
GZRG (מספר אצווה 26210483) סופק על ידי בית החולים המסונף של אוניברסיטת הרפואה הסינית בצ'אנגצ'ון (ג'ילין, סין). הרכיבים הביואקטיביים העיקריים ופרמטרי בקרת האיכות של GZRG אופינו במחקר קודם18.

ריאגנטים ונוגדנים
ערכות בדיקה מסחריות שימשו לכימות גלוקוז, גליקוגן, חומצות שומן לא אסטריות (NEFAs), טריגליצרידים (TG), כולסטרול כולל (TC), כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) וכולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL). ערכות ELISA (ELISA) לבדיקות המוגלובין ואינסולין הגליקוזיליטיים נרכשו גם הן באופן מסחרי. ערכות ELISA לפירובט דה-הידרוגנאז (PDH) ופירובט קרבוקסילאז (PC) נרכשו גם הן באופן מסחרי. לצורך עבודת RNA ו-cDNA, נרכשו באופן מסחרי ערכת רקמות/תאים RNA, qPCR PreMix ו-gDNA RT SuperMix. הטרנספקציה בוצעה באמצעות תגובת טרנספקציה. נוגדנים ראשיים נגד SIRT3 (RRID: AB_2837621), פוספונולפירובט קרבוקסיקינאז 1 (PCK1; RRID: AB_2838732), PDH-E2, גלוקוז-6-פוספטאז (G6Pase; RRID: AB_2845572), נשא פירובט מיטוכונדריאלי 1 (MPC1; RRID: AB_2836209), PC (RRID: AB_2836732), וגליצראלדהיד-3-פוספט דה-הידרוגנאז (GAPDH; RRID: AB_2833041) נרכשו מספק מסחרי.

עכברים וטיפולים
עכברים זכרים מסוג C57BL/6J (בגיל 5-6 שבועות) הושגו מחברת Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. ונשמרו בתנאים סטנדרטיים (22 ± 2 מעלות צלזיוס, 50%-60% לחות, מחזור אור/חושך של 12 שעות) עם גישה חופשית למזון ומים. לאחר תקופת הסתגלות של שבוע, שישה עכברים הוגדרו באקראי כקבוצת הביקורת (Con) והוזנו בדיאטת אוכל סטנדרטית. העכברים הנותרים קיבלו תזונה עתירת שומן (HFD) למשך 12 שבועות כדי לעודד השמנת יתר ועמידות לאינסולין.

בשבוע ה-13, עכברים שהראו רמת סוכר בצום (FBG) ≥ 11.1 mmol/L סווגו כמודלים מוצלחים לסוכרת סוג 2 (T2DM). עכברים סוכרתיים אלו חולקו באקראי לחמש קבוצות ניסוי (n = 6 לכל קבוצה): קבוצת מודל HFD, GZRG במינון נמוך (L-GZRG, 3.2 גרם/ק"ג/יום), GZRG במינון בינוני (M-GZRG, 6.4 גרם/ק"ג/יום), GZRG במינון גבוה (H-GZRG, 12.8 גרם/ק"ג/יום), ומטפורמין (Met, 0.2 גרם/ק"ג/יום). GZRG ו-Met ניתנו מדי יום באמצעות שיטת אוראלית במשך 8 שבועות. קבוצות המודלים של Con ו-HFD קיבלו נפחים שווים של מים מזוקקים. עם סיום תקופת הטיפול, נאספו דגימות דם ורקמת כבד מכל העכברים לניתוח נוסף.

בדיקת סבילות לגלוקוז תוך-פריטונאלי (IPGTT), בדיקת סבילות לפירובט (PTT) ובדיקת סבילות לאינסולין (ITT)
בדיקות סבילות מטבולית בוצעו בין 6 ל-8 שבועות לאחר תחילת הטיפולים התרופתיים. ב-IPGTT ו-PTT, העכברים צומו ללילה (כ-16 שעות). ל-ITT, הוטמע תקופת צום קצרה יותר של 4 שעות. לאחר הצום, העכברים קיבלו זריקה תוך-פריטונלית של גלוקוז (2 גרם לק"ג ל-IPGTT), נתרן פירובט (2 גרם/ק"ג ל-PTT), או אינסולין רגיל אנושי (1 U/kg ל-ITT). רמות הסוכר בדם נמדדו מדגימות דם בוריד הזנב ב-0 דקות, 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות ו-120 דקות לאחר ההזרקה באמצעות מד סוכר מכויל.

ניתוח ביוכימי ובדיקות פעילות אנזימטיים
רמות הסוכר בצום בדם (FBG), המוגלובין A1c (HbA1c) ואינסולין (INS) נקבעו באמצעות ערכות בדיקה מסחריות בהתאם להוראות היצרנים. הערכת מודל ההומאוסטטי של עמידות לאינסולין (HOMA-IR) חושבה באמצעות הנוסחה:

HOMA-IR = [FBG (mmol/L) x INS (μU/mL)] / 22.5

רמות המחזור של NEFAs, TG, TC, LDL-C, HDL-C, והפעילות האנזימטית של PDH ו-PC ברקמות כבד נמדדו באמצעות ערכות מסחריות מתאימות.

ניתוח היסטופתולוגי של רקמות כבד
רקמות כבד טריות הוקצו ב-10% פורמלין נייטרלי במשך 24 שעות, ולאחר מכן עיבוד סטנדרטי להטמעת פרפין. חתכים (בעובי 5 מיקרון) נחתכו ונצבעו בהמטוקסילין ואוזין (H&E) להערכה מורפולוגית כללית. לצורך ויזואליזציה של שומן, דגימות כבד נבחרות הוטמעו בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), הוקפאו במהירות, עברו קריוחתה, וצבועו בשמן אדום O.

תרבית תאים וטיפול
קו תאי הפטומה האנושית HepG2 התקבל מאוסף תרביות הטיפוס של האקדמיה הסינית למדעים (סין). התאים גודלו במדיום חיוני מינימלי (MEM) עם תוספת של 25 מ"מ גלוקוז, 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. התרביות נשמרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנור לחות עם 5%CO2.

כדי לקבוע מודל חוץ גופי של עמידות לאינסולין (IR), תאים במפגש של 70%-80% טופלו במשך 24 שעות בתערובת חומצות שומן חופשיות (FFA) שכללה חומצה אולאית וחומצה פלמיטית ביחס מולרי של 2:1, בהתבסס על שיטה שדווחה קודם לכן עם שינויים קלים29. לאחר השראת FFA, התווך הוחלף ב-MEM טרי שמכיל את אותה תערובת FFA יחד עם ריכוזים שונים של GZRG לצורך דגירה נוספת של 24 שעות.

בדיקת כחיות תאים (CCK-8)
תאי HepG2 בשלב הצמיחה הלוגריתמי נקטפו והוזרעו ללוחות של 96 בארות בצפיפות של 1 על 10תאים לבאר . הבארות ההיקפיות מולאו ב-100 מיקרו-ליטר של מלח סטרילי עם בופר פוספט (PBS) כדי למזער אידוי. לאחר דגירה לילית להבטחת היצמדות, טופלו התאים בהתאם לעיצוב הניסוי. לאחר הטיפול, נוספו 10 מיקרוליטר של תמיסת CCK-8 לכל באר, והצלחות נדגרו במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הספיגה ב-450 ננומטר נמדדה באמצעות קורא מיקרופלט. הכדאיות של התאים חושבה כך:

[(As - Ab) / (Ac - Ab)] x 100%

כאשר As היא ספיגת הדגימה, Ac היא ספיגת הבקר (תאים לא מטופלים), ו-Ab היא הספיגה של הריק (בארות ללא תאים).

טרנספקציה של פלסמיד בתאי HepG2
הפלסמיד עם ביטוי יתר SIRT3 (OV-SIRT3) ושלושה פלסמידים קטנים ומפריעים ל-SIRT3 (si-SIRT3-1#, si-SIRT3-2#, si-SIRT3-3#), יחד עם siRNA ביקורתי שלילי (si-NC), נבנו על ידי ספק. טרנספקציות בוצעו באמצעות תגובת טרנספקציה כאשר התאים הגיעו למפגש של 50%-60%. קומפלקס הטרנספקציה הוכן בתנאים סטריליים כדלקמן: תמיסה A נוצרה על ידי דילול 1 מיקרוגרם DNA פלסמיד ב-250 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת עם ערבוב עדין. תמיסה B הוכנה על ידי דילול 2-3 מיקרוליטר של תגובת טרנספקציה ב-250 מיקרוליטר של מדיום סרום מצומצם, ואחריו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ללא מערבולת. שני התמיסות שולבו, התערבבו בעדינות באמצעות פיפטינג, ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ליצירת קומפלקסים של DNA-ליפידים. לצורך טרנספקציה, שעה לפני ההליך, תווך תרבית התאים נשאפ, התאים נשטפו עם PBS, והוסף 1 מ"ל של מדיום סרום מופחת (ללא סרום וללא אנטיביוטיקה). לאחר מכן, נוספו 500 מיקרו ליטר של קומפלקס הטרנספקציה בטיפה לכל באר, וצלחת התרבית סובבה בעדינות כדי להבטיח הומוגניות. התאים דוגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שעות, ולאחר מכן הוחלף המדיום במדיום שלם כדי להפחית את הרעילות הציטוטוקסית. לאחר מכן, התאים תורבו במשך 24-48 שעות נוספות לפני ניתוח נוסף. יעילות הטרנספקציה הוערכה באמצעות PCR כמותי (qPCR). סך ה-RNA הופק, שוחזר ל-cDNA, והוגבר באמצעות פריימרים ספציפיים ל-SIRT3 עם 18S rRNA כבקרה פנימית. רמות הביטוי היחסיות נקבעו באמצעות שיטת ΔΔCt, והמבנה היעיל ביותר של siRNA נבחר לניסויים הבאים בהתבסס על תוצאות אלו.

צביעת שמן אדום O להצטברות שומנים תוך-תאית
תאי HepG2 בשלב הצמיחה הלוגריתמי הוזרעו בלוחות של 24 בארות בצפיפות של 2 על 105 תאים בכל באר והושרו עם מדיום עתיר שומן המכיל 250 מיקרומום חומצה אולאית ו-250 מיקרומום חומצה פלמיטית במשך 48 שעות כדי לקבוע את מודל הצטברות השומן. לאחר הטיפולים, התאים נשטפו עם PBS וקיבעו אותם ב-10% פורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה במים מזוקקים וטבילה קצרה באיזופרופנול של 60%, התאים צובעו בתמיסת עבודה שמן אדום O טרייה (שהושגה על ידי ערבוב רכיבים A1 ו-A2 ביחס של 3:2) למשך 10-15 דקות. הצבע העודף הוסר על ידי שטיפה עם 60% איזופרופנול, ולאחר מכן מים מזוקקים. הגרעינים צוברו נגד עם המטוקסילין מאייר (1.0 גרם לליטר) למשך 1-2 דקות. לאחר שטיפה סופית, תאים הותקנו בג'לטין גליצרול, ותמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 200 להערכה איכותית של טיפות שומן.

השראת עמידות לאינסולין וכימות גלוקוז בתאי HepG2
תאי HepG2 גודלו בלוחות של 24 בארות בצפיפות זריעה של 2 על 10תאים בבאר כדי להקים מודל חוץ-גופי של עמידות לאינסולין. לאחר 24 שעות טיפול, נאסף הסופרנטנט של התרבית לניתוח נוסף. למדידת גלוקוז תוך-תאי, תליות התאים צנטריפוגות ב-1000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט נזרק, והכדור התא נשטף פעם או פעמיים עם בופר איזוטוני, ואחר כך בוצע צנטריפוגה באותם תנאים. הכדור הומוגני לאחר מכן ב-0.2 עד 0.3 מ"ל של מדיום הומוגניזציה ועבר הפרעה אולטרסונית באמבט מים קרח באמצעות גלאי בהספק 300 וואט, עם פולסים של 3-5 שניות ואחריהם מרווחים של 30 שניות, שחוזרים על עצמם 3x-5x. ההומוגנט שהתקבל נבדק ישירות ללא צנטריפוגה נוספת. רמות הגלוקוז הן בסופרנטנט התרבית והן בהומוגנאט התא נמדדו באמצעות ערכת בדיקת גלוקוז סטנדרטית לפי הוראות היצרן, כדי להבטיח הערכה מדויקת וניתנת לשחזור של תגובות מטבוליות.

מדידת תכולת הטריגליצריד התאית
תאי HepG2 נאספו בצנטריפוגה בעוצמה של 1000 x גרם למשך 10 דקות, והסופרנטנט נזרק. כדור התא נשטף 1x או 2 עם בופר פוספט איזוטוני (0.1 M, pH 7.0-7.4), ואחריו צנטריפוגה באותם תנאים. לאחר הסרת הסופרנאנט, הכדור הושתה מחדש והוגן עם 0.2-0.3 מ"ל אתנול מוחלט. ההומוגנט עבר הפרעה אולטרסונית על קרח (300 וואט, 3-5 שניות לכל פיצוץ, מרווחים של 30 שניות, חזרה על עצמה 3-5 פעמים). ההומוגנט שהתקבל שימש ישירות לניתוח מאוחר יותר ללא צנטריפוגה נוספת. לוחית של 96 בארות הוקמה עם בארות ריקות, סטנדרטיות ודגימות. לאחר ערבוב יסודי, הפלטה דגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והספיגה נמדדה ב-500 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. תכולת הטריגליצריד בדגימות התאים חושבה על בסיס עקומה סטנדרטית שנגזרה מדילול סדרתי של תקני גליצרול.

מדידת תכולת הכולסטרול הכוללת
תאי HepG2 (5 x 106) פורקו ב-1 מ"ל של בופר חילוץ על ידי הפרעה אולטרסונית על קרח. ההומוגנט עבר צנטריפוגה בעוצמה של 10,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והסופרנטנט נאסף לניתוח מיידי. תמיסת סטנדרט של כולסטרול (50 מיקרומול/מ"ל) הוכנה ודיוללה באופן סדרתי ליצירת עקומה סטנדרטית (0.3125 עד 10 מיקרומול/מ"ל). תמיסה כרומוגנית עובדת הוכנה על ידי ערבוב מגיבים אחד, שתיים ושלוש שסופקו בערכת בדיקת הכולסטרול, וחימום מראש ל-37 מעלות צלזיוס. דגימות או תקנים עורבבו עם תמיסת העבודה, דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, והספיגה נמדדה ב-500 ננומטר. תכולת הכולסטרול חושבה על פי עקומת הסטנדרט.

צביעת אימונופלואורסצנציה
תאים שגדלו על כיסויי כיסוי נשטפו ב-PBS קר וקבע ב-4% פאראפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפות PBS, התאים חודרו ב-0.1% טריטון X-100 למשך 10 דקות וחסמו עם 5% BSA בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. התאים נדגרו לאחר מכן בנוגדן אנטי-SIRT3 ראשוני (דילול של 1:500) בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה. לאחר שטיפות PBS, התאים דוגרו בנוגדן משני מצומד פלואורסצנציה (דילול של 1:2000) למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. הגרעינים צוברו ב-DAPI (0.5 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 10 דקות. כיסויי כיסוי הותקנו על שקופיות זכוכית באמצעות מדיום נגד דהייה והוצגו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

חילוץ RNA ו-PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)
סך ה-RNA הופק מהתאים באמצעות ערכת רקמת RNA/תאים. ה-DNA הגנומי הוסר, וה-cDNA סונתז באמצעות ערכת gDNA RT. PCR כמותי בוצע באמצעות ערכת qPCR על מערכת זיהוי PCR בזמן אמת. רצפי פריימר ספציפיים לגן מוצגים בטבלה 1.

ניתוח כתמים מערביים
לצורך הפקת חלבון מרקמות כבד, נשקלו כ-50-200 מ"ג רקמה, טוחנו בצלחת פטרי, והועברו להומוגנייזר. בופר ליזיס מקורר מראש (RIPA buffer) בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז נוסף למניעת פירוק חלבון. הומוגניזציה בוצעה באופן יסודי על הקרח כדי להבטיח הפרעה מלאה ברקמה, וההומוגנט הועבר לצינור צנטריפוגה והונח על קרח למשך 30 דקות כדי לאפשר מסיסת חלבון. לאחר מכן, ההומוגנט צונטריפוגה בטמפרטורה של 4°C ב-12,000 x גרם למשך 10-30 דקות, והסופרנטנט נאסף בקפידה כתמצית החלבון הכוללת, תוך הימנעות מזיהום מהכדור. לצורך הפקת חלבון תאי, נוסף לתאים בופר ליזיס מקורר מראש (בופר RIPA המכיל 1% טריטון X-100 ומעכבי פרוטאז), ולאחר מכן דגירה על קרח למשך 15-30 דקות להשגת פירוק מלא. הפרעת התא הובטחה על ידי גירוד חוזר עם מגרד תאים או פיפטינג נמרץ. הליזאט הועבר לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C ב-14,000 x גרם למשך 30 דקות, והסופרנטנט נאסף כתמצית החלבון הכוללת. ריכוז החלבון נמדד באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA, והאליקווטים נשמרו בטמפרטורה של -80°C לניתוח Western Blot עתידי או שימשו ישירות להכנת דגימה. דגימות החלבון עברו דנטור בבופר Laemmli בטמפרטורה של 100°C למשך 10 דקות, מופרדות על ידי SDS-PAGE, והועברו לממברנות PVDF. הממברנות נחסמו עם 5% חלב דל שומן במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ולאחר מכן דגרו עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C. לאחר השטיפה, הממברנות נדגרו עם נוגדנים משניים צמודים ל-HRP למשך שעה בטמפרטורת החדר. רצועות החלבון הוצגו באמצעות תת-כימיליומינציה מוגברת (ECL). אותות הכימילומינסנטיים נלכדו, ועוצמות הרצועה נמדדו באמצעות ניתוח צפיפות באמצעות תוכנת ImageJ. הכתמים המערביים הגולמיים מסופקים בקובץ המשלים 1.

ניתוח סטטיסטי
כל הנתונים מבוטאים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). בוצעו השוואות סטטיסטיות בין שתי קבוצות באמצעות מבחן t של סטודנט לא מזווג. להשוואות בין שלוש קבוצות או יותר, הוחל ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA), ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי להשוואות מרובות. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת GraphPad Prism (גרסה 9.5.0). ערך p של פחות מ-0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

GZRG שיפר את עמידות האינסולין ואת הגלוקונאוגנזה בעכברים T2DM שנגרמו על ידי HFD
מודל העכבר T2DM (סוכרת סוג 2) המושרה על ידי HFD, המאופיין בעמידות לאינסולין, היפרגליקמיה ודיסליפידמיה, נמצא בשימוש נרחב לחקר פתוגנזה של מחלות ולהערכת התערבויות טיפוליות30. במחקר הנוכחי, הוקם מודל T2DM המושרה על ידי HFD בעכברי C57BL/6J להערכת היעילות והמנגנונים הבסיסיים של GZRG.

בהשוואה לקבוצת הביקורת, עכברים שהוזנו ב-HFD הראו עליות משמעותיות במשקל הגוף ובמדד הכבד, ששניהם ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקר הנוכחי מראה כי GZRG מפעיל אפקטים משמעותיים של אנטי-היפרגליקמיה ורגישות לאינסולין הן במודלים in vivo והן in vitro של T2DM, בעיקר באמצעות דיכוי גלוקונאוגנזה כבדית באמצעות וידולציה של ציר SIRT3-MPC1-PC/PDH. נתונים ניסיוניים מצביעים על כך שמתן GZRG הפחית את ההיפרגליקמיה בצום, שיפר את סבילות הגלוקוז והאינסולין, החזיר את ההומאוסטזיס של השומנים והפחית סטיטוזיס כבדי בעכברים סוכרתיים שנגרמו על ידי HFD. במקביל, הטיפול ב-GZRG שיפר את ניצול הגלוקוז, הגביר את סינתזת הגליקוגן, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שעשויים להיראות כמשפיעים על העבודה המדווחת במאמר זה.

תודות

מחקר זה מומן על ידי תוכנית פיתוח המדע והטכנולוגיה של מחוז ג'ילין, מספר מענק 20210101199JC, YDZJ202301ZYTS454.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
FastKing gDNA מבטל RT SuperMix      Tiangen Biotech Co., Ltd. (סין). KR118-02
נוגדן גלוקוז-6-פוספטאז (G6Pase)חברת ווהאן לינגג'ייסי ביוטכנולוגיה בע"מ (סין)LJS-D-12610
נוגדן גליצראלדהיד-3-פוספט דה-הידרוגנאז (GAPDH)חברת ווהאן לינגג'ייסי ביוטכנולוגיה בע"מ (סין)LJS-T-0004
ערכות ELISA עם המוגלובין גליקוזילated     חברת התעשייה ג'יאנגסו מיימיאן בע"מ (סין).MM-0159M2
GZRGבית החולים המסונף של אוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית (ג'ילין, סין)26210483
ערכות בדיקת כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL)מכון נאנג'ינג ג'יאנצ'נג להנדסה ביולוגית (סין)A112-1-1
ערכות אינסולין ELISAחברת התעשייה ג'יאנגסו מיימיאן בע"מ (סין).MM-0579M2
Lipofectamine2000 אינויטרוגן, ארה"ב11668-019
ערכות בדיקת כולסטרול לליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL)מכון נאנג'ינג ג'יאנצ'נג להנדסה ביולוגית (סין)A113-1-1
ערכות מדידת בדיקות גלוקוזמכון נאנג'ינג ג'יאנצ'נג להנדסה ביולוגית (סין)F006-1-1
נוגדן פירובט מיטוכונדריאלי 1 (MPC1)חברת ווהאן לינגג'ייסי ביוטכנולוגיה בע"מ (סין)LJS-D-3852
ערכות בדיקה של חומצות שומן לא אסטריות (NEFAs)מכון נאנג'ינג ג'יאנצ'נג להנדסה ביולוגית (סין)A042-2-1
נוגדן PCחברת ווהאן לינגג'ייסי ביוטכנולוגיה בע"מ (סין)LJS-D-4364
נוגדן PDH-E2חברת ווהאן לינגג'ייסי ביוטכנולוגיה בע"מ (סין)LJS-D-14046
פוספואנולפירובאט קרבוקסיקינאז 1 (PCK1) נוגדןחברת ווהאן לינגג'ייסי ביוטכנולוגיה בע"מ (סין)LJS-D-6770
ערכות ELISA של פירובט קרבוקסילאז (PC)  חברת ווהאן לינגג'ייסי ביוטכנולוגיה בע"מ (סין)LJS-160408H
ערכות פירובט דה-הידרוגנאז (PDH)ערכות ELISA   חברת ווהאן לינגג'ייסי ביוטכנולוגיה בע"מ (סין)LJS-160300H
ערכת רקמות/תאים קלה ל-RNA    Tiangen Biotech Co., Ltd. (סין). DP451
נוגדן SIRT3חברת ווהאן לינגג'ייסי ביוטכנולוגיה בע"מ (סין)LJS-A-5135
Talent SYBR Green qPCR PreMix  Tiangen Biotech Co., Ltd. (סין). FP209-02
ערכות בדיקה לכולסטרול כולל (TC)מכון נאנג'ינג ג'יאנצ'נג להנדסה ביולוגית (סין)A110-1-1
ערכות בדיקה של טריגליצרידים (TG)מכון נאנג'ינג ג'יאנצ'נג להנדסה ביולוגית (סין)A111-1-1

מקורות

  1. Ahmad, E., Lim, S., Lamptey, R., Webb, D. R., Davies, M. J. Type 2 diabetes. Lancet (London, England). 400, 1803-1820 (2022).
  2. Singh, A., Shadangi, S., Gupta, P. K., Rana, S. Type 2 Diabetes Mellitus: A Comprehensive Review of Pathophysiology, Comorbidities, and Emerging Therapies. Comp Physiol. 15, e70003(2025).
  3. Lu, X., et al. Type 2 diabetes mellitus in adults: pathogenesis, prevention and therapy. Signal Transduct Target Ther. 9, 262(2024).
  4. Yang, W., Jiang, W., Guo, S. Regulation of Macronutrients in Insulin Resistance and Glucose Homeostasis during Type 2 Diabetes Mellitus. Nutrients. 15 (21), 4671(2023).
  5. Petersen, M. C., Vatner, D. F., Shulman, G. I. Regulation of hepatic glucose metabolism in health and disease. Nat Rev Endocrinol. 13 (10), 572-587 (2017).
  6. Barroso, E., Jurado-Aguilar, J., Wahli, W., Palomer, X., Vázquez-Carrera, M. Increased hepatic gluconeogenesis and type 2 diabetes mellitus. Trends Endocrinol Metab. 35 (12), 1062-1077 (2024).
  7. Dutta, S., et al. Metformin: A Review of Potential Mechanism and Therapeutic Utility Beyond Diabetes. Drug Des Devel Ther. 17, 1907-1932 (2023).
  8. Lebovitz, H. E. Thiazolidinediones: the Forgotten Diabetes Medications. Curr Diab Rep. 19 (12), 151(2019).
  9. Yao, H., et al. Comparative effectiveness of GLP-1 receptor agonists on glycaemic control, body weight, and lipid profile for type 2 diabetes: systematic review and network meta-analysis. BMJ. 384, e076410(2024).
  10. Vallon, V., Verma, S. Effects of SGLT2 Inhibitors on Kidney and Cardiovascular Function. Annu Rev Physiol. 83, 503-528 (2021).
  11. Dou, Z., et al. Syndrome Differentiation and Treatment Regularity in Traditional Chinese Medicine for Type 2 Diabetes: A Text Mining Analysis. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 728032(2021).
  12. Ni, Y., et al. Evidence of traditional Chinese medicine for treating type 2 diabetes mellitus: from molecular mechanisms to clinical efficacy. Pharm Biol. 62 (1), 592-606 (2024).
  13. Wang, J., et al. Effects of three Huanglian-derived polysaccharides on the gut microbiome and fecal metabolome of high-fat diet/streptozocin-induced type 2 diabetes mice. Int J Biol Macromol. 273 (Pt 1), 133060(2024).
  14. Qi, L., et al. Structural characterization of red yeast rice-derived polysaccharide and its promotion of lipid metabolism and gut function in high-fat diet-induced mice. Int J Biol Macromol. 282 (Pt 1), 136744(2024).
  15. Liu, Y., et al. Flavonoid-Rich mulberry leaf extract modulate lipid metabolism, antioxidant capacity, and gut microbiota in high-fat diet-induced obesity: potential roles of FGF21 and SOCS2. Food Med Homol. 1, 9420016(2024).
  16. Wu, H., et al. Efficacy and safety assessment of traditional Chinese medicine for metabolic syndrome. BMJ Open Diabetes Res Care. 8 (1), e001181(2020).
  17. Jin, Z., Wang, X. Traditional Chinese medicine and plant-derived natural products in regulating triglyceride metabolism: Mechanisms and therapeutic potential. Pharmacol Res. 208, 107387(2024).
  18. Chen, S., et al. Screening and identification of active compounds of GanZhiRong granule based on liquid chromatography-mass spectrometry and biomolecular networks. Chinese J Anal Chem. 51, 100294(2023).
  19. Yu, Y., Liu, T., Yang, Y., Wang, H., Liu, Y. Effects of Liver Fat Soluble Granule Comnined and Metformin on Blood Glucose in Diabetic Rats. Jilin J Trad Chinese Med. 39, 654-656 (2019).
  20. Ji, Z., Liu, G. H., Qu, J. Mitochondrial sirtuins, metabolism, and aging. J Genet Genomics. 49 (4), 287-298 (2022).
  21. Zhang, J., et al. Mitochondrial Sirtuin 3: New emerging biological function and therapeutic target. Theranostics. 10 (18), 8315-8342 (2020).
  22. Chen, J., et al. The role of sirtuins in the regulatin of oxidative stress during the progress and therapy of type 2 diabetes mellitus. Life Sci. 333, 122187(2023).
  23. Weng, S., et al. Chaperonin counteracts diet-induced non-alcoholic fatty liver disease by aiding sirtuin 3 in the control of fatty acid oxidation. Diabetologia. 66 (5), 913-930 (2023).
  24. Liang, L., Li, Q., Huang, L., Li, D., Li, X. Sirt3 binds to and deacetylates mitochondrial pyruvate carrier 1 to enhance its activity. Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 807-812 (2015).
  25. Guo, X., et al. The Role of Palmitoleic Acid in Regulating Hepatic Gluconeogenesis through SIRT3 in Obese Mice. Nutrients. 14 (7), 1482(2022).
  26. Han, Y., et al. Bawei Chenxiang Wan ameliorates right ventricular hypertrophy in rats with high altitude heart disease by SIRT3-HIF1α-PDK/PDH signaling pathway improving fatty acid and glucose metabolism. BMC Complement Med Ther. 24 (1), 190(2024).
  27. Wei, X., et al. Both prolonged high-fat diet consumption and calorie restriction boost hepatic NAD+ metabolism in mice. J Nutr Biochem. 115, 109296(2023).
  28. Kavanaugh, J. W. Skeletal Muscle Acetylation in Response to an Acute and Chronic High-Fat Diet [Doctoral Dissertations]. , Virginia Tech. (2017).
  29. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. Attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  30. Qu, X., et al. Riligustilide alleviates hepatic insulin resistance and gluconeogenesis in T2DM mice through multitarget actions. Phytother Res. 36 (1), 462-474 (2022).
  31. Rui, L. Energy Metabolism in the Liver. Compr Physiol. 4, 177-197 (2014).
  32. Li, A., et al. Berberine Reduces Pyruvate-driven Hepatic Glucose Production by Limiting Mitochondrial Import of Pyruvate through Mitochondrial Pyruvate Carrier 1. EBioMedicine. 34, 243-255 (2018).
  33. Tavoulari, S., Sichrovsky, M., Kunji, E. R. S. Fifty years of the mitochondrial pyruvate carrier: New insights into its structure, function, and inhibition. Acta Physiol (Oxford, England). 238 (4), e14016(2023).
  34. Dutta, S., et al. Metformin: A Review of Potential Mechanism and Therapeutic Utility Beyond Diabetes. Drug Des Devel Ther. 17, 1907-1932 (2023).
  35. Xu, G., et al. Mitochondrial ACSS1-K635 acetylation knock-in mice exhibit altered metabolism, cell senescence, and nonalcoholic fatty liver disease. Sci Adv. 10 (20), eadj5942(2024).
  36. Jin, L., et al. FGF21-Sirtuin 3 Axis Confers the Protective Effects of Exercise Against Diabetic Cardiomyopathy by Governing Mitochondrial Integrity. Circulation. 146 (20), 1537-1557 (2022).
  37. Ning, Y., et al. SIRT3: A potential therapeutic target for liver fibrosis. Pharmacol Ther. 257, 108639(2024).
  38. Xian, Y., et al. Enhanced SIRT3 expression restores mitochondrial quality control mechanism to reverse osteogenic impairment in type 2 diabetes mellitus. Bone Res. 13 (1), 30(2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מסלול SIRT3עמידות לאינסוליןמטבוליזם של פירובירטתאי HepG2ביטוי חלבוןמטבוליזם של ליפידיםסבילות לגלוקוז
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.