מאמר שיטה

דגימה בזמן אמת של נוזל ביניים עורקי-ורידי של עכברים בפמורל על ידי מיקום גלאי מיקרודיאליזה

437 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69551

⸱

30 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג טכניקת מיקרודיאליזה שמקלה על דגימה מדויקת בזמן אמת ואנטומית של נוזל אינטרסטיציאלי אדוונציאלי (AISF) בעכברים מונדים, וחושפת שינויים מטבוליים מובחנים ומאשרת את חשיבותו הפיזיולוגית הייחודית. בהשוואה לשיטות דגימת נוזל בין-תחומי (ISF) קיימות, גישה זו מספקת רזולוציה מולקולרית משופרת ויציבות דגימה.

תקציר

נוזל אינטרסטיציאלי (ISF) הוא מרכיב חיוני במיקרו-סביבה החוץ-תאית, המסייע להחלפה מטבולית ותקשורת בין-תאית. עם זאת, העומק האנטומי והקרבה למבני כלי הדם מקשים במיוחד על דגימת ה-ISF האדוונטיציאלי (AISF) מבלי לגרום לזיהום או להפרעה ברקמות. במחקר זה, אנו מציגים שיטה בזמן אמת, זעיר-פולשנית, לאיסוף AISF באמצעות מיקרודיאליזה בעכברים מורדמים. שני גשושי חיתוך של 20 קילו-דלטון הושתלו בניתוח באדוונטיציה העורקית-ורידית הירך ובוריד היוגולרי, כדי לאפשר דגימה רציפה של ISF ודם, בהתאמה. הפרפוזיה עם נוזל חוץ-תאי מלאכותי אפשרה דיפוזיה סלקטיבית של מטבוליטים בעלי משקל מולקולי נמוך. באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) וניתוח הבחנה חלקית של ריבועים אורתוגונליים (OPLS-DA), נצפתה סטייה מטבולית ברורה בין AISF לדם, שזיהתה 146 מטבוליטים שונים באופן משמעותי. דפוסי ההעשרה של לקטט וסרוטונין אישרו את הספציפיות האנטומית והאמינות התפקודית של השיטה. חשוב לציין כי AISF הועשר במטבוליטים מסונתזים מקומית שהיו חסרים בפלזמה, מה שמדגיש את חשיבותו הפיזיולוגית הייחודית. בהשוואה לשיטות דגימת נוזל אינטרסטיציאלי (ISF) הנוכחיות, כגון מחטים מיקרו, שלפוחיות יניקה ויונטופורזה הפוכה, מיקרודיאליזה מספקת רזולוציה מולקולרית משופרת, יציבות דגימה גבוהה יותר והפחתת פולשנות. טכניקה זו מהווה פלטפורמה אמינה לניתוח in vivo של אנליטים בנוזל אינטרסטיציאלי (AISF) ומראה פוטנציאל משמעותי לקידום גילוי סמנים ביולוגיים ומחקר בפתופיזיולוגיה וסקולרית.

מבוא

נוזל רקמה, או נוזל אינטרסטיציאלי (ISF), מהווה מרכיב חיוני במיקרו-סביבה התאית, עם מחקר מחקרי שמתחיל בסוף המאה ה-19. בשנת 1896, סטארלינג הציגה את תיאוריית הסינון-ספיגה מחדש של הנימים, שאפיינה לראשונה את ISF כנוזל הומוגני הנוצר באמצעות אולטרה-פילטרציה בפלזמה, ושיחק תפקיד חיוני בהובלת תזונתיים ובהסרת פסולת מטבולית1. בעשרים השנים האחרונות, התקדמות בטכנולוגיית הדמיה מיקרוסקופית ובביולוגיה מולקולרית שיפרה את הבנת החוקרים לגבי המגוון המשמעותי בהתפלגות, ההרכב והתפקוד האנטומי של ISF2.

מחקר על נוזל אינטרסטיציאלי (ISF) באתרים אנטומיים שונים הבהיר את תפקידיו הייחודיים ברקמות שונות. לדוגמה, ברקמה מוחית, ISF מסייע בניקוי מטבוליטים נוירוטוקסיים, כגון β-אמילואיד, במהלך שינה דרך מערכת הגלימפה3. לעומת זאת, נוזל אינטרסטיציאלי של הגידול (TIF) תורם לחדירת גידול ולהתחמקות חיסונית על ידי קידום מיקרוסביבה חומצית דרך הצטברות חומצה לקטית4. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-ISF פועל לא רק כמתווך להחלפה מטבולית, אלא גם כגורם רגולטור פעיל של תהליכים פתופיזיולוגיים ספציפיים לרקמה. בהקשר זה, נוזל הביניים האדוונטיציאלי (AISF) מהווה אתגר מחקרי ייחודי בשל המיקום האנטומי הספציפי שלו ומורכבותו התפקודית. AISF ממוקם בממשק בין האדוונטיציה לרקמות הסובבות5, ומשחק תפקיד מרכזי באינטראקציה בין דופן כלי הדם למערכת העצבים והחיסוניות. עם זאת, מיקומו האנטומי העמוק והקרבה לדם ולנוזלי לימפה הציבו אתגרים טכניים משמעותיים בדגימה במקום ובניתוח הרכב.

טכניקות מסורתיות לדגימת ISF, כולל שיטת הוויק וניקוז כירורגי, נתקלות באתגרים משמעותיים בקבלת דגימות AISF טוהרות בשל הסיכון לזיהום דם ולנזק לרקמות. לדוגמה, הסרה כירורגית של האפיתל הווסקולרי עלולה לגרום לפגיעה בעצבים היקפיים או בכלי לימפה, מה שמוביל לתערובת של ביומולקולות לא מטרה6. יתרה מזאת, שיטות אלו מוגבלות בשל שיעורי דגימה נמוכים, חוסר יציבות, רגישות להפרעות ויכולת שחזור נמוכה, לעיתים קרובות כתוצאה מדלקת הנגרמת מהחדרת פתיל תת-עורי7 ונזק תאי במהלך השתלת שריר. פיתוח מיקרודיאליזה מציג גישה יעילה יותר למחקרי ISF. טכניקה זו מאפשרת לכידה במקום ודינמי של מולקולות קטנות, כגון מטבוליטים וציטוקינים, בתוך ה-ISF מבלי לפגוע במבנה כלי הדם באמצעות גלאי ממברנה חצי-חדיר. הגשוש יכול להיות ממוקם בדיוק בתוך מרחב האפיתל הווסקולרי, ובכך מפחית את הסיכון לזיהום מדם או נוזלי לימפה. בנוסף, הוא מאפשר דגימה רציפה, המאפשרת ניטור בזמן אמת של שינויים דינמיים במטבוליזם של ISF בתנאים שונים. להבטיח ניטור רציף ויציב של תהליכים מטבוליים אלו במהלך הניסוי.

פרוטוקול

הניסויים בבעלי חיים בוצעו לאחר אישור מוועדת האתיקה של בעלי החיים של מכללת הרפואה של בייג'ינג. כל הנהלים עמדו בקפדנות בפרוטוקולים שנקבעו. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנה ניסיונית

  1. המחיש את מערכת הדגימה של המיקרודיאליזה וכלי הניתוח הנלווים כפי שמוצג באיור 1.
  2. הכינו נוזל חוץ-תאי מלאכותי (aECF) המכיל 153.5 מ״מ נ״מ, 4.3 מ״מ ק״מ, 0.41 מ״מ מ״ר מ״ג, 0.71 מ״מ קאלסיבריום, 139.4 מ״מ קלוריום ו-1.25 מ״מ גלוקוז, וכיוון את ה-pH ל-7.4.
  3. הכן שני גלאי mD של 20 קילו-דלטון וסמן אותם כ-Probe 1 (גלאי נוזל רקמה) ו-Probe 2 (גלאי דם). הניחו את פרוב 1 במים מסוננים סטריליים (dH₂O) ואת פרוב 2 בנפרן 1% נפתרון, כדי להבטיח שקצות הגשוש נשארים לחים באופן רציף.
  4. קבע שני זוגות מסלולים (נתיבים 1 ו-2) עבור "זרימת כניסה" ו"זרימה יוצאת". חבר שני מקטעי צינור FEP בקוטר 1 מטר באמצעות צינור PE50, תוך מזעור שטח מת. חבר כל צינור זרימה למזרק אקסמיר בגודל 1 מ"ל: מלא את המזרק הראשון ב-dH₂O ואת המזרק השני ב-1% נפתרן הפארין. חבר את המיקרוסינג'ים לגשושים והכין את עצמך להזרקת aECF לאחר הכנסת הגשושים לווריד היוגולרי.
  5. הפעל את משאבת ה-mD וקבע את קצב הזרימה ל-1.5 מיקרוליטר לדקה עד שנוזל יוצא מצינור היציאה. חבר את צינור היציאה לקו איסוף הדגימות.
  6. מלאו שני מיקרוסינג'ים ב-aECF מסונן והתחילו שאיבה במהירות של 1 מיקרוליטר/דקה.

2. הכנת בעלי חיים

  1. עכברי Sprague-Dawley בוגרים נבחרים במשקל 280 ± 20 גרם (n = 6).
  2. השרה הרדמה באמצעות איזופלורן 3% ושמירה על איזופלורן של 1.8%-2.2% בתערובת אוויר/חמצן תוך ניטור פעילות לב (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). אשר הרדמה עמוקה על ידי הערכת היעדר תגובה לכאב וציון ירידה בקצב הלב (340-390 פעימות בדקה). הנח את העכברוש על שמיכת תרמוסטטית ושתק את הגפיים.
  3. מרחי קרם להסרת שיער על הצוואר והגפה האחורית השמאלית, ומגיעה עד הבטן התחתונה השמאלית. חטא את האזורים המפורקים פעמיים ביודופור והסירו את שארית היוד באמצעות 75% אלכוהול רפואי.

3. מיקום גשוש דו-אתר (אדוונטיציה ירך ווריד יוגולרי)

  1. השתמש בגלאי עם חלון דיאליזה פעיל בקוטר 10 מ"מ (CMA-20, חיתוך 20 קילו-דלטון, קוטר ציר 0.5 מ"מ) כפי שמוצג באיור 2A.
  2. הכינו את מחט ההנחיה וצינור הקריעה (איור 2B).
  3. הארכי את הגפה האחורית של העכברוש כך שהקו שמחבר בין מפרק הברך לנקודת האמצע של הקפל המפשעה יהיה בניצב לציר האורכי של הגוף. מדוד קטע של 2 ס"מ לאורך העור של אזור המפשעה בכיוון הגפה האחורית כדי להגדיר את אזור הציון הנכירודי (איור 2C). זהה את נקודת האמצע של אזור המפשעתי הזה כנקודת המיקום של מיקרו-חלון. סמן את אתר הדקירה במרחק 2 ס"מ לרוחב לנקודת מיקום זו (איור 2D).
  4. שים את החיה תחת מיקרוסקופ סטריאו.
  5. יש לבצע חתך בגודל 0.5-0.8 ס"מ באמצע הקפל המפשעי כדי להקל על הדמיה ולהבטיח מיקום מדויק של הגלאי בתוך ממברנת הפריוסקולרית. נתח באופן ישיר את הרקמה התת-עורית כדי לחשוף את העורק והווריד הפמורלי, את הווריד הספן, ואת וריד דופן הבטן השטחי (איור 2E).
  6. עטוף את השכבה החיצונית של מחט הדקירה בצינור קרע ליצירת מחט מנחה.
  7. ודאו שאין כלי דם מתחת לעור באתר הניקוב. הכנס את המחט אנכית דרך העור, ואז כוון את הזווית ל-45° כדי להיכנס למרחב הרקמה שמסביב לווריד הספנוסי.
  8. התקדמו את המחט לכיוון זרימת הדם בתוך הווריד הספנוס הגדול, תוך שמירה על מגע קרוב עם דופן כלי הדם לאורך כל ההליך. השתמש במיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ כדי לנטר את מיקום המחט בזמן אמת ולמנוע פגיעה וסקולרית או זיהום דם. לאחר מכן, הנח את המחט אל אדוונטיציה של וריד הירך (איור 2F).
  9. משכו את מחט הדקירה תוך השארת צינור הקריעה במקומו בתוך הרקמה (איור 2G).
  10. הכנס את גלאי נוזל הרקמה לקטטר הקריע, ופתח בזהירות את הקטטר כדי לחשוף את אתר הדגימה ולשלוף את דגימת הרקמה (איור 2H). ודאו שהגשוש ממוקם בדיוק בתוך האדוונטיציה של עורק הירך והווריד (איור 2I). אבטח את הגשוש לעור לפני התפירה (איור 2J). בצע את כל ההליכים בתנאים אספטיים קפדניים, תוך שמירה על מניעת הפרעה לאדוונטיציה הווסקולרית ומניעת דלקת ברקמות או תגובות גופים זרים שעלולות לפגוע באיסוף נוזלי הרקמה.
  11. אמת את מיקום הגשוש על ידי צילום סרגל ניתוחי יחד עם הגשוש הקבוע כדי לתעד את אורך החשיף, והצג את התמונה כפי שמוצג באיור 2I.
  12. בצע חתך עור באורך 2 ס"מ כ-0.5 ס"מ לרוחב לקו האמצעי של הצוואר, החל ב-1 ס"מ מעל החריץ הסטרנלי.
  13. חתך באופן ישיר דרך שריר הסטרנוקליידומסטואיד כדי לחשוף את הווריד היוגולרי, שנמצא לצד העורק הקרוטידי ומזוהה בצבעו הכחול-כהה. השתמש במקלון כותנה רטוב כדי להפריד בעדינות את הפאשיה, תוך היזהרות להימנע ממגע עם עצב הוואגוס.
  14. באמצעות מלקחיים מיקרוסקופיים, הרימו בעדינות את הממברנה החיצונית של הווריד היוגולרי והסירו בזהירות את רקמת החיבור הסובבת כדי לקבל לפחות 1 ס"מ של אורך כלי דם חופשי. הנח תפר משי 4-0 קרוב לשמש כרצועת גיבוי (איור 2K).
  15. לניקוב ורידי, יש לבצע חתך אלכסוני בזווית של 45°, בערך שליש מקוטר כלי הדם. השתמשו במיקרופוספס כדי לפתוח בעדינות את החתך וליצור פתח להחדרת הגלאי.
  16. הכניסו בזהירות את קצה הגשוש לתוך הווריד והתקדמו לאט לעומק של 3.5-4.0 ס"מ, כדי להבטיח שהקצה מגיע לכניסה לאטריום הימני (איור 2L).
  17. אבטח את הגשוש על ידי הידוק רצועת המשי הקרובה עם קשר כפול. סגור את שכבת השריר עם תפרי ויקריל 4-0, ואז תפר את העור עם תפרים מופרעים. מקבע את החלק החיצוני של הגשוש על פני העור כדי למנוע הזזה.

4. איסוף דגימות והחזרת הגשוש

  1. איסוף דגימות: להעריך את הקשר בין דיאליזה ברקמה להעברת דגימה לצינור האיסוף. שמרו על נפח כולל של 20 מיקרולטר בין הגשוש לאספן.
    1. יש לאפשר תקופה של 20 דקות שהדגימה תעבור דרך הגלאי והצינור ותגיע לקצה הצינור לאיסוף בקצב זרימה של 1 מיקרוליטר/דקה. אספו נפח מספק כדי להגיע לריכוז הנדרש לבדיקה. אסוף 30 מיקרו-ליטר דיאליזט בכל צינור איסוף.
  2. אחסון דגימות: צינורות איסוף פוליפרופילן 0.5 מ"ל לפני קירור עד 4 מעלות צלזיוס. מיד לאחר האיסוף, סגרו את הצינורות, הקפיאו אותן בחנקן נוזלי למשך 30 שניות, והעבירו למקפיא בטמפרטורה של מינוס 80°C תוך 2 דקות.
  3. מדגם בסיס: שיווי משקל מלא לפני תחילת איסוף הדגימות. אסוף שלוש דגימות לכל חולדה תחת הרדמה כדי לקבוע קו בסיס מדידה יציב.
  4. הסרת הגשוש: הסרת הגשוש מראש בעל החיים לאחר סיום איסוף הדגימה ומניחים אותה בבקבוקון אחסון המכיל 1% נתרן הפארין. הרס את החיה על ידי שאיפת איזופלורן עודף.
  5. שימור הגשוש: שטפו היטב את הגשוש עם תמיסת מלח ואחסנו אותו בבקבוקון המכיל תמיסת מלח. שטוף את הצינורות במי מלח באמצעות מזרק כדי למנוע צמיחת מיקרואורגניזמים. שימוש חוזר בגלאי רק אם הוא שומר על זרימה מספקת והממברנה נשארת שלמה.

5. ניתוח נתונים

  1. בצע ניתוח רכיבים עיקריים (PCA), ניתוח הבחנה חלקי אורתוגונלי של ריבועים מינימליים (OPLS-DA), וניתוחים סטטיסטיים נוספים באמצעות MetaboAnalyst 6.0. השתמש ב-OPLS-DA במיוחד כדי לקבוע את החשיבות המשתנה בהקרנה (VIP).
  2. יישם מבחנים לא-פרמטריים, כולל הערכות ערך P וניתוח שינוי קיפול, כדי לבחון מטבוליטים דיפרנציאליים. קבעו סף קריטי לסינון מטבוליטים שונים כ-VIP > 1, FC ≥ 2, או FC ≤ 0.5, ו-P < 0.05.
  3. יש להוסיף הערות על המטבוליטים שזוהו באמצעות מאגר התרכובות KEGG.

6. HPLC - MS/MS

  1. בצע כימות מטבוליט באמצעות ספקטרומטר מסה משולש AB Sciex 6500+ המצויד במקור יינון אלקטרוספריי (ESI) הפועל במצב יוני חיובי.
  2. הגדר את פרמטרי המכשיר כך: גז וילון, 40 psi; גז התנגשות, 10 psi; גז מקור יונים 1 (GS1), 50 psi; גז יונים 2 (GS2), 55 psi; מתח ריסוס יונים, 4500 וולט; וטמפרטורת המקור, 550 מעלות צלזיוס.
  3. הפעל את המערכת במצב ניטור תגובה מרובה (MRM). אופטימיזציה של מעברי MRM, פוטנציאלי פירוק ואנרגיות התנגשות בנפרד עבור כל מטבוליט. לבצע איסוף נתונים באמצעות תוכנת Analyst 1.7.1 וניתוח כמותי באמצעות MultiQuant 3.0.3.
  4. להפרדה כרומטוגרפית, השתמשו בעמודת C18 (2.1 × 100 מ"מ, 1.7 מיקרון) הנשמרת ב-45 מעלות צלזיוס. הכינו את הפאזות הניידות כ-(A) חומצה פורמית 0.1% במים ו-(B) חומצה פורמית 0.1% באצטוניטריל. הגדר את קצב הזרימה ל-0.35 מ"ל/דקה ונפח ההזרקה ל-6 מיקרוליטר. שמור על טמפרטורת האוטוסטמפלר ב-4 מעלות צלזיוס לפני הניתוח.
    הערה: במחקר זה, כל ריצה נמשכה כ-25 דקות בסך הכל.

תוצאות

מערך הנתונים נורמל על ידי יישום טרנספורמציות סכום ולוגריתמה, ולאחר מכן עבר מערך מקיף של ניתוחים סטטיסטיים. בוצע ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) (איור 3A), שחשף הפרדות מובחנות והדגיש הבדלים מטבוליים. בהמשך, פותח מודל ניתוח הבחנה חלקי אורתוגונלי של ריבועים מינימליים (OPLS-DA), כאשר הציונים שהתקבלו הוצגו באיור 3B, המדגימים את היעילות ההבחנה של המודל. בהערכה של 618 מטבוליטים, גרפים של הר געש שהשוו בין AISF לדגימות דם זיהו 146 מטבוליטים מופרזים, כאשר נוזל רקמה הציג מטבוליטים עם ויסות נמוך וגבוה (איור 3C). בנוסף, נוצרה מפת חום כדי לספק סקירה השוואתית של 50 המטבוליטים הדיפרנציאליים המובילים (איור 3D).

להערכת אמינות שיטת הדגימה, נעשה שימוש בסרוטונין וחומצה לקטית כאמצעי ביקורת חיוביים המייצגים רכיבי נוזל רקמה ודם, בהתאמה. התוצאות תאמו את דפוסי ההתפלגות הקבועים של רכיבים אלו על פני נוזלי גוף שונים, כפי שמודגם באיור 4. איור משלים 1 מראה את היציבות של לקטט וסרוטונין באליקווטים של מיקרודיאליזאט המאוחסנים בטמפרטורה של -80°C.

146 המטבוליטים הדיפרנציאליים סווגו באופן שיטתי למספר קטגוריות: נוקלאוזידים, נוקלאוטידים והאנלוגים שלהם; חומצות שומן ונגזרותיהן; חומצות אמינו, פפטידים, ומקבילים להן; פחמימות ופחמימות; חומצות אורגניות ונגזרותיהן; אמינים ביוגניים; פורינים ופירימידינים; ויטמינים וסטרואידים; וכן תרכובות נוספות (איור 5A). טבלה משלימה 1 מראה מטבוליטים שונים שזוהו בדם. ניתוחי Heatmap מבהירים עוד יותר את דפוסי ההעשרה של אמינים ביוגניים וחומצות אמינו, פפטידים, ומקביליהם בנוזלי גוף שונים (איור 5B,C). ניתוח העשרת מטבוליטים דיפרנציאלית מוצג באיור 6. טבלה משלימה 2 מפרטת את מקדם השונות (CV) עבור חמישה-עשר מטבוליטים שנבחרו באקראי בשלוש דגימות נוזל-רקמה פריוסקולריות עוקבות.

איור 1
איור 1: תמונות של המכשיר הניסיוני. (A) קולקטור שברים מקורר. (ב) משאבת מזרק. (ג) מיקרו-מזרקים. (ד) כלים כירורגיים, כולל מספריים וסקולריים ופינצטה, וכו'. (ה) מכונת הרדמה. (ו) גשושי מיקרודיאליזה. (G) גשושי מיקרודיאליזה, מחט הדרכה לרקמות, וצינור קריעה. (H) הרכבות מחטים למדריך רקמות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2
איור 2: השלבים המרכזיים במחקר. (א) ייצוג סכמטי המתאר דיאגרמה המדגימה את מיקום אתר הניתוח ואת כיוון הגשוש. (ב) זיהוי צמתים וסקולריים קריטיים להבטחת תצפית מדויקת על אתרי מיקום הגשושים. (ג) הכנסת מחט המנחה החודרת לעור ומתקדמת אל חלל הרקמה. (ד) משיכת מחטי הסיכה הנחוכה נמשכת, ומשאירה את הצינור הקרוע בתוך הרקמה. (ה) הגשוש המיקרודיאליזה מוכנס לרקמה דרך הערוץ שנקבע. (ו) משיכה עדינה של צינור הקריעה. הצינור הקריע נמשך בעדינות לאחר שמאובטח את הגשוש במקומו. (ז) הדמיית גשושים הממוקמים באפיתל של כלי הדם העורקיים והוורידיים של הירך. (ח) הפרדת רקמה מהווריד היוגולרי. (I) מיקום הגשוש בווריד הג'וגולרי. (J) גלאי המיקרודיאליזה מקובע על פני העור. (K) בידוד הווריד היוגולרי. (L) הכנסת הגלאי לווריד היוגולרי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3
איור 3: ניתוח סטטיסטי רב-משתני של נוזל אינטרסטיציאלי (ISF) ודם. (א) הנתונים הוקטנו כדי להדגיש הפרדות משמעותיות, המדגימים הבדלים ברורים בין רכיבי ISF לרכיבי דם. (B) ציוני מודל ניתוח הדיסקרימיננטי החלקי OPLS-DA (OPLS-DA) מצביעים על ערכי R2Y ו-Q2 של 0.925 ו-0.811, בהתאמה. (ג) תרשים הר הגעש מציג 146 מטבוליטים דיפרנציאליים, כאשר 85 מטבוליטים מופחתים ו-61 כלפי מעלה ב-ISF. (ד) בהתאם לכך, מפות חום שמבדלות בין 30 המטבוליטים המובילים ב-ISF ובדם חושפות הבחנה ברורה בין שתי קבוצות הרכיבים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4
איור 4: הצגת סדרת תרשימי קופסה שהבהירה את רמות ההעשרה של לקטט וסרוטונין ב-ISF ובדם. כל נקודות הנתונים מייצגות ממוצע ± SEM; מדדי השגיאה מוצגים עבור כל הפאנלים הכמותיים. פאנל (א) ממחיש כי דגימות ISF מציגות העשרה משמעותית גבוהה יותר של לקטט בהשוואה לדגימות דם. לעומת זאת, הפאנל (B) מראה שסרוטונין מועשר יותר בדגימות דם, שמראות בו זמנית רמות לקטט נמוכות יותר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5
איור 5: טבלת הטבעת של מטבוליטים דיפרנציאליים ומפת החום של חומצות אמינו, פפטידים ואנלוגים, וכן אמינים ביוגניים, מוצגות. (א) כל בלוק צבע מתאים לסוג נפרד של מטבוליטים. חומצות אמינו, פפטידים ואנלוגים מהווים את הקטגוריה הגדולה ביותר, המהווים 19.29% מהסך הכולל, אחריהם נוקלאוזידים, נוקלאוטידים ואנלוגים (15%), חומצות שומן ונגזרות (12.86%), פחמימות וקונוגטים פחמימות (7.86%), חומצות אורגניות ונגזרות (10%), אמינים ביוגניים (7.14%), פורינים/פירימידינים (5.71%), ויטמינים וסטרואידים (8.57%), ותרכובות נוספות, כולל אינדולים, אזפינים, פירידינים ובנזנים, עם 13.57%. (B) בנוזל אינטרסטיציאלי (ISF), רמות ההעשרה של תרכובות כמו דאוקסיקרניטין וספרמידין בקטגוריית האמינים הביוגניים גבוהות משמעותית בהשוואה לאלו שבדם, בעוד שרמות הסרוטונין (D4), הסרוטונין, הטריפטמין והתרכובות הקשורות יורדות משמעותית. (ג) ב-ISF, רוב המטבוליטים הקשורים לחומצות אמינו, פפטידים ואנלוגים נמוכים משמעותית מאלו שנצפו בדם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6
איור 6: ניתוח העשרת קבוצות מטבוליט (MSEA) של נוזל אינטרסטיציאלי תקין חשף כי פעילות מטבולית מתחלקת בעיקר בין מסלולים הקשורים לייצור אנרגיה, הומאוסטזיס רדוקס ומהפכת חומצות אמינו. המסלולים המועשרים ביותר כוללים את מטבוליזם הבוטנואט, מטבוליזם פורין ומטבוליזם גלוטתיון, המשקפים את שמירת אספקת האנרגיה המיטוכונדריאלית ואת קיבולת נוגדי החמצון בתנאים פיזיולוגיים. בנוסף, מיוצגים מספר מסלולים הקשורים לחומצות אמינו, כגון מטבוליזם ארגינין ופרולין, מטבוליזם של טריפטופן, ומטבוליזם ציסטאין ומתיונין, המעידים על המרה פעילה בין חומצות אמינו וויסות איזון חנקן בסביבה המיקרו-תאית. ממצאים אלו מצביעים על כך שהמטבולום הבין-תקיני התקין שומר על איזון דינמי בין תהליכים ביואנרגטיים, הגנה חמצונית ומטבוליזם של חומצות אמינו, התומך בהומאוסטזיס הרקמתי וביציבות מיקרו-זרימתית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: יציבות של לקטט וסרוטונין באליקווטים מיקרודיאליזאטיים המאוחסנים בטמפרטורה של -80°C. הנתונים הם ממוצעים ± SEM (n = 6 שכפולים לכל נקודת זמן). אף אנליט לא סטה >5% מהבסיס מעל 72 שעות. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 1: מטבוליטים שונים שזוהו בדם ובמיקרודיאליזאט נוזלי בין-תחום אדוונציאלי. זה כולל את שם המטבוליט, שינוי קיפול (FC), ערך P במבחן t של סטודנט, ו-VIP (OPLS-DA). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 2: מקדם השונות (CV) עבור חמישה עשר מטבוליטים שנבחרו באקראי בשלוש דגימות נוזל-רקמה פריוסקולריות עוקבות. כל קורות החיים הם <20%. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

נוזל אינטרסטיציאלי (ISF) הוא מיקרו-סביבה מימית העוטפת כל תא רקמה ומהווה כ-75% מאזור הנוזל החוץ-תאי 8,9. נוצר על ידי סינון קפילרי של פלזמה, ISF חסר את תכולת התאים והחלבון הגבוהה בדם אך שומר על אלקטרוליטים, מומסים קטנים ומים9. הרכב זה ממקם את ISF כממשק המרכזי בין העולם הווסקולרי לעולם התאי. פונקציונלית, ISF הוא מדיום תחבורה דינמי. הוא מעביר חמצן, גלוקוז, חומצות אמינו ומיקרונוטריינטים מזרם הדם אל התאים, תוך איסוף פחמן דו-חמצני, אוריאה ופסולת מטבולית אחרת כדי להחזיר למחזור הדם. הנוזל משמש גם כחומר סיכה ובופר, ומייצב את הלחץ האוסמוטי הבין-תחומי, ה-pH והאיזון היוני11. מעבר למטבוליזם, ISF תומך במעקב חיסוני על ידי העברת לויקוציטים, נוגדנים וציטוקינים דרך חללי הרקמה ומשמש ככביש תקשורת להורמונים ואותות פאראקריניים12,13. בהשוואה לדם, ISF הוא למעשה פילטראט14 ללא תאים, דל חלבון. הדם, המוגבל לעץ כלי הדם, מכיל תאים אדומים ולבנים, טסיות דם, וריכוזים גבוהים של אלבומין וגורמי קרישה. רמות החמצן והחומרים המזינים הן הגבוהות ביותר בדם ויורדות בהדרגה ב-ISF בגלל קליטת התאים, בעוד שפסולת מצטברת ב-ISF לפני כניסה לחזרת הלימפה או הוורידית10. היעדר חלבונים ותאים גדולים ב-ISF תקין ממזער לחץ אונקוטי ומאפשר דיפוזיה מהירה, אך מצבים דלקתיים יכוליםלשנות פרופיל זה באופן חולף.

עם זאת, מחקר ISF נותר מוגבל בשל היעדר שיטות דגימה פשוטות, מהירות ואמינות. השיטות הנוכחיות כוללות טלאי מיקרונידל (MN), שלפוחיות יניקה, יונטופורזה הפוכה, אבלציה תרמית ומיקרודיאליזה. טלאי MN יוצרים מיקרו-ערוצים לחילוץ ISF דרך העור, כאשר וריאנטים של קליפת ליבה מפיקים ISF בפחות מ-30 שניות ו-MN הידרוג'ל אוסמוטי בכ-3 דקות. ניתן לשלב אותם עם חיישנים לניתוח על פי פאץ', אך מוגבלים בנפח ודורשים איזון בין חוזק לנפיחות. שלפוחיות יניקה מספקות ISF טהור עם זיהום דם מינימלי אך פולשניות, כואבות ואיטיות 16,17,18. יונטופורזה הפוכה (RI) עושה שימוש בזרמים חשמליים נמוכים כדי להעביר אנליטים טעונים, כגון יוני גלוקוז וליתיום, אל פני העור לצורך ניטור לא פולשני. עם זאת, הוא מתמודד עם אתגרים כמו תפוקה נמוכה, שונות בין אנשים, וגירוי עור פוטנציאלי19,20. מתן דרך העור (TA) משבש את שכבת הקרנית באמצעות חימום מקומי כדי לאפשר ל-ISF להיכנס באופן פסיבי לתעלות מיקרו-הידרופיליות. למרות שעיצוב המכשיר פשוט יותר, הוא אוסף פחות מ-5 מיקרוליטר נוזל, מה שדורש גילוי רגיש מאוד וניהול תרמי זהיר כדי למנוע כוויות21,22. לעומת זאת, מיקרודיאליזה (MD), המתבססת על דיפוזיה על פני גשואים חדירים למחצה מושתלים, מציעה סלקטיביות מולקולרית ייחודית באמצעות ממברנות חיתוך משקל מולקולרי מתכוונן (MWCO), כגון 10 kDa לגלוקוז ו-100 kDa לחלבונים וציטוקינים23,24. טכניקה זו תומכת בדגימה רציפה וזעיר-פולשנית. עם זאת, MD מורכב מבחינה תפעולית, דורש כיול בתוך החיים, ומציג שיעורי התאוששות משתנים עבור מינים הידרופוביים. ראוי לציין כי MD היא הטכניקה היחידה המסוגלת לבידוד סלקטיבי בגודל של ביומולקולות גדולות25. מחקרים השוואתיים של דיאליזט שנאספו בסמוך לאדוונטיציה וסקולרית לעומת דם מראים פרופילים מובחנים של לקטט וסרוטונין, ובכך מאשרים את היציבות והספציפיות של גישת MD.

מחקרים בבעלי חיים הראו כי, בוויסות סינרגטי על ידי הלב והריאות, ה-ISF יכול לזרום באדוונטיציה הקשורה לעורקים גדולים, ורידים ועצבים היקפיים 5,9. בדרך כלל, ISF מכיל מטבוליטים שמקורם ישירות בפלזמה וכן מסונתזים מקומית ברקמות 26,27,28. לכן, סביר כי החפיפות וההבדלים שזוהו בין מטבוליטים ב-AISF ובפלזמה מייצגים את מעורבות מערכת הדם של ISF בהובלה וניקוי חומרים מזינים ומטבוליטים ברקמות לאורך כלי הדם. הטכניקה המבוססת על מיקרודיאליזה שהוצגה כאן לדגימת AISF תשפר משמעותית את המחקרים על זרימת ה-ISF המערכתית בוויסות חילוף חומרים באיברים ורקמות שונות בגוף.

ממברנת החיתוך במשקל מולקולרי (MWCO) של 20 קילו-דלטון (MWCO) ששימשה במחקר זה תוכננה בצורה מיטבית לשחזור כמותי של מטבוליטים קטנים, כולל גלוקוז, לקטט, פירובט וחומצות אמינו. עם זאת, הוא באופן עקבי מדגימות חסרות או שולל לחלוטין מקרומולקולות ביולוגיות משמעותיות רבות, כגון ציטוקינים, כימוקינים, גורמי גדילה ואנזימים חוץ-תאיים. סקירות קליניות ומתודולוגיות הדגישו כי קטטרים סטנדרטיים של 20kDa יעילים באיסוף מטבוליטים הידרופיליים קטנים, אך הם מציגים שיעורי החלמה חלבונים ומתווכים דלקתיים נמוכים29. כתוצאה מכך, ממברנות עם MWCO גבוהים יותר (למשל, 100 kDa) או אסטרטגיות דגימה חלופיות נחוצות לכימות מדויק של ציטוקינים30,31. לכן, מחקרים עתידיים שנעשו על ידי הקבוצה שלנו ישתמשו בממברנות עם MWCO גדולים יותר כדי לאפיין את הרכב המקרומולקולות של נוזל בין-תחומי היקפיים. במחקר זה נאספו דיאליזטים תחת הרדמה כללית. מיקרודיאליזה אושרה בעבר בבעלי חיים ערים ונעים בחופשיות, ומספר טכניקות מיקרופרפוזיה "זרימה פתוחה" הותאמו לשימוש במודלים מודעים32. עם זאת, התאמת עיצוב הגשוש ופרוטוקול ההשרשה שלנו לשימוש בבעלי חיים ערים תדרוש התמודדות עם אתגרים הקשורים לקשירה, לחץ על בעלי חיים, יציבות הגשוש, ארטיפקטים של תנועה ויכולת עמידה ארוכת טווח. כעת אנו בתהליך פיתוח מערכת קשירה-סיבוב קלה ומתכננים לבצע דגימה מודעת במחקר הבא שלנו.

גילויים

אין ניגודי עניינים פיננסיים שיש לחשוף.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית הלאומית של סין (2025YFC3507601) וקרנות המחקר הבסיסיות למכוני המחקר המרכזיים לרווחת הציבור (מס' ZZ-YC2023007).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת ניטור ECGAD אינסטרומנטס, אוסטרליהPowerLabציוד
מלקחייםF.S.T (FINE SCIENCE TOOLS) גרמניה11252-00כלי ניתוח
הפארין נתרןסיגמא-אלדריץ', ארה"ב9041-08-1חומר
ספקטרומטר מסה טנדם בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC-MS/MS)SCIEX, ארה"בExionLC-20ACציוד
מספריים סטנדרטיים של IRISF.S.T (FINE SCIENCE TOOLS) גרמניה14060-09כלי ניתוח
איזופלוראןמדעי החיים RWD, הרפובליקה העממית של סיןR510-22-10חומר
מערכת ההרדמה בזרימה נמוכהקנט סיינטיפיק, ארה"בSomnoSuiteציוד
נוזל מיקרודיאליזה פרפוזיה T1מיקרודיאליזה CMA, שוודיהP000034חומר
מיקרודיאליזה, 20 אליטמיקרודיאליזה CMA, שוודיה8010436חומר
מזרקי מיקרודיאליזה 1 מ"ל Gastightמיקרודיאליזה CMA, שוודיה8309020חומר
אוסף שברים מקורריםמיקרודיאליזה CMA, שוודיה470ציוד
צינור מפוצל לגלאי CMA 20מיקרודיאליזה CMA, שוודיה8309019חומר
מיקרוסקופ סטריאוסקופיאולימפוס, יפןSZ61ציוד
משאבת מזרקCMA MD AB, שוודיה800310ציוד

מקורות

  1. Reed, R. K., Rubin, K. Transcapillary exchange: role and importance of the interstitial fluid pressure and the extracellular matrix. Cardiovasc Res. 87 (2), 211-217 (2010).
  2. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiol Rev. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  3. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 4 (147), 147ra111(2012).
  4. Jain, R. K. Antiangiogenesis strategies revisited: from starving tumors to alleviating hypoxia. Cancer Cell. 26 (5), 605-622 (2014).
  5. Li, H., et al. Regulation of interstitial fluid flow in adventitia along vasculature by heartbeat and respiration. iScience. 27 (4), 109407(2024).
  6. Clough, G. F. Microdialysis of large molecules. AAPS J. 7 (3), E686-E692 (2005).
  7. Fadnes, H. O., Aukland, K. Protein concentration and colloid osmotic pressure of interstitial fluid collected by the wick technique: Analysis and evaluation of the method. Microvasc Res. 14 (1), 11-25 (1977).
  8. Brinkman, J. E., Dorius, B., Sharma, S. Physiology, body fluids. , StatPearls. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482447/ (2025).
  9. Li, H., et al. Active interfacial dynamic transport of fluid in a network of fibrous connective tissues throughout the whole body. Cell Prolif. 53 (2), e12760(2020).
  10. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Front Neuroanat. 15, 665803(2021).
  11. Hussain, N. M., Amin, B., O'Halloran, M., Elahi, A. Development and characterization of interstitial-fluid-mimicking solutions for pre-clinical assessment of hypoxia. Diagnostics. 13 (19), 3125(2023).
  12. Handly, L. N., Pilko, A., Wollman, R. Paracrine communication maximizes cellular response fidelity in wound signaling. eLife. 4, e09652(2015).
  13. Fan, D., Creemers, E. E., Kassiri, Z. Matrix as an interstitial transport system. Circ Res. , (2014).
  14. Friedel, M., et al. Opportunities and challenges in the diagnostic utility of dermal interstitial fluid. Nat Biomed Eng. 7 (12), 1541-1555 (2023).
  15. Levick, J. R., Michel, C. C. Microvascular fluid exchange and the revised Starling principle. Cardiovasc Res. 87 (2), 198-210 (2010).
  16. Jiang, X., et al. Microneedle-based sampling of dermal interstitial fluid using a vacuum-assisted skin patch. Cell Rep Phys Sci. 5 (6), 101975(2024).
  17. Wu, Z., et al. Interstitial fluid-based wearable biosensors for minimally invasive healthcare and biomedical applications. Commun Mater. 5 (1), 33(2024).
  18. Samant, P. P., Prausnitz, M. R. Mechanisms of sampling interstitial fluid from skin using a microneedle patch. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4583-4588 (2018).
  19. Sieg, A., Guy, R. H., Delgado-Charro, M. B. Electroosmosis in transdermal iontophoresis: implications for non-invasive and calibration-free glucose monitoring. Biophys J. 87 (5), 3344-3350 (2004).
  20. Nair, A. B., Goel, A., Prakash, S., Kumar, A. Therapeutic drug monitoring by reverse iontophoresis. J Basic Clin Pharm. 3 (1), 207-213 (2012).
  21. O'Brien, D. J., et al. A needle-free transdermal patch for sampling interstitial fluid. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (9), 2573-2580 (2023).
  22. Yang, J., et al. Microneedle-integrated sensors for extraction of skin interstitial fluid and metabolic analysis. Int J Mol Sci. 24 (12), 9882(2023).
  23. Stenken, J. A., et al. How minimally invasive is microdialysis sampling? A cautionary note for cytokine collection in human skin and other clinical studies. AAPS J. 12 (1), 73-78 (2009).
  24. Dorothee, S., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (5), 1322-1330 (2024).
  25. Kho, C. M., et al. A review on microdialysis calibration methods: the theory and current related efforts. Mol Neurobiol. 54 (5), 3506-3527 (2017).
  26. Oharazawa, A., et al. Metabolome analyses of skin dialysate: insights into skin interstitial fluid biomarkers. J Dermatol Sci. 114 (3), 141-147 (2024).
  27. Samant, P. P., et al. Sampling interstitial fluid from human skin using a microneedle patch. Sci Transl Med. 12 (571), eaaw0285(2020).
  28. Niedzwiecki, M. M., et al. Human suction blister fluid composition determined using high-resolution metabolomics. Anal Chem. 90 (6), 3786-3792 (2018).
  29. Hillman, J., et al. Microdialysis of cytokines: methodological considerations, scanning electron microscopy, and determination of relative recovery. J Neurosci Methods. 179 (1), 29-33 (2009).
  30. Buchholtz, D. A., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (8), 1942-1951 (2024).
  31. Klein, J., et al. Enhanced microdialysis relative recovery of inflammatory cytokines using antibody-coated microspheres. Anal Chem. 82 (18), 7850-7855 (2010).
  32. Scheller, H., et al. Observational evaluations of mice during cerebral microdialysis for pediatric brain tumor research. PLoS One. 9 (5), e98256(2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

נוזל בין-תאי (ISF) אדוונטיציאליעורק פמורלי של חולדהפרופיל מטבוליניתוח רכיבים ראשיים (PCA)מטבוליטים בעלי משקל מולקולרי נמוךגילוי סמנים ביולוגייםפתופיזיולוגיה של כלי דם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.