Research Article

ניתוח משולב של פרוטאומיה טרנסקריפטומית וסקרטום של תאי אנדותל המונעים על ידי היפרגליקמיה וסינון של תרכובות מטרה

DOI:

10.3791/69578

⸱

December 30th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hebei Luoxue Innovation Medicine Research Institute, 2State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory, 3Hebei University of Chinese Medicine, 4Hebei Medical University, 5Chengde Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה יוצר צינור משולב של מולטי-אומיקס (טרנסקריפטום ופרוטאום) בשילוב עם סקר פרמקולוגי רשתתי לזיהוי מניעים מולקולריים ומטרות טיפוליות לתפקוד לקוי באנדותל בסיבוכי סוכרת.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תפקוד לקוי של האנדותל הוא גורם מרכזי למחלת כליות סוכרתית (DKD), אך המנגנונים המולקולריים המערכתיים שלה נותרו לא מפוענחים לחלוטין. השענו כי ניתוח מולטי-אומיקס משולב יכול למפות נזק לאנדותל הנגרם מהיפרגליקמיה ולזהות טיפולים רב-פעמיים. הוחל צינור חישובי רב-פעמי לשילוב פרופילים טרנסקריפטומיים/סקרטומים מתאי אנדותל היפרגליקמיים וכליות סוכרתיות. זה זיהה 534 גנים/חלבונים שנפוצים עם ויסות גבוה. העשרה פונקציונלית חשפה הפעלה של עיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית, תקשורת בין-תאית ומסלולי דלקת. אימות חוצה מסדי נתונים שיפר 278 מתווכים בעלי ביטחון גבוה, וניתוח רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון זיהה עשרה גנים מרכזיים. באמצעות פרמקולוגיה של רשת, סקרנו ספריית תרופות מאושרת, וזיהינו מספר תרכובות מועמדות (כגון ברוסאנטין, אידלליסיב) שעשויות לכוון לרשת זו. יתרה מזאת, ויסות פקטורי שעתוק וסימולציות עגינה מולקולריות לדוגמה (למשל, idelalisib עם CTCF/BRD4) סיפקו השערות מכניות לאימות ניסוי. לסיכום, מחקר זה מקים מסגרת מולטי-אומיקס רב-פעמית שמגדירה מנגנונים פתוגניים אנדותליים ב-DKD וממנה מועמדים לתרופות ניתנות לשימוש חוזר, ומציע גישה אסטרטגית לגילוי מכני וטיפולי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סוכרת, כאתגר בריאותי עולמי, השפיעה על 529 מיליון אנשים ברחבי העולם בשנת 2021, כאשר תחזיות מצביעות על כך שהיא תשפיע על 1.31 מיליארד אנשים עד 2050. מעבר לשליטה גליקמית, סיבוכים ארוכי טווח הם המקור העיקרי לתחלואה, תמותה וירידה באיכות החיים. אלה כוללים סיבוכים מיקרווסקולריים (למשל, מחלת כליות סוכרתית (DKD), רטינופתיה, נוירופתיה) וסיבוכים מקרווסקולריים (למשל, טרשת עורקים מואצת). באופן קריטי, DKD משפיע על 30%-40% מחולי סוכרת, מה שמהווה את הגורם המוביל למחלת כליות סופית (ESRD) בעולם. הנטל העמוק של סיבוכים אלו מדגיש צורך דחוף ובלתי מסופק בטיפולים חדשניים המכוונים למנגנונים הבסיסיים שלהם.

תאי אנדותל (ECs), המרכיבים את הרירית הפנימית של כל כלי הדם, הם שומרי הסף המרכזיים של בריאות כלי הדם. הפרעת תפקוד האנדותליאלי הנגרמת מהיפרגליקמיה פועלת כגורם מרכזי לווסקולופתיה סוכרתית ולנזק לאיברים 3,4. רמות גבוהות של גלוקוז מעוררות שרשרת של תגובות לא מותאמות בתוך ECs, הכוללות זמינות ביולוגית של חנקן אוקסיד (NO) לא מווסת, הפרשת אנדותלין-1 (ET-1) מוגברת, ביטוי מולקולות הידבקות מוגבר (כגון VCAM-1, ICAM-1), לחץ חמצוני מוגבר עקב ייצור מופרז של מיני חמצן תגובתי (ROS) (למשל, באמצעות NADPH אוקסידאזות), ודלקת נמוכה מתמשכת 3,4. יחד, שינויים אלו גורמים להרחבת כלי דם פגועה, להגברת חדירות כלי הדם, להידבקות וחדירת לויקוציטים, למצבים פרו-תרומבוטיים, ולבסוף לעיצוב כלי דם5. בתוך מיקרו-כלי דם בכליות, נזק אנדותליאלי גלומרולרלי משבש את מחסום הסינון, מקדם אלבומינוריה ותורם ישירות להצטברות מטריצה חוץ-תאית (ECM), גלומרולוסקלרוזיס ופיברוזיס טובולואינטרסטיציאלי 5,6. ההפעלה הבאה של תאי הכליה התושבים, יחד עם זרימת תאים דלקתיים, יוצרת מעגל קסמים שמגביר פגיעה בכליה 5,7. חשוב לציין, מחקרים קליניים מראים שסמנים לתפקוד לקוי של אנדותל מערכתית קשורים בקשר חזק עם הופעת והתקדמות אלבומינוריה וירידה בקצב הסינון הגלומרולי (GFR) אצל חולי סוכרת 6,7,8, מה שמדגיש את הרלוונטיות הישירה שלו לתוצאות מחלות אנושיות. למרות מרכזיותה המוכרת, הבנה מקיפה ברמת מערכת של התכנות מחדש המדויק של שעתוק והפרשה שנגרם על ידי היפרגליקמיה כרונית ב-ECs - במיוחד שינויים המניעים את עיצוב מחדש של ECM, מפתח לפיברוזיס כלייתי - נותרת מאופיינת באופן חלקי, ומגבילה את זיהוי מטרות טיפוליות חדשות ומכניות ל-DKD וסיבוכים וסקולריים סוכרתייםאחרים 7,8.

המורכבות המולקולרית העמוקה שמאחורי תפקוד לקוי באנדותל בסוכרת מציבה אתגר משמעותי לגישות טיפוליות מסורתיות ממוקדות מטרה יחידה. כאן מתגלים ביולוגיה חישובית וביואינפורמטיקה ככלים חיוניים, המאפשרים אינטגרציה וכרייה של מאגרי נתוני אומיקס מגוונים ובעלי ממדים גבוהים, כדי לתת עדיפות למרכזים סיבתיים בתוך רשתות פתולוגיות ולזהותאסטרטגיות טיפוליות רב-מטרה 9. קריטית, גישות חד-מודליות קונבנציונליות (למשל, טרנסקריפטום/פרוטאום בלבד או סקר פרמקולוגי) לעיתים קרובות מפספסות אינטראקציה קריטית בין שכבות מולקולריות (למשל, ביטוי גנים, דינמיקת חלבונים, תגובת תרופות), ואינן מצליחות ללכוד מניעים סינרגטיים או השפעות לא מדויקות10,11. צינור המולטי-אומיקס המשולב מתגבר על מגבלות אלו על ידי פרופיל מקביל של נתונים טרנסקריפטומיים, סקרטומיים ופרמקולוגיים בתוך אותה מערכת, ויוצר תפיסת מנגנון מחלה הוליסטי. פרמקולוגיה רשתית, אלגוריתמים לחיזוי ליגנדים/מטרות, ועגינה מולקולרית בסיליקו מאפשרים חקירה שיטתית של ספריות תרופות מאושרות, ומאיצים את מיקום או גילוי תרכובות המסוגלות לנטרל חתימות מחלה מורכבות3. שינוי פרדיגמה זה טומן בחובו פוטנציאל מיוחד לזיהוי טיפולים המתמקדים בדיסרגולציה אנדותלית ובהשלכותיו המיקרווסקולריות ההרסניות, כגון DKD, ומציע פוטנציאל ליעילות משופרת ולהפחתת פרופילי תופעות לוואי. שילוב של ניתוחים טרנסקריפטומיים/סקרטומיים של תאי אנדותל חשופים להיפרגליקמיה זיהה 534 מולקולות שנפוצות לוויסות גבוהים. העשרה פונקציונלית כללה שינוי מטריצת חוץ-תאית, לחץ חמצוני ודלקת בפתוגנזה מוקדמת של DKD. ניתוח חוצה מסדי נתונים נתן עדיפות ל-278 יעדים בעלי ביטחון גבוה, שעובדו באמצעות רשתות PPI של גנים מרכזיים. סקר פרמקולוגי רשת של תרופות מאושרות חזה 85 תרכובות מועמדות (כולל ברפלדין-A, ברוסאנטין, פאראצטמול ואידלליסיב) המיועדות למרכזים אלו. בחיזוי פקטורי שעתוק סילקו ועגינה חקרו מנגנונים. העבודה הזו מגדירה את המניעים האנדותליים של DKD, יוצרת מסלול גילוי חישובי ומספקת מועמדים טיפוליים לאישור. בסופו של דבר, מסלול זה צפוי לקדם תוכניות גילוי טיפוליות לסיבוכי סוכרת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור ועדת מחקר ואתיקה בבעלי חיים של מכון המחקר הרפואי יילינג של חביי (מספר אישור: N2024082). בדקו את טבלת החומרים לחומרים הניסיוניים והכלים ששימשו במחקר זה. הצוות חייב ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים בעת טיפול בתגובות מסוכנות כגון טריזול (מגרה לעור/עיניים, מכיל פנול) ומעכבי פרוטאז (רגישים לנשימה/עור). הפרדו פסולת ביולוגית/נוזלית בשקיות אוטוקלביות, ופסולת כימית מסוכנת במיכלים ייעודיים לטיפול מסוכנ מוסדי. לנקות את הצרכנים לפני ההשלכה.

מידול עכברים של נפרופתיה סוכרתית

העכברים הזכרים db/db ו-db/m (בני 12 שבועות) נשמרו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF) בטמפרטורה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס ולחות 56% ± 5% עם מחזורי אור/חושך של 12 שעות וגישה חופשית למזון/מים. לאחר תקופת הסתגלות של שבוע, העכברים הוקצו באקראי מזהים מספריים והוקצו לקבוצות ניסוי. העכברים מסוג db/db קיבלו תזונה עשירה בחלבון במשך 6 שבועות כדי לבסס DKD. המודלים המוצלחים אושרו על ידי יחס אלבומין לקריאטינין בשתן (UACR) גבוה משמעותית לעומת ביקורת db/m, כאשר UACR >30 מ"ג/גרם שימש כסמן הביו-תפקודי הראשי ל-DKD12 מוקדם.

מידול תאי אנדותל בעלי גלוקוז גבוה

תאי אנדותל גלומרולריים של הכליה (HRGECs) הוכנו בתנאים סטנדרטיים. HRGECs גודלו במדיום גלוקוז תקין (NG, 5.5 mM D-glucose) או גלוקוז גבוה (HG, 30 mM D-glucose) ונשמרו באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2. התאים נחשפו ללא הפסקה ל-HG או גדלו בתנאי ביקורת במשך 24 שעות לפני ניתוחים במורד הזרם. יש לכלול בקרה אוסמוטית (HM, המכילה 5.5 mM D-גלוקוז עם 24.5 mM מניטול). כל התנאים צריכים לעמוד בקריטריונים מחמירים לכושר התאים: הקיימות נשארה ≥85%, רמות האפופטוזיס נשארו מתחת ל-15%, עלייה ב-ROS ב-HG בהשוואה ל-HM לא עלתה על 20%, ושחרור LDH נשאר מתחת ל-10%, מה שמאשר שלמות תאית לפני ניתוחים בהמשך.

אוסף מדיה מותנה

מדיה מותנית (CM) נאספה באמצעות פרוטוקול סטנדרטי לניתוח סקרטום13 עם שינויים. לאחר 24 שעות של גירוי גבוה של גלוקוז גבוה (30 מ"מ D-גלוקוז), גלוקוז תקין (5.5 מ"מ D-גלוקוז) או בקרה אוסמוטית (5.5 מ"מ D-גלוקוז + 24.5 מ"מ מ"מ מניטול), נשטפו HRGECs עם מי מלח סטריליים מפושט-פוספט (PBS) להסרת חלבוני סרום שנותרו. התאים מולאו במדיום בסיסי אנדותליאלי ללא סרום, פנול אדום, ודגרו במשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ לצורך צבירת גורמים מופרשים.

ה-CM נקטף באמצעות צינורות צנטריפוגה מקוררים מראש. בהמשך, עיבוד הדגימה בוצע כפי שמתואר להלן.

הבהרה ראשית: CM הועבר לצינורות חרוטיים ללא RNase/DNase וצונטריפוגה בעוצמה של 3,000 x g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הפסולת הכדורית הושלכה.

עיכוב פרוטאז: בתוך 2 דקות מהבהרה ראשונית, נוסף קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA לריכוז סופי פי 1 (1:50) שכלל 1x מעכבי פוספטאז.

ריכוז: הסופרנטנט נטען מיד למסנני PBS צנטריפוגליים שטופים מראש (3 kDa MWCO) וצנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 90 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להגיע לריכוז פי 10.

הבהרה משנית: הריכוז הועבר לצינורות מיקרוצנטריפוגות מקוררות מראש וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. סופרנטנט נאסף, תוך הימנעות מגרגטים עם כדורים.

אחסון: אליקווטים בנפח של 50 מיקרוליטר נעשו בקריוביאלים סטריליים עם קישור חלבון נמוך. הבקבוקים הוקפאו במהירות בחנקן נוזלי תוך 30 דקות מסיום הקציר. הבקבוקים אוחסנו בטמפרטורה של -80°C (ללא מחזורי הקפאה-הפשרה).

אצוות CM עברו בדיקות אנדוטוקסין (<0.25 EU/mL). פרוטוקול האינקובציה ללא סרום לא הראה השראה למתח (מאומת על ידי אימונובלוטים HSP70/CHOP). תפוקת חלבון CM התאזנה לספירת תאים/תכולת DNA ברי קיימא בקציר. קפדנות העיבוד נשמרת: טכניקת סטרילית לאורך כל הדרך; ≤חלון קציר עד הקפאה: 30 דקות; איזון טמפרטורת הרוטור אושר.

בדיקת CCK-8 של תאי כליה צינוריים מטופלים במדיה מותנית

כדי להעריך את ההשפעה הפונקציונלית של הסקרטום האנדותליאלי על חיוניות תאי הצינורית של הכליה, בוצעה בדיקת CCK-8 על קו התאים האפיתל הצינוריים הפרוקסימלי האנושי HK-2 שטופלו ב-CM שמקורו בתאי אנדותל גלומרולריים של הכליה (HRGECs) בבני אדם, בהתאם לפרוטוקולים שנקבעו. תאי HK-2 תרבדו במדיום DMEM שהושלמו עם סרום בקר עוברי (FBS) של 10%. לבדיקה, תאים הוזרעו ללוחות של 96 בארות בצפיפות של 5 על 10³ תאים לכל באר. רעב תאי סרום בוצע במשך 12 שעות במדיום שהכיל 0.5% FBS מיד לפני הטיפול ב-CM.

CM הוחל עם מסת חלבון מנורמלת שווה בסך הכול. אליקווטים קפואים של CM הופשרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט יבש (<5 דקות) והוברו בצנטריפוגציה בעוצמה של 10,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. תאי HK-2 (100 מיקרוליטר/באר) טופלו ב-HG-CM, NG-CM או HM-CM, ונרמלו לתכולת חלבון/DNA תואמת. בסך הכל הוכנו 3 שכפולים ביולוגיים לכל תנאי (עם 3 שכפולים טכניים כל אחד). הדגימות נדגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ במשך 24 שעות. הערכה שקיימות התאים הוערכה באמצעות ערכת ספירת תאים-8. לשם כך, נוספו 10 מיקרוליטר של תמיסת CCK-8 לכל באר ודגרו במשך 1-4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. הכדאיות חושבה כך:

כדאיות (%) = [(A_sample - A_blank) / (A_baseline_control - A_blank)] x 100

זיהוי מאמץ חמצוני

רמות המלונדיאלדהיד התאית (MDA) נמדדו, אחד התוצרים המרכזיים של פרוקסידציה של ליפידים בממברנה, באמצעות בדיקת TBA. ליזטים של תאים (1 x10 7 תאים) הובהרו על ידי צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 15 דקות, ולאחר מכן 0.02 מ"ל סופרנטנט הוזרק לצינורות הדגימה לצד 0.02 מ"ל של תקני MDA. לאליקווט נוספו 0.02 מ"ל מבהיר ו-0.6 מ"ל של תגובת חומצה. הדגימות/התקנים טופלו ב-0.2 מ"ל של הסוכן הכרומוגני (צינורות בקרה: נוספו 0.2 מ"ל של 50% חומצה אצטית). לאחר איטום, ערבוב ודגירה ב-100 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות, הדגימות צונרו ואז צונטריפוגות בטמפרטורה של 9569 x g למשך 10 דקות. הסופרנטנט הועבר למיקרופלטות בנפח 250 מיקרוליטר למדידת OD₅₃₂.

פרופילינג טרנסקריפטומי

סך ה-RNA בודד באמצעות תגובת טריזול בהתאם לפרוטוקול היצרן. כמות ה-RNA והטוהר הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטר ומנתח קטעים, בהתאמה. רק דגימות RNA איכותיות שימשו עם מספר שלמות RNA (RIN) > 7.0 לבניית ספריית ריצוף.

mRNA פוליאדנילאט (poly(A)+) הועשר בשני סבבים של ברירה מגנטית מבוססת חרוזים אוליגו(dT). ה-mRNA המטוהר פורק ל-200-300 נוקלאוטידים באמצעות ערכת פירוק מבוססת מגנזיום בטמפרטורה של 94°C למשך 5-7 דקות. סינתזת cDNA בגדיל ראשון בוצעה באמצעות טרנסקריפטאז הפוך, ולאחר מכן סינתזת cDNA של גדיל שני באמצעות E . coli DNA polymerase I ו-RNase H בנוכחות dUTP (לאפשר ספציפיות של גדיל). השלבים הבאים כללו תיקון קצה, חיבור A-tailing, קישור מתאם ובחירת גודל באמצעות חרוזים מגנטיים. לפני הגברת ה-PCR, הגדיל השני המשולב ב-dUTP עוכל באמצעות אנזים UDG.

נבנתה ספרייה ייעודית לגדיל עם גודל הinsert הממוצע של 400 ±-50 bp באמצעות PCR בתנאים הבאים: דנאטורציה ראשונית ב-98 °C למשך דקה; 14 מחזורי דנאטורציה ב-98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, חישוש ב-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; והארכה אחרונה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. רצף זוגות של 150 bp בוצע על פלטפורמת Illumina, עם עומק רצף של ≥40 מיליון קריאות לדגימה (Q30 > 85%).

ניתוח ביואינפורמטי של נתונים טרנסקריפטומיים

בדיקת איכות של הקריאות הגולמיות בוצעה באמצעות FastQC (v0.11.8), ובוצעה יישור לגנום הייחוס GRCh38.p13 עם HISAT2 (v2.2.1). כימות תמלול והרכבת תמלול לפי דגימה בוצעו באמצעות StringTie (v2.1.6) עם פרמטרים ברירת מחדל. כל הטרנסקריפטומים שהורכבו אוחדו מדגימות בודדות כדי לשחזר טרנסקריפטום מקיף באמצעות תוכנת gffcompare (v0.12.6; gffcompare הוא כלי עצמאי, שאינו חלק מ-StringTie, וגרסתו מתוקנת לגרסה היציבה המשותפת). ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בוצע עם DESeq2 (v1.38.3) תוך שימוש בספים של |log2 שינוי קפלים (FC)| > 1 ושיעור גילוי שגוי (FDR) < 0.05. אפקטי אצווה תוקנו באמצעות חבילת variancePartition.

אנליזה פרוטאומית סקרטום

CM נאסף מ-HRGECs שגודלו בתנאי בקרה NG, HG או HM באמצעות שיטה13 שתוארה קודם עם שינויים לניתוח סקרטום. התאים נשטפו עם PBS לאחר גירוי והוסטו במדיום ללא סרום למשך 12 שעות. CM נאסף וצנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 10 דקות (4 מעלות צלזיוס).

כמויות שוות של פפטיד מכל דגימה מעורבבות ואז מדוללות עם ממס A (5% ACN, pH 9.8) והוזרקו לעמודה. הפרקציה של תערובת הפפטידים בוצעה באמצעות עמודה 3.5 מיקרון בגודל 4.6 x 150 300Extend- C18 במערכת ההפרדה המהירה הבינארית. הסרת גרדיאנט בוצעה בקצב זרימה של 0.3 מ"ל לדקה: 5% עד 21% ממס B (97% ACN, pH 9.8) ב-38 דקות, 21.5% עד 40% ממס B ב-20 דקות, 40% עד 90% ממס B ב-2 דקות, 90% ממס B למשך 3 דקות, ו-5% ממס B מאוזן במשך 10 דקות. שיאי ההשקה נעקבו ב-214 ננומטר, ונאספו חלקים בכל דקה. החלקים שולבו לפי כרומטוגרמות של פסגות ההסרה. בסך הכל נאספו 10 חלקים, אשר יובשו בהקפאה.

הוכנו שלבים ניידים A (100% מים, 0.1% חומצה פורמית) ו-B (80% אצטוניטריל), ודגימות הפפטיד היבשות שוחזרו עם 0.1% חומצה פורמית וצונטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך 10 דקות. ההפרדה בוצעה באמצעות מערכת פאזה נוזלית UHPLC. הדגימות הוזנו לעמודת HPLC ES906 (150 מ"מ) עם שיפוע של 8 דקות ב-2.5 מיקרוליטר/דקה, והופרדו עם הגרדיאנט האפקטיבי הבא: 0-4 דקות, 4% ניידות פאזה B עם עלייה ליניארית עד 25%; 4-6.9 דקות, שלב B הנייד עולה ליניארית מ-25% ל-35%; 6.9-7.3 דקות, שלב B הנייד עולה ליניארית מ-35% ל-99%; 7.3-8.0 דקות, שמר על שלב B הנייד ב-99%. הפפטידים המופרדים בשלב נוזלי הועברו לספקטרומטר מסה לרכישת מצב DIA. הפרמטרים העיקריים נקבעו כך: אנרגיית התנגשות מנורמלת 25%, מצב טעינה ברירת מחדל 2, רזולוציה 240,000, סריקה כל 0.6 שניות, טווח סריקה של 380-980 מ'/z, ספקטרומטריית מסה AGC 500%. סריקות יוני שבר תועדו עם זמן סריקה מקסימלי של 3 מילישניות והשתמשו ב-300 חלונות סריקה 2-Th, שנעים בין 380 ל-980 מ"ר.

ה-DIA-NN (https://www.nature.com/articles/s41592-019-0638-x, גרסה 1.9.1) שימש לניתוח נתוני ה-DIA בשיטה ללא ספרייה. נתוני MS/MS נבדקו מול רצפי חלבונים, שהורדו ממאגר Uniprot עם ההגדרות הבאות: אנזים: Trypsin/P; החמצות מקסימליות: 2; שינוי קבוע: קרבימידומתיל (C); שינויים משתנים: חמצון (M) ואצטיל (מונח N חלבון); סבילות מסה לקדם: 20 ppm; סבילות מסה למקטעים: 0.05 דליברטון. התוצאות סוננו על ידי 1% FDR, ורק קבוצות חלבון שעברו את קריטריון הסינון הזה בניתוח במורד הזרם.

ניתוח העשרה פונקציונלית של אומיקס (GO, KEGG ו-GSEA)

ניתוחי העשרה פונקציונלית בוצעו על קבוצות מסוננות של גנים מבוטאים באופן שונה (טרנסקריפטומיקס) וחלבונים (פרוטאומיקס סקרטום), בהתאם לצינורות ביואינפורמטיקה מבוססים. מזהים מופו באמצעות Org.Hs.eg.db. העשרת GO (תהליכים ביולוגיים, פונקציות מולקולריות, רכיבים תאיים) בוצעה באמצעות clusterProfiler. בנג'מיני-הוכברג התאימה את ערך ה-p < 0.05, והפחתת דמיון סמנטי (cutoff=0.7) יושמה על מונחים מעובים. ניתוח מסלולי KEGG בוצע באמצעות KEGG REST API (שחרור 2023). בדיקות היפרגיאומטריות שימשו יחד עם תיקון יקוטיאלי FDR. ויזואליזציה של טופולוגיית מסלולים בוצעה באמצעות Pathview. GSEA יושם בגישה מבוססת דרגה עם דירוג גנים בין אות לרעש. בוצע העשרת בדיקות מול אוספי MSigDB (HALLMARK, C2, C5; v2023.2) וחתימות אנדותליות סוכרתיות מאוצרות. המובהקות הוערכה לאחר 1000 פרמוטציות פנוטיפ (FDR < 25%).

ניתוח רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון

כדי לזהות רגולטורים מולקולריים מרכזיים במאגר המועמדים הפתוגיים, בוצעו בניית רשת PPI וניתוח טופולוגי באמצעות תהליך חישובי משולב. 278 הגנים המועמדים הוגשו למסד הנתונים STRING (גרסה 12.0; הומו ספיינס; מקורות הראיות כללו מאגרי מידע ניסיוניים, ביטוי משותף ומאגרי מידע נבחרים; סף ביטחון אינטראקציה (ציון משולב) >0.7 לקצוות בעלי ביטחון גבוה; ואין אינפלציה נוספת של אינטראקטורים. התוצאות יובאו ל-Cytoscape (v3.9.1), וניתוח טופולוגיית רשת בוצע באמצעות תוספים MCODE (v1.5.2) ו-CytoHubba (v0.4.1). לאחר מכן, הרשת עברה אופטימיזציה ויזואלית בהתאם למידת החיבור של הצמתים, כך שצמתים עם קישוריות גבוהה יהיו כהים יותר, גדולים יותר בגודלם ובולטים יותר בתווית.

פיתוח קבוצת גנים מטרה למחלת כליות סוכרתית

הקריטריונים ל-mRNAs/חלבונים משותפים הוגדרו כך: טרנסקריפטום (FDR < 0.05 ו-|log2FC| > 1) וסקרטום (FDR < 0.01 ו-|log2FC| > 1.5). שמות החלבונים והגנים ננורמו באמצעות UniProt והומרו לפורמט מאוחד (סמל גן). מערך גנים מטרה נבנה למחלת כליות סוכרתית על ידי שילוב גנים הקשורים למחלה ממספר מאגרי מידע ציבוריים, כולל GeneCards (גרסה 5.25, מונח שאילתה: נפרופתיות סוכרתיות, תאריך גישה יולי 2025), מאגר הנתונים השוואתי לטוקסיגנומיקה (CTD; https://ctdbase.org/, מונח השאילתה: נפרופתיות סוכרתיות, תאריך גישה ביולי 2025), ופלטפורמת Open Targets (https://platform.opentargets.org/, גרסה 0.13.8, מונח שאילתה: נפרופתיות סוכרתיות, תאריך גישה ביולי 2025)13, 14, 15. מערך זה הוגדר כסט הפניות המקיף למחלות כליות סוכרתיות. החיתוך בין mRNA/חלבונים משותפים לבין סט גנים זה זוהה לניתוחים בהמשך.

זיהוי חלבון CCL2

כדי לכמת את CCL2, לוח של 96 בארות צופה בנוגדן לכידה (100 מיקרוליטר/באר) ודגרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת, הצלחת נשטפה ב-2x עם בופר ונחסמה עם מדלל ELISA (200 מיקרוליטר/באר) למשך שעה אחת ב-RT. עקומת תקן בת 7 נקודות הוכנה על ידי דילול סדרתי דו-כפול של תקן S1, ואז נוספו הדגימות (100 מיקרוליטר/באר) ודגרו במשך שעתיים ב-400 סל"ד. לאחר שטיפה 5x, נוספו נוגדנים לזיהוי (100 מיקרוליטר/באר) ודגרו במשך שעה אחת במהירות 400 סל"ד, לאחר מכן הוספת תמיסת אנזימים (100 מיקרוליטר/באר) ודגירה למשך 30 דקות ב-400 סל"ד. הדגימות פותחו עם מצע TMB (15-30 דקות, RT). התגובה נעצרה עם חומצה (100 מיקרוליטר/באר), והספיגה נקראה ב-450 ננומטר (620 ננומטר אופציונלי). השלבים המרכזיים כוללים שטיפה קפדנית, דגירות מתוזמנות ודילול סטנדרטי להבטחת שחזוריות.

מיקום מחדש של תרופות

תרכובות טיפוליות נחזו באמצעות הפלטפורמה הבאה: מנוע החיפוש LINCS L1000 Characteristic Direction Signatures (L1000CDS2; https://maayanlab.cloud/L1000CDS2). פלטפורמה זו משתמשת בשיטת MODZ ובניתוח כיוון מאפיין לזיהוי מולקולות קטנות או שילובי תרכובות המסוגלות להפוך או לחקות חתימות ביטוי גנים קלט16. התרופות המועמדות זוהו כאלו שמבטאות את הדיסרגולציה של גנים כלייתיים המובעים באופן שונה באמצעות פלטפורמה זו. התרכובות דורגו על פי ציוני ההיפוך שלהן בקווי תאי כליות לפי כליות נבחרות בעמודת הרקמה, והמועמדים המדורגים ביותר עברו עגינה מולקולרית כדי להעריך את הזיקה שלהן ליעדי החלבונים המרכזיים.

סקר פקטורי שעתוק רגולטורי משותף

מאגר הנתונים hTFtarget נבדק לגבי קישור TFs רגולטורי משותף למערך הגנים. מאגר hTFtarget נותח לזיהוי קשרי גנים בין גורמי השעתוק האנושיים (TF) למטרה על ידי ניתוח חישובי של מאגרי נתוני ChIP-Seq בקנה מידה גדול בתאים, רקמות ותנאים מגוונים. הצינור האינטגרטיבי שילב אותות שיא ChIP-Seq עם הקשר אפיגנטי כדי לאתר קישור TF במקדמים/משפרים, תוך התחשבות מפורשת בדינמיקת רגולציה מרחבית-זמנית. כפי שהראו ג'אנג ואחרים, הוא שימש כפלטפורמה רב-ממדית שאפשרה חקר מטרות TF או רגולטורים גנטיים, המחשת נתוני ChIP-Seq, חקירת שיתופיות TF וחיזוי אתרי קישור17.

צינור חישובי וניתוח לעגינת מולקולות קטנות וחלבון

AutoDock Vina 1.2.018 שימש לביצוע ניתוח עגינה מולקולרית של אינטראקציות קישור בין רכיבים פעילים לבין גורמי השעתוק BRD4, CTCF, EP300 ו-SPI1. מבני הגביש של BRD4 (מזהה PDB: 7REK), CTCF (מזהה PDB: 5K5I), EP300 (מזהה PDB: 5NU5) ו-SPI1 (מזהה PDB: 8E3K) התקבלו מבנק נתוני החלבונים (https://www.rcsb.org/)19,20. מבני מולקולות קטנות בפורמט SDF הורדו ממסד הנתונים PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 21), הומר לפורמט MOL2 באמצעות Open Babel 2.4.1, ומזעורבו אנרגיה באמצעות PyRx 0.8. עיבוד מוקדם של חלבונים נעשה על ידי הסרת מולקולות מים, הוספת אטומי מימן, חישוב מטעני גסטייגר והמרתם לפורמט PDBQT (נדרש ל-AutoDock Vina). שימשה אסטרטגיית עגינה חצי-גמישה, שהגדירה את מיקום ומידות רשת העגינה בהתבסס על אתרי הקישור של ליגנדים מתגבשים יחד בכל חלבון. MA9-086 משמש כליגנד בקרה חיובית עבור BRD4, ו-XDM-CBP עבור EP300. עבור CTCF ו-SPI1 (ללא ליגנדים חיוביים ידועים), זוהו כיסי קישור פוטנציאליים באמצעות ניתוח מבני באמצעות פלטפורמת Proteins Plus המקוונת (https://proteins.plus/). פרמטרי רשת העגינה נקבעו כך (קואורדינטות ומימדים ב-Å לאורך צירי x, y ו-z): מרכז BRD4 ב-(-11.907, -8.617, -3.973) עם גודל קופסה (18.387, 18.387, 18.387); מרכז CTCF ב-(15.165, 4.854, 6.388) וגודל קופסה (17.25, 20.25, 9.75); EP300 במרכז (39.781, 5.326, 9.998) וגודל קופסה (16.516, 16.516, 16.516); SPI1 במרכז (3.155, -3.853, 0.668) וגודל הקופסה (17.25, 25.5, 10.5). במהלך העגינה, טווח האנרגיה הוגדר ל-3, פרמטר המיצוי ל-8, והמרחק בין הרשת ל-0.375 Å. יציבות הקשר הוערכה מאנרגיית קשר, שבה ערכים נמוכים מעידים על קונפורמציות יציבות יותר והסתברות אינטראקציה גבוהה יותר, עם סף של <-5 קקלוריות/מול המוגדר כפעילות קשירהחזקה 22,23. לבסוף, זוהו מצבי אינטראקציה בין תרכובות לקולטנים באמצעות PyMOL.

ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. מבחנים סטטיסטיים נבחרו על בסיס נורמליות (שפירו-וילק) והומוגניות שונות (מבחן לוון). מבחני t לא זוגיים (שתי קבוצות) או ANOVA חד-כיווני עם מבחני פוסט-הוק LSD (≥3 קבוצות) שימשו להשוואות בין קבוצות. p < 0.05 הוגדר כסף מובהקות. גרפים נוצרו באמצעות GraphPad Prism 9.0.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדגמה של ההשפעה הפתוגנית של הסקרטום האנדותליאלי ההיפרגליקמי על צינורות הכליה

מחקר זה החל באימות ההשפעה הפתוגנית של הסקרטום האנדותלי ההיפרגליקמי. מדיום מותנה מתאי אנדותל גומרולריים אנושיים היפרגליקמיים (HG-CM) פגע משמעותית בחיוניות תאי אפיתל פרוקסימליים של הצינורות האנושיים (HK-2) בהשוואה לקבוצות הביקורת.

בהתבסס על ראיות פונקציונליות זו, בוצעו ניתוחים מ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה קובע כי תפקוד לקוי של הסקרטום האנדותליאלי הנגרמת מהיפרגליקמיה הוא גורם קריטי לפגיעת כליות סוכרתית באמצעות גישות משולבות מולטי-אומיקס וחישוביות. הדגמה כי ציטוטוקסיות המתווכת על ידי הסקרטום כלפי צינורות הכליה מתרחשת במקביל לדיסרגולציה שיטתית של 534 גורמים שמקורם באנדותליה, המתכנסים לשינויי מטריצה, לחץ חמצוני ומסלולי ליבת דלקת בפתוגנזה של DKD. זיהוי 278 מתווכים בעלי ביטחון גבוה, כולל מרכזים מאומתים מכנית CCL2, VWF, SERPINE1 ו-THBS1 (המציגים קו-אפוגולציה של 1.15 עד 2630 פעמים), פותר ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32200644), פרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של חביי (246W2501D, 252W7716D) ופלטפורמת הזהב יאנזאו (A20240022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ערכת CCL2 ELISAתרמו פישר סיינטיפיק#88-7399-88
מעכב CCR2מרק מיליפור#227016
ערכת בדיקת כחיות תאיםשבעה ביוטכנולוגיהCCK-8, SC119-01
סיקוונסר DNAאילומינהNovaSeq 6000
מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהיםתרמו פישר סיינטיפיקאולטימייט 3000 בינארי RSLC
מדיום התרבות של HRGECשנגחאי ג'ונג צ'יאו שין ג'ואו ביוטכנולוגיה בע"מ.1001
תאי אנדותל גלומרולריים של הכליה (HRGECs)ביוטכנולוגיה של שנגחאי ג'ונגצ'יאו שינז'ואוPRI-H-00038
תא אפיתל צינורי של הכליה האנושית מדיום מלא  פרוסלCM-H193
תאי אפיתל צינוריים של הכליה (HK2)פרוסלCP-H193
עכברים זכרים עם db/db ו-db/m (בן 4 שבועות)חברת האנגג'ואו זיואן ביוטכנולוגיה בע"מ.SCXK 20190004
ספקטרומטר מסהתרמו פישר סיינטיפיקאסטרל
קורא ספיגת מיקרופלטמכשירים מולקולרייםספקטרמקס iD5
קוקטייל מעכב פרוטאז (ללא EDTA)רושקומפלטה, #5056489001
תגובת חילוץ RNAתרמו פישר סיינטיפיקטריזול, #15596026
מנתח איכות RNAאג'ילנט טכנולוגיותמנתח קטעים 5300, M5311AA
מכשיר כימות RNAתרמו פישר סיינטיפיקקיוביט 3.0, Q33216
ערכת זיהוי ROSתרמו פישר סיינטיפיק#EEA019
התקני אולטרה-פילטרציה צנטריפוגליים (3 kDa MWCO)מרק מיליפוראמיקון אולטרה-4

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuttle, K. R., et al. Diabetic kidney disease: a report from an ADA Consensus Conference. Diabetes Care. 37 (10), 2864-2883 (2014).
  2. Gu, H. F. Genetic and Epigenetic Studies in Diabetic Kidney Disease. Front Genet. 10, 507(2019).
  3. Młynarska, E., et al. Novel Insights into Diabetic Kidney Disease. Int J Mol Sci. 25 (18), (2024).
  4. Tanase, D. M., et al. Oxidative Stress and NRF2/KEAP1/ARE Pathway in Diabetic Kidney Disease (DKD): New Perspectives. Biomolecules. 12 (9), (2022).
  5. Li, S., et al. Research progress on extracellular vesicles in the renal tubular injury of diabetic kidney disease. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1257430(2023).
  6. Chen, Y., et al. ANGPT2/CAV1 regulates albumin transcytosis of glomerular endothelial cells under high glucose exposure and is impaired by losartan. Nefrologia (Engl Ed). 44 (1), 50-60 (2024).
  7. Chae, S. Y., Kim, Y., Park, C. W. Oxidative Stress Induced by Lipotoxicity and Renal Hypoxia in Diabetic Kidney Disease and Possible Therapeutic Interventions: Targeting the Lipid Metabolism and Hypoxia. Antioxidants. 12 (12), (2023).
  8. Wang, X., et al. CERS6-derived ceramides aggravate kidney fibrosis by inhibiting PINK1-mediated mitophagy in diabetic kidney disease. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (2), C538-C549 (2023).
  9. Zou, Y., et al. Development and internal validation of machine learning algorithms for end-stage renal disease risk prediction model of people with type 2 diabetes mellitus and diabetic kidney disease. Ren Fail. 44 (1), 562-570 (2022).
  10. Ma, L., et al. Baicalin Alleviates Oxidative Stress and Inflammation in Diabetic Nephropathy via Nrf2 and MAPK Signaling Pathway. Drug Des Devel Ther. 15, 3207-3221 (2021).
  11. Du, L., et al. Inhibition of S100A8/A9 ameliorates renal interstitial fibrosis in diabetic nephropathy. Metabolism. 144, 155376(2023).
  12. Imafuku, T., et al. Cysteinylated Albumin as a Potential Biomarker for the Progression of Kidney Disease in Patients With Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 44 (6), e115-e117 (2021).
  13. Ochoa, D., et al. The next-generation Open Targets Platform: reimagined, redesigned, rebuilt. Nuc Acids Res. 51 (D1), D1353-D1359 (2023).
  14. Safran, M., et al. GeneCards Version 3: the human gene integrator. Database (Oxford). 2010, baq020(2010).
  15. Davis, A. P., et al. Comparative Toxicogenomics Database (CTD): update 2023. Nucl Acids Res. 51 (D1), D1257-D2126 (2023).
  16. Duan, Q., et al. L1000CDS2: LINCS L1000 characteristic direction signatures search engine. NPJ Syst Biol Appl. 2 (1), (2016).
  17. Zhang, Q., et al. hTFtarget: A Comprehensive Database for Regulations of Human Transcription Factors and Their Targets. Genom Proteo Bioinfo. 18 (2), 120-128 (2020).
  18. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comp Chem. 31 (2), 455-461 (2009).
  19. Karuppasamy, M. P., Venkateswaran, S., Subbiah, P. PDB-2-PBv3.0: An updated protein block database. J Bioinfo Comp Biol. 18 (02), (2020).
  20. O'Boyle, N. M., et al. Open Babel: An open chemical toolbox. J Cheminfo. 3 (1), (2011).
  21. Kim, S., et al. PubChem Substance and Compound databases. Nuc Acids Res. 44 (D1), D1202-D1213 (2016).
  22. Li, B., Rui, J., Ding, X., Yang, X. Exploring the multicomponent synergy mechanism of Banxia Xiexin Decoction on irritable bowel syndrome by a systems pharmacology strategy. J Ethnopharmacol. 233, 158-168 (2019).
  23. Xue, B., et al. A System-Level Investigation into the Mechanisms of Chinese Traditional Medicine: Compound Danshen Formula for Cardiovascular Disease Treatment. PLoS ONE. 7 (9), (2012).
  24. Kasiske, B. L., et al. Response to Bui et al, "Patient Functional Status at Transplant and Its Impact on Posttransplant Survival of Adult Deceased-donor Kidney Recipients". Transplantation. 104 (2), e59(2020).
  25. Kawecki, C., Lenting, P. J., Denis, C. V. von Willebrand factor and inflammation. J Thromb Haemost. 15 (7), 1285-1294 (2017).
  26. Wilkening, A., et al. C-C chemokine receptor type 2 mediates glomerular injury and interstitial fibrosis in focal segmental glomerulosclerosis. Nephrol Dial Transplant. 35 (2), 227-239 (2020).
  27. Karasek, D., et al. Association of pigment epithelium derived factor with von Willebrand factor and plasminogen activator inhibitor 1 in patients with type 2 diabetes. Physiol Res. 68 (3), 409-418 (2019).
  28. Liu, J., et al. Single-Cell Spatial Transcriptomics Unveils Platelet-Fueled Cycling Macrophages for Kidney Fibrosis. Adv Sci (Weinh). 11 (29), e2308505(2024).
  29. Passi, I., Salwan, S., Kumar, B. US-FDA Approved Drugs in 2020 and 2021: A Review. Mini Rev Med Chem. 23 (12), 1273-1297 (2023).
  30. Das, P., Delost, M. D., Qureshi, M. H., Smith, D. T., Njardarson, J. T. A Survey of the Structures of US FDA Approved Combination Drugs. J Med Chem. 62 (9), 4265-4311 (2019).
  31. Zhou, L., et al. Brefeldin A inhibits colorectal cancer growth by triggering Bip/Akt-regulated autophagy. Faseb J. 33 (4), 5520-5534 (2019).
  32. Issa, M. E., Berndt, S., Carpentier, G., Pezzuto, J. M., Cuendet, M. Bruceantin inhibits multiple myeloma cancer stem cell proliferation. Cancer Biol Ther. 17 (9), 966-975 (2016).
  33. Guzzi, F., Cirillo, L., Roperto, R. M., Romagnani, P., Lazzeri, E. Molecular Mechanisms of the Acute Kidney Injury to Chronic Kidney Disease Transition: An Updated View. Int J Mol Sci. 20 (19), (2019).
  34. Tesch, G. H. MCP-1/CCL2: a new diagnostic marker and therapeutic target for progressive renal injury in diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 294 (4), F697-F701 (2008).
  35. Wu, F., Sun, C. The Role of Chemokine Receptors in Renal Fibrosis. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 177, 1-24 (2020).
  36. Davids, M. S., et al. An Integrated Safety Analysis of the Next Generation PI3Kδ Inhibitor Umbralisib (TGR-1202) in Patients with Relapsed/Refractory Lymphoid Malignancies. blood. 130, 4037(2017).
  37. Marar, P. V., Kumar, A., Swami, R., Shrivastava, S., Jeengar, M. K. Unlocking the Potential of Brusatol as an Antitumoral Agent: Molecular Mechanisms and Therapeutic Benefits. Rev Brasileira Farmaco. 34, 250-260 (2024).
  38. Seifert, S. A., et al. Acute hepatotoxicity associated with therapeutic doses of intravenous acetaminophen. Clin Toxicol. 54 (3), 282-285 (2016).
  39. Bolesta, S., Haber, S. L. Hepatotoxicity Associated with Chronic Acetaminophen Administration in Patients without Risk Factors. Ann Pharmacother. 36 (2), 331-333 (2002).
  40. Zhao, L., Zou, Y., Liu, F. Transforming Growth Factor-Beta1 in Diabetic Kidney Disease. Front Cell Dev Biol. 8, 187(2020).
  41. Matoba, K., et al. Unraveling the Role of Inflammation in the Pathogenesis of Diabetic Kidney Disease. Int J Mol Sci. 20 (14), (2019).
  42. Ezzo, M., Hinz, B. Novel approaches to target fibroblast mechanotransduction in fibroproliferative diseases. Pharmacol Ther. 250, 108528(2023).
  43. Giarratana, A. O., Prendergast, C. M., Salvatore, M. M., Capaccione, K. M. TGF-β signaling: critical nexus of fibrogenesis and cancer. J Transl Med. 22 (1), 594(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endothelial DysfunctionDiabetic Kidney DiseaseMulti Omics AnalysisTranscriptomic ProfilingSecretome ProteomicsHyperglycemic Endothelial CellsProtein Interaction NetworkDrug RepurposingNetwork PharmacologyMolecular Docking

Related Articles