Method Article

הכנת דגימה אוטומטית לניתוח מולטי-פלקסי של שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים חד-תאיים (sc-hPTM2)

DOI:

10.3791/69588

⸱

December 19th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Albert Einstein College of Medicine, 2SCIENION, 3Department of Chemical, Life and Environmental Sustainability Sciences, University of Parma

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאוטומציה של ניתוח שינוי פוסט-תרגומי של היסטונים חד-תאיים באמצעות אסטרטגיית תיוג איזוטופי דו-פלקס ועיכול ArgC. תהליך עבודה זה מאפשר פרופילינג כמותי, שכפול ורגיש מאוד של הטרוגניות כרומטין ותגובות אפיגנטיות ברזולוציה של תא יחיד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים פוסט-תרגומיים של היסטונים (hPTMs) הם רגולטורים מרכזיים של ארגון הכרומטין וביטוי הגנים. הדיסרגולציה שלהם קשורה להתפתחות, סרטן והזדקנות. בעוד שספקטרומטריית מסה היא השיטה המועדפת לחקר hPTMs, רוב הפרוטוקולים מיועדים לדגימות גדולות ואינם יכולים לפתור שונות בין תאים. הרחבת ניתוח PTM של היסטונים לרמת תא יחיד היא לכן חיונית אך מאתגרת טכנית, שכן היסטונים דלים בשפע, עשירים בליזין ועברו שינויים כבדים.

כאן, אנו מתארים תהליך אוטומטי של פרוטאומיקה חד-תאית לניתוח PTM היסטוני באמצעות טיפול ננו-נוזלי. המערכת מאפשרת עיבוד בקנה מידה ננוליטרי של תאים בודדים עם טיפול מינימלי ושכפול גבוה. תהליך העבודה כולל עיכול עם ArgC Ultra פרוטאז, שחותך את שאריות הארגינין ומונע את הצורך בשלבי גזירה החוסמת ליזין הנדרשים בדרך כלל בפרוטאומיקה של היסטון. כדי לאפשר השוואה כמותית בין תנאים, אנו מיישמים אסטרטגיית תיוג דו-פלקסית עם אנידיד פרופיוני והאנלוג הדויטרטי שלו, אנידריד פרופיוני-d10. שילוב זה של הכנת דגימה אוטומטית, ריבוב איזוטופי ועיכול ArgC Ultra יוצר פרוטוקול רגיש ויעיל לניתוח PTM של היסטונים חד-תאיים.

השיטה מאפשרת חקירת הטרוגניות הכרומטינית והשפעות הפרעות אפיגנטיות ברזולוציה של תא יחיד. כדי להדגים את תהליך העבודה, יצרנו ספרואידים מתאי HepG2/C3A של קרצינומה כבדית תאולרית וטיפלנו בהם בנתרן בוטיראט, מעכב היסטון דה-אצטילז שמעורר היפראצטילציה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היסטונים הם רכיבי החלבון בנוקלאוזומים, היחידות החוזרים של הכרומטין. הזנבות ה-N-טרמינליים שלהם עשירים בשאריות ליזין וארגינין ומוסדרים מאוד על ידי שינויים פוסט-טרנסלציונליים (PTMs), כגון אצטילציה, מתילציה ופוספורילציה. שינויים אלו משפיעים על נגישות ה-DNA ובכך לשלוט בתהליכים הכוללים שעתוק, שכפול ותיקון. דפוסי PTM היסטונים משתנים קשורים באופן חזק למצבי מחלה, מסרטן ועד ניוון נוירולוגי והזדקנות 1,2. מסיבה זו, ניתוח PTM בהיסטון הפך למעניין מאוד במחקר אפיגנטיקה ופרוטאומיקה. ספקטרומטריית מסה (MS) מספקת ניתוח מותאם לאתר וכמותי של שינויים בהיסטונים, אך היסטונים מציבים אתגרים אנליטיים ייחודיים. הרכב חומצות האמינו שלהן, אתרי שינוי מרובים ודפוסים קומבינטוריים מורכבים הופכים אותם לקשים יותר לניתוח מאשר חלבונים טיפוסיים. פרוטוקולים מבוססים מסתמכים על גזירה כימית לחסימת שאריות ליזין לפני העיכול, מה שמשפר את שחזור הפפטידים ואת ביצועי הכרומטוגרפיה3. למרות שהם יעילים בניתוחים מרובים, פרוטוקולי נגזרת רב-שלביים אלו עלולים לגרום להפסדים הבעייתיים עבור קלטים חד-תאיים. ניתוח תא יחיד הופך לחשוב יותר ויותר משום שמערכות ביולוגיות הן מטבען הטרוגניות. היסטון בכמויות מנתחות אותות ממוצעים על פני תאים רבים ולכן לא מצליחה ללכוד את השונות הזו. תת-אוכלוסיות של תאים עשויות להיות שונות במצבי הכרומטין שלהן, והבדלים אלו יכולים להניע התפתחות, תכנות מחדש של תאים או תגובות תרופתיות 4,5.

כאן אנו מציגים שיטת הכנת דגימה אוטומטית לניתוח PTM היסטוני חד-תאי מולטיפלקס (sc-hPTM2). שיטה זו מתבססת על מערכת CellenONE, המאפשרת חלוקה מדויקת של תאים בודדים ורגיבים בקנה מידה ננוליטרי באופן אוטומטי. שיטה זו היא וריאציה על שיטת הכנת הדגימה הננו פרוטאומית (nPOP), שהציגה לראשונה את השימוש בהכנת טיפות על סליידזכוכית 6. פלטפורמת nPOP כוללת פרוטאומיקה חד-תאית אוטומטית מתקדמת, אך פרוטוקול העיכול הטריפטי הסטנדרטי שלה אינו אופטימלי להיסטונים בשל תכולת הליזין הגבוהה שלהן וצפיפות השינויים הנרחבת. כאן, התאמנו את מערכת CellenONE לשילוב נגזרת ההיסטונים בתקן הזהב עם אנידיד פרופיוני והכנסנו תיוג איזוטופי, מה שאפשר כימות מדויק ומקיף של שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים ברזולוציה של תא יחיד. במיוחד, אנו מפשטים את הפרוטוקול באמצעות ArgC Ultra פרוטאז לעיכול חלבונים. בניגוד לטריפסין, ArgC חותך רק בשאריות ארגינין ואינו דורש חסימת ליזין. דבר זה מבטל את הצורך באסטרטגיית גזירה דו-שלבית, מה שמפשט את הפרוטוקול. בנוסף, השיטה משלבת מערכת תיוג איזוטופית דו-פלקסית באמצעות אנהידריד פרופיוני ואנידריד-d10 פרופיוני, המאפשרת ניתוח של שני תאים בו-זמנית 7,3. לאחר עיכול ותיווג, דגימות תא בודד נאספות ומנותחות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS)/MS באמצעות רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA). בידינו, שיטה זו הוכחה כמספקת שיפור הן ברגישות והן בשחזוריות לכימות של PTMs היסטונים בהשוואה לגרסה הקודמת של שיטהזו 8.

כדי להדגים את השיטה, פרופילנו דינמיקת PTM של היסטונים חד-תאיים בספרואידים שמקורם בתאי קרצינומה כבדית HepG2/C3A. טיפלנו בספרואידים אלה בנתרן בוטיראט, מעכב היסטון דה-אצטילאז מאופיין היטב שמגביר אצטילציה של היסטונים ומשמש כנקודת ייחוס לוויסות כרומטין 9,10. על ידי השוואת ספרואידים מבוקרים וסופרואידים שטופלו בנתרן בוטיראט ברזולוציה של תא יחיד, אנו מראים הוכחת עקרון לתוצאות מייצגות, המדגישות את הפוטנציאל ליישומים רחבים יותר בביולוגיית כרומטין ובאפיגנטיקה של סרטן. ראוי לציין שבפרוטוקול אנו מתייחסים לפרסום קודם המתאר צמיחה וטיפול בספרואידים תלת-ממדיים10, רכישת פפטידי היסטונים בספקטרומטרייתמסה 11, וניתוח נתונים באמצעות התוכנה EpiProfile12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מאגרים ומגבים

  1. מדיום גדילה לתאי HepG2/C3A: הכינו את מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM, 4.5g/L גלוקוז) המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS), חומצות אמינו לא חיוניות (1% v/v), L-גלוטמין (1% v/v), ופניצילין/סטרפטומיצין (0.5% v/v). מדיום הגידול מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. תערובת ראשית: להכין ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) 0.03%, דיתיותרייטול (DTT) 10 mM במים בדרגת LC-MS.
  3. תמיסת HA: הכינו 1% (v/v) הידרוקסיאמין במים בדרגת LC-MS.
  4. תמיסת שטיפה: הכינו 10 מ"ל מתערובת אצטוניטריל/מים 50:50 המכילה 0.1% חומצה פורמית (כולה בדרגת LC-MS).
  5. שלב A נייד (MPA) - 0.1% חומצה פורמית: מוסיפים 1 מ"ל חומצה פורמית מרוכזת ל-999 מ"ל מים בדרגת HPLC ומערבבים היטב.
  6. שלב B נייד (MPB) - 80% אצטוניטריל בדרגת HPLC + 0.1% חומצה פורמית: הוסף 800 מ"ל אצטוניטריל בדרגת HPLC ל-199 מ"ל מים בדרגת HPLC. לאחר מכן, מוסיפים 1 מ"ל חומצה פורמית מרוכזת לתמיסה ומערבבים.

2. הכנת ספרואידים

  1. להכנת הספרואידים, ראו את סטרנסקי ס' ואח' 11.
  2. תרבית תאי קרצינומה הפטותאלית HepG2/C3A בביוריאקטור תלת-ממדי מסתובב למשך 5-7 ימים לקידום היווצרות כדורית אחידה עד לקוטר ~400-600 מיקרון. השתמש ב-DMEM עם תוספת של 10% FBS, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 1% L-גלוטמין ו-0.5% פניצילין/סטרפטומיצין. לשמור על ספרואידים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2 עד לטיפול.
    הערה: איור 1A מייצג את הציוד ששימש להכנת הספרואידים במאמר המקור.

3. תרבית תאים וטיפול

  1. שים ~10 ספרואידים בצלחת תרבית רקמה עם 6 בארות המכילה 2 מ"ל מדיום גידול.
  2. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטורCO2 עם לחות של 5%.
  3. טפלו בספרואידים במשך 24 שעות עם 5 מ"מ מולר נתרן בוטיראט או הוסיפו את אותו נפח מים לבקרה (איור 1B).

4. בידוד תאים והכנת תלייה חד-תאית

  1. לאחר 24 שעות טיפול, דגרו את התאים ב-1 מ"ל טריפל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.
  2. הפיפט בעדינות למעלה ולמטה עד שהספרואיד מתפרק ומתקבלים תאים בודדים.
  3. אסוף את התאים בצינור של 15 מ"ל ושוטף, מדלל עד 10 מ"ל עם 1x PBS קר מאוד, צנטריפוגה ב-500 גרם ל-5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ושאוף את הסופרנאנט.
  4. החזירו את התאים ל-1 מ"ל של 1x PBS קר ומוסיפים כתם תאי מת ירוק Sytox בריכוז סופי של 1 מיקרומון.
  5. דגרו את התא עם סיטוקס ירוק למשך 20 דקות על קרח בסביבה חשוכה.
  6. שטוף את התא ב-10 מ"ל של 1x PBS קר כקרח, צנטריפוגה ב-500 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ושאוף את הסופרנאנט.
  7. החזירו את התאים ל-1 מ"ל של 1x PBS קר ומוסיפים פאראפורמלדהיד (PFA) בריכוז סופי של 0.5%.
  8. דגרו את התא עם PFA למשך 15 דקות על קרח.
    הערה: למרות ש-Sytox green בדרך כלל אינו תואם לקיבוע עקב חדירות ממברנה, עבור התאים שבדקנו היחס של תאי Sytox Green נשאר זהה עד 8 שעות לאחר הקיבוע ללא סימני דליפת חלבון היסטון.
  9. שטוף את התא ב-10 מ"ל של 1x PBS קר כקרח, צנטריפוגה ב-500 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ושאוף את הסופרנאנט.
  10. לשחזר את התאים בריכוז סופי של 200-500 תאים/מיקרוליטר.
    הערה: לתאים קטנים שאינם נוטים להצטבר, מומלץ ריכוז של 500 תאים/מיקרוליטר, בעוד שלתאים גדולים שנוטים להצטבר, מומלץ ריכוז של 200 תאים/מיקרוליטר. אם תליית התא נוטה להצטברות, יש להעביר אותו דרך מסננת של 40 מיקרון לפני השאיבה כדי למנוע סתימה בפיות. אם תאים גדולים מ-40 מיקרון מעניינים וסביר להניח שקיימים בדגימה, ניתן להשתמש במסננת של 70 מיקרון להסרת אגרגטים גדולים מאוד.
  11. מאחסנים את התאים על קרח עד שמכניסים לתוך המכשיר למיון.

5. חיבור תוכנה ואתחול מערכת

  1. הפעל את מערכת cellenONE (איור 2A), אתחל את מחשב הבקרה, הפעל את התוכנה ופתח את מרחב העבודה של המשתמש v2.0-nPOP2 ; כל קבצי השדה הנדרשים ותבניות הרצה ל-nPOP נטענים שם מראש.
  2. ודא שהצ'ילר של המכשיר פועל, ואז הגדר את ערך נקודת הטל לפי הטמפרטורה הפנימית המדווחת על ידי המכשיר כרגע.
  3. הכינו את המערכת ל-PDC-70, פיות פיזור מסוג ציפוי 2 (איור 2B) המותקנים בחריצים 1 ו-3, בהתאם להוראות שעל המסך.
  4. הגדר את רוחב הפולס ומתח ההנעה של כל פיה לערכים המצוינים באריזת היצרן.
    הערה: שימוש בשתי פיות נפרדות שומר על עקביות בהפצה: אחת מספקת את תליית התא, והשנייה את התגובות, כך שכל פסולת שנדבקת לפיה לא תפגע בטיפולים הבאים. שימוש בשתי הפיות בשלב האיסוף הסופי גם מאיץ את שחזור הדגימות.
    1. (שלב קריטי) ליעילות איסוף מקסימלית, ה-z-offset בין שתי הפיות אמורה להיות שונה ב-<50 מיקרון. קבע זאת על ידי הגדרת מיקום המגע האופטימלי לכל פיה והשוואת קריאות ה-Z-height בלשונית Nozzle Setup.
  5. מלאו את מאגר האדים במים דה-יוניים עד לקו המילוי המיועד.

6. תצורת הפעלה מראש על מטפל הנוזלים

  1. בחר את כמות שקופיות הזכוכית (איור 2C) שיש להכין. בחירה זו מגדירה ישירות את מספר התאים הכולל המתוכנן לניתוח.
  2. לסכמת מולטיפלקסינג דו-פלקסית (איור 3A), טענו סלייד יחיד עם 320 תאים.

7. פיזור "חפיר" דימתיל סולפוקסיד (DMSO) סביב קצוות הסלייד

הערה: איור 3B מייצג את השלבים להכנת הדגימות ב-cellenONE שמתחילים מהחפיר של DMSO. כאמצעי מניעה נוספת מפני אידוי טיפות, DMSO מוזרת לאורך קצוות המגלשות.

  1. בלשונית הראשית, בחר את הריצה ל-0_Dispense_DMSO_Moat.
  2. גש ללשונית Target Setup, טען את קובץ DMSO_Moat.fld מתיקיית הסכמה המתאימה, והגדר את מספר השדות ל-Y, בהתאם למספר השקופיות המתוכננות לעיבוד.
  3. העבירו 150 מיקרוליטר DMSO בדרגת LC-MS לצינור PCR חדש והניחו במיקום 2 של תחנת CellenWASH כאשר מכסה הצינור פונה לדלת המכשירים.
  4. פתח את לשונית Run ולחץ על Start Run. המערכת תשאוף 10 מיקרו ליטר של DMSO ותעצור לאישור המשתמש לגבי יציבות הטיפה. לירות שלוש טיפות בדיקה אוטומטיות (איור 4A); אם שלושתם בנויים בצורה מושלמת, לחץ על המשך ריצה.
  5. לאחר הפיזור, הפיות נשטפות אוטומטית, והמכשיר מצלם תמונות בכל השקופיות לבקרת איכות. בדוק את התמונות כדי לוודא טיפה אחידה של DMSO בכל שקף ולבדוק אם יש טיפות חסרות או לא במטרה (איור 4B).

8. חלוקת DMSO

  1. בלשונית הראשית , בחר את הריצה ל-1_Dispense_DMSO.
  2. פתח את לשונית Target Setup, ייבא את קובץ השדה DMSO.fld (איור 4C) מתיקיית הסכמות המתאימה, והגדר את מספר השדות ל-Y, בהתאם למספר השקפים שאתה מתכוון לעבד.
  3. העבירו 150 מיקרוליטר DMSO בדרגת LC-MS לצינור PCR חדש והניחו במיקום 2 של תחנת CellenWASH כאשר מכסה הצינור פונה לדלת המכשירים.
  4. פתח את לשונית Run ולחץ על Start Run. המערכת תשאוף 10 מיקרו ליטר של DMSO ותעצור לאישור המשתמש לגבי יציבות הטיפה. לירות שלוש טיפות בדיקה אוטומטיות; אם שלושתם בנויים בצורה מושלמת, לחץ על המשך ריצה.
  5. בעת חלוקת גימורים, התוכנה שוטפת אוטומטית את הפיות ותופסת תמונות בכל שקופית לצורך הבטחת איכות. בדוק את התמונות כדי לוודא טיפת DMSO אחידה בכל שקף ולבדוק טיפות חסרות או לא במטרה.

9. חלוקת תא

  1. בלשונית הראשית , בחר ב'ריצה ל-2_Dispense_Cells'.
  2. בלשונית Target Setup , פתח את תת-תיקיית Cells Field Files בתיקיית הסכמות המולטי-פלקסינג שנבחרה.
  3. מכיוון שהניסוי כולל שני תנאים, בחרו את קובץ השדה התואם לדגימה שעומדת למיין - או CellType_A.fld או CellType_B.fld.
  4. לאחר טעינת הקובץ, הגדר את מספר השדות ל-Y, כך שיהיה שווה לסך כל השקופיות בריצה זו.
  5. שחרר גז מהמתלים של התא מהשלב 4.11 עם משאבת ואקום למשך 10 דקות על הקרח.
  6. העבר 150 מיקרוליטר מהמתלה של התא המוכן ל-CellenVIAL נקי, ואז הניחו את הבקבוקון בחריץ 1 של קרוסלת CellenWASH כשהמכסה פונה לעבר דלת המכשיר.
  7. גש ללשונית Nozzle Setup > Do Task ובצע Take10ul_CellenVIAL_nozzle1 כדי לשאוב את הדגימה מהבקבוקון.
  8. נשארים בלשונית Nozzle Setup , השקו את צופה מפיצוי התאים (איור 5A) והפעילו את שגרת המיפוי כדי להגדיר את אזור הפליטה ואובייקטי השער בהתבסס על גודל והארכה. פרמטרי הבידוד של תא יחיד המוצגים באיור 5A תואמים בדיוק להגדרות המשמשות לחלוקת תאי HepG2/C3A שהתנתקו מספרואידים.
  9. לאחר מכן הפעל מצב פלואורסצנציה על ידי בחירת T > F. הגדר את מצב הבחירה לשלילי. הגדל את טווח פרמטרי הבידוד לגודל ועוצמה מהמינימום לערכים המקסימליים כדי להבטיח שלא יהיו תאים מתים מבודדים.
  10. אמת עם פרמטרי המיפוי, פתח את לשונית Run , ולחץ על Start Run, ואז עקב אחרי הפקודות של התוכנה. כאשר ההפצה מסתיימת, המכשיר ינקה אוטומטית את הפיות ויצילם תמונות שקופיות לסקירת מיקום הטיפות ואחידותן.
    הערה: במהלך מיון התאים, מצלמים תמונות של כל תא בודד שמבודד במהלך הריצה (איור 5B).
  11. לאחר סיום מיון התאים, סגור את חלון החלוקה (המרוקן).
  12. להשאיר כל תליית תא שנותרה על הקרח עד לסיום סעיף 9; העודף יכול לשמש מאוחר יותר לדגימות נרחבות, בניית ספריות אמפיריות או מחקרי אימות נוספים.

10. חלוקת תערובת מאסטר העיכול

  1. בלשונית הראשית , בחר ב'ריצה ל-2_Dispense_Digest_10ulPickup'.
  2. פתח את לשונית Target Setup, טען את Digest.fld מתיקיית סכמת המולטיפלקסינג המתאימה, והגדר את מספר השדות ל-Y כך שיהיה שווה למספר השקופיות של הריצה הזו.
  3. הכינו תערובת עיכול ראשית טרייה והסרו גזים מהתמיסה עם משאבת ואקום למשך 10 דקות על קרח (תערובת ראשית: ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, DDM 0.03%, DTT 10 mM במים בדרגת LC-MS).
  4. פיפט 20 מיקרוליטר של תערובת המאסטר ללוח עם 384 בארות ומניח את הלוח בתוך מערכת X1.
  5. בלשונית Run , לחץ על Start Run ועקב אחרי הפקודות. לאחר שהמערכת שואבת את המגיב (מגיב שאיבה), אשר את יציבות הטיפה כאשר מתבקשים.
  6. בעת גימור הפיזור, המכשיר שוטפת אוטומטית את הפיות ומצלמת כל שקופית; בדוק את התמונות כדי לוודא שכל טיפה קיבלה את תערובת העיכול באופן אחיד.
  7. דגרו את המגלשות במשך הלילה לעיכול, תוך שמירה על הלחות והגדרות נקודת הטל המוגדרות. כל טיפה מכילה ~13.5 ננוליטר של תערובת עיכול. בצע עיכול במהלך הלילה בלחות יחסית ~75%, כאשר נקודת הטל נשמרת בטמפרטורה של 1-2 מעלות צלזיוס מתחת לטמפרטורת התא כדי למנוע אידוי טיפות.

11. דגירה בלילה

  1. בלשונית הראשית , בחר את הריצה ל-4_Incubation_16h.
  2. עברו ללשונית Run , לחצו על Start Run.
    הערה: המכשירים מצלמים את השקופיות כל 30 דקות כדי לעקוב אחרי מצב הטיפות. אם הם מתייבשים או מתנפחים במהלך הדגירה, התאימו את הגדרת נקודת הטל לפי הצורך.
  3. כאשר הדגירה מסתיימת, תופיע הודעה שאומרת שהדגירה הושלמה.
    הערה: עיכול מהיר (≤4 שעות) עשוי להיות אפשרי בתנאים יעילים יותר בין אנזימים למצע; זה לא הוערך כאן, ולכן התנאי המאומת נשאר 16 שעות.

12. אידוי

הערה: לפני שעוברים לשלב הסימון, מומלץ לבדוק את מצב הטיפות כדי לוודא שהן אינן נפוחות מדי ממים, שכן מים עלולים להפריע ליעילות התווית. למטרה זו, מומלץ לבצע את שלב האידוי.

  1. בלשונית הראשית , בחר את הריצה ל-5_Evaporation.
  2. עבור לקובץ בקרת יחידת קירור, ותחת בקרת נקודת הטל הגדר טמפרטורת בקרה קבועה על 23 מעלות צלזיוס.
  3. עברו ללשונית Run , לחצו על Start Run. הייבוש יימשך 5 דקות, והכלים יצלמו אוטומטית תמונות של השקופיות לאחר הייבוש.
  4. בדוק את התמונות; אם הטיפות יבשות מספיק, עצור את הריצה. אם לא, לחץ על המשך וייבש עוד 5 דקות (איור 6A).
  5. בסוף הריצה, חזרו לבקרת נקודת הטל הקודמת.

13. חלוקת תוויות

  1. בלשונית הראשית , בחר את הריצה ל-6_Dispense_PA_Labels.
  2. גש ללשונית Target Setup, טען את קובץ Labels.fld מתיקיית הסכמה המתאימה, והגדר את מספר השדות ל-Y, בהתאם למספר השקופיות המתוכננות לעיבוד.
  3. Aliquot 150 מיקרוליטר DMSO בדרגת LC-MS לחריץ 2 של תחנת CellenWASH.
  4. הכינו תמיסת מלאי של שני מניות התיוג לנגזרת היסטונים מרובעת: 25% (v/v) אנהידריד פרופיוני ב-DMSO ו-25% (v/v) פרופיוני אנהידריד-D10 ב-DMSO.
    הערה: דה-גז את שתי התמיסות לפני העברתן ללוח כדי למזער את היווצרות הבועות.
  5. הזרקו 20 מיקרוליטר מכל תגובת תיוג לבארות המיועדות של לוח 384 בארות ומניחים את הלוח בתוך מערכת X1. כל טיפה מקבלת ~10 ננוליטר של תגובת תיוג (25% אנהידריד פרופיוני או 25% פרופיון אנהידריד d10 ב-DMSO).
  6. עבור ללשונית ריצה , לחץ על Start Run ועקב אחרי ההנחיות.
  7. תן לתוויות להגיב על סלייד במשך שעה.
  8. לאחר הזריקה, המכשיר משטיף אוטומטית את הפיות ומצלם כל שקופה. בדוק את התמונות כדי לוודא התפלגות אחידה ומיקום נכון של הטיפות בכל השקופיות.

14. חלוקת HA

  1. הכין את תמיסת ה-HA ופתח גזים לפני השימוש.
  2. טען את הבקבוקון. פיפט 150 מיקרוליטר של תמיסת ה-HA לתוך צינור PCR נקי, מקם אותו בחריץ CellenWASH 2, וכיוון את הפקק לכיוון דלת המכשירים.
  3. בחר את פרופיל הריצה. בלשונית הראשית , בחר 7_Dispense_Quench.
  4. הגדר את קובץ השדה. פתח את לשונית Target Setup, טען את HA.fld מתיקיית סכמת המולטי-פלקסינג המתאימה, והגדר את מספר השדות ל-Y כך שיהיה שווה למספר השקופיות הכולל.
  5. תתחיל לריצה. נווט ל-Run, לחץ על Start Run, ופעל לפי ההוראות שעל המסך.
  6. לדוגם. תן ל-HA להגיב על השקופיות במשך 30 דקות.
  7. בדוק את החלוקה לשירותים. לאחר השלמה, המערכת שוטפת את הפיות ומצלמת תמונות של כל שקופית – סקירה של תמונות אלו כדי לאשר מיקום ונפח טיפות אחידים.

15. איסוף דוגמאות

  1. הכינו את תמיסת הכביסה ב-WashTray XL.
  2. תכין את לוחית האיסוף. שפכו 2 מיקרוליטר של 0.01% (w/w) DDM במים בדרגת LC-MS לכל באר של פלטת 384 בארות טרייה והניחו את הפלטה בתוך מטפל הנוזלים.
  3. בחר את ריצת האיסוף. בלשונית הראשית , בחר את הפרופיל 8_Pickup_2plex.
  4. טען את קובץ השדה. פתח את לשונית Target Setup, ייבא את Pick-up.fld מתיקיית סכמת המולטי-פלקסינג הנכונה, והגדר את מספר השדות ל-Y כך שיתאים למספר השקופיות.
  5. בצע את הריצה. עבור ללשונית ריצה , לחץ על Start Run ועקב אחרי ההנחיות. המכשיר יאסוף כל טיפה, ינקה את הפיות ויצילם את השקופיות לבדיקה כדי לוודא שכל דגימה נאספה.

16. עיבוד לאחר האיסוף

  1. אטום לזמן קצר את לוח 384 הבארות בנייר אלומיניום דביק וצנטריפוגה כדי להעביר טיפות לתחתית הבארות.
  2. הסר את נייר האלומיניום וייבש את הדגימות בחום נמוך במכשיר ריכוז ואקום.
  3. אטום את הפלטה בנייר אלומיניום דביק ואחסן את הפלטה המיובשת בטמפרטורה של -80°C עד שתהיה מוכנה לניתוח LC-MS/MS.

17. הכנת דגימות בתפזורת

  1. באמצעות שארית ההשעיה מסעיף 9, סובבים את התאים והשלים מחדש ב-1x PBS כדי לקבל ריכוז של 2,000 תאים/מיקרוליטר. יש לבצע זאת לאחר השלמת סעיף 10.
  2. ליזיס תרמי: הקפאת המתלה הנותרת בטמפרטורה של -80°C למשך 10 דקות, ואז הלם חום ב-90°C למשך 10 דקות.
  3. תן לצינור להתקרר חזרה לטמפרטורת החדר.
  4. העבר 25 מיקרוליטר מהליזאט לצינור PCR והוסיף 5 מיקרוליטר מתערובת העיכול שהוכנה מראש.
  5. הדגרה בלילה (≈ 16 שעות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במחזור תרמי.
  6. נגזרת תווית אור: מוסיפים 5 מיקרוליטר של תווית אור טרייה של 25% (v/v) באצטוניטריל ולדוגרים במשך שעה אחת.
  7. כיבוי תגובה: הוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת הידרוקסיאמין (HA) של 1% (w/w) ודגירה למשך 30 דקות.
  8. ייבשו את הדגימה במרכז ואקום על חום נמוך, ואז שמרו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים ל-LC-MS/MS.

18. הקמת LC/MS ורכישת נתונים

הערה: כדי לאסוף את הנתונים עבור כתב היד הזה, מערכת LC-MS\MS התקיימה עם עמודה אנליטית של Ion Optics בגודל 75 מיקרון x 25 ס"מ x 1.7 מיקרון.

  1. הכינו את שלבי הניידות לפעול על ה-HPLC:
    שלב A נייד (MPA): חומצה פורמית 0.1% במים בדרגת HPLC
    שלב B נייד (MPB): חומצה פורמית 0.1% באצטוניטריל בדרגת HPLC
  2. תכנתו את שיטת HPLC לגרדיאנט פעיל של 30 דקות: 5-23% MPB ב-25.7 דקות, 23-35% MPB ב-2.6 דקות ו-35-45% MPB ב-1.7 דקות, בקצב זרימה של 200 nL/דקה. תכנת את האוטוסמפלר להשעות את הדגימה מחדש ב-0.1% FA + 0.01% DDM לאיסוף 'יבש'.
  3. הגדר את שיטת רכישת ה-MS לביצוע רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA):
    הערה: הגדרות אלו ספציפיות ל-Thermo Exploris 480 המצויד ב-FAIMS Pro Duo ועשויות להשתנות בהתאם לכלי שלך. מומלץ להשתמש באלה הנפוצים לפרוטאומיקה חד-תאית של DIA עם טווחי m/z דומים כפי שמתואר להלן.
    1. הגדר את ה-MS לסריקה מלאה מ-300-1100 מ'/z עם רזולוציה של 120,000, יעד AGC של 300%, זמן הזרקה מקסימלי של 246 מילישניות, ו-50 וולט של FAIMS CV.
    2. הגדר את MS/MS לסריקת DIA מ-300-1100 מ'/z ברזולוציה של 60,000, חלון בידוד של 50 מ'/z, אנרגיית התנגשות HCD של 27%, מסה ראשונה של 120 מ'/z, יעד AGC של 1000%, זמן הזרקה מרבי של 118 מילישניות, ו-50 וולט של FAIMS CV.
  4. הסר את אטם האלומיניום מלוח 384 בארות המכיל את התאים הבודדים. שחזר את הדגימה הגדולה ב-100 תאים/מיקרוליטר ב-0.1% FA + 0.01% DDM והעבר 10 מיקרו-ליטר לבאר ריקה, כמו P24. לאחר מכן, אטום את הפלטה עם משטח גומי חדיר וטען אותו לתוך האוטוסמפלר.
  5. ריצות בתור: הרץ תחילה דגימות בכמויות גדולות ואז את קבוצות התאים הבודדים.

19. ניתוח נתונים

  1. הרץ את הנתונים הגולמיים עם EpiProfile2.1 כדי לקבל את הפלט עם שפע הפפטידופורמים עבור התאים המסומנים באנידריד פרופיוני.
    הערה: יש לאסוף דגימות על מכשיר תרמו כדי להשתמש ב-EpiProfile 2.1 לעיבוד נתונים. תוכנה זו מחלקת כ-250 פפטידופורמים עם הגרסה הקנונית שלה, אך ניתן לערוך אותה בהתאם לאורגניזם, שינויים נוספים, מוטציות וכו'.
  2. הרץ את הנתונים הגולמיים עם EpiProfile2.1_D5 כדי לקבל את הפלט עם שפע הפפטידופורמים עבור התאים המסומנים באנידריד פרופיוני-d10.
  3. בצע את המיפוי וקישור המטא-דאטה עם פלטי ה-Epiprofile באמצעות תוכנת quantQC.
  4. סנן דגימות שנכשלו על ידי השוואה לריקים.
  5. סנן פפטידופורמים שאינם נמצאים לפחות ב-50% מהדגימות.
  6. לסנן פפטידופורמים שאות עוצמת התא היחיד שלהם אינו גדול מ-150% בכדורים ריקים.
  7. קבל את טבלת התוצאות (איור 7A) ועבד את הנתונים בהמשך לפי הצורך.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להדגים את יישום תהליך העבודה של פרוטאומיקת היסטונים חד-תאית באמצעות המערכת שלנו, ניתחנו ספרואידים של תאי HepG2/C3A שטופלו ב-5 mM נתרן בוטיראט במשך 24 שעות. לאחר רכישת LC-MS/MS, נתונים גולמיים עובדו באמצעות EpiProfile הן לתיוג קל (אנידיד פרופיוני) והן לתיוג כבד (אנהידריד פרופיוני-d10), וקיבלו נתונים מנורמלים המייצגים את שפע הפפטידים וסימני ההיסטונים. חבילת QuantQC R שימשה למיפוי מטא-דאטה של המטפל בנוזל לפלטי ה-EpiProfile במטרה לקבל מידע על תכולת הפפטידים והשפע הקשור לכל תא, ואז סיננה פפטידופורמים שלא זוהו באופן עקבי ל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת למדוד שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים ברמת תא יחיד מהווה צעד קריטי בהבנת ההטרוגניות האמיתית של ויסות הכרומטין. שיטות הייצור המסורתיות סיפקו תובנות יקרות ערך לגבי התפלגות ממוצעת של hPTMs ברקמות, אך הן מסתירות שונות בין תאים שמוכרת יותר ויותרכבעלת משמעות ביולוגית. גישות פרוטאומיות חד-תאיות מאפשרות לנו כעת לפתור את שכבת המורכבות הנסתרת הזו, ולחשוף מצבי כרומטין מובחנים שעשויים להוות בסיס לוויסות גנים שונה, פלסטיות תאית ופגיעות למחלות4. ש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג'יי.סי. הוא עובד בחברת SCIENION US Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר ברניס מורו וד"ר ג'ידונג שאן בליבת הציטוגנטיקה המולקולרית במכללת אלברט איינשטיין לרפואה על תחזוקת מכשיר cellenONE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לביו-ראד2239480
1000 ומיקרו; קצות פיפט ברוחב Lפישר סיינטיפיק14222703
200 ומיקרו; קצות פיפט ברוחב Lפישר סיינטיפיק14222730
לוח PCR 384 באר Lo Bind אפנדורף30129547
מניפולד ואקום עם 96 בארותמיליפורMAVM0960R
אצטוניטריל, דרגת Optima LC-MS/MSפישר סיינטיפיקA955-1
לוחות PCR דביקיםתרמו פישרAB0626
אצטוניטריל חסר מיםפישר סיינטיפיקAA42311AKתמיסת המלאי לתפזיר
Arg-C אולטרה, דרגת מסהפרומגהVA1831
מים ברמת תרבית תאיםקורנינג25-055-CV
CellenVIALsסייניון/מספר הקטלוג מגיע עם הצעת מחיר
DMSO, אנהידרוסתרמו פישרD12345תמיסת סטוק לתוויות
DTTסיגמאD0632-5G
מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM)פישר סיינטיפיקMT17205CV
סרום בקר עובריפישר סיינטיפיקMT35010CV
חומצה פורמיתתרמו28905
חומצה פורמית 98%– 100% ל-LC-MS LiChropurסיגמא5330020050
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)פישר סיינטיפיקMT21022CV
HEPES (אולטרה פיור)תרמו פישר11344041
אצטוניטריל בדרגת HPLCפישר סיינטיפיקA955-4
מים בדרגת HPLCפישר סיינטיפיקW5-4
תמיסת הידרוקסיאמין 50 wt. % ב-H2Oסיגמא438227-50ML
L-גלוטמיןפישר סיינטיפיקMT25015CI
דטרגנט n-Dodecyl-beta-Maltoside (DDM)פישר סיינטיפיקBN2005
חומצות אמינו לא חיוניותפישר סיינטיפיקMT25025CI
ספקטרומטר המסה Orbitrap Exploris 480תרמו פישרBRE725539
פרפורמלדהיד 16% תמיסה מימית בדרגת EMמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15710-S
PDC-CM (ציפוי סוג 2)סייניון/מספר הקטלוג מגיע עם הצעת מחיר
פניצילין-סטרפטומיציןפישר סיינטיפיקMT3002CI
סליין מפוזר-פוספט (PBS), 10x, pH 7.4, ללא RNaseתרמו פישרAM9625
פירס דימתילסולפוקסיד (DMSO), דרגת LC-MSתרמו פישר85190
רובה פיפטהאפנדורףZ666467 (מיליפור סיגמא)
אנידריק פרופיוני &GE; 99%סיגמא240311-50G
אנידריד פרופיוני-d10 ≥ 98 אטום % D, ≥ 99% (CP)סיגמא615692-1G
צנטריפוגה מקוררתתרמו75-217-420
שקופיות זכוכית מצופות SciCHIP H1סייניון/מספר הקטלוג מגיע עם הצעת מחיר
מרוכז ואקום SpeedVac (לוחות 96 בארים)תרמו15308325סוואנט SPD1010
מכסה מנוע סטריליתרמו1375
פיפטות סרולוגיות סטריליותפישר סיינטיפיק1367549
SYTOX Green Dead Stain, לציטומטריית זרימהתרמו פישרS34860
אנזים TrypLE Express (1X), ללא פנול אדוםתרמו פישר12604013
מערבולתסיגמאZ258415
אמבט מיםפישר סיינטיפיקFSGPD10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).
  2. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  3. Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis. J Vis Exp. (111), e54112(2016).
  4. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biol. 19 (1), 161(2018).
  5. Slavov, N. Single-cell protein analysis by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).
  6. Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP. Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).
  7. Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond. Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).
  8. Cutler, R., et al. Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity. Nature Communications. , (2025).
  9. Davie, J. R. Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate. J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).
  10. Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model. Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).
  11. Stransky, S., et al. Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures. J Vis Exp. (1), e65086(2023).
  12. Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  13. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell ProteomicsHistone ModificationsAutomated Sample PreparationMultiplex LabelingChromatin HeterogeneityMass SpectrometryArgC Ultra DigestionSpheroid AnalysisHigh Throughput WorkflowEpigenetic Perturbations

Related Articles