מאמר מחקר

RNA ארוך שאינו מקודד IRAIN מניע תכנות מחדש אימונומטבולי בגליומה דרך ציר IGF1R-JAK-STAT-BIRC5

328 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69711

⸱

12 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Zhangzhou Municipal Hospital of Fujian Province and Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University, 2The School of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

באמצעות למידת מכונה משולבת במספר קבוצות, בנינו חתימת פרוגנוסטית חזקה של IMRG לגליומה. IRAIN מופחתת באופן ניכר, קשור הפוך לדרגה ולהישרדות, ומדכא את האיתות של IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5, מגביל התפשטות, נדידה ואנגיוגנזה. הממצאים מציבים את IRAIN ו-IMRGs כסמנים ביולוגיים ומטרות טיפוליות.

תקציר

גליומה היא ממאירה אגרסיבית עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות ותחזית לקויה. ההתקדמות שלו קשורה קשר הדוק לתכנות מחדש מטבולי ולהתחמקות חיסונית, מה שמדגיש את הצורך לזהות רגולטורים מולקולריים המשלבים תהליכים אלו. כאן, קבענו חתימת פרוגנוסטית חזקה של גן אימונומטבולי (IMRG) והבהרה את תפקידו של RNA IRAIN הלא-מקודד ארוך בוויסות אימונומטבוליזם של גליומה דרך ציר IGF1R-JAK-STAT-BIRC5. נותחו נתונים טרנסקריפטומיים וקליניים מקבוצות TCGA, CGGA (693/325) ו-GEO (GSE43378). ביטוי דיפרנציאלי וניתוח רשתות ביטוי משולב משוקלל (β = 8) הבטיחו טופולוגיה חופשית מסוללות, ומסגרת אימות צולב של 'השאיר אחד בחוץ' המשלבת עשרה אלגוריתמים של למידת מכונה יצרה 101 מודלים פרוגנוסטיים. חתימת IMRG האופטימלית של 17 גנים אושרה בכל הקבוצות וחיזתה באופן עצמאי הישרדות כללית. בדיקות פונקציונליות הראו כי ביטוי יתר של IRAIN מעכב את IGF1R, מדכא זרחן JAK2/STAT3, והוריד את ויסות BIRC5, ובכך מקדם אפופטוזיס והפחית את האנגיוגנזה. ביטוי נמוך של IRAIN היה קשור ל-Tregs מדכאי חיסון ולמקרופאגים M2 ולציונים גבוהים של מיקרו-סביבה גידולית, מה שמרמז על פנוטיפ התחמקות חיסונית. ממצאים אלו מבססים את IRAIN כרגולטור מרכזי לתכנות מחדש אימונומטבולי בגליומה ומאמתים את חתימת IMRG ככלי פרוגנוסטי אמין, תוך הדגשת מסלול IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 כגשר מכני המקשר בין דיסרגולציה חיסונית למטבולית בגליומה ומציעים מטרות פוטנציאליות לטיפול מדויק.

מבוא

גליומה מייצגת את הממאירות הראשונית הנפוצה ביותר במערכת העצבים המרכזית ונשארת בין סוגי הסרטן הקטלניים ביותר בבני אדם למרות התקדמות בנוירוכירורגיה, רדיותרפיה וכימותרפיה. גליומות בדרגה גבוהה, במיוחד גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM), מאופיינות בהתרבות מהירה, חדירה מפוזרת והישנות בלתי נמנעת 1,2. לאחרונה צצו מגוון גישות טיפוליות יעילות, כגון התערבויות כירורגיות, אימונותרפיה וכימותרפיה3. ההישרדות החציונית נשארת בערך 14-18 חודשים, אפילו עם טיפול מקסימלי, מה שמדגיש את הצורך באסטרטגיות טיפוליות חדשניות וסמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים4.

האינטראקציה בין מיקרו-סביבת הגידול (TME) לתאי הסרטן מניעה באופן קריטי את הצמיחה האגרסיבית וההטרוגניות המולקולרית של גליומות. רכיבים חיסונים רבים, כולל מיקרוגליה, תאי מקדים נוירונים, תאי כלי דם ותאי חיסון אדפטיביים, מעורבים באופן מורכב בעיצוב TME 5,6,7. בשנים האחרונות נרשמה התקדמות מרשימה באימונותרפיה, שהביאה לעידן משנה חיים באונקולוגיה. עם זאת, חסימת נקודות ביקורת חיסונית (ICB) ושיטות אימונותרפיות אחרות הראו הצלחה מוגבלת בלבד בגליומה8. הכישלון של אימונותרפיה בהקשר זה נובע ממספר תכונות פנימיות של מיקרו-סביבת הגליומה – וביניהן עומס מוטציוני נמוך של גידול, הטרוגניות תוך-גידולית בולטת, חדירות לקויה של מחסום דם-מוח, ירידה בוויסות מולקולות מורכבות עיקריות של תאימות היסטו, וחדירה דלילה לתאי T 9,10,11,12.

עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמיקרו-סביבת הגידול (TME), שמפגינה תפקוד מטבולי לקוי, מתאפיינת בתנאים חומציים, מחסור בחומרים מזינים והצטברות מטבוליטים שמדכאים תגובות חיסוניות. מצב זה מוביל לאחר מכן לתפקוד לקוי של תאי מערכת החיסון החודרים לגידולים ומפחית את יעילות האימונותרפיה13. במקביל, תאי החיסון בתוך ה-TME עוברים שינויים מטבוליים תלויי הקשר שמכתיבים את ההתמיינות ותפקודי האפקטור שלהם. לדוגמה, תאי T מופעלים מסתמכים על גליקוליזה להתרבות מהירה, בעוד שתאי T רגולטוריים (Tregs) ומאקרופאגים הקשורים לגידולים (TAMs), במיוחד תת-הסוג M2, תלויים בזרחון חמצוני ובמטבוליזם של חומצות שומן כדי לשמור על פעילותם המדכאת חיסון14,15.

לכן, שילוב חתימות חיסוניות ומטבוליות מספק מסגרת רציונלית לסיווג טוב יותר של גליומות ולחיזוי פרוגנוזה של המטופל. RNA לא מקודד ארוך (lncRNAs) הופיעו לאחרונה כרגולטורים רב-תכליתיים של ארכיטקטורת הכרומטין, שעתוק גנים ושינוי לאחר שעתוק. מספר lncRNA היו מעורבים בפתוגנזה של גליומה, והשפיעו על התפשטות, פלישה ומודולציה חיסונית16. ביניהם, תמלול אנטיסנס המוטבע IRAIN (RNA לא מקודד חלבון מודפס ב-IGF1R antisense) זכה לתשומת לב בזכות תפקידו בוויסות גן קולטן גדילה 1 דמוי אינסולין (IGF1R) באמצעות אינטראקציות כרומטין ציס-פועלות, שהוכח כמופחת ומפחיתה את השליטה בתחרות ציס, במיוחד בתאי סרטן כמו סרטן השד וקווי תאי לוקמיה. סרטן הגרון ולוקמיה מיאלואידית חריפה, שמובילה ישירות להגברת IGF1R 17,18,19. מכיוון שאיתות IGF1R מפעיל את מסלולי JAK-STAT ו-PI3K-AKT במורד הזרם – שניהם מרכזיים לצמיחת הגידול ולוויסות החיסון20,21 – שינויים בביטוי IRAIN עשויים להשפיע באופן קריטי על אימונומטבוליזם של הגידול. עם זאת, תפקידו של IRAIN בגליומה והשפעתה הפוטנציאלית על הנוף האימונומטבולי טרם הובהר. התמודדות עם פער ידע זה עשויה לספק תובנות מכניות לגבי האופן שבו RNA שאינו מקודד מתאם הסתגלות מטבולית והתחמקות חיסונית בגליומה.

במחקר זה, שילבנו נתוני טרנסקריפטומיה רב-קוהורטיים עם אימות ניסויי כדי לחקור ויסות אימונומטבולי בגליומה. באמצעות מסגרות משולבות של למידת מכונה בין קבוצות TCGA, CGGA (693/325) ו-GEO (GSE43378), זיהינו חתימת פרוגנוסטית חזקה של 17 גנים הקשור לגן אימונומטבולי (IMRG) המסוגלת לדרגת שירוד מטופלים בין מערכי נתונים. בהמשך התמקדנו ב-IRAIN כרגולטור פוטנציאלי למעלה הזרם של רשת זו, בהתחשב באינטראקציה הצפויה שלה עם ציר האיתות IGF1R-JAK-STAT. בדיקות פונקציונליות גילו כי ביטוי יתר של IRAIN מדכא התרבות גליומה ואנגיוגנזה על ידי עיכוב ביטוי IGF1R ופוספורילציה של STAT3 במורד הזרם, מה שמוביל להפחתת הביטוי של החלבון האנטי-אפופטוטי BIRC5 (המוכר גם כסורביווין). ביחד, ממצאים אלו תומכים במודל עבודה שבו IRAIN פועל כגשר מכני המקשר בין ויסות מערכת החיסון לתכנות מחדש מטבולי בגליומה. אנו משערים כי ביטוי לא מוסדר של IRAIN מקדם התקדמות הגידול על ידי הפרת איזון זה, ובכך יוצר מיקרוסביבה מדכאת חיסון ומעניק עמידות לטיפול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים רקמות אנושיות עמדו בהנחיות המוסדיות ובהצהרת הלסינקי ואושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פוג'יאן לרפואה (אישור מס' 2021KYB089). התקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל המשתתפים לפני רכישת הרקמות.

ביטוי גנים וניתוח הישרדות
נתוני ריצוף ה-RNA והמידע הקליני המתאים התקבלו ממספר מאגרי מידע ציבוריים. 1) קוהורט TCGA: נתוני RNA-seq (FPKM) עבור 175 דגימות גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM) ו-534 דגימות גליומה בדרגה נמוכה (LGG) הורדו מאטלס הגנום של הסרטן (https://portal.gdc.cancer.gov/); 2) ביקורת תקינה: פרופילי ביטוי של 211 רקמות מוח תקינות ו-662 רקמות גליומה הורדו ממאגר UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/); 3) אימות חיצוני: נתונים מקבוצות CGGA693 ו-CGGA325 התקבלו מאטלס הגנום הסיני לגליומה (http://www.cgga.org.cn); 4) מערך נתונים GEO: מערך הנתונים GSE43378, הכולל נתוני ביטוי וקליניים עבור 50 דגימות גליומה, הורד מ-Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). כל נתוני הספירה הגולמיים הומרו לתמלילים למיליון (TPM) והוסבו ללוג2. עבור מערכי נתונים שכבר נורמלו, נבדקו מטריצות ביטוי כדי להבטיח התפלגויות דומות. גנים עם ערכי TPM < 1 ביותר מ-80% מהדגימות הוצאו. מידע קליני חסר (גיל, מצב IDH, קודלציה של 1p/19q, מתילציה של MGMT) הוסר באמצעות סינון מקרים מלאים. אפקטי האצווה בין מערכי הנתונים הותאמו באמצעות אלגוריתם ComBat שמיושם בחבילת R sva. ערכי הביטויים תוקנו על ידי טרנספורמציית ציון z בכל מערך נתונים. ניתוחי הישרדות בוצעו באמצעות חבילות R של Survival ו-survminer. המטופלים חולקו לקבוצות ביטוי גבוה ונמוך בהתאם לרמת הביטוי החציונית של IRAIN. נוצרו עקומות הישרדות של קפלן-מאייר, והמשמעות הסטטיסטית הוערכה באמצעות מבחן ה-log-rank. יחסי סיכון (HRs) ורווחי ביטחון של 95% (CIs) הוערכו באמצעות מודלים של רגרסיית סיכונים פרופורציונליים של Cox.

הגדרת קבוצות גנים חיסוניות ומטבוליות
גנים הקשורים למערכת החיסון (IRGs, n = 2,483) התקבלו ממאגר ImmPort (https://www.immport.org/shared/), וגנים הקשורים למטבוליה (MRGs, n = 948) התקבלו ממאגר החתימות המולקולריות (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/). הסט המשולב של גנים אלו הוגדר כגנים הקשורים לאימונומטבוליה (IMRGs). רשימות גנים אלו שימשו כמקורות לביטוי שונה וניתוחי רשתות מאוחרים יותר.

ביטוי שונה וניתוח רשת קו-ביטוי של גנים משוקללים
גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) בין רקמות המוח והגליומה התקינות זוהו באמצעות חבילת R limma. נתוני הביטוי הותקנו במודל ליניארי ואחריו מתון אמפירי של בייס. גנים עם שינוי קפל |log₂| > 1.5 ושיעור גילוי שגוי (FDR) < 0.05 נחשבו כביטויים באופן מובהק באופן שונה. ניתוח רשת ביטוי משותף של גנים משוקלל (WGCNA) בוצע באמצעות חבילת R WGCNA. מדגמים חריגים הוצאו באמצעות קיבוץ היררכי. עוצמת סף הרכות הוגדר ל-β = 8 כדי להשיג אינדקס התאמה טופולוגי ללא קנה מידה (R2 ≥ 0.85) תוך שמירה על קישוריות ממוצעת מספקת. נבנו מטריצות חפיפה טופולוגית (TOM), והגנים קובצו למודולים בגודל מינימלי של 50 באמצעות אלגוריתם חיתוך עץ דינמי. הגנים העצמיים של המודול היו קשורים לתכונות קליניות, והמודול המזוהה ביותר עם גליומה (Pearson's r > 0.7, P < 1×10-10) נבחר לזיהוי גן המרכזי.

בניית מודלים פרוגנוסטיים מבוססי למידת מכונה
מסגרת LOOCV מקיפה הכוללת עשרה אלגוריתמים של למידת מכונה יושמה לבניית והערכת מודלים פרוגנוסטיים. בסך הכל, 101 תהליכי עבודה קומבינטוריים יושמו באמצעות קבוצת TCGA כמערך הנתונים להדרכה. גנים אימונוממטבוליים הקשורים לפרוגנוזה (IMRGs) זוהו לראשונה באמצעות רגרסיה חד-משתנית של Cox (P < 0.05). המודל האופטימלי נקבע על ידי מקסום מדד הקונקורדנס הממוצע של הארל (מדד C) בשלושה מערכי נתונים לאימות (CGGA693, CGGA325 ו-GSE43378). מודל RSF-Enet שנוצר (α = 0.3) הראה את הביצועים החיזויים הגבוהים ביותר ושמר על הכללה איתנה בין קבוצותעצמאיות 22.

TME וחדירת מערכת חיסון
כדי לאפיין באופן מקיף את הנוף האימונוגנומי, השתמשנו בגישה אנליטית רב-שכבתית. ראשית, רמות החדירה החיסונית והסטרומלית נמדדו באמצעות אלגוריתם ESTIMATE23. ביטוי שונה של מולקולות מפתח בנקודות ביקורת חיסוניות, כולל PDCD1, CTLA4 ו-LAG3, הוערך לאחר מכן באמצעות ניתוח מבוסס לימה, והקורלציות בין גני נקודות הביקורת הוצגו באמצעות מטריצות קורלציה. פרופילי מוטציות סומטיות מ-903 דגימות גליומה בקבוצת TCGA שימשו לחישוב ציוני עומס מוטציה של גידול (TMB), אי-יציבות מיקרו-סווייט (MSI) ודיספונקציה והדרה חיסונית של גידול (TIDE) כדי לחזות תגובות פוטנציאליות לאימונותרפיה. לאחר מכן חולקו המטופלים לארבע קבוצות פרוגנוסטיות לפי ציון משולב של מצב TMB (גבוה/נמוך) וסיכון (גבוה/נמוך), והושוו תוצאות הישרדות באמצעות ניתוח קפלן-מאייר.

ניתוח העשרה פונקציונלית
אונטולוגיית גנים (GO) וניתוחי העשרת מסלולים של אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) נערכו באמצעות clusterProfiler של חבילת R. תוצאות העשרה עם ערכי P מותאמים < 0.05 נחשבו מובהקות סטטיסטית. תהליכים ביולוגיים, רכיבים תאיים ותפקודים מולקולריים מיוצגים ביתר על המידה הוצגו באמצעות גרפים של נקודות וגרפים בר. רשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) נבנו באמצעות מסד הנתונים STRING (≥ 0.4) והוצגו ב-Cytoscape. מודולים פונקציונליים בתוך רשת ה-PPI זוהו באמצעות אלגוריתם MCODE. אינטראקציה בין גן לגן ורשתות ביטוי משותף נותחו בהמשך באמצעות GeneMANIA (https://string-db.org; ציון ביטחון ≥ 0.4) והוצגו ב-Cytoscape. מודולים פונקציונליים בתוך רשת ה-PPI זוהו באמצעות אלגוריתם MCODE. אינטראקציה בין גנים לרשתות ביטוי משותף וביטוי משותף נותחו בהמשך באמצעות GeneMANIA (https://genemania.org), שמשלב מידע על אינטראקציות פיזיות וגנטיות, מסלולים משותפים ודפוסי ביטוי משותף כדי להסיק אסוציאציות פונקציונליות פוטנציאליות.

דגימות קליניות
רקמות גליומה טריות (n = 6) ורקמות מוח לא גידוליות סמוכות (n = 6; נמצאות לפחות 3 ס"מ משפת הגידול ואושרו היסטולוגית כנטולות גידול) נאספו ממטופלים שעברו כריתה ראשונית של גליומה בבית החולים המסונפ ג'אנגג'ואו של אוניברסיטת פוג'יאן לרפואה. אף אחד מהמטופלים לא קיבל כימותרפיה או רדיותרפיה לפני הניתוח. כל האבחנות הפתולוגיות אושרו באופן עצמאי על ידי שני נוירופתולוגים לפי סיווג ארגון הבריאות העולמי (WHO) לשנת 2021 של גידולים במערכת העצבים המרכזית. מיד לאחר כריתה כירורגית, דגימות רקמה נשטפו במלח קר עם פוספט קר (PBS) להסרת שאריית דם, הוקפאו במהירות בחנקן נוזלי (-196°C), ונשמרו בטמפרטורה של -80°C עד להוצאת ה-RNA.

קווי תאים ותרבות תאים
קווי תאי גליובלסטומה אנושיים SHG44, U251, A172 ו-T98G, וכן תאי גליה אנושיים רגילים (HEB), התקבלו ממאגרים מאומתים ואושרו כי הם נקיים מזיהום מיקופלזמה לפני השימוש. התאים נשמרו במדיום Modified Eagle's Medium (DMEM, גלוקוז גבוה) של Dulbecco, עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין, בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO₂. התאים עברו כל 4-5 ימים עם הגעתם ל-80-90% מפגש מתאים. כדי לקבוע קווי תאים שמביעים ובקרת יתר של IRAIN, תאים הועברו עם וקטורים לנטיויראליים הנושאים את תמלול IRAIN באורך מלא או וקטור ריק כביקורת. שיבוטים יציבים נבחרו באמצעות פורומיצין (2 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 14 ימים. יעילות הבעה מופרזת אושרה על ידי PCR שעתוק הפוך כמותי (qRT-PCR) לפני הבדיקות במורד הזרם.

3- (4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפנילטרזוליום ברומיד (MTT)
התאים זרעו בלוחות של 96 בארות בצפיפות של 1 ×-104 תאים לבאר ב-100 מיקרו ליטר של מדיום תרבית מלא. לאחר 24, 48 ו-72 שעות לאחר הזרעה, נוספו לכל באר 20 מיקרוליטר של תמיסת MTT (5 מ"ג/מ"ל במי מלח מפוזר פוספט) ודגרו במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט הוסר, והוספו 150 מיקרוליטר דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להמיס את גבישי הפורמזן. הצלחת נערכה בעדינות במשך 10 דקות כדי להבטיח מסיסות מלאה. הספיגה נמדדה ב-490 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרופלט. קריאות רקע מבארות ריקות הוחסרו. חיאום התאים חושב ביחס לקבוצת הביקורת של 24 שעות (נקבע כ-1.0). כל הניסויים בוצעו עם שישה שכפולים טכניים ושלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים. הנתונים מבוטאים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD), והמובהקות הסטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן t דו-זנב.

ציטומטריית זרימה לאפופטוזיס (Annexin V - FITC/PI TINING)
התאים זרעו בנקודת מפגש של 60-70% וטופלו במשך 24 שעות בתנאים המצוינים. תאים צפים ותאים דביקים נאספו באמצעות טריפסין ללא EDTA, שולבו ונשטפו פעמיים עם PBS קר כקרח. כדורי התאים הושעו מחדש בבופר קשירת Annexin V (10 mM HEPES pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2) ב-1 ×10 6 תאים למ"ל. לכל דגימה, 100 מיקרוליטר של תלייה הודגרו יחד עם 5 מיקרוליטר של Annexin V-FITC ו-5 מיקרוליטר יוד פרופידיום (PI; 50 מיקרוגרם/מ"ל) בחושך למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הוספת 400 מיקרוליטר של בופר קישור, הדגימות נשמרו על קרח ונותחו תוך שעה על ציטומטר זרימה (488 ננומטר; 530/30 ננומטר ל-FITC ו->585 ננומטר ל-PI). נכללו ביקורות צבע יחיד וביקורת פלואורסצנציה מינוס אחת מתאימות לפיצוי. לפחות 10,000 אירועים נרשמו לכל דגימה. הנתונים נותחו באמצעות גייטינג רבעי: אוכלוסיות חיות (Annexin V⁻/PI⁻), אפופטוטיות מוקדמת (Annexin V⁺/PI⁻), אפופטוטיות מאוחרות (Annexin V⁺/PI⁺), ונמקיות (Annexin V⁻/PI⁺). דווחו אחוזים של תאים אפופטוטיים מוקדמים + מאוחרים (ממוצע ± SD, n = 3).

PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)
סך ה-RNA בודד באמצעות תגובת חומצה פנול-גואנידיניום בהתאם לפרוטוקול היצרן. טוהר ה-RNA אושר באמצעות ספקטרופוטומטריה (A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.1), והשלמות אושרה על ידי אלקטרופורזה ג'ל (מספר שלמות RNA ≥ 7). מיקרוגרם אחד של RNA כולל טופל ב-DNase I והועתק לאחור בתגובה של 20 מיקרוליטר באמצעות הקסמרים אקראיים ופריימרים אוליגו(dT). התגובה בוצעה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ו-85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. PCR כמותי בוצע במערכת של 10 מיקרוליטר שכללה 5 מיקרוליטר של 2× SYBR Green Master Mix, 0.3 מיקרומולר לכל פריימר, ו-1 מיקרוליטר cDNA (≈ 20 ng RNA שקול). תנאי המחזור התרמי היו 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריהם 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ולאחר מכן ניתוח עקומת התכה מ-65 מעלות צלזיוס עד 95 מעלות צלזיוס במרווחים של 0.3 מעלות צלזיוס. כל התגובות בוצעו בשלוש כפילות, יחד עם בקרות ללא תבנית ו-RT מינוס. ערכי Ct > 35 או שכפול טכני של SD > 0.5 הוצאו. הביטוי היחסי חושב באמצעות שיטת 2⁻ΔΔCt, כאשר GAPDH משמש כבקרה פנימית. דווחו ערכי ממוצע ± SD משלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים, והבדלים בקבוצות נותחו באמצעות מבחן t דו-זנב.

ניתוח כתמים מערביים
התאים עברו פירוק על קרח בבופר RIPA (50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, 1% NP-40, 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, 0.1% SDS) בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז. הליזטים דוגרו במשך 30 דקות על קרח עם מערבולת לסירוגין ונוקרו בצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ריכוזי החלבון נמדדו באמצעות מבחן BCA, הותאמו ל-1-2 מיקרוגרם/מיקרוליטר, וערבבו 1:3 עם 4× בופר Laemmli (בופר סופי 1× המכיל 100 mM DTT). הדגימות עברו שינוי טמפרטורה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. כמויות שוות של חלבון (50 מיקרוגרם) נפתרו על ידי 12% SDS-PAGE ב-100 וולט במשך 90 דקות והועברו אלקטרו לממברנות PVDF ב-250 mA למשך 90 דקות. הממברנות נחסמו עם 5% חלב דל שומן ב-TBST (0.1% Tween-20) למשך שעה בטמפרטורת החדר (או 5% BSA לפוספופרוטאנים) ודגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד IGF1, IGF1R, JAK2, p-JAK2 (Y1007/1008), STAT3, p-STAT3 (Y705), BIRC5 ו-β-אקטין (דילול טיפוסי 1:1000, β-אקטין 1:5000). לאחר שלוש שטיפות של 10 דקות ב-TBST, הממברנות דגרו בנוגדן משני מצמיד ל-HRP (1:5000) למשך שעה בטמפרטורת החדר, נשטפו שוב ופותחו באמצעות מצע כימילומינצנטי. עוצמות הרצועות נמדדו באמצעות ImageJ, נורמל ל-β-אקטין או חלבון כולל, והובאו לביטוי כממוצע ± SD משלושה ניסויים עצמאיים.

אימונוציטוכימיה
תאים שגדלו על כיסויי זכוכית סטריליים נשטפו פעמיים עם PBS וקיבעו ב-4% פאראפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש שטיפות PBS, התאים חודרו עם 0.2% Triton X-100 למשך 10 דקות, נחסמו עם אלבומין סרום בקר (BSA) של 5% למשך שעה אחת, ודגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדן אנטי-CD31 ראשוני (דילול של 1:200 ב-1% BSA). לאחר שלוש שטיפות PBS, התאים הוגברו בנוגדן משני מצומד אלקסה פלואור (דילול 1:500) למשך שעה בחושך, צובעו ב-DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל, 5 דקות), והותקנו במדיום אנטיפייד. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה באותן הגדרות חשיפה והגבר. אחוז השטח החיובי ל-CD31 נמדד בחמישה שדות לא חופפים שנבחרו באקראי לכל דגימה באמצעות תוכנת ImageJ. בדיקה זו בוצעה במודלים תאיים ולא בחתכי רקמה.

ניתוח סטטיסטי
בוצעו ניתוחים סטטיסטיים באמצעות גרסה 4.3.0 של R יחד עם החבילות הנלוות אליה. להשוואת משתנים קטגוריים, נעשה שימוש במבחן חי-בריבוע, בעוד שמשתנים רציפים הוערכו באמצעות מבחן סכום הדרגה וילקוקסון או מבחן T. הערכת משתנים רציפים בוצעה באמצעות מקדם המתאם של פירסון. ניתוחי הישרדות בוצעו באמצעות חבילת ההישרדות, שכללה מודלים של סיכונים פרופורציונליים של Cox ויצירת עקומות קפלן-מאייר, כאשר ספי הסטרטיפיקציה האופטימליים נקבעו על ידי חבילת הסורוויינר והנוסחה Riskscore = משוואה 1. חבילת CompareC שימשה להערכת מדדי C של משתנים שונים. עקומת מאפייני ההפעלה של המקלט (ROC), שנועדה לחזות משתנים קטגוריים בינאריים, נוצרה באמצעות חבילת pROC. בנוסף, השטח התלוי בזמן תחת עקומת ROC (AUC) עבור מדדי הישרדות נותח באמצעות חבילת timeROC. כל המבחנים הסטטיסטיים בוצעו בגישה דו-צדדית. רמת מובהקות של P < 0.05 נחשבה מובהקת סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

IRAIN מופחת בגליומה ומקושר לתסמינים קליניקופתולוגיים שליליים
תהליך הניתוח מוצג באיור 1. ביטוי IRAIN הוערך לראשונה באמצעות qRT-PCR באסטרוציטים ראשוניים, רקמות גליומה וקווי תאי גליומה. רמות IRAIN ירדו משמעותית הן ברקמות גליומה בדרגה נמוכה והן בדרגה גבוהה ובכל ארבעת קווי התאים של גליומה (SHG44, A172, U251 ו-T98G) בהשוואה לאסטרוציטים תקינים (איור 2A). בהתאם לממצאים אלו, ניתוח נתוני RNA-seq מקבוצות TCGA ו-CGGA הראה ביטוי IRAIN נמוך משמעותית בדגימו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

גליומה נותרה אחת מהמאירויות הקטלניות ביותר במערכת העצבים המרכזית, המאופיינת בהטרוגניות עמוקה תוך-גידולי ועמידות לטיפול קונבנציונלי. למרות כריתה כירורגית בשילוב כימורטיפוליה, החזרה והתמותה נשארים גבוהים, ושיעור ההישרדות החציוני של המטופלים, במיוחד אלו עם גליובלסטומה, הראה שיפור מוגבל בעשורים האחרונים 4,24. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שתכנות מחדש מטבולי ודיכוי מערכת החיסון בתוך מיקרו-סביבת הגידול (TME) הם גורמים מרכזיים לאגר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לכל המשתתפים והחוקרים המעורבים בפרויקט ביטוי גנוטיפ-רקמה (GTEx) ולמאגרי הנתונים של TCGA ו-CGGA על שיתוף הנתונים הזמינים. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט טכנולוגיית הבריאות של מחוז פוג'יאן (2024GG01010154) ופרויקט טיפוס תחנות עבודה דוקטורט של בית החולים ג'אנגג'ואו (PDA202306). המממן סיפק מימון למחקר שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת אפופטוזיס Annexin V-PI  סאות'רן ביוטכנולוגיה, בירמינגהם, אלבמה, ארה"בNAמשמש להערכת אפופטוזיס
ערכת אפופטוזיס AnnexinV-PIביוטכנולוגיה דרומית10010-02משמש להערכת אפופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה.
אנטי-IGF1, אנטי-IGF1R, אנטי-JAK2, אנטי-STAT3, אנטי-סורביווין, אנטי-&בטא;-אקטיןאבקאםAB182408, AB108596, AB109085, AB76424, AB8227נוגדנים המשמשים לניתוח Western Blot של מסלולי איתות.
BiocManagerקראן1.30.25להתקין ולנהל חבילות ביוקונדונט ב-R & GE; 3.6.
מערכת Bio-Rad Cfx96ביו-קונדוקטור1.5.1גישה תכנותית לחלבון STRING– אינטראקציות חלבון.
קרטקראן0.4ROC/AUC תלוי זמן למודלים של הישרדות.
אטלס גנום גליומה סיני (CGGA)NACGGA693 ו-CGGA325 משמש לתכנון ואימות מודלים
Clusterprofilerביו-קונדוקטור2.18.0ניתוח קבצי MAF; חשב את עומס המוטציה של הגידול (TMB) ונוף המוטציה.
קורפלוטקראן3.5.0תכנון כללי (תרשימי קופסה, גרפים לכינור, פיזור, קווי מגמה).
קוקסבוסטקראן7.3-60stepAIC לבחירת מודל קוקס מדרגת-שלבית.
Data.Tableקראןreadr2.1.5קריאה מהירה של קבצים מוגדרים; טיפול עמיד ב-UTF-8.
מינוןביו-קונדוקטור3.17.0הערות גנים אנושיים (Entrez, Ensembl, מיפוי סמלים).
חיתוך עץ הדינמיקראן1.73ניתוח רשתות ביטוי משולב של גנים משוקלל; pickSoftThreshold, TOM, זיהוי מודול.
אדגרביו-קונדוקטור3.56.2ביטוי דיפרנציאלי (מודלים של voom/ליניארי); וילקוקסון/אמפיריקל בייס; קלטים של Volcano/Heatmap.
עלילת העשרביו-קונדוקטור3.26.2העשרת אונטולוגיית מחלות ועוזרי GSEA (בשימוש עם clusterProfiler).
פלאשקלאסטקראן1.63-1חיתוך ענף אדפטיבי לזיהוי מודולי WGCNA.
GBMקראן1.12פיקח על רכיבים עיקריים לניתוח הישרדות.
אוסף ביטוי גנים (GEO)NAGSE43378משמש לתכנון ואימות מודלים
GEOqueryביו-קונדוקטורNAהורד ופרש מערכי נתונים של GEO.
Ggplot2קראן1.0.12מפות חום מוכנות לפרסום של חתימות ביטוי.
Glmnetקראן3.3.1יער הישרדות אקראי לתוצאות מצונזרות נכון.
נוגדנים משניים אנטי-ארנבים המסומנים על ידי פרוקסידאז חזרתאבקאםab6721נוגדנים משניים לגילוי ב-Western Blot.
קווי תאים של גליובלסטומה אנושית (SHG44, U251, A172, T98G)אוסף תרביות רקמה אמריקאיNAקווי תאים של גליובלסטומה אנושית למחקר גליומה. תאים תורבדו ב-DMEM + 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין.
איגרףקראן10.0.1גישה לקבוצות גנים של MSigDB (למשל, MRGs מטבוליים); מסגרות מסודרות ונוחות.
תוכנת Image J  מדיה סייברנטיקס, ארה"ב152משמש להמחשה
וקטור לנטיוויראלי המקודד lncRNA-IRAINGeneChem, שנגחאי, סין  NAוקטורים לנטיויראליים המשמשים לטרנספקציה של גליומה ותאי HEB להקמת שיבוטים יציבים.
לימהביו-קונדוקטור3.48.0תיקון אצווה (ComBat) וניתוח משתנים חלופיים.
Maftoolsביו-קונדוקטור1.52.0הארל' מדד הקונקורדנס s (מדד C) וכלי השוואת הישרדות.
מסהקראן4.1-8מודלים של Cox עם עונש: Lasso, Ridge ו-Elastic Net.
Msigdbrקראן0.0.5שיטות מכונת וקטור תמיכה לנתוני הישרדות.
MTTסיגמא-אלדריץ'M2128משמש לבדיקות התרבות תאים.
תאי גליה תקינים (HEB)אוסף תרביות רקמה אמריקאיNAקו תאי גליאל אנושי תקין למחקרי השוואה. מעודד ב-DMEM + 10% FBS.
Org.Hs.Eg.Dbביו-קונדוקטור4.8.3העשרה ו-GSEA של GO/KEGG; תומך במספר סוגי מזהים.
Pheatmapקראן2.0.0דקדוק במדעי הנתונים; כולל את DPLYR, Tidyr, Purrrr, Ggplot2 לניהול ותכנון.
Plsrcoxקראן1.5הגברה מבוססת הסתברות למודלים של קוקס.
ממברנות PVDFמיליפורIPVH00010ממברנות המשמשות להעברת חלבון לאחר SDS-PAGE.
Randomforestsrcקראן6.0-94דגימה מחדש מאוחדת (כולל LOOCV), רשתות כיוון וצינורות מודלים.
רידרקראןNAשלף מטריצות/פנוטיפים מ-UCSC Xena (למשל, מרכזי TCGA/GTEx).
SDS-Page Gel (12%)ביו-ראד185-5096המערכת המשמשת ל-PCR כמותי.
Stringdbביו-קונדוקטור1.20.3ויזואליזציה לתוצאות העשרה (dotgraph, cnetplot, ridgegraph).
Superpcקראן1.7.7רגרסיה חלקית של ריבועים קטנים, מותאמת למודלים של קוקס.
Survcompביו-קונדוקטור3.42.4סופר נירמול והערכת פיזור כשנדרש (אופציונלי, משלים limma voom).
הישרדותקראן1.01-2קיבוץ היררכי מהיר בשימוש WGCNA (אופציונלי).
Survivalsvmקראן2.2.2מידול רגרסיה מוגברת כללית (הגברת גרדיאנט).
סורבמינרקראן3.8-3מודלים של סיכונים פרופורציונליים של קוקס; קפלן– מאייר מתעקל.
TCGAbiolinksביו-קונדוקטורT9039גישה תכנותית לנתוני TGA; הורד/הכין נתוני ביטוי וקליניים.
תוכנית אטלס הגנום לסרטן (TCGA)NAhttps://www.cancer.gov/tcga; 175 GBM ו-534 LGGמשמש לתכנון ואימות מודלים
טידיוורסקראן1.17.6מניפולציה של נתונים בביצועים גבוהים עבור מטריצות וטבלאות גדולות.
טיימרוקקראן0.5.0ויזואליזציה של KM ורינדור טבלת סיכונים.
טריזולInvitrogen15596026תגובת חילוץ RNA מתאים.
UCSC זינהNAhttps://xenabrowser.net/datapages/משמש לתכנון ואימות מודלים
Ucscxenatoolsביו-ראד4561044משמש להפרדת חלבונים בניתוח Western Blot.
WGCNAקראן0.95מטריצות קורלציה לגנים של נקודות ביקורת ויחסי תכונות.

מקורות

  1. Goodenberger, M. L., Jenkins, R. B. Genetics of adult glioma. Cancer Genet. 205 (12), 613-621 (2012).
  2. Cordier, D., Krolicki, L., Morgenstern, A., Merlo, A. Targeted radiolabeled compounds in glioma therapy. Semin Nucl Med. 46 (3), 243-249 (2016).
  3. Jiang, T., et al. Clinical practice guidelines for the management of adult diffuse gliomas. Cancer Lett. 499, 60-72 (2021).
  4. Huang, X., et al. Immune-Related Gene SERPINE1 Is a Novel Biomarker for Diffuse Lower-Grade Gliomas via Large-Scale Analysis. Front Oncol. 11, 646060(2021).
  5. Cole, A. P., et al. Microglia in the Brain Tumor Microenvironment. Adv Exp Med Biol. 1273, 197-208 (2020).
  6. Vitale, I., Manic, G., Coussens, L. M., Kroemer, G., Galluzzi, L. Macrophages and metabolism in the tumor microenvironment. Cell Metab. 30 (1), 36-50 (2019).
  7. Cheng, W., et al. Bioinformatic profiling identifies an immune-related risk signature for glioblastoma. Neurology. 86 (24), 2226-2234 (2016).
  8. Rodriguez, S. M. B., et al. Glioblastoma and immune checkpoint inhibitors: a glance at available treatment options and future directions. Int J Mol Sci. 25 (19), (2024).
  9. Arrieta, V. A., et al. Immune checkpoint blockade in glioblastoma: from tumor heterogeneity to personalized treatment. J Clin Invest. 133 (2), (2023).
  10. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69(2020).
  11. Wang, Q., et al. Tumor evolution of glioma-intrinsic gene expression subtypes associates with immunological changes in the microenvironment. Cancer Cell. 32 (1), 42-56.e6 (2017).
  12. Jansen, J. A., Omuro, A., Lucca, L. E. T-cell dysfunction in glioblastoma: a barrier and an opportunity for the development of successful immunotherapies. Curr Opin Neurol. 34 (6), 827-833 (2021).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324 (5930), 1029-1033 (2009).
  14. Dong, X., et al. Tumor metabolism-rewriting nanomedicines for cancer immunotherapy. ACS Cent Sci. 9 (10), 1864-1893 (2023).
  15. Kesarwani, P., Prabhu, A., Kant, S., Chinnaiyan, P. Metabolic remodeling contributes towards an immune-suppressive phenotype in glioblastoma. Cancer Immunol Immunother. 68 (7), 1107-1120 (2019).
  16. Xu, X., et al. LncRNA as potential biomarker and therapeutic target in glioma. Mol Biol Rep. 50 (1), 841-851 (2023).
  17. Sun, J., et al. A novel antisense long noncoding RNA within the IGF1R gene locus is imprinted in hematopoietic malignancies. Nucleic Acids Res. 42 (15), 9588-9601 (2014).
  18. Wang, J. Y., Liu, D., Meng, Y. D., Guo, Y. Y., Zhao, M. Aberrant allelic switch of antisense lncRNA IRAIN may be an early diagnostic marker in laryngeal cancer. Oncol Lett. 20 (4), 65(2020).
  19. Pian, L., et al. Targeting the IGF1R pathway in breast cancer using antisense lncRNA-mediated promoter cis-competition. Mol Ther Nucleic Acids. 12, 105-117 (2018).
  20. Salminen, A., Kaarniranta, K., Kauppinen, A. Insulin/IGF-1 signaling promotes immunosuppression via the STAT3 pathway: impact on the aging process and age-related diseases. Inflamm Res. 70 (10-12), 1043-1061 (2021).
  21. Cortés-Ballinas, L., López-Pérez, T. V., Rocha-Zavaleta, L. STAT3 and the STAT3-regulated inhibitor of apoptosis protein survivin as potential therapeutic targets in colorectal cancer (Review). Biomed Rep. 21 (6), 175(2024).
  22. Liu, Z., et al. Machine learning-based integration develops an immune-derived lncRNA signature for improving outcomes in colorectal cancer. Nat Commun. 13 (1), 816(2022).
  23. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  24. Ostrom, Q. T., et al. The epidemiology of glioma in adults: a "state of the science" review. Neuro Oncol. 16 (7), 896-913 (2014).
  25. Weidner, N., Semple, J. P., Welch, W. R., Folkman, J. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med. 324 (1), 1-8 (1991).
  26. Perrin, S. L., et al. Glioblastoma heterogeneity and the tumour microenvironment: implications for preclinical research and development of new treatments. Biochem Soc Trans. 47 (2), 625-638 (2019).
  27. Justus, C. R., Sanderlin, E. J., Yang, L. V. Molecular connections between cancer cell metabolism and the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 16 (5), 11055-11086 (2015).
  28. Boedtkjer, E., Pedersen, S. F. The acidic tumor microenvironment as a driver of cancer. Annu Rev Physiol. 82, 103-126 (2020).
  29. Bernhard, C., Reita, D., Martin, S., Entz-Werle, N., Dontenwill, M. Glioblastoma metabolism: insights and therapeutic strategies. Int J Mol Sci. 24 (11), 9137(2023).
  30. Kesarwani, P., Kant, S., Prabhu, A., Chinnaiyan, P. The interplay between metabolic remodeling and immune regulation in glioblastoma. Neuro Oncol. 19 (10), 1308-1315 (2017).
  31. Pellegrino, M., et al. Manipulating the tumor immune microenvironment to improve cancer immunotherapy: IGF1R, a promising target. Front Immunol. 15, 1356321(2024).
  32. Zhang, W., et al. Polarization of macrophages in the tumor microenvironment is influenced by EGFR signaling within colon cancer cells. Oncotarget. 7 (46), 75366-75378 (2016).
  33. DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17/regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667.e10 (2020).
  34. Pennati, M., Folini, M., Zaffaroni, N. Targeting survivin in cancer therapy: fulfilled promises and open questions. Carcinogenesis. 28 (6), 1133-1139 (2007).
  35. Sah, N. K., Khan, Z., Khan, G. J., Bisen, P. S. Structural, functional and therapeutic biology of survivin. Cancer Lett. 244 (2), 164-171 (2006).
  36. Altieri, D. C. Survivin apoptosis: an interloper between cell death and cell proliferation in cancer. Lab Invest. 79, 1327-1333 (1999).
  37. Feng, J., et al. A novel long noncoding RNA IRAIN regulates cell proliferation in non-small cell lung cancer. Int J Clin Exp Pathol. 8 (10), 12268-12275 (2015).
  38. Zhang, H., Zhang, D., Luan, X., Xie, G., Pan, X. Inhibition of the signal transducers and activators of transcription (STAT) 3 signalling pathway by AG490 in laryngeal carcinoma cells. J Int Med Res. 38 (5), 1673-1681 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים