מאמר שיטה

שיפור מסכי CRISPR-Cas9 בתאי CAR T – שיטה משופרת להכנת ספרייה

DOI:

10.3791/69721

⸱

2 בינואר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hemato-Oncology Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 2Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer (CIBERONC), 3Computational Biology and Translational Genomics Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 4Cancer Center Clinica Universidad de Navarra (CCUN), 5Data Science and Artificial Intelligence Institute (DATAI), Universidad de Navarra, 6Hematology and Cell Therapy Department, Clinica Universidad de Navarra, IdiSNA

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו פרוטוקול סקר CRISPR-Cas9 אופטימלי לתאי CAR T ראשוניים. על ידי הפחתת העברת ה-gDNA באמצעות עיכול אנזימטי ומשיכת קלטת sgRNA, גישה זו ממזערת ארטיפקטים של PCR, ומבטיחה זיהוי מדויק של sgRNA וזיהוי חזק של מטרות גנים פונקציונליות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפולי קולטני אנטיגן כימרי (CAR) לתאי T הוכיחו יעילות מרשימה במספר ממאירות המטולוגיות, אך הצלחתם לא שוחזרה במלואה בגידולים מוצקים. יתרה מזאת, אפילו בסרטן המטולוגי, הישנות לאחר הזרקת תאי T של CAR ממשיכה לפגוע בתוצאות ארוכות טווח. אתגרים אלו מדגישים את הצורך הדחוף לפתח אסטרטגיות שמשפרות את היעילות, ההתמדה, התמודדות עם גידולים ועמידות מתווכת מיקרו-סביבה. פלטפורמות סקר המבוססות על חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR)-Cas9, מקובצות באופן קבוע, מספקות גישה עוצמתית לזיהוי שיטתי של גנים המווסתים את תפקוד תאי ה-CAR T. על ידי קישור הפרעות גנטיות לתוצאות פנוטיפיות, בדיקות אלו מאפשרות גילוי מסלולים השולטים בהפעלה, התפשטות, יצירת זיכרון וטיטוטוקסיות. תהליכי עבודה סטנדרטיים כוללים טרנסדוקציה של מספר משמעותי של תאים עם ספריית RNA מונחה (sgRNA) יחידה, עריכה בתיווך Cas9, בחירת תאים ערוכים, והגברת PCR של קלטות sgRNA מ-DNA גנומי (gDNA) לפני ריצוף. עם זאת, הגברה של PCR באמצעות כמויות גדולות של gDNA מציבה אתגרים משמעותיים ולעיתים נכשלת בהגברה ושליפת sgRNA באופן סלקטיבי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול סקר CRISPR-Cas9 מאופטמלי, אותו בדקנו על תאי CAR T ראשוניים בבני אדם. השיטה כאן כוללת שלב ביניים במהלך הכנת ספריית sgRNA, שמפחית את העברת ה-gDNA באמצעות עיכול אנזימטי ומשיכה סלקטיבית של קלטת sgRNA, ובכך משפרת את יעילות ההגברה הראשונה של ה-PCR. שינוי זה אפשר לנו לשלוף מידע sgRNA על מסכי תאי ה-CAR T שלנו, שהיו בלתי מושגים בניסיונותינו הקודמים באמצעות פרוטוקולי הגברה PCR מסורתיים של 1 ו-2 שלבים. לסיכום, תהליך העבודה האופטימלי הזה מאפשר הכנת ספריית סקר CRISPR בדגימות מאתגרות ומאפשר זיהוי גורמים גנטיים מרכזיים שניתן למקד אותם לשיפור היעילות הטיפולית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימונותרפיה חוללה מהפכה בטיפול בסרטן, והציעה אסטרטגיות חדשניות לרתום ווויסות מערכת החיסון. מבין אלה, טיפול בתאי T בקולטני אנטיגן כימריים (CAR) הפך לאחת הגישות הטרנספורמטיביות ביותר. טיפול זה כולל הנדסה גנטית של תאי ה-T של המטופל מחוץ לחי עם קולטן סינתטי שנועד לזהות אנטיגן גידולי ספציפי, ובכך לשפר את פעילות האנטי-גידולים1. תאי CAR T הראו הצלחה מרשימה במאירויות המטולוגיות, עם תוצאות שנעות בין הפוגות קצרות ועד הישרדות ממושכת ללא מחלה עם רעילות מינימלית במטופלים שקיבלו טיפולים ממוקדים CD19 או BCMA2. עד כה, ה-FDA אישר שבעה מוצרי תאי CAR T לסרטן המטולוגי3. למרות ההתקדמות הזו, עדיין קיימות מגבלות משמעותיות. אתגרים נובעים ממוצר תאי CAR T עצמו, לעיתים מושפעים מתהליך הייצור או מכושר תאי ה-T של המטופל, אשר עשויים להיפגע מהתקדמות המחלה, טיפולים קודמים או גיל. מנגנוני עמידות פנימית לגידולים, כגון ירידה באנטיגן, עלולים גם הם לפגוע ביעילות4. יתרה מזאת, מיקרו-סביבת הגידול המדכאת חיסון מציבה מחסום נוסף שמגביל מאוד את ההתמדה והתפקוד של תאי CAR T, במיוחד אצל מטופלים עם גידול מוצק5. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף לשפר את היעילות הראשונית והארוכת טווח של טיפולי תאי T ב-CAR.

הופעת עריכת הגנים ב-CRISPR-Cas9 סיפקה כלים רבי עוצמה לניתוח תפקוד הגנים באמצעות גישות סקר בקנה מידה רחב. במבחנים אלו, התאים מועברים לספריית RNA מדריך יחיד (sgRNA), בדרך כלל באמצעות וקטורים לנטיויראליים, מה שמבטיח sgRNA אחד לכל תא ואינטגרציה גנומית יציבה. לאחר עריכה ובחירה בתיווך Cas9 של תאים מועברים, מופק DNA גנומי (gDNA), וקלטות sgRNA מוגברות על ידי PCR להכנת ספרייה. ריצוף בתפוקה גבוהה מאפשר לכימות התפלגות sgRNA בין פנוטיפים שונים, ובכך לזהות גנים שמווסתים באופן חיובי או שלילי את התהליך במחקר6.

סקר CRISPR מיושם באופן נרחב לחקר ביולוגיית תאי T ובזמן האחרון גם לשיפור ביצועי תאי CAR T. מסכים כלליים של גנום זיהו רגולטורים של תהליכי תאי T בסיסיים, כולל הפעלה, התרבות והתמיינות. לדוגמה, FAM49B זוהה כרגולטור של איתות קולטני תאי T7, בעוד SOCS1, TCEB2, RASA2 ו-CBLB הוכחו כחיוניים להתרבות לאחר גירוי8. מעבר למסלולים המרכזיים הללו, סקר CRISPR גם הבהיר גנים המעורבים בזיכרון ובעייפות של תאי T. מחקרים ב-vivo זיהו את Fli1 כמועמד לשיפור תגובות האפקטור מבלי לפגוע בזיכרון או תשישות9, ואת משחזר הכרומטין Arid1a כרגולטור שאובדנו מפחית את התשה של תאי T10. גם רגולטורים של התמיינות T עוזר סוג 2 (Th2) אופינו בגישה זו11. באמצעות ספריית sgRNA מותאמת המיועדת ל-25 קינאזות, נמצא כי p38 מקדם התרחבות, יצירת זיכרון והגנה מפני לחץ חמצוני וגנומי12. באופן דומה, REGNASE-1 knockout בתאי T ב-CD8+ העניק פנוטיפ אפקטור ארוך טווח ששיפר את השליטה בגידול במודלים של מלנומה ולוקמיה13. סקרים גנומיים נוספים זיהו את Dhx37 כרגולטור להפעלת תאי T וטוטוקסיות14, בעוד ש-LTBR וגנים נוספים אומתו כמחזקים את תפקוד תאי T בתאי CAR T ו-γδ T15. לאחרונה יותר, סקר CRISPR יושם ישירות בתאי CAR T, וחשף מטרות חדשות כגון PRODH2, אנזים המעורב במטבוליזם של פרולין שמגביר את פעילות האנטי-גידולים של CAR T16, ו-TLE4 ו-IKZF2, ששביתתם שיפרה את יעילות CAR T בגליובלסטומה17.

שלב קריטי במסכי CRISPR הוא בדיוק ההגברה הסלקטיבית של קלטות sgRNA מכמויות גדולות מאוד של gDNA, אתגר שקשה לעקוף לאור המספר העצום של תאים בבדיקות CRISPR. הגברת PCR מכמויות כה גדולות של העברת DNA מציבה מספר אתגרים טכניים, כולל צפיפות מולקולרית שמגבילה את הדיפוזיה הפיזית של מולקולות DNA ופולימראז, קישור זמני לא ספציפי של הפריימרים והפולימראז לרקע DNA, הגברה מחוץ למטרה שגורמת לדלדול הפריימר, או סגירתMg2+ על ידי עמוד השדרה של פוספט DNA, בין אתגרים נוספים18. 19, 20, 21. לעיתים קרובות אלה גורמים לכשל PCR ו/או הטיה. כדי להקל על בעיות אלו, הוצעו אסטרטגיות שונות, כולל הפרדת הגברת sgRNA מהוספת מתאם לשני שלבים22 של PCR, שימוש בהעשרת מטרה עם אוליגוס ביוטינילציה ולכידת חרוזים מגנטיים23,24, או תכנון פלסמידים עם אתרי הגבלה משני צידי קסטת sgRNA להעשרת מקטעים25.

במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול סקר CRISPR-Cas9 אופטימלי לתאי CAR T ראשוניים בבני אדם. ספריית ה-CRISPR שבה משתמשים היא Brunello Kinome 1, ספרייה המכילה 3052 sgRNA ייחודיים באורך 20nt, המיועדים ל-763 גני קינאז אנושיים (4 sgRNA לכל מטרה). תאי T בודדו באמצעות סלקציה מגנטית חיובית CD4+ ו-CD8+ מתוך חלקי דגימות דם מונו-גרעיניים מעשירים ב-PBMC של תורמים בריאים. עם ההפעלה עם אנטי-CD3 ואנטי-CD28, תאי T נדבקו בספריית הסקר של CRISPR, ואז הועברו ללנטיווירוס CAR. התאים הורחבו, ואז הונקלטו להכנסת חלבון Cas9. תאים נושאי CRISPR נבחרו עם פורומיצין, ותאי T חיוביים ל-CAR מוינו. לאחר ההוצאה, ה-DNA הגנומי עוכל באמצעות אנזימי הגבלה (RE), והקטעים המכילים sgRNA נמשכו למטה באמצעות לכידת ביוטין פרוב-סטרפטווידין. לאחר מכן, sgRNA הוגבר ואנדקס סלקטיבי באמצעות שני PCRים רצופים, והספריות שהתקבלו סודרו. על ידי שילוב שלב ביניים להפחתת העברת ה-gDNA, הצלחנו לשלוף ולהגביר באופן סלקטיבי את ה-sgRNA הרלוונטי שלנו, מה שמאפשר לנו לחקור את תפקיד הקינאזות בתאי CAR T.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה בוצע בהתאם להנחיות אוניברסיטת נווארה. כל הנבדקים קיבלו הסכמה מדעת בכתב. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. בידוד והפעלה של תאי T

  1. בידוד PBMC
    1. איסוף דגימות דם מתורמים באמצעות צינורות EDTA (אתילנדיאמין-טטראצטית), העבר דגימות דם לחצוצרות קונית של 50 מ"ל, ודילל דם באמצעות PBS (דילול 1:1).
    2. הוסף 15 מ"ל מדיום גרדיאנט צפיפות לתחתית צינור קוני של 50 מ"ל (צפיפות עבור PBMCs: 1.07). לאחר מכן, הוסיפו בזהירות 25 מ"ל דם מדולל מעל שכבת מדיום גרדיאנט הצפיפות (המהירות האיטית ביותר של בקר הפיפטה). צנטריפוגה ל-30 דקות ב-800 × גרם בלי בלם.
    3. אסוף טבעת/שכבת PBMCs עם פיפטת פסטר לתוך צינור קוני של 50 מ"ל והוסף PBS לנפח כולל של 50 מ"ל לכביסה. צנטריפוגה ב-650 × גרם למשך 8 דקות. זרוק את הסופרנטנט.
      הערה: בדוק את עכירות הסופרנטנט כדי לוודא שאין תאים שם. אם יש ספק, חלקו את המתלים למספר כפול של צינורות חרוטיים בגודל 50 מ"ל, הוסיפו PBS עד 50 מ"ל, וחזרו בצנטריפוגה.
    4. תשעה מחדש ב-50 מ"ל של PBS. לספור עם אקרידין אורנג'-פרופידיום יודיד (AOPI) במונה תאים. צנטריפוגה ב-650 × גרם למשך 8 דקות.
  2. בחירה מגנטית ל-CD4 ו-CD8
    1. הכינו בופר מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS): PBS, EDTA 2.5 מיקרומטר, BSA 0.5% וסינון דרך 0.2 מיקרון.
    2. החזירו PBMCs ל-80 מיקרו-ליטר של FACS סטרילי לכל 10 ×-10 6 תאים והוסף 10 מיקרו-ליטר מיקרו-חרוזים CD4 ו-10 מיקרוליטר מיקרו-חרוזים CD8 לכל 10 ×-10 6 תאים. דגרו 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף 10 מ"ל של בופר FACS וצנטריפוגה ל-8 דקות ב-650 × גרם. השליכו את הסופרנטנט לחלוטין.
    4. החזר ל-500 מיקרוליטר ל-1 ×-10-8 תאים של FACS Buffer בצינור קוני של 15 מ"ל.
      הערה: מסלול יכול להכיל 200 על 10 תאיםבגודל 6 תאים.
    5. השתמש בתוכנית Possel לבידוד AutoMacs (מיין תאים מגנטיים מהיר).
    6. תוסיף עד 10 מ"ל PBS, תספור עם AOPI במונה תאים פלואורסצנטיים, ותצנטריפוגה ב-650 × גרם למשך 8 דקות.
    7. השעתי תאים 1 x 106/מ"ל במדיום גדילה של תאי T המכיל 3% סרום אנושי (HS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 625 IU/mL אינטרלוקין (IL)-7, 85 IU/mL IL-15. הוסף 10 מיקרוליטר של תגובת גירוי תאי T לכל 1 מ"ל וערבב היטב. פלטה של 2 מ"ל לכל באר בפלטת 24 בארות (p24w) ודגירה ל-24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

2. ייצור תאי CAR T וסקר CRISPR

  1. זיהום ספרייה והעברת CAR
    1. הוסף את כמות ספריית ה-CRISPR של לנטיווירוס (למשל, ספריית Brunello Kinome 1). ראו טבלה משלימה 1), שנקבעה במבחן טיטרציה, ו-8 מיקרוגרם/מ"ל פוליברן.
    2. זיהום באמצעות צנטריפוגציה ב-700 x גרם למשך שעה ו-30 דקות ב-32 מעלות צלזיוס.
    3. החלף מדיום בתווך גידול תאי T טרי המכיל 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 ([תא] סופי =10 6 תאים/מ"ל).
    4. לאחר 6 שעות, מוסיפים את הכמות המתאימה של וקטור הלנטי-וירוס של CAR למספר זיהום (MOI) של 3 ולדגר במשך 4 ימים.
  2. אלקטרופורציה של Cas 9
    1. אסוף תאי T של CAR, שטוף פעם אחת עם PBS, וספור תאים עם AOPI במד תאי פלואורסצנטי.
    2. הכינו 4 מיקרומום Cas9 בבופר אלקטרופורציה.
    3. החזירו תאי CAR T ל-50 מיקרוליטר לכל 5 ×-10תאים. מערבבים והוסיפו בזהירות 50 מיקרו ליטר של תליית תא בכל באר של רצועת קובטה רב-בארית מבלי ליצור בועות. לאחר מכן, בעזרת קצה פיפטה, הסר כל בועה אפשרית והעבר את הקצה לאורך קצוות הבאר.
      הערה: אם נשאר באר כלשהי בקובטה ללא דגימה, הוסף את אותו נפח של בופר אלקטרופורציה. זהו שלב קריטי: אם המכשיר מזהה הבדל בועה או נפח, הוא ייתן שגיאה.
    4. השתמשו בתוכנית EXPAND T CELL 3 כדי לפרק תאי T של CAR.
    5. השאירו את התאים בקובטות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
    6. החזירו את התאים שנפגעו גרעין בתווך גידול תאי T המכיל 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 ([תא] הסופי = 106 תאים/מ"ל) ודוגרים בטמפרטורה של 37 °C למשך 3 ימים.
  3. בחירת פורומיצין
    1. תספור עם AOPI במונה תאים פלואורסצנטיים.
    2. כוון ל-1 x 106 תאים למ"ל עם מדיום גדילה של תאי T המכיל IL7 ו-IL15.
    3. הוסף פורומיצין (2.5 מיקרוגרם/מ"ל) למדיה.
    4. ספירת תאים כל יומיים במשך 6 ימים והתאימה ל-10 תאים6 למ"ל עם מדיום גדילה של תאים המכיל 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15, ו-2.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין.
    5. בדוק % CAR.
  4. מיין את אוכלוסיות תאי CAR T ואחסן דגימות (פלט תאים יבשים) בטמפרטורה של -80°C.

3. בידוד gDNA

הערה: הימנע מאובדן תאים או gDNA לאורך התהליך, שכן זה עלול לפגוע בייצוג של ה-sgRNA. תכוון לכיסוי sgRNA של לפחות פי 500.

  1. להפיק gDNA מדגימות באמצעות ערכת חילוץ DNA של תאים ורקמות. שחרר פעמיים כדי למקסם את שחזור ה-gDNA.
    הערה: אין להשתמש ביותר מ-4 x10 תאים /עמודה כדי לשחזר את ה-gDNA בצורה יעילה יותר.
  2. מדדו את ריכוז ה-gDNA עם ערכת הכימות של dsDNA.
    הערה: אם הריכוז נמוך מדי לשלבים הבאים בפרוטוקול, השתמש במגיב ניקוי מבוסס חרוזים (SPRI) במצב מוצק (SPRI) לריכוז ה-DNA.

4. העשרת קלטת sgRNA (והסרת העברת gDNA)

  1. עיכול אנזימי הגבלה
    1. לעכל מקסימום של 5 מיקרוגרם gDNA עם 20 U של האנזים לשנייה (למשל, עבור lentiGuide-puro עמוד שדרה לספריית Brunello Kinome 1 השתמש בשילוב NdeI ו-PspXI) בנפח כולל של 50 מיקרוליטר. הגדילו את מספר התגובות כדי להשיג את הייצוג הרצוי של sgRNA.
      הערה: בחר את אנזימי ההגבלה לחתוך באזורים הצדדיים של הקלטת, אך יש לזכור שחלק מה-sgRNA עשויים להכיל אתר הגבלה. ה-sgRNA האלה יאבדו בשלב הזה, ולא יופיעו בריצוף. היעדר מדריך זה משמש כשליטה על העיכול. טבלה משלימה 1 מציגה רשימה של sgRNA של קינום 1 שנחתך על ידי PspXI ו-NdeI.
    2. דגרו לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמחזור.
    3. בצע ניקוי SPRI כפול.
      1. הכינו 10 מ"ל של בופר שחרור (EB) (10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0) ו-50 מ"ל של 70% אתנול טרי.
      2. מערבל את החרוזים ומוסיפים 100 מיקרוליטר לתוצרת העיכול.
      3. ערבבו היטב על ידי פיפטינג ודגרו במשך 5 דקות. מגנטיזציה עוד 5 דקות.
      4. בזמן המגנט, הוסף 200 מיקרוליטר של 70% אתנול מבלי להפריע לכדור. חכה 30 שניות, ואז זרוק את הסופרנטנט.
      5. חזור על שלב 4.1.3.3 לסך הכל 2 שטיחות. תן לחרוזים להתייבש במשך 2 דקות.
      6. הסר מהמגנט, הוסיף 40 מיקרוליטר של בופר שחרור, ותליית מחדש את החרוזים באמצעות פיפטינג. תדגר ל-2 דקות.
      7. מגנטיזציה למשך 2 דקות והעבר את הסופרנטנט לצינור חדש.
        הערה: בעת הקמת הפרוטוקול הזה בפעם הראשונה, יש לוודא את העיכול באמצעות אלקטרופורזה (קפילרית). ודא שמתבצע מריחה.
  2. משיכה למטה של קסטת sgRNA.
    1. הכנת חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין.
      1. הכינו בופר כביסה/קישור 2x: 10 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 2 מ' NaCl, 1 מ"מ EDTA. מדלל חצי מהנפח עם H2 Oל-1x.
      2. מערבולת את החרוזים לדקה אחת.
      3. העבר את נפח החרוזים הרצוי לצינור (בדרך כלל 1 מ"ג יספיק), הוסף נפח שווה של בופר כביסה/קישור פי אחת, או לפחות 1 מ"ל, ותשהה מחדש.
      4. הנח את הצינור על מגנט לדקה אחת וזרוק את הסופרנטנט.
      5. הסר את הצינור מהמגנט ותלה מחדש את החרוזים השטופים בנפח של 1x Wash/Binding Buffer כמו הנפח ההתחלתי של החרוזים שנלקחו מהבקבוקון.
      6. חוזר על זה עד סך הכל 3 שטיפות כפייה.
      7. תלה מחדש את החרוזים ב-2 בופר כביסה/קישור כפול.
    2. הוסף 5 מיקרו-ליטר של 10 מיקרומום פריימרים של פולדאון המפורטים בטבלה 1 לעיכול המטוהר מהשלב 4.1.3.6.
    3. דגרו באמבטיה יבשה בטמפרטורה של 96 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז מיד מקפיאים ל-5 דקות.
    4. הוסיפו 1 מ״ג של חרוזי סטרפטווידין מגנטיים שטופו מראש.
      הערה: קישור ביוטין-סטרפטווידין עובד הכי טוב ב-1 M NaCl. ודא לערבב נפחים שווים של חרוזים ו-DNA ביוטינילט.
    5. דגרו ל-20 דקות תוך השעיית התערובת כל 4 דקות.
    6. מגנטיזציה במשך 5 דקות.
    7. שטוף את החרוזים 3 פעמים עם 1× Wash/Binding Buffer.
    8. תלה מחדש את החרוזים ב-50 מיקרוליטר של EB 8.0.
      הערה: קלטות sgRNA המשמשות כאן קשורות לחרוזי הסטרפטווידין. אל תזרקו אותם.

5. הכנת ספריית sgRNA

  1. PCR1
    1. הכינו תערובת PCR1 עם 20 מיקרוליטר של בופר 5x של הרקולאז, 1 מיקרוליטר dNTP (100 מ"מ), 1 מיקרוליטר DNA פולימראז, 2.5 מיקרוליטר של 10 מיקרומום של פריימרים קדמיים ואחוריים של PCR1 המפורטים בטבלה 1, ו-23 מיקרוליטר מים בדרגת PCR. ערבב פיפט והוסף תערובת PCR1 לחרוזים מהשלב 4.2.8.
      הערה: טבלה 1 מפרטת פריימרים של PCR1 שתוכננו עבור ספריית הקינומים של ברונלו 1.
    2. הניחו את הצינורות בתרמוסייקלר והריצו את התוכנית ל-PCR1 המתוארת בטבלה 2.
      הערה: ודא שהתרמחזור יכול להכיל תגובות של 100 מיקרוליטר. אחרת, תגיב ב-50 מיקרוליטר. קנה מידה לפי הצורך.
    3. אסוף את כל ה-PCR1 מאותם דגימות בצינור אחד.
    4. ניקוי SPRI PCR1 באמצעות 150 מיקרוליטר (1.5x) של חרוזים (עקבו אחר שלבים 4.1.3.3-4.1.3.7). החזירו כל תגובה PCR ל-100 מיקרוליטר של EB 8.0.
      הערה: אם אתה מגדיר פרוטוקול זה בפעם הראשונה, יש לוודא את גודל ואיכות מוצר ה-PCR על ידי הרצת 2 מיקרוליטר של מוצר PCR של 30 מחזורים במערכת אלקטרופורזה קפילרית (למשל, TapeStation Systems של Agilent).
  2. PCR2
    1. הכינו תערובת PCR2 עם 10 מיקרוליטר של תוצר PCR1, 10 מיקרוליטר של בופר 5X, 0.5 מיקרוליטר dNTP (100 מילימטר), 1 מיקרוליטר DNA פולימראז, 1.25 מיקרוליטר של פריימרים PCR2 של 10 מיקרומום קדימה ואחורית המפורטים בטבלה 1 (השתמשו בשילוב שונה של rP7-i7-BC ו-P5-i5-BC לכל דגימה), ו-26 מיקרוליטר מים בדרגת PCR לנפח כולל של 50 מיקרוליטר.
      הערה: כדי לשמור על ייצוג הספרייה, בצע תגובת PCR2 אחת לכל 104 מבנים בספרייה.
    2. הניחו את הצינורות בתרמוסייקלר והריצו את התוכנית עבור PCR2 המתוארת בטבלה 2.
    3. ניקוי SPRI PCR2 באמצעות 75 מיקרוליטר (1.5x) של חרוזים (עקבו אחר שלבים 4.1.3.3-4.1.3.7). החזירו כל תגובת PCR ל-50 מיקרוליטר של EB 8.0.
  3. כמת PCR2 (כלומר, ספריית sgRNA) באמצעות ערכת הכימות dsDNA ואימות גודל האמפליקון באמצעות אלקטרופורזה קפילרית (למשל, TapeStation Systems). אסוף את הדגימות.
  4. רצף על כלי Illumina.
    הערה: עבור ספריית Brunello Kinome 1 של 3052 sgRNA כאן, עומק רצף של 100-200 מיליון קריאות לדגימה בדרך כלל מספיק.

6. ניתוח

  1. דגימות דה-מולטי-פלקס באמצעות bcl2fastq.
  2. בדוק את איכות קבצי fastq שנוצרו עם FastQC.
  3. יש להוציא את רצף ה-sgRNA באמצעות רצפי הקלטות שמקיפים את ה-sgRNA כדפוס, וכן את אורך המדריך (20 nt).
  4. יישר את הרצף שהופק להפניה בספרייה באמצעות Bowtie2 כדי לבדוק כמה מהמדריכים ההיפותטיים הם sgRNA אותנטיים מהספרייה. השתמש ב-samtools כדי להמיר את קובץ ה-SAM עם מידע על היישור לפורמט BAM וליצור קבצי סיכום.
  5. לספור ולנרמל את מספר הקריאות עבור כל sgRNA בדגימות העריכה והבקרה באמצעות פונקציית הספירה מתוכנת MAGecK.
  6. השווה את הספירות עם פונקציית הבדיקה של MAGecK כדי לקבל את ציוני ה-RRA ואת רשימת הגנים המועמדים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול, תאי CAR T נוצרו בהתאם לפרוטוקול26 שנקבענו. לצורך סינון CRISPR, התאמנו את תהליך העבודה שפותח על ידי Wang ואחרים. 17 (איור 1A). בקצרה, תאי T משני תורמים עצמאיים בודדו והופעלו במשך 24 שעות לפני ההעברה הרצופה עם ספריית ה-CRISPR sgRNA ווקטור הלנטיויראלי של CAR, והגיעו ל-67% ו-72% תאי CAR חיוביים ביום החמישי. חלק מהתאים עברו נוקלופקט עם חלבון Cas9 כדי לגרום לנוקאאוטים, בעוד שהתאים הנותרים שימשו כבסיס לייצוג sgRNA. תאים מועברים נבחרו עם אנטיביוטיקה, ואוכלוסיות מובחנות סווגו לאחר מכן לפי הפנוטיפים הנבדקים. התרבות תאי CAR T נבדקה לאורך כל המסך באמצעות ספירות תאים מבוססות AOPI והובאה לידי ביטוי בשינוי קיפול (איור 1B). לאחר תוספת פורומיצין בימים 8, 10 ו-12, אישרנו העשרה מוצלחת של תאי CAR T שהועברו עם ספריית ה-CRISPR בשני התורמים, כפי שמעיד המשך הישרדות והתרבות. תאי T לא מועברים (UTD) ותאי CAR T ללא העברת ספריית CRISPR שימשו כבקרות לברירה אנטיביוטית.

לאחר חילוץ DNA גנומי, ספריות sgRNA הוכנו באמצעות הגברת PCR. כדי להתגבר על בעיות הנובעות מהעברת gDNA מופרזת, יישמנו פרוטוקול המשלב עיכול אנזימי הגבלה ומשיכת ביוטין-סטרפטווידין של קלטת sgRNA (איור 2A,B). gDNA עוכל עם אנזימי הגבלה NdeI ו-PspXI שמטרתו לאתרים משני צידי קלטת sgRNA (איור 2C). אוליגואים ביוטינילטים, שנועדו להיקשר במעלה הזרם של אתרי חישוש פריימר PCR1, שימשו ללכידת קטעי sgRNA, ואז נמשכו עם חרוזי סטרפטווידין כדי לחסל gDNA שנשא. מקטעים המכילים sgRNA הוגברו באופן סלקטיבי (איור 2D) וסומנו דרך שני PCRים עוקבים.

ספריות מכל דגימה סומנו באמצעות רצף דור הבא (NGS). לאחר דה-מולטי-פלקסינג, בקרת איכות וזיהוי sgRNA, הנתונים נותחו באמצעות צינור MAGeCK. ראשית, פקודת הספירה כמותה ונרמלה את ספירות הקריאה של sgRNA בדגימות בקרה (בסיס) ובדגימות שנערכו על ידי Cas9 (איור 3A,B). הקורלציות בין פירסון לספירמן מצביעות על כך שהייצוג של sgRNA נשמר במהלך הניסוי (gDNA תורם) בהשוואה לספריית הפלסמידיה (איור 3C). לאחר מכן, פקודת הבדיקה השוותה בין שני המצבים, והקצתה ציוני צבירת דרגה חזקה (RRA) לכל גן (איור 3D). גנים מועשרים או מדוללים משמעותית זוהו באמצעות ספי p < 0.05 ושינוי לוגריתם קפלי (LFC) > 0.5 (איור 3E). לבסוף, בוצע ניתוח העשרת מסלולים של גנים מועמדים באמצעות Metascape, וחשף את מונחי אונטולוגיית הגנים המובילים הקשורים לרגולטורים שזוהו (איור 3F).

figure-results-1
איור 1: סינון CRISPR בתאי CAR T. (A) סכמה של סינון CRISPR בתאי CAR T. (B) בחירת תאים מומרת עם פורומיצין (P). ספריות פלסמידיות כוללות גן עמידות לפורומיצין לברירה חיובית. האנטיביוטיקה נוספה ביום השמיני למדיה בדגימות לא מומרת של תאי T לא מומרת (UTD) ו-CAR ותאי CAR T שהועברו. דגימות ללא פורומיצין שימשו כאמצעי בקרה על התפשטות. נתונים משני תורמים עצמאיים מוצגים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: הכנת ספרייה לניתוח העשרת sgRNA. (א) תכנית הפרוטוקול להכנת הספרייה. (B) סכמה של המיקום היחסי של גדלי החיתוך של האנזים ההגבלה (מספריים) ואזורי החישוש של פריימרים PCR1 (חץ) ופריימרים ביוטיניליים (חץ עם נקודה ירוקה). (ג) אלקטרופורזה של ה-gDNA לפני ואחרי עיכול RE. (D) העשרה סלקטיבית של קלטות sgRNA לאחר PCR1. נתונים משני תורמים עצמאיים מדגימות בסיסיות ו-Cas9 של שני הפנוטיפים מוצגים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: ניתוח העשרה מדריך עם MAGeCK. (א) סיכום הפלט של פונקציית הספירה של MAGeCK. (ב) חלוקת ספירות הקריאה. (ג) מקדמי פירסון וספירמן לקורלציה בין gDNA תורם לספירת ספריית הפלסמידים. (ד) גנים פוטנציאליים מועשרים/מדוללים המדורגים על ידי צבירת דירוג חזקה מותאמת (ציון RRA). (ה) תרשים הר געש שמראה גנים משמעותיים (ערך p < 0.05, LFC > 0.5) באדום. (ו) מונחי אונטולוגיית גנים מובילים (GO) לאחר ניתוח מסלול מטאסקייפ של הגנים המשמעותיים המועשרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1: רצף של פריימרים. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2: תנאי PCR. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה משלימה 1: רשימת sgRNA בספריית Kinome 1 ו-sgRNA שאבדו במהלך עיכול עם NdeI ו-PspXI אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקר CRISPR מבוסס על עקרון הפרעה במדריך יחיד, כלומר יש לשלב רק sgRNA אחד לכל תא. כדי להשיג זאת, sgRNA מועברים בדרך כלל דרך וקטורים לנטי-ויראליים, ויש לשלוט בזהירות בריבוי ההדבקה (MOI). MOI של כאלה. 0.3 מומלץ בדרך כלל, מה שמוביל לכך ש-25% עד 30% מהתאים מועברים לחלקיק ויראלי יחיד6. לכן, טיטרציה מדויקת חיונית לקביעת נפח חלקיקי הווירוס הנדרשים. שלב קריטי נוסף הוא אובדן כיסוי sgRNA במהלך הפרוטוקול. אובדן תאים במהלך הקציר, חוסר יעילות במהלך חילוץ ה-gDNA (כלומר עומס עמוד ופליטת DNA לא מלאה), או תבנית מופרזת במהלך הגברת PCR – כולם יכולים לתרום לאובדן זה, מה שמטה את ניתוח ה-sgRNA שלנו. לגבי האוליגואים הביוטיניליים, עדיף שהם מטוהרים ב-HPLC כדי למנוע מהביוטין החופשי המשמש בסינתזה לרוויה את חרוזי הסטרפטווידין. יתרה מזאת, מומלץ מאוד להשתמש במומחה אמינו-3' כדי למנוע הגברה מהפריימרים הביוטינילטים בבדיקות PCR הבאות. כמו כן, בעת תכנון האוליגואים הללו, יש להימנע מכל חפיפה עם פריימרים של PCR1 כדי למנוע תחרות במהלך ההגברה. בנוסף, ניתוח ביואינפורמטי דורש תשומת לב קפדנית: דפוסי חילוץ sgRNA תלויים בעמוד השדרה של הפלסמיד (למשל, lentiGuide-puro או lentiCRISPR v2), והקפדנות ביישור יכולה לנוע מהתאמה מדויקת ועד לסבילות מסוימת לאי-התאמות. יתרה מזאת, מכיוון שפרוטוקול זה כולל שלב עיכול, ייתכן שחלק מ-sgRNA המכילים אתרי הגבלה יאבדו, מה שידרוש התאמת ספריית ההתייחסות.

במחקר זה, אנו מציעים פרוטוקול הכנת ספריית סקר CRISPR אופטימלי שמעשיר מקטעים המכילים sgRNA באמצעות עיכול, וחשוב מכך, דרך שלב משיכה למטה. עיכול אנזימי הגבלה הוצע בעבר כאסטרטגיה להפחתת קלט gDNA ולהעשיר את קלטות sgRNA27. באופן דומה, גשושי ביוטינילציה יושמו באופן נרחב בביולוגיה מולקולרית ללכידת חומצות גרעין ספציפיות או קומפלקסים של חלבון-חומצהגרעין 28,29,30,31.

הפרוטוקול שלנו בונה על עקרונות אלו ומתאים אותם לסריקת CRISPR בתאי CAR T ראשוניים, אם כי יש להכיר בכמה מגבלות. ראשית, תאי CAR T ראשוניים מטילים מגבלות על היקף הסקר, שכן קיבולת ההתרחבות שלהם מוגבלת. כדי לשמור על כיסוי מספק וייצוג sgRNA, נדרשים מספר רב של תאי התחלה. כאשר זה לא אפשרי, ניתן להשתמש בספריות מותאמות אישית קטנותיותר 12, אם כי זה מצמצם את רוחב החקירה הגנטית. שונות ביולוגית היא אתגר נוסף; צפויים הבדלים בין תורמים, והחפיפה של פגיעות משמעותיות היא לעיתים קרובות צנועה17. שנית, אסטרטגיית ההעשרה מתבססת על נוכחות ומיקום של אתרי חיתוך אנזימי הגבלה. במקרים נדירים, אתרים אלו עשויים להופיע בתוך רצפי sgRNA, מה שמבעיה יותר בספריות קטנות עם יתירות מוגבלת. עם זאת, רוב הספריות, במיוחד עיצובים כלל-גנומיים, כוללות מספר sgRNAs לכל מטרה, מה שממזער את ההשפעה הכוללת של אובדן המדריך. לבסוף, אסטרטגיות העשרה חלופיות המבוססות על פרגמנטציה, כמו סוניקציה בשילוב עם לכידת פרוב24, עשויות לספק גמישות מסוימת במקרים שבהם עיכול אנזימי הגבלה אינו מתאים.

בסך הכול, קלטת sgRNA מייצגת חלק זעיר מסך ה-DNA הגנומי הכולל בתאים שעברו עריכת CRISPR, מה שהופך את ההעשרה היעילה לקריטית להכנת ספרייה מוצלחת. בהשוואה לפרוטוקולים סטנדרטיים, זרימת העבודה האופטימלית שלנו מפחיתה את העברת ה-gDNA ומעדיפה הגברת PCR של ה-sgRNA הרלוונטי. למרות שהשילוב של פיצול gDNA ומשיכת גלאי ביוטינילציה עם חרוזי סטרפטווידין אינו חדש מבחינה רעיונית, השילוב שלו בסקר CRISPR מונע מכשולים נפוצים ב-PCR ומגביר את יכולת השחזור על מסך CRISPR. יתרה מזאת, שילוב מדדי QC סטנדרטיים בכל שלב מפתח (כגון טוהר תאי T לאחר מיון, שיעור תאי עמיד לפורומיצין, שלמות gDNA ויעילות הטרנסדוקציה של CAR) ישפר עוד יותר את החוסן והשחזוריות של תהליך העבודה. לסיכום, למרות שפותח בהקשר של תאי CAR ראשוניים ועם שני תורמים בלבד (שעשוי להוות מגבלה, אף על פי שנעשה שימוש במספר דגימות מכל תורם), פרוטוקול אופטימלי זה עשוי להיות רלוונטי באופן רחב לסקרי CRISPR אחרים ולזרימות עבודה של NGS עם העברת gDNA גדולה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי פרויקט PID2022-137914OB-I00 שמומן על ידי MICIU/AEI /10.13039/501100011033 ועל ידי FEDER, UE. מחקר זה נתמך על ידי Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) דרך Red de Terapias Avanzadas TERAV ו-TERAV+ (RD21/0017/0009 ו-RD24/0014/0010) ודרך מרכז החקירה הביורפואית האדום של סרטן CIBERONC (CB16/12/00489). מחקר זה נתמך על ידי Gobierno de Navarra Salud (GN2023/08 ו-GN2024/04) ו-Proyectos Estratégicos (DIAMANTE 0011-1411-2023-000105 ו-0011-1411-2023-000074). איור 1B ואיור 2A נוצרו עם BioRender.com

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4200 TapeStationאג'ילנטG2991A
אקרידין אורנג'InvitrogenA1301
AMPure XP בקמן קולטרA63881
autoMACS NEO מפרידמילטני130-120-327ממיין תאים מגנטיים במהירות גבוהה
אוליגואים ביוטינילייםIDT
BSAסיגמאA9647
מונה תאים פלואורסצנטיים של Cellometer K2RevvityCMT-K2-MX-150מונה תאים פלואורסצנטיים
חדרי ספירה של CHT4RevvityCHT4-SD100-002
ננו-חרוזי CytoSinct CD4GenScriptL00863-1
ננו-חרוזי CytoSinct CD8GenScriptL00864-1
dNTPאג'ילנט200418-51
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen11206D
מגנט DynaMag-2Invitrogen12321D
EDTA 0.5 M, pH 8.0Invitrogen15575-038
אתנולמרק1,00,98,31,000
אלקטרופורטור ExPERT AtxMaxCyteExPERT ATx
פיקול-פאקהציטיבה17544203
פילטרופור S 0.2 ומיקרו; mסארסטדט83,18,26,001
GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-ResearchGenScriptZ03621-1
בופר הרקולאז 5Xאג'ילנט600675-52בופר 5X
אנזים מיזוג הרקולאז IIאג'ילנט600679-51DNA פולימראז
IL-15מילטני130-095-765
IL-7מילטני130-095-362
מאסטרסייקלר X50aאפנדורף6313HG006059
בופר אלקטרופורציה של MaxCyteציטיבהEPB1
NdeIניו אינגלנד ביולאבסR0111L
רקמת נוקלאוספיןמאשרי-נגל74,09,52,250
PBSגיבקו14190-094
פוליברןמרקTR-1003-6
מבניםתרמופישר
פרופידיום יודסיגמאP4864
PspXIניו אינגלנד ביולאבסR0656S
פורומיציןגיבקוA11138-03
פלואורומטרי קיוביט 3.0InvitrogenQ33216
בדיקת DNA של קיוביט HSInvitrogenQ32851
מכלול עיבוד באר סטרילית R-50x3MaxCyteLM243882
T Cell TransAct אנושימילטני130-111-160מגיב גירוי תאי T
תחנת טייפ HSD1000אג'ילנט5067-5585
TEXMACSמילטני130-097-196מדיום גדילה של תאי T
בופר טריס, 1.0 מטר, pH 8.0, דרגת ביולוגיה מולקולריתEMD מיליפורה648314
מים, לביולוגיה מולקולרית, DNAse, RNAse וללא פרוטאזתרמו-סיינטיפיקי327390010

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brudno, J. N., Maus, M. V., Hinrichs, C. S. CAR T cells and T-cell therapies for cancer: A translational science review. JAMA. 332 (22), 1924-1935 (2024).
  2. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: What we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  3. Cui, K., et al. The challenges and progress of CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors. Mol Cell Biochem. 480 (10), 5345-5367 (2025).
  4. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  5. Redondo-Frutos, R. A., et al. Genetic engineering in CAR T cells for solid tumors: Current state, barriers and future developments. Hum Gene Ther. 36 (17-18), 1138-1153 (2025).
  6. Bock, C., et al. High-content CRISPR screening. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-23 (2022).
  7. Shang, W., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies FAM49B as a key regulator of actin dynamics and T cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), E4051-E4060 (2018).
  8. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971 (2018).
  9. Chen, Z., et al. In vivo CD8+ T cell CRISPR screening reveals control by Fli1 in infection and cancer. Cell. 184 (5), 1262-1280.e22 (2021).
  10. Belk, J. A., et al. Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).
  11. Henriksson, J., et al. Genome-wide CRISPR screens in T helper cells reveal pervasive crosstalk between activation and differentiation. Cell. 176 (4), 882-896.e18 (2019).
  12. Gurusamy, D., et al. Multi-phenotype CRISPR-Cas9 screen identifies p38 kinase as a target for adoptive immunotherapies. Cancer Cell. 37 (6), 818-833.e9 (2020).
  13. Wei, J., et al. Targeting REGNASE-1 programs long-lived effector T cells for cancer therapy. Nature. 576 (7787), 471-476 (2019).
  14. Dong, M. B., et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells. Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).
  15. Legut, M., et al. A genome-scale screen for synthetic drivers of T cell proliferation. Nature. 603 (7902), 728-735 (2022).
  16. Ye, L., et al. A genome-scale gain-of-function CRISPR screen in CD8 T cells identifies proline metabolism as a means to enhance CAR-T therapy. Cell Metab. 34 (4), 595-614.e14 (2022).
  17. Wang, D., et al. CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies. Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).
  18. Yukl, S. A., Kaiser, P., Kim, P., Li, P., Wong, J. K. Advantages of using the QIAshredder instead of restriction digestion to prepare DNA for droplet digital PCR. BioTechniques. 56 (4), 194(2014).
  19. Latham, S., Hughes, E., Budgen, B., Morley, A. Inhibition of the PCR by genomic DNA. PLoS One. 18 (4), e0284538(2023).
  20. Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Wälder, J. A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry. 47 (19), 5336-5353 (2008).
  21. Sasaki, Y., Miyoshi, D., Sugimoto, N. Effect of molecular crowding on DNA polymerase activity. Biotechnol J. 1 (4), 440-446 (2006).
  22. Seitz, V., Schaper, S., Dröge, A., Lenze, D., Hummel, M., Hennig, S. A new method to prevent carryover contaminations in two-step PCR NGS library preparations. Nucleic Acids Res. 43 (20), e135(2015).
  23. Giuffre, A., et al. Overview of the Agilent Technologies SureSelectTM target enrichment system. J Biomol Tech. 22 (Suppl), S30(2011).
  24. Chen, R., Im, H., Snyder, M. Whole-exome enrichment with the Roche NimbleGen SeqCap EZ Exome Library SR platform. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 634-641 (2015).
  25. Horlbeck, M. A., et al. Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760(2016).
  26. Rodriguez-Marquez, P., et al. density influences antitumoral efficacy of BCMA CAR T cells and correlates with clinical outcome. Sci Adv. 8 (39), 514(2022).
  27. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  28. Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based pulldown assay to validate mRNA targets of cellular miRNAs. J Vis Exp. (136), e57786(2018).
  29. Tsuji, Y. Optimization of biotinylated RNA or DNA pulldown assays for detection of binding proteins: Examples of IRP1, IRP2, HuR, AUF1, and Nrf2. Int J Mol Sci. 24 (4), 3604(2023).
  30. Sui, H., Chen, Q., Imamichi, T. A pulldown assay using DNA/RNA-conjugated beads with a customized competition strategy: An effective approach to identify DNA/RNA binding proteins. MethodsX. 7, 100890(2020).
  31. Chaparian, R. R., van Kessel, J. C. Promoter pulldown assay: A biochemical screen for DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 2346, 165-172 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPRCas9sgRNADNA

מאמרים קשורים