מאמר שיטה

מבחן אימונופלואורסצנציה מרובה לצורך הערכה מרחבית של סמני הזדקנות ב-vivo

532 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69742

⸱

24 ביולי 2026

 ,  ,  ,  , 
1Blizard Institute, Faculty of Medicine and Dentistry, Queen Mary University of London

במאמר זה

סיכום

אימונופלואורסצנציה מרובה מאפשרת תיוג רציף של מספר סמני נוגדנים בתוך חתך רקמה אחד כדי לתמוך בניתוח מרחבי של ארכיטקטורת הרקמה ואוכלוסיות התאים. כאן מוצגת זרימת עבודה לזיהוי מולטיפלקס של סמנים מבניים וחיסוניים הקשורים להזדקנות, הכוללת הכנת שקופיות ידנית ואוטומטית, הדמיה איטרטיבית וניתוח תאים בודדים באמצעות תוכנת פתולוגיה דיגיטלית.

תקציר

צביעת אימונופלואורסצנציה מרובה (IF) מייצגת שינוי מהותי בתחכום לעומת הדמיה IF מסורתית, ומאפשרת זיהוי רציף של מספר סמנים של נוגדנים בתוך חתך רקמה אחד. דבר זה מאפשר פרופילינג רחב יותר של סוגי תאים ומבני רקמה, וכן מאפשר הערכה של הקשר המרחבי ביניהם באופן שאינו אפשרי בחתכים עוקבים. אין סמן אוניברסלי אחד להזדקנות, וכיום מקובל להעריך כי חתימות הזדקנות משתנות לפי סוג תא, טריגר הזדקנות והזמן מאז האינדוקציה. לכן, הגישות הקומבינטוריות שמציע Multiplex IF מספקות כלי עוצמתי לאפשר זיהוי תאי זקנה בלתי מוטה בתוך חתך רקמה יחיד.

כאן נעשה שימוש במיקרו-מערכי רקמות המכילים ליבות מ-34 סוגי רקמות אנושיות. אלה צוברו בשילוב של סמנים מבניים, חיסוניים וזקנות במבחן 10-פלקס, עם תמונות שצולמו באמצעות סורק שקופיות מולטיפלקס. שיטה זו מאפשרת הערכה של שפע והתפלגות מרחבית של תאים מזדקנים ברקמה. מחזורי צביעה, הדמיה וביטול צבע עוקבים שימשו ליצירת מערכי נתונים מרובי פלטפורמה, כאשר תמונות צולמו באמצעות מערכת סריקת שקופיות פלואורסצנציה מרוב-פלקס. מתוארים פרוטוקולים הן להכנת שקופיות ידנית והן לעיבוד אוטומטי באמצעות צבוע שקופיות, יחד עם סגמנטציה של תא יחיד וניתוח מרחבי באמצעות תוכנת פתולוגיה דיגיטלית. בסך הכול, שיטות אלו מספקות מדריך מקיף לצביעה, הדמיה וניתוח מרחבי של סמנים ביולוגיים הקשורים להזדקנות בדגימות רקמה, וכן מדריך כללי יותר להדמיה מרובעת.

מבוא

הזדקנות היא גורל תא סופי מורכב שהוכח כי הוא תורם למגוון רחב של תהליכים כולל הזדקנות, סרטן ותפקוד מערכת החיסון, וכן הומאוסטזיס רקמתיתקין 1. עם זאת, לא תואר סמן ביולוגי אוניברסלי של הזדקנות, והזיהוי מתבסס על הערכת טווח של מה שמכונה סימני היכר2. הדמיית ה-IF של רקמה הוגבלה להערכה של סמן ביולוגי אחד או שניים באותו מקטע, מה שהופך את הערכת שילובי סמנים באותה דגימה למאתגרת3. הבעיה הזו מחמירה בשל התמונה המתפתחת של הטרוגניות של תאים זקנים ברמתתא יחיד 4, ומחסור בסימני הזדקנות 2 ב-in vivo, מה שמקשה על בחירת לוחות גילוי צרים בהקשרים חדשים או עם דגימות יקרות ערך 5,6.

הדמיית IF מרובה שואפת להתגבר על מגבלה זו על ידי הקלה בזיהוי רציף של מספר סמנים ביולוגייםבתוך רקמה אחת 3. זה אפשרי באמצעות מדווחי אוליגונוקלאוטידים עם תיוג פלואורסצנטי או באמצעות נוגדנים ראשוניים מסומנים שאות הפלואורסצנטי שלהם מנותק בתהליך השבתת צבע7. בשני המקרים, הדמיה סדרתית משמשת לבניית פאנל של סמנים ביולוגיים שמפוחד מרחבית, ומציע יתרונות על פני IF מסורתי לצביעת רקמות רציפה. באמצעות יצירת פרופילים מורכבים אלה בתוך דגימת רקמה אחת, ניתן לזהות מספר רב יותר של פנוטיפים, סוגי תאים ומבני רקמה זקנים, מה שמאפשר הערכה מתקדמת של הקשרים וההתפלגות המרחביים שלהם7.

עם זאת, בעוד שהמורכבות של פרופילי הדמיית IF מרובבים גבוהה משמעותית מזו של IF מסורתי, פאנלי הסמנים מוגבלים בדרך כלל ל-<100 סמנים ביולוגיים בשל מגבלות מעשיות3. אלה כוללים גם אובדן פוטנציאלי של אנטיגניות האפיטופים, עוצמת האות או שלמות הרקמה בכל סבב נוסף, וגם את האתגר של אופטימיזציה של שילובים גדולים של נוגדנים שחייבים בהכרח לא להכיל תגובתיות צולבת 8,9. לכן, קביעת ההרכב האופטימלי של כל סבב נוגדנים היא שיקול חשוב בעיצוב פאנלים מרובי פעם. כתוצאה מכך, ה"פלקס" הכולל קטן מזה שמושג בטכניקות כמו טרנסקריפטומיקה מרחבית. עם זאת, בהינתן שמולטיפלקס IF מכמת חלבון במקום רמות תמלול, שתי הטכניקות עשויות להיחשב כמשלימות וניתן לשלב אותן בצינורות "מולטי-אומיקס" בקנה מידה גדול10.

כאן צולמו מיקרו-מערכים של רקמות אנושיות המכילים ליבות מ-34 סוגי רקמות. אלה צוברו בשילוב של סמנים מבניים, חיסוניים וזדקנות במבחן 10-פלקס: פאן-ציטוקרטין (PANCK), CD31, אקטין שריר חלק אלפא (aSMA), קרטין 15 (K15), וימנטין, FOXP3, CD8, Ki67, p16 ולמין B1. מסופקים פרוטוקולים מפורטים שלב אחר שלב הן להכנה ידנית של שקופיות, וכן התאמה לשילוב אוטומציה באמצעות כבוע שקופיות אוטומטי. השוואות ניסיוניות מייצגות מראות שהאחרון משפר הן את שלמות הרקמה ועבור רוב הסמנים את אות הפלואורסצנציה11. לבסוף, מסופק מדריך שלב אחר שלב לניתוח תמונות מיקרו-מערך רקמות מרובות באמצעות תוכנת הפתולוגיה הדיגיטלית HALO, הכולל סגמנטציה של תא יחיד וניתוח מרחבי של ביטוי הסמנים הביולוגיים. תוצאות מייצגות מדגימות את ההיתכנות הטכנית של זיהוי וכימות תאי הזדקנות בהתבסס על לוח הסמנים הביולוגיים (בניגוד לאימות ביולוגי מקיף של סיווג הזדקנות).

בסך הכול, שיטה זו מוצגת כמדריך להערכת מולטיפלקס של סמנים ביולוגיים של הזדקנות ב-vivo וכן כמדריך כללי יותר להדמיה מולטי-פלקסית (איור 1).

פרוטוקול

הצהרת אתיקה

דגימות הרקמות שנכללו בעבודה זו היו עודפות לדרישות האבחון מארכיון Barts Health NHS, הדגימות התקבלו בהתאם לכל ההנחיות המוסדיות והרגולטוריות הרלוונטיות ואושרו לפי פרוטוקולי אתיקה 10/H0704/65 ו-05/QO605/140.

1. הכנת שקופיות, שליפת אנטיגנים וחסימה

הערה: אלא אם נאמר כך, כל השלבים מתבצעים בטמפרטורת החדר (~20–25 מעלות צלזיוס) בתנאי מעבדה סטנדרטיים.

  1. הרכבת דגימות ראשונית
    1. כדי להבטיח שמירה מיטבית של הרקמה, התקן דגימות רקמה מוטמעות, פרפין קבוע (FFPE) על שקופיות מיקרוסקופיות איכותיות (טעונות חיובית), שהוכנו מחבילה חדשה כדי להבטיח אובדן מטען מינימלי.
    2. ודא שהחלקים לא עובים יותר מ-5 מיקרון עם גודל מקסימלי של 4 x 2 ס"מ2 המותקן במרכז כדי להבטיח נראות בתוך חלון התצפית של מחזיק החלקה ללא כיסוי.
    3. בצע הכנת דגימות ידנית באמצעות תא הסרה או באופן אוטומטי באמצעות צבע אוטומטי.
  2. תא הסרת הסוואה
    1. אפו עד 24 שקופיות בלילה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס עם רקמה פונה כלפי מעלה.
    2. הסרת שעווה והידרציה מחדש של דגימות באמצעות דגימות רצופות של 5 דקות בקסילן (ביצוע שלב פעמיים) והפחתת ריכוזי אתנול (100%, 100%, 90%, 70%) על ידי טבילה מלאה של השקופיות בכל מגיב.
    3. שטוף שקופיות על ידי טבילה ב-PBS למשך 5 דקות (בצע שלב פעמיים).
    4. Permeabilize מחליק על ידי טבילה ב-0.3% Triton X 100 מדולל ב-PBS למשך 10 דקות.
    5. שטיפו שקופיות על ידי טבילה ב-PBS למשך 5 דקות.
    6. הכינו את תא ההסרה על ידי הוספת החומרים הבאים לכל אחד מהחלקים הנפרדים:
      1. 500 מ"ל DDH2O לתא הראשי.
      2. 250 מ"ל ddH2O למיקום המאגר המרכזי על סל המדפים המתכתיים.
      3. 250 מ"ל pH 6 תמיסת חשיפת אנטיגן 1 (ARS1) במיקום המאגר השמאלי על סל המדף המתכתי.
      4. 250 מ"ל pH 9 תמיסת חשיפת אנטיגן 1 (ARS2) במיקום ימין במאגר על סל המתכת (מדולל ב-DDH2O מקת 10x).
    7. טבל דגימות לתמיסת ARS1 ומניח רצועת קיטור מעל שלושת המאגרים.
    8. מניחים את המכסה על תא ההסרה וסובבו כדי לנעול אותו במצב סגור, כדי לוודא שערך שחרור הלחץ יושב שטוח על גבעול הלחץ.
    9. בחר והתחל פרוטוקול שמגיע לנקודת טמפרטורה מתוכנתת מראש של 110 מעלות צלזיוס ונמשך 4 דקות.
    10. במהלך שלב החימום, כאשר לוח מד הטמפרטורה מציג 70 מעלות צלזיוס, יש להפעיל טיימר ל-20 דקות. המערכת תגיע לטמפרטורה, תחזיק ותתחיל להוריד לחץ במהלך תקופה זו.
    11. שחרור מלא מהמערכת על ידי הטיית שסתום שחרור הלחץ בזהירות עם פינצטה ופתיחת המכסה. בדוק את רצועת הנחל כדי לוודא שהטמפרטורה הגיעה.
    12. העבר את הדגימות מתמיסת ARS1 לתמיסת ARS2. החזירו את מכסה התא (אבל אל תנעלו או תדחסו מחדש) ותתחילי טיימר ל-20 דקות.
    13. הסירו את סלסלת המאגר עם המחסניות אל משטח הספסל.
    14. השאירו את הסל על הספסל בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    15. שטוף דגימות על ידי טבילה ב-PBS למשך 5 דקות (בצע את השלב הזה ארבע פעמים).
    16. דגימות בלוק על ידי טבילה ב-PBS המכיל 10% סרום חמור ו-0.3% BSA למשך שעה אחת.
    17. שטוף דגימות על ידי טבילה ב-PBS למשך 5 דקות.
    18. דגימות נגד צבע על ידי טבילה ב-DAPI (1 מיקרוגר·מ"ל-1) מדולל ב-PBS למשך 15 דקות.
    19. שטוף דגימות על ידי טבילה ב-PBS למשך 5 דקות.
    20. התקן את המחסניות לתוך מחזיקי Coverslipless Slide.
  3. כבתם אוטומטי עם סלייד (למשל Bond RXm)
    1. שים את השטיפה, תגובות ER1 ו-ER2 בכמות גדולה במגירה התחתונה.
    2. הפעל את המערכת כדי לאתחל.
    3. ודא שמיכלי הפסולת ריקים, וכל שאר החומרים מעל הרמות המינימליות.
    4. הכינו את זרוע התגובה על ידי מילוי מיקומי הפוט בחומרים הבאים בנפחים הנדרשים שצוינו על ידי המערכת למספר הכולל של השקופיות:
      1. הכנס את כלי הריאקנט המלא ב-PBS לזרוע המגיב המלא.
      2. הכנס סיר תגובה המכיל 0.3% טריטון X-100 מדולל ב-PBS לזרוע המגיב
      3. הכנסת בופר חסימה המכיל כלי תגובה – 10% סרום חמור ב-0.3% BSA ב-PBS לזרוע המגיב לזרוע.
      4. הכנסת פוטנציאטור תגובה המכיל DAPI (1 מיקרוג·מ"ל-1) מדולל ב-PBS לזרוע תגובה.
    5. הכנס את זרוע התגובה המלאה (עם סירי מיכל מוכנים) למערכת.
    6. בהתאם להוראות שעל המסך, בנו פרוטוקול צביעה אוטומטי הכולל את השלבים הבאים שיש להריץ במהלך הלילה:
      1. אפו ב-60 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות.
      2. דגרו עם 0.3% Triton X-100 מדולל ב-PBS (10 דקות).
      3. שטוף עם תגובת כביסה בכמויות גדולות (שגרה מתוכנתת מראש).
      4. דגרו עם תגובת Epitope Retrieval 1 (ER1) (20 דקות, 100 מעלות צלזיוס).
      5. שטוף עם תגובת כביסה בכמויות גדולות (שגרה מתוכנתת מראש).
      6. דגרו עם תגובת Epitope Retrieval 2 (ER2) (20 דקות, 100 מעלות צלזיוס).
      7. שטוף שלוש פעמים עם תגובת כביסה בכמויות גדולות (שגרה מתוכנתת מראש).
      8. דגירה עם בופר חוסם - 10% סרום חמור ו-0.3% BSA ב-PBS (שעה).
      9. DAPI (1 מיקרוג·מיליטר-1 ב-PBS) ארבע פעמים במשך 5 דקות בכל פעם.
      10. שטיפה (שגרה מתוכנתת מראש).
    7. ודאו שכל נפחי התוספת מוגדרים ל-150 מיקרו ליטר וששלב ההכנה מוגדר להסרת שעווה באמצעות תפריט הנפתח (נפתח).
    8. הוסף פרטים לעד 30 שקופיות והדפס תוויות ברקוד.
    9. הסר את מגש הסלייד והכניס את השקופיות הפונות כלפי מעלה. הוסף אריחי כיסוי מעל כל מגלשה הפונה כלפי מעלה. הנח את תוויות הברקוד כך שיקראו מלמעלה למטה על השקופית.
    10. החזר את מגש ההחלקה לתוך האוטוסטיינר ונעל דרך כפתור המגש הקדמי.
    11. לחץ על כפתור ההתחלה עבור כל זרוע סלייד טעונה כרגע בשקופיות.
      הערה: הפרוטוקול המלא לוקח ~15 שעות לפעול (כולל 10 שעות אפייה). ניתן לדחות את זמן ההתחלה כדי לחסוך בשטיפות של החזרת מים.
    12. התקן את המחסניות לתוך מחזיקי Coverslipless לאחר סיום המחזור.
  4. מטען מחסנית ללא כיסוי ללא החלקה
    1. הניחו את הסליידס במחזיק ה-Coverslipless Slide, תוך שמירה על יישור הקצוות העליונים והימניים כנגד עצירות המתכת.
    2. נעול את המחסנית במקום עם הקאם הפלסטי (באמצעות שניהם בו זמנית) על ידי פנייה למצב המנעול הסגור.
    3. בדוק שהמחסנית יושבת שטוחה לחלוטין ואינה מתנדנדת בתוך המחזיק.
    4. הניחו את תא ההכנסת מחזיק הסלייד ללא כיסוי מעל הסלייד, על ידי לחיצה על מוטות הצד בשתי ידיים כדי להגביל לחץ ולמנוע שבירה.
    5. טען את מחזיק הסלייד ללא כיסוי דרך יציאת הכניסה עם מדיה התקנה של 2 מ"ל המורכבת מ-50% גליצרול ב-PBS.
    6. הוסיפו תווית ברקוד לשקף עצמו בצד השמאלי של השקופית בכל כיוון.
    7. המשך להדמיה.

2. הדמיית מולטיפלקס

  1. בחירת אזורים ודימות אוטופלואורסצנציה
    1. פתח את תוכנת רכישת הדמיות המולטי-פלקס (למשל Mx workflow (4.2.0.4)) ויצר פרוטוקול עם הסבבים / הביוסמקרים וזמני החשיפה הנדרשים באמצעות אשף הפרוטוקול Publisher.
      הערה: קבעו מראש את הקצאת כל נוגדן לערוצים הזמינים. הגבל סמנים חלשים (כלומר כאלה שדורשים זמני חשיפה גבוהים יותר) לערוצי Cy5 ו-Cy7 שיש להם את האוטופלואורסצנציה הנמוכה ביותר. ניתן להשתמש במקסימום 4 נוגדנים בכל סבב במערכת ההדמיה הפלואורסצנטית המולטיפלקס.
    2. אם נדרשת תמונות H&E וירטואליות, יש לוודא שערוץ Cy3 נרכש.
    3. הוסף את השקופיות לפרוטוקול (באמצעות מספר הברקוד) דרך כלי יוצר האצווה כדי ליצור תהליך ניסוי במולטיפלקס.
    4. טען את השקופית למיקרוסקופ דרך תוכנת הרכישה (4.2.0.4) ועקוב אחרי תהליך העבודה על ידי ציור אזורים מעניינים באמצעות שלבי ההדמיה של 2x ו-10x לכל שקף. בעת בחירת אזורים, ודאו שלכל שדה ראייה יש לפחות שני שכנים כדי למנוע בעיות תפירה.
    5. מזער את כמות הזכוכית הריקה שצולמה כדי למנוע בעיות תפירה ולהפחית את זמני הריצה על ידי אי בחירת שדות ריקים.
    6. בצע את הדמיית אוטופלואורסצנציה של 20x לפי זמני החשיפה שנקבעו בשלב 2.1.1 ופעל לפי אשף בקרת האיכות (QC). תאשר ויזואלית שאין אזורים מטושטשים או ארטיפקטים. אם זוהו אותם, נכשל בבקרת האיכות וההדמיה מחדש.
      הערה: אין מדד יחיד לחומרת בקרת איכות מקובלת, וההצלחה תלויה בקריאות הניסוי הנדרשות ובכמה המדגם יקר. רקמה בפוקוס עם עוצמת צביעה מספקת צריכה להיראות חדה ושקופה מבחינה ויזואלית. לעיתים קרובות נצפים אזורים קטנים של היפרדות או התפרקות רקמה, שלא ישתפרו עם הדמיה נוספת וניתן לסבול אותם אם שאר הדגימה צולמה היטב. אם נצפים ארטיפקטים גדולים ובהירים (למשל אבק), מומלץ להסיר אותם על ידי ניקוי המחסנית והדמיה מחדש.
    7. יצירת תמונות רקע שיוסרו מהאות הביומרקר הסופי, בתהליך שחוזר על עצמו בכל סבב מולטיפלקס.
      הערה: כל סבבי המולטיפלקס יתיישרו אוטומטית באמצעות תוכנת הרכישה.
  2. שימוש במטפל רובוטי בלוחות
    1. ודא שתוכנת הרכישה סגורה.
    2. פתח את תוכנת האינטגרציה הרובוטית ולחץ על התחל.
    3. הנח את מחזיק הסלייד ללא כיסוי בערימה בתוך ערימת הקלט.
    4. תוודא שערכת הפלט ריקה.
    5. פתח את תוכנת בקרת מטפל הלוחות הרובוטי (למשל תוכנת הרובוטיקה של Harmony (3.2.0)) ועקוב אחרי האשף, כדי לוודא שסוג הלוח והמספר הנכונים נבחרו.
    6. לחץ על התחלה ומטפל הפלטות יטען את המיקרוסקופ, שידע אוטומטית את שלב העבודה הנכון בגלל ברקוד השקופית.
      הערה: אם משתמשים במעמיס הרובוטי לשלבי הדמיית הביומרקר למטה, חשוב להסיר את האפשרות "זמני חשיפה דינמית" בתוכנה ולהשתמש בזמני חשיפה מוגדרים מראש.
  3. צביעת סמן ביולוגי רציף, השבתה של צבע והדמיית מולטיפלקס
    1. נוגדנים בצנטריפוגה בעוצמה של 13,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להגביל ארטיפקטים.
    2. הכינו את תמיסת הנוגדנים ב-PBS המכילה 0.3% BSA.
      הערה: ריכוזי הנוגדנים הסופיים משתנים, אך דילול של 1:200 הוא נקודת התחלה טובה לאופטימיזציה של נוגדן חדש.
    3. הסר את מדיום ההרכבה על ידי פיפטינג מיציאת מחזיק הסלייד Coverslipless ושוטף על ידי הוספת 2 מ"ל PBS המכיל 0.01% טווין למשך 5 דקות (חזור על השלב הזה שלוש פעמים).
    4. הסרת PBS וביצוע צביעת נוגדנים על ידי פיפטור של 350 מיקרוליטר תמיסת נוגדנים מדוללת ב-PBS אל הפורט. נפח זה מותאם כדי להבטיח כיסוי מלא של הדגימה בתוך תא הצביעה.
    5. תדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר על משטח החדר.
    6. הסר את תמיסת הנוגדנים על ידי פיפטינג מיציאת Coverslipless Slide Holder ושטוף על ידי הוספת 2 מ"ל PBS המכיל 0.01% טווין למשך 5 דקות (חזור על השלב הזה שלוש פעמים).
    7. הסר את PBS והוסיף מדיה של 2 מ"ל.
    8. הכנס מחזיק סלייד ללא כיסוי למיקרוסקופ כדי להתחיל את שלב ההדמיה האוטומטי הספציפי לסיבוב.
    9. לאחר שסיימו, תהליך העבודה מתקדם על ידי העברת שלבי האיכות, לפי ההוראות על המסך.
    10. הסר את מדיום ההרכבה על ידי פיפטינג מיציאת מחזיק הסלייד Coverslipless ושוטף על ידי הוספת 2 מ"ל PBS המכיל 0.01% טווין למשך 5 דקות (חזור על השלב הזה שלוש פעמים).
    11. יש להכין מחדש את תמיסת השבתה של הצבע המכילה 7 מ"ל ddH2O, 2 מ"ל 0.5M NaHCO3 ו-1 מ"ל 30%H2 O2. הכינו את התמיסה מיד לפני השימוש ומרחו על שקופיות ללא דיחוי.
      זהירות: יש לטפל במי חמצן באמצעות ציוד מגן מעבדתי מתאים.
    12. הסר PBS והוסף 2 מ"ל השבתה של צבע לכל שקופית מיד לאחר הוספת H2O2 לתמיסה עובדת.
    13. תדגר במשך 15 דקות על הספסל במחזיק המגלשה.
    14. הסר את תמיסת השבתה של צבע על ידי פיפטרינג מיציאת מחזיק המחסנית Coverslipless ושוטף במשך 5 דקות ב-2 מ"ל PBS המכיל 0.01% טווין.
    15. הסר את PBS והוסיף מדיה של 2 מ"ל.
    16. הכנס מחזיק סלייד ללא כיסוי למיקרוסקופ כדי להתחיל הדמיה אוטומטית ספציפית של 20x אוטופלואורסצנציה.
    17. לאחר שסיימו, תהליך העבודה מתקדם על ידי העברת שלבי האיכות, לפי ההוראות על המסך.
    18. חזור על שלבים 2.3.1 עד 2.3.17 לכמה סבבים/סימנים שנדרשים. (ההליך אומת על ידי היצרן עד 10 כדורים, אם כי שלמות הרקמה תהיה הגורם העיקרי למגבלה זו).

3. ניתוח HighPlex אוטומטי באמצעות תוכנת פתולוגיה דיגיטלית

  1. טעינת נתונים וחלוקת TMA
    1. גרור ושחרר תמונות IF מרובות ללשונית "מחקרים" בתוכנת הפתולוגיה הדיגיטלית.
      1. תמונות H&E וירטואליות חייבות להיות מיובאות בנפרד.
    2. לדגימות מיקרואריי רקמות (TMA) השתמשו ב"מודול TMA". זה מאפשר תיוג על בסיס ליבה-ליבה, מה שהופך את נתוני המעקב להרבה יותר פשוטים מאשר טיפול בשקופית כולה.
    3. כדי ליצור בלוק TMA, תחילה לנווט לפעולות בלוק וליצור מפה חדשה של TMA.
      1. ניתן להזין זאת ידנית או באמצעות גיליון אקסל דרך אשף הייבוא.
    4. חלק את ה-TMA על ידי לחיצה ימנית על הדגימה בלשונית המחקרים ובחירת "Segment TMA".
    5. בחר את גודל הליבות ויישר אותן למפה על ידי הזזת הקופסאות האדומות. לחץ על שמירה לאחר שהושלם.
    6. ניתוח וייצוא נתונים יכולים כעת להתבצע באופן מרכזי.
      הערה: הצינור הבא יכול להיות מופעל גם על חתכי רקמה מלאים ללא שימוש במודול TMA.
  2. סגמנטציה של יעד יחיד
    1. עבור ללשונית הניתוח.
    2. בתפריט הנפתח "פעולות הגדרות" לחץ על טעינה ובחר את מודול ניתוח הפלואורסצנציה HighPlex.
      1. לתוצאות אלו השתמשו בגרסה 5.2.2.
      2. בבחירת צבע, מלא את הסימנים הנבחנים ידנית או באמצעות פונקציית "צבעי מילוי אוטומטי".
      3. בגילוי גרעיני בחר סוג סגמנטציה המתאים לגרסה של HALO (כאן מתוארת הגרסה המסורתית, שאינה בינה מלאכותית).
      4. קבע סף ניגודיות גרעינית לקליטת גרעינים (בדרך כלל בטווח 0.4 – 0.6).
        1. הגדר את עוצמת הגרעין המינימלית לאיסוף גרעינים (בדרך כלל לא פחות מ-0.05).
        2. הפחתת בהירות התמונה המקסימלית לכ-0.4 בהתאם לעוצמת אות ה-DAPI (ירדה מ-1 בגלל טווח דינמי של תמונות 16 ביט).
        3. התאימו פרמטרים נוספים, כמו אגרסיביות סגמנטציה, מילוי חורים ומסנני גודל, בהתאם לסוג הרקמה.
      5. חזור על תהליך זה לזיהוי ממברנה וציטופלזמה.
        1. לגילוי ציטופלזמה מסורתי, רדיוס קולר בין 2 ל-5 הוא לעיתים נקודת התחלה טובה.
  3. בחירת סף חיובי בסמן ביולוגי
    1. כל סמן ביולוגי שנבחר בשלב בחירת הצבע יימדד לערכי עוצמה גולמיים.
    2. קבע סיווג בינארי (חיובי מול שלילי) או מספר סיווגי סף (גבוה, בינוני, נמוך, שלילי) לכל סמן, והתאם את הערכים באמצעות הסליידרים בתאי הגרעין, הציטופלזמה או הממברנה בהתאם לדפוס הצביעה.
      1. כדי לקבוע סף בינארי, כוון רק את הסליידר התחתון כדי לקבוע את ערך החיתוך.
      2. הערך ביצועים באמצעות חלון הכוונון בזמן אמת בתפריט "ניתוח" ועל ידי הפעלה/כיבוי מסכת הניתוח כדי להשוות לרמות הכתמים הגולמיים.
    3. צור שילובים של סמנים באמצעות פונקציית "פנוטיפים".
      1. שער לוגי כולל AND/OR חיובי/שלילי לכל הסימנים, מה שמאפשר לבנות מטריצה בלתי מוגבלת על פני כל הכתמים.
    4. הגדר את נתוני האובייקטים לאחסון ל-true אם נדרש נתוני יעד יחיד (נדרש לניתוח מרחבי).
    5. שמור את הפרוטוקול ובלשונית המחקרים סמן את כל השקופיות לניתוח, לחץ קליק ימני וניתוח לפי הפרוטוקול הרצוי.

4. סקירת תוצאות

  1. הערכה מרחבית בתוכנת פתולוגיה דיגיטלית
    1. צפו בכל התוצאות בלשונית "תוצאות" של תוכנת הפתולוגיה הדיגיטלית.
    2. טבלת הסיכום למעלה תכלול ממוצעים של כל התכונות בתמונה הנוכחית.
      1. זה יהיה עבור ליבה אחת אם תיפתח בנפרד.
    3. הטבלה התחתונה תציג את נתוני היעד היחידים עבור כל תכונה.
      1. חקור נקודות נתונים בודדות על ידי בחירה מתוך הטבלה או לחיצה על התמונה.
    4. פנוטיפים של סינון, חיוביות הסמנים או ספי עוצמה בעמודות המתאימות. ניתן לשרטט אותם על ידי ניווט ל: "פעולה של אובייקט" > "שרטוט" > "תרשים מרחבי".
    5. לאחר שזה נעשה עבור מספר קבוצות שונות, ניתן לבצע ניתוח מרחבי.
    6. בחירת כפתור "ניתוח מרחבי" ובחירת האפשרויות לפי הצורך:
      1. השכן הקרוב ביותר: ימצא את המרחק לתצפית הקרובה ביותר של סוג תא מסוים מאחר.
      2. ניתוח קרבה: ימדוד ברצועות סביב סוג תא נבחר ויכמת הן את מספר והן את המרחק של כל סוג תא אחר.
      3. ניתוח חדירה: ימדוד ברצועות את המרחק לשכבת אנוטציה מסוימת (מסומנת בתמונה באמצעות כלי ההערות) שבו נמצא סוג תא מסוים.
      4. מפת חום צפיפות: תיצור ויזואליזציה של התפלגות סוג תא בכל התמונה.
    7. ניתוח מרחבי ניתן להריץ בכל ליבות ה-TMA דרך כפתור "spots result" תחת פעולות החלקה ותפריט הנפתח "פעולות תוצאות".
  2. ייצוא תוצאות מ תוכנת פתולוגיה דיגיטלית
    1. ניתן לייצא תוצאות מהלשונית TMA על ידי ניווט ל"פעולות שקופה" > "ייצוא".
    2. ניתן לייצא נתוני סיכום בלבד או ניתוח מטרה יחיד מלא דרך הלשונית המתקדמת.
    3. יצירת נתונים כקבצי .csv שניתן לנתח אותם בתוכנות כמו R כדי ליצור ניתוח ברמת האוכלוסייה של עוצמת הביומרקר בכל התאים. תכונות אובייקט בודד כוללות: מזהה דגימה, מזהה אובייקט ייחודי (לכל תא), ערכי עוצמה גולמיים לכל סמן, סיווגי פנוטיפ וקואורדינטות מרחביות.

תוצאות

IF ב-10-plex ו-H& וירטואלי מזווג תמונות E נוצרו עבור 136 ליבות מיקרו-אריי רקמות המכסות 34 סוגי רקמות אנושיות בשני שקופיות שהוכנו בשיטות שונות (איור 2). תמונות מייצגות אלו מדגימות צביעת מולטיפלקס מוצלחת עם מורפולוגיית רקמות שמורה וזיהוי ברור של מספר סמנים ביולוגיים על פני ליבות מיקרו-מערך רקמות. שקופית אחת השתמשה בצביעה אוטומטית, והשנייה בתהליך הכנת שקופיות ידני. שכיחות גבוהה יותר של ארטיפקטים רקמתיים נצפתה בשיטה הידנית המבוססת על תא הסוואה, כולל ניתוק רקמות, וכן ליבות שאבדו או החליקו (איור 3). ארטיפקטים אלו מפחיתים את אזור הרקמה הניתנת לניתוח לפי דגימה או ליבה, ובכך משפיעים על ניתוח תמונות מולטיפלקס במורד הזרם. תצפיות אלו מאשרות שהפרוטוקול מאפשר צביעת מולטיפלקס אמינה ודימות במגוון סוגי רקמות.

הדמיה מוצלחת במולטיפלקס מתבטאת בשימור מורפולוגיית הרקמות, יישור עקבי בין סבבי הצביעה, וזיהוי ברור וספציפי של אותות ביומרקרים. לעומת זאת, תוצאות לא אופטימליות מאופיינות בניתוק רקמות, אובדן אות או ארטיפקטים של הדמיה שמפחיתים אזורים ניתנים לניתוח ופוגעים בניתוח בהמשך.

לאחר מכן, פרופיל הצביעה של סמנים כולל PANCK (רקמת אפיתל), CD31 (רקמת אנדותליה), aSMA (רקמת סטרומל), קרטין 15 (K15; אפיתל בסיסי), וימנטין (תאי מזנכימה), Ki67 (סמן רבייה), CD8 (תאי T ציטוטוקסיים) ו-FOXP3 (TREGs), הושוו בין שתי טכניקות הכנת השקופיות, עם ירידה קלה באות שנצפתה באופן איכותי (חזותי) בשיטה הידנית (איור 4A). באמצעות שימוש בספי סיווג סמנים ביולוגיים בתוכנת פתולוגיה דיגיטלית, הדגימות חולקו לאוכלוסיות חיוביות ושליליות עבור כל אחד מהתאים ~630K במאגר הנתונים (איור 4B). הערכה כמותית של אות הסמן בוצעה באמצעות מדידות עוצמה שמקורן בתהליך הניתוח הדיגיטלי של פתולוגיה. הערכות צפיפות האוכלוסייה (כאשר השטח מתחת לעקומה מייצג 100% מהאוכלוסייה) וערכי עוצמה חציונית הראו עליות מתונות ב-5/8 סמנים ביולוגיים באוכלוסיות חיוביות בעת שימוש בצבע השקף אוטומטי בהשוואה לתהליך הידני (איור 4C).

בהשלמת הפאנל, הסמנים שתוארו לעיל שולבו עם סמנים ביולוגיים נוספים עבור לממין B1 (ממברנה גרעינית) ו-p16 (מעכב קינאז תלוי ציקלין), מה שאפשר ויזואליות של שפע הרקמות היחסי והפיזור של כל 10 הסמנים בדגימה אחת (איור 5). היכולת לבנות פרופיל של מספר רב של סמנים ביולוגיים היא בעלת תועלת מיוחדת בתחום ההזדקנות, התלוי בהערכת מספר סמנים אורתוגונליים כדי להבטיח סיווג תקף2. כאן הצלחנו לפרופיל את השינויים בעוצמת הלאמין B1 באוכלוסיות הגבוהות והנמוכות של p16. חשוב לציין, מאחר שמדובר בדגימת מולטיפלקס, התאים הללו יכלו להיות מונחים בהקשר מרחבי, על ידי השוואה להתפלגות סוגי תאים אחרים באותה רקמה (איור 6A). באמצעות סף הסיווג של תוכנת הפתולוגיה הדיגיטלית, צביעה זו נמדדה כדי להראות שתאי p16 החיוביים היו קשורים לרמות נמוכות יותר של לאמין B1 מאשר התאים השליליים שלהם (איור 6B), פרופיל התואם לתבניות הסמן הקשורות להזדקנותשתוארו קודם לכן 12. הבחינו גם שתאי לאמין B1 שליליים היו בעלי רמות גבוהות יותר של p16 (איור 6C). באמצעות פונקציית הפנוטיפים בתוכנת הפתולוגיה הדיגיטלית (שמסווגת תאים על בסיס סגמנטציה של תא יחיד וסף של מספר סמנים), השילוב של הסמנים הללו שימש להגדרת אוכלוסיית תאים כזקנה, כלומר אלו שהם גם p16 חיוביים וגם Lamin B1 שליליים. לאחר מכן, היחס של התאים הללו על פני כל הליבות לפי סוג הרקמה נמדד, יחד עם כל אחד מעשרת הסמנים בנפרד (איור 6D). פלט זה מאפשר השוואה כמותית של אוכלוסיות תאים מוגדרות על ידי סמנים ביולוגיים בין סוגי רקמות שונים במאגר הנתונים של המולטיפלקס. למרות שצינור הניתוח פועל ברמת תא יחיד, מערך הנתונים הנוכחי מוצג בעיקר באמצעות התפלגויות ברמת האוכלוסייה. השפע הנמוך יחסית של תאים חיוביים ל-p16 במאגר נתונים זה עשוי להגביל את היכולת הסטטיסטית לניתוח קורלציה עמידה בין תא אחר תא בין p16 ל-Lamin B1, ולכן יש לפרש קשרים כאלה בזהירות.

figure-results-1
איור 1: סכמטיקה המציגה את תהליך העבודה המלא של אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: סקירה של הדמיית מולטיפלקס: (A-B): Virtual H& תמונות E שנוצרו מצביעת DAPI ואוטופלואורסצנציה Cy3 של סבב 1 כדי להמחיש את שלמות הרקמה של השקופיות שהוכנו באמצעות תהליכי צביעת שקופיות אוטומטיים או הכנת שקופיות ידניות. (C-D): צביעת IF מולטיפלקס של כל הסמנים הביולוגיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: דוגמאות לסוגי פריטים: דוגמאות מייצגות לסוגים שונים של חפצים שניתן ליצור בעיקר במהלך הכנת השקופית. ניתן להבחין בהיפרדות חלקית של רקמה באזורים לא מפוקוסים ויכולה לגרום לבעיות ביישור הרקמות בסבבים הבאים. ליבות חסרות מפחיתות את כוח הניסוי ולעיתים קרובות מתרחשות באופן לא פרופורציונלי בסוגי רקמות עדינות. ליבות מחליקות או חופפות מתרחשות כאשר ליבה מתנתקת ממקומה ב-TMA אך נדבקת לאזור אחר, מה שמחמיר את אובדן הדגימה בכך שמקשה על ניתוח הליבה הנסתרת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: השוואה בין אוטוסטיינר BOND לאות פלואורסצנציה ידני להכנת שקופית: (A): צביעת IF מייצג לסמנים מבניים פאן ציטוקרטין (PANCK), CD31, ואקטין אלפא לשריר חלק (aSMA). מיזוג של שלוש התמונות הללו מוצג בעמודה הראשונה. (B): מסכות ניתוח סיווג בינארי של Digital Pathology Software, המצביעות על זיהוי חיובי של סמנים בסוגי תאים שונים: CD31 (אדום), FOXP3 (טורקיז), Ki67 (צהוב), CD8 (לבן), PANCK (ירוק). הקופסה הלבנה מציינת את אזור הזום הדיגיטלי בפאנלים התחתונים. (C): כימות עוצמת הסמן הביולוגי באוכלוסיות תאים המקובלות לפי שיטת הכנת רקמות (צבע אוטומטי עם שקופית = אדום, מדריך = כחול) וחיוביות הסמנים (כהה = שלילי, בהיר = חיובי). השטח מתחת לכל תרשים צפיפות מייצג 100% מאוכלוסיית התאים שנבדקו. AF = אוטופלואורסנציה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5: פאנל מולטיפלקס מלא: תמונות מייצגות מרקמת התוספתן המראות A-B: פאנל IF מלא 10-פלקס C: PANCK (ירוק), D: CD31 (אדום), E:aSMA (צהוב), F: K15 (ורוד), G: וימנטין (לבן), H: Lamin B1 (טורקיז), I:p16 (זהב), J: Ki67 (צהוב בוהק), K: CD8 (ירוק בוהק) ו-L: FOXP3 (סגול). תיבה לבנה = זום דיגיטלי (מיזוג, CD31, aSMA, K15, Vim, LB1, p16), קופסה מקווקו = זום דיגיטלי (Ki67, CD8, FOXP3). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-6
איור 6: זיהוי סמן הזדקנות: (A): IF מייצג מתמונות רקמת הלבלב המציגים דפוסי צביעה מנוגדים של Lamin B1 (טורקיז) ו-p16 (זהב) יחד עם קשר מרחבי לסמנים אחרים PANCK (ירוק), CD31 (אדום) ו-Vimentin (לבן). (B): כימות עוצמת גרעין למין B1 (LB1) באוכלוסיות תאים חיוביים ושליליים ב-p16. (C): כימות עוצמת התאים p16 באוכלוסיות תאים חיוביות ושליליות של Lamin B1 (LB1). שטח גרף הצפיפות מתחת לעקומה מייצג 100% מהאוכלוסייה. (D): מפת חום מנורמלת בדירוג Z של ממוצע אחוזי הליבה החיוביים עבור כל סמן ביולוגי או פנוטיפ הזדקנות (p16+/LB1-ve) בין סוגי רקמות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

הדמיית IF מרובה באמצעות פלטפורמות אוטומטיות מאפשרת יצירת פרופילים מורכבים של פאנל גדול של סמנים ביולוגיים בתוך רקמה בודדת13. כאשר משולבים עם תוכנות פתולוגיה דיגיטליות, כמו HALO, הדבר מאפשר בחינה של השפע והיחסים המרחביים של סוגי התאים, ביחס זה לזה וכן את התפלגות שלהם במבני רקמה שונים3. יש לכך פוטנציאל להעניק ערך משמעותי לתחום ההזדקנות, התלוי בשילובי פרופיל של סימני היכר לסיווג חזק של תאי זקנה, אשר בתורם נקבעו כבעלי הטרוגניות משמעותית ולכן דורשים פרופיל תאי מטרה יחיד שאינו אפשרי עם מקטעי רקמה סדרתיים14. יתרה מזאת, עומס התאים המזדקנים משתנה בין רקמות, עשוי להצטבר בקצב שונה במהלך ההזדקנות, וקיים מחסור מובהק בסמנים אמינים ב-in vivo של הזדקנות, מה שהופך את היכולת להשתמש בפאנל גדול יותר של סמנים ביולוגיים לרצויה בהקשרים חדשים שבהם נדרשת גמישות רבה יותר 5,15,16. חשוב לציין, מחקרים קודמים הראו כי הצטברות ודינמיקת הזמן של תאים מזדקנים תלויה מאוד ברקמות, עם שונות משמעותית בשפע ובהתחלה בין מערכות איברים, מה שמדגיש שההזדקנות אינה מתרחשת בסינכרון בין רקמות. טכניקות פרופיל מרחבי חלופיות, כגון טרנסקריפטומיקה מרחבית או ציטומטריית מסה בהדמיה, יכולות לספק מידע מולקולרי משלים; עם זאת, אימונופלואורסצנציה מולטיפלקס מודדת ישירות ביטוי חלבונים ומאפשרת ניתוח מרחבי ברזולוציה גבוהה של פנוטיפים של תאים בתוך חתכי רקמה שלמים. האופי הסדרתי של IF במולטיפלקס מאפשר גם צינור גילוי איטרטיבי.

ניתן לבצע הדמיית IF במולטיפלקס בתהליכי עבודה בעלי תפוקה גבוהה על ידי אינטגרציה עם צביעה אוטומטית של שקופיות. בנוסף למתן יתרונות משמעותיים מבחינת סטנדרטיזציה, נראה כי הכנת הסקופיות האוטומטית גם מובילה לפחות ארטיפקטים מאשר שימוש בגישה ידנית מבוססת תא הסתרה, שכן נצפו פחות היפרדות רקמה ואובדן ליבות. עם זאת, תצפיות אלו מבוססות על השוואה איכותנית, ונדרש הערכה כמותית נוספת כדי לקבוע באופן פורמלי הבדלים בנזק לרקמות הנגרמות מעיבוד. זו דאגה מיוחדת בסוגי רקמות שומן כמו עור ושד. יתרה מזאת, מערכת Coverslipless Slide Holder מאפשרת אינטגרציה עם מטפלי לוחות רובוטיים, מה שמאפשר תפוקה גבוהה יותר ומפחית את זמן המפעיל על ידי שיפור זרימת העבודה כמו ריצות הדמיה ליליות. בעוד שאוטומציה צפויה לשפר את קצב התפוקה והסטנדרטיזציה, השוואות כמותיות של שיפורים אלו לא הוערכו רשמית במחקר זה ויש לפרש אותה כתצפית מעשית ולא כתוצאה מדודה. עם דגימות המוכנות כמיקרו-מערכי רקמות, ניתן ליצור ניתוחים מקיפים אלה עבור מאות דגימות מטופלים במספר נמוך יחסית של שקופיות, מה שעשוי להקל על מחקרים עתידיים החוקרים תאים מזדקנים בדגימות רקמה קלינית 5,11.

למרות שנצפו עליות קלות בעוצמות הסמנים באמצעות הכתם האוטומטי של הסלייד בתהליך הכנת המגלש הידני, בפועל יתרון זה קטן, שכן בדרך כלל ניתן להתגבר על אות נמוך באמצעות זמני חשיפה ארוכים יותר או התאמות לספי ניתוח. מספר שלבים מרכזיים משפיעים באופן קריטי על הצלחת הבדיקה, כולל אופטימיזציה של נוגדנים, עיצוב פאנל מולטיפלקס ובחירת פרמטרי הדמיה. אימות מדויק של תאימות נוגדנים, עוצמת האות ועמידות למחזורי צביעה חוזרים הוא חיוני להבטחת נתוני מולטיפלקס איכותיים וניתנים לשחזור. חשוב הרבה יותר הוא האופטימיזציה העגולה ובחירת הערוצים של הסמנים הביולוגיים. הבדיקות הללו נבדקות על דגימות בדיקה בנפרד ובשילוב, כדי להבטיח היעדר תגובתיות צולבת בין נוגדנים, וכן להראות כי ניתן היה להשתתף בצבע וזיהוי אפיטופים בסבבים הרצויים. מומלץ להשתמש בסמנים חלשים או פחות בשכיחות בערוצים Cy5 ו-Cy7, שלרוב מציגים אוטופלואורסצנציה נמוכה יותר. הפאנל הסופי נבדק בסוג הרקמה הרלוונטי, שכן חלק מהרקמות האופטימיזציה הנפוצות (למשל שקדים) דורשות לעיתים ריכוזים וזמני חשיפה נמוכים יותר מאשר בסביבות ניסוי, שיכולות להיות שונות גם בתכונות כמו אוטופלואורסצנציה. עם זאת, רקמות בקרה חיוביות כאלה יכולות להיות שימושיות כאשר נוכחות סוג התא אינה ודאית ברקמות ניסיוניות, שכן חוסר אות אינו ניתן להבחנה בקלות מהיעדר תאי מטרה. הקפדה באופטימיזציות הפאנליות הללו בתוך סוג הרקמה היעד היא הצעד הניסויי הקריטי ביותר להבטחת בדיקה מוצלחת, כדי למזער את אובדן הסמנים הביולוגיים בהריצות הסופיות. רוב הבעיות נובעות מתגובה צולבת של נוגדנים, אות לא מספק עקב ריכוזי נוגדנים נמוכים או אות נמוך לרעש בערוצי FITC/Cy3. בנוסף, שימור האנטיגן בשלבי השבתה חוזרים של צבע תלוי הן בנוגדנים והן ברקמות, מה שמחייב שימוש בשלבי אופטימיזציה מקיפים כדי להבטיח בחירת הרכב פנל/עגול מתאים לדגימות הניסוי. מגבלה מרכזית של תהליכי עבודה באימונופלואורסצנציה במולטיפלקס היא התלות בנוגדנים איכותיים, יחד עם יציבות האפיטופים לאורך מחזורי צביעה וביטול צבעים חוזרים.

בסך הכל, ההדמיה המולטי-פלקסית, בשילוב עם פלטפורמות אוטומציה, מהווה שינוי שלב בתחכום בהערכת IF של דגימות רקמה בתוך החיים , ומקלה על ניתוח מרחבי מקיף של פאנלים מורכבים של סמנים ביולוגיים ברמת התא היחיד. יישומים עתידיים של זרימת עבודה זו כוללים פרופילינג רחב היקף של סמנים ביולוגיים הקשורים להזדקנות בין סוגי רקמות מגוונים ואינטגרציה עם גישות אומיקס מרחביות מתקדמות לפתרון הטרוגניות תאית בסביבות רקמות מורכבות.

גילויים

CLB שימש כיועץ עבור Senisca, StarkAge ו-AKLRD. המעבדה של CLB קיבלה מימון מ-ValiRx.

תרומת המחבר:

RW LG ו-CLB פיתחו את הקונספט הראשוני. RW, FM, MGC, LG ו-CLB סיימו את הקונספט, פיתחו ותכננו ניסויים. RW, FM, MGC ו-LG ביצעו את כל הניסויים. RW ו-CLB כתבו את טיוטת כתב היד הראשוני, כאשר כל המחברים תרמו לתיקונים של כתב היד לפני ההגשה. כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד הסופי.

תודות

CLB מכירה במימון ל-FM ו-MGC מה-BBSRC (BB/T008709/1 ו-BB/W510427/1, בהתאמה) ולרכישת Cell DIVE מ-Wellcome Trust (223803/Z/21/Z).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
30% Hydrogen Peroxide (H2O2)MerckH1009
Antigen unmasking solution 1 (H3300) (ARS1)Vector Labs.H-3300הכן עם 12.5 מ"ל תמיסת הסרת אנטיגן + 237.5 מ"ל ddH2O
Antigen unmasking solution 2 (ARS2)SigmaT6066 / E5134הכן מלאי 10x (12.9 גרם Trizma base, 3.7 גרם EDTA, 5 מ"ל Tween 20, 995 מ"ל ddH20). 
Bovine Serum Albumin (BSA)MerckA2153
Bulk Dewaxing SolutionLeicaAR9222
Bulk Epitope Retrieval 1 (ER1)LeicaAR9961
Bulk  Epitope Retrieval (ER2)LeicaAR9640
Bulk Wash SolutionLeicaAR9590
DAPIMerckD3571
Doubled distilled water (ddH20)N/AN/A
DMSOMerck472301
Donkey SerumMerckD9663
EDTAMerckE5134
GlycerolMerckG5516
NaHCO3MerckS5761
Phosphate Buffered Saline (PBS)MerckBP399
Propyl GallateMerckP3130
Sodium BicarbonateMerckS5761
Triton X 100MerckH5141
Trizma BaseMerckT6066
Tween20MerckP1379
Other consumables or Equipment
Decloaking chamberBioCareDC2012
Steam stripsBioCare613QC
Bond RXm Auto Slide StainerLeicaHIS2330מכונה צביעה אוטומטית של שקפים 
Cell DIVELeica29429159מכונה מערכת הדמיית פלואורסנטיות מרובת ערוצים 
Click Well slide holdersLeica29463259מכונה מחזיק שקפים ללא כיסוי Well 
Antibody List
CD31 (Pecam-1)Cell Signalling61255Clone: 89C2
Fluorophore: AF555
Dilution: 1 in 50
CD8aBioLegend372906Clone: C8/144B
Fluorophore: Alexa 647
Dilution: 1 in 100
CDKN2A/p16Santa Cruzsc-56330 AF647Clone: jc8
Fluorophore: Alexa 647
Dilution: 1 in 200
FOXP3BioLegend320114Clone: 206D
Fluorophore: Alexa 647
Dilution: 1 in 50
Keratin 15Abcamab194065Clone: EPR1614Y
Fluorophore: AF_488
Dilution: 1 in 200
Ki67Abcamab215226Clone: EPR3610
Fluorophore: AF555
Dilution: 1 in 50
Lamin B1Abcamab194106Clone: EPR8985(B)
Fluorophore: AF_488
Dilution: 1 in 100
PanCK_AE1/AE3Thermofisher53-9003-82Clone: AE1/AE3
Fluorophore: AF_488
Dilution: 1 in 100
SMAR&D systemsIC1420SClone: 1A4
Fluorophore: Alexa 750
Dilution: 1 in 100
VimentinCell Signalling69227Clone: D21H3
Fluorophore: Alexa 750
Dilution: 1 in 100

מקורות

  1. Gorgoulis, V., et al. Cellular senescence: Defining a Path Forward. Cell. 179 (4), 813-827 (2019).
  2. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends Cell Biol. 28 (6), 436-453 (2018).
  3. De Souza, N., Zhao, S., Bodenmiller, B. Multiplex protein imaging in tumour biology. Nat Rev Cancer. 24 (3), 171-191 (2024).
  4. Teo, Y. V., et al. Notch signaling mediates secondary senescence. Cell Rep. 27 (3), 997-1007 (2019).
  5. Ogrodnik, M., et al. Guidelines for minimal information on cellular senescence experimentation in vivo. Cell. 187 (16), 4150-4175 (2024).
  6. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  7. Schürch, C. M., et al. Coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoral immunity at the colorectal cancer invasive front. Cell. 182 (5), 1341-1359.e19 (2020).
  8. Lin, J. R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, e31657(2018).
  9. Tomimatsu, K., et al. Precise immunofluorescence cancelling for highly multiplexed imaging to capture specific cell states. Nat Commun. 15, 3657(2024).
  10. Kiessling, P., Kuppe, C. Spatial multi-omics: novel tools to study the complexity of cardiovascular diseases. Genome Med. 16 (1), 14(2024).
  11. Chaib, S., Tchkonia, T., Kirkland, J. L. Cellular senescence and senolytics: the path to the clinic. Nat Med. 28, 1556(2022).
  12. Freund, A., Laberge, R. M., Demaria, M., Campisi, J. Lamin B1 loss is a senescence-associated biomarker. Mol Biol Cell. 23 (11), 2066-2075 (2012).
  13. Eng, J., et al. A framework for multiplex imaging optimization and reproducible analysis. Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).
  14. Wallis, R., et al. Senescence-associated morphological profiles (SAMPs): an image-based phenotypic profiling method for evaluating inter- and intra-model heterogeneity of senescence. Aging (Albany NY). 14, 1-27 (2022).
  15. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. FEBS J. 288 (1), 56-80 (2021).
  16. O’Sullivan, E. A., Wallis, R., Mossa, F., Bishop, C. L. The paradox of senescent-marker positive cancer cells: challenges and opportunities. NPJ Aging. 10 (1), 1-11 (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביולוגיהגיליון 233גיליון 233ערך ריקגיליוןדימוי מרובה (Multiplexed imaging)פלואורסצנציה אימונית מחזוריתסימון אימוני חזרתי והלבנה כימיתדימוי של סלייד שלםביולוגיה מרחביתפתולוגיה דיגיטליתצובע אוטומטיאינטגרציה רובוטיתCell DIVEHALOBOND RXm
מבחן אימונופלואורסצנציה מרובה לצורך הערכה מרחבית של סמני הזדקנות ב-vivo
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.