הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

מנגנונים מולקולריים של DBNL באי ספיקת לב: מאימונומטבוליזם של מקרופאגים ועד השלכות טיפוליות

445 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69756

⸱

2 בינואר 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 2Department of Cardiology, the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול לשילוב מולטיאומיקס של רנדומיזציה מנדלית, טרנסקריפטומיקה חד-תאית וסקר מבוסס מבנה בסיליקו כדי להגדיר באופן שיטתי את ציר מקרופאג' דמוי דרברין (DBNL) באי ספיקת לב. אנו ממליצים על DBNL כמטרה אימונומטבולית שניתן לסרוף.

תקציר

אי ספיקת לב (HF) נותרה אתגר בריאותי עולמי משמעותי, עם טיפולים יעילים מוגבלים המכוונים למנגנונים הפתופיזיולוגיים המרכזיים שלו. במחקר זה נעשה שימוש בגישה משולבת של מולטיאומיקס המשלבת רנדומיזציה מנדלית (MR) וריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) לזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ומטרות טיפוליות ל-HF. השתמשנו בנתונים ממחקרי אסוציאציה גנומית רחבת היקף (GWASs), לוקוסי תכונות ביטוי כמותיות (eQTLs), לוקוסי תכונות כמותיות מתילציה (mQTLs) ולוקוסים כמותיים של תכונות חלבון (pQTLs) כדי לחקור את המנגנונים הגנטיים של HF. בוצעה ריצוף RNA חד-תאי לניתוח ביטוי גנים במקרופאגים לבביים, וניתוח פסאודוטיים שימש לחקר הוויסות הדינמי של DBNL במהלך התמיינות מקרופאגים. סימולציות עגינה מולקולרית ודינמיקה זוהו חומצה פיריניקסית (WY-14643; PubChem CID: 4594; מילים נרדפות: 50892-23-4; WY-14643) כרגולטור פוטנציאלי של DBNL. ניתוח מולטיאומיקס גילה כי DBNL (דמוי דרברין) הוא גן מרכזי הקשור לסיכון ל-HF. ריצוף RNA חד-תאי גילה ש-DBNL מתבטא בעיקר במאקרופאגים לבביים והוא מווסת בתנאים פתולוגיים. הביטוי של DBNL על ידי מקרופאגים קשור למטבוליזם החיסוני ולמסלולים פרופיברוטיים, במיוחד מסלולי האיתות IL-6/JAK/STAT3, PI3K/AKT/mTOR ו-TGF-β. ניתוח פסאודוטיים הראה של-DBNL יש השפעה רגולטורית דינמית על התמיינות המאקרופאג'ים, במיוחד בדלקת כרונית. עגינה מולקולרית וסימולציות דינמיות הראו שלחומצת פירידין יש תפקיד פוטנציאלי בוויסות DBNL. מחקר זה מבהיר את תפקיד DBNL בהתקדמות אי ספיקת לב ומציע את פוטנציאל הפוטנציאל שלו כמטרה טיפולית. חשוב לציין שהרלוונטיות הטיפולית נלקחת מחיזויים חישוביים. ממצאים אלו מציעים תובנות חדשניות לגבי מטבוליזם חיסוני ותקשורת בין-תאית מתווכת על ידי מקרופאגים, ומקינים בסיס תיאורטי ליישומים עתידיים באופטימיזציה של תרופות ממוקדות DBNL ובמחקר פונקציונלי. עם זאת, נדרשים אימות ניסויי נוסף ומחקרים פרה-קליניים כדי לאמת את היעילות הקלינית של DBNL כמטרה טיפולית.

מבוא

אי ספיקת לב (HF) מייצגת אתגר בריאותי עולמי משמעותי וגדל שמשפיע על מיליוני אנשים ברחבי העולם ומטיל עומס כלכלי משמעותי על מערכות הבריאות1. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף בהתערבויות יעילות בניהול אי ספיקת לב (HF).

הפתופיזיולוגיה המורכבת של אי ספיקת לב נובעת מפגיעה בכיווץ שריר הלב של החדר השמאלי, מה שמוביל לשרשרת של סיבוכים מערכתיים, כגון גודש ריאתי ופריפרי2. עם זאת, התייחסות ישירה למנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים שמאחורי התקדמות אי ספיקת הלב, במיוחד שיחזור שריר הלב השלילי, נותרת אתגר קריטי ובלתי נענה3. בעשורים האחרונים, תחום המחקר הביו-רפואי עבר שינוי פרדיגמה משמעותי, בעיקר בזכות שילוב טכנולוגיות מולטיאומיקס ומתודולוגיות ביואינפורמטיקה מתקדמות. כלים אלו מציעים הזדמנויות יוצאות דופן לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים של מחלות ומטרות טיפוליות. אקראיות מנדליאנית (MR), גישה אפידמיולוגית גנטית קפדנית, משתמשת בפולימורפיזמים חד-נוקלאוטידיים (SNPs) כמשתנים אינסטרומנטליים כדי להסיק קשרים סיבתיים בין חשיפות גנטיות לתוצאות קליניות4. על ידי אימוץ המסגרת המתודולוגית של ניסויים מבוקרים אקראיים, רנדומיזציה מנדלית (MR) מתמודדת ביעילות עם בעיות של בלבול וסיבתיות הפוכה כדי לספק ראיות חזקות לזיהוי ושימוש חוזר של מטרות תרופות. במקביל, ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) חושף הטרוגניות ברקמה ברזולוציה שאין לה מתחרים, ומציע תובנות עמוקות לגבי ביטוי גנים ספציפי לסוג תא ורשתות תקשורת בין-תאיות באיברים מורכביםכמו הלב. הגישה המולטיאומית, המסנתזת נתונים גנטיים, טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים, מציעה פוטנציאל משמעותי להבהרת מנגנוני מחלה ולזיהוי מסלולים טיפוליים.

למרות ההתקדמות הטכנולוגית הזו, פערי ידע משמעותיים קיימים לגבי המנגנונים התאיים והמולקולריים הספציפיים שמניעים דלקת לב ועיצוב מחדש באי ספיקת לב. ראיות מצטברות מצביעות על כך שתאי מערכת החיסון, במיוחד מקרופאג'ים, חיוניים לתזמור תגובות דלקתיות ולעיצוב מחדש של רקמות במהלך פגיעות שריר הלב ותהליכי אי ספיקת לב כרונית, אשר בתורם חיוניים להתפתחות המחלה6. מחקרים קודמים התרכזו בעיקר במתווכים דלקתיים רחבים או בסמנים על פני שטח התא, מה שיצר פער משמעותי בחקירת מטרות רגולציה תוך-תאית בתוך אוכלוסיות תאי החיסון הקריטיות הללו. בנוסף, אף שמחקרי אסוציאציה גנומיים מסורתיים (GWASs) זיהו מספר רב של קשרים גנטיים הקשורים לאי ספיקת לב, הם נתקלים לעיתים קרובות בקשיים בקביעת קשרים סיבתיים סופיים, מה שמגביל את יישומם לתרגום תרופתי ישיר7. כתוצאה מכך, יישום מסגרת אקראית מנדלית (MR) מקיפה במולטיאומיקס, הכוללת וריאנטים גנטיים המשפיעים על מתילציה של DNA (mQTLs), ביטוי גנים (eQTLs) ושפע חלבונים (pQTLs), הוא חיוני להשגת הסקות סיבתיות חזקות יותר בשכבות רגולציה ביולוגיות מרובות. גישה זו מתמודדת עם המגבלות הטבועות במחקרי QTL בשכבה אחת. ראוי לציין כי חלבון דמוי דרברין (DBNL) היה נושא למחקר נרחב בהקשר של התפתחות נוירונים ודינמיקת שלד ציטוסקלטלי8; עם זאת, חשיבותו התפקודית והפוטנציאל הטיפולי שלה במחלות לב וכלי דם, במיוחד אי ספיקת לב, נותרו ברובן בלתי נחקרות. פער משמעותי זה בהבנתנו מונע את ההתייחסות ל-DBNL כמטרה חדשה ופוטנציאלית אפשרית לפיתוח תרופות בטיפול באי ספיקת לב.

כדי להתמודד עם פערי הידע הקריטיים הללו, מחקר זה שואף לזהות באופן יציב גנים מרכזיים הקשורים סיבתית לסיכון לאי ספיקת לב באמצעות מסגרת MR משולבת של מולטיאומיקס המשלבת נתוני eQTL, mQTL ו-pQTL. מחקר זה מציג גישה חדשנית הכוללת שילוב של ניתוחי רנדומיזציה מנדליאניים של מולטיאומיקים — כולל לוקוסי תכונות כמותיות של ביטוי (eQTLs), אתרי תכונות כמותיים של מתילציה (mQTLs) ואתרי תכונה כמותיים של חלבון (pQTLs) — עם נתוני טרנסקריפטומיים חד-תאיים ברזולוציה גבוהה (GSE161470) ונתוני טרנסקריפטומיים בכמויות גדולות (GSE161472) לזיהוי שיטתי של גן DBNL כגורם סיבתי קריטי לאי ספיקת לב. ממצאים אלו מראים ש-DBNL מתבטא בעיקר ובאופן ספציפי במקרופאגים לבביים, ושהביטוי שלו משתנה דינמית לאורך תהליך ההתמיינות. יתרה מזאת, תוצאות מחקר זה מבהירות את התפקיד המרכזי של DBNL בוויסות המיקרו-סביבה החיסונית של הלב ובתיאום מסלולים אימונומטבוליים הקשורים לאי ספיקת לב, כגון מפל האיתות IL-6/JAK/STAT3, וכן מסלולי איתות פרופיברוטיים. בנוסף, באמצעות שימוש בטכניקות ביולוגיה חישובית, מחקר זה חוזה כי חומצה פירידילית (WY-14643) היא ליגנד בעל זיקה גבוהה ל-DBNL, ובכך מספקת מסגרת תיאורטית מקיפה ורב-ממדית התומכת בהכרזת DBNL כמטרה טיפולית חדשה לאי ספיקת לב ומקלה על פיתוח התערבויות פרמקולוגיות ממוקדות. באמצעות ריצוף RNA חד-תאים, אפיינו את הביטוי והמסלולים התפקודיים הספציפיים לתא של הגן המרכזי DBNL שזוהה בתוך המיקרו-סביבה הלבבית, וחקרנו את תפקיד DBNL במסלולי איתות אימונומטבוליים ופרופיברוטיים, וכן בתקשורת תא-תא בין סוגי תאי לב. ליגנדים פוטנציאליים של מולקולות קטנות עבור DBNL זוהו באמצעות סימולציות חישובית של עגינה מולקולרית ודינמיקה מולקולרית. אנו משערים ש-DBNL, המתבטא בעיקר במאקרופאגים לבביים, משפיע סיבתיות על התקדמות אי ספיקת לב על ידי ויסות מסלולי אימונומטבוליזם ושיח צולב בין-תאי. לסיכום, על ידי שילוב מולטיאומיקה מתקדמת של רנדומיזציה מנדלית עם ניתוח תא יחיד ברזולוציה גבוהה, זיהינו ואפיינו באופן שיטתי מטרות טיפוליות חדשות לאי ספיקת לב וחקרנו מטרות מודל מולקולות קטנות פוטנציאליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הורדת נתונים
נתוני ביטוי גנים
נתוני ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) ששימשו במחקר הנוכחי נאספו ממאגר Gene Expression Omnibus (GEO) המנוהל על ידי המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), במיוחד ממאגר הנתונים עם מספר הגישה9 GSE161470 (רקמת לב אנושית הכוללת ארבעה דגימות ביקורת ודגימה פתולוגית אחת). מערך נתונים זה פורסם במקור על ידי Zhang ואחרים בשנת 2022,10. המטרה העיקרית של המחקר המקורי הייתה לבחון את ההטרוגניות התאית ומנגנוני הרגולציה המולקולרית ברקמת הלב האנושית בתנאי אי ספיקת לב. לניתוח הנוכחי, נבחרו חמש דגימות מתוך מאגר נתונים זה, שכל אחד מהם כולל פרופילי ביטוי חד-תאיים מקיף שמקורם ברקמת לב אנושית. מערך הנתונים הנוסף ששימש במחקר זה התקבל גם הוא ממאגר הציבורי של NCBI GEO, במיוחד מקובץ מטריצת הסדרה המתאים למספר הגישה GSE161472, בליווי קובץ ההערות GPL11154. פרופיל הביטוי כולל סך של 84 דגימות, כולל 37 דגימות ביקורת ו-47 דגימות מחלה. מחקר זה כולל ניתוח מולטי-אומיקס אינטגרטיבי, כאשר כל החקירות מבוצעות באמצעות נתונים נגישים לציבור.

נתוני eQTL
נתוני eQTL, שהתקבלו מקונסורציום eQTLGen, מתמקדים בהבהרת המסגרת הגנטית של ביטוי גנים בדם ובגורמים הגנטיים המשפיעים על תכונות מורכבות3. הקונסורציום עוסק כיום בשלב השני של הפרויקט הנרחב שלו, בו מבצעים מטא-אנליזות של נתוני גנום רחבי העולם הנוגעים לביטוי גנים בדם.

נתוני חשיפה - mQTLs
נתוני mQTL התקבלו ממטא-אנליזה שפורסמה של קבוצת אירופה (EUR), הבוחנת מתילציה של DNA דם מלא במסגרת הגנטית של 3,701 דגימות מאוכלוסיות ממוצא אירופי11. מערך הנתונים כלל מידע על 426,636 תכונות mQTL.

נתוני חשיפה-pQTL
נתוני pQTL של פלזמה התקבלו ממסד הנתונים deCODE (https://www.decode.com/summarydata/)4. מחקר זה השתמש בפרסום הנתונים של מאגר הנתונים deCODE pQTL משנת 2021, הכולל מחקר אסוציאציה גנומי רחב (GWAS) של רמות חלבוני פלזמה שנמדד באמצעות 4,907 אפטמרים בקבוצה של 35,559 אנשים ממוצא אירופי.

נתוני תוצאה
סטטיסטיקות סיכום לאי ספיקת לב התקבלו ממחקר אסוציאציה גנומי רחב היקף (GWAS) שכלל בעיקר משתתפים ממוצא אירופי, ונגיש דרך מאגר הנתונים של המכון האירופי לביואינפורמטיקה (EBI) (GCST90162626). מאגר הנתונים של אי ספיקת לב כלל 115,150 מקרים ו-1,550,331 ביקורת. קטלוג GWAS, הכולל פרסומים, אגודות מובילות וסטטיסטיקות סיכום מפורטות, מציע כיום נתונים הממופים ל-Genome Assembly ול-dbSNP Build.

ניתוח רנדומיזציה מנדלית של mQTLs, eQTLs ו-pQTLs
כדי לחקור באופן שיטתי את הקשרים הסיבתיים הפוטנציאליים בין ביטוי גנים, שפע חלבונים, רמות מתילציה ב-DNA וסיכון לאי ספיקת לב, בוצעו ניתוחי רנדומיזציה מנדלית (MR) תוך שימוש בלוקי תכונות ביטוי כמותיות (eQTLs), לוקוסי תכונות כמותיים של חלבון (pQTLs) ואתרי תכונות כמותיים של מתילציה (mQTLs). במהלך שלב העיבוד המוקדם של נתוני החשיפה, חולצו פולימורפיזמים חד-נוקלאוטידיים (SNPs) הקשורים לכל משתנה חשיפה (גן, חלבון או אתר מתילציה) ממאגרי הנתונים הרלוונטיים בסף מובהקות כלל-גנומי של P < 1 × 10⁻⁵ כדי לשמש כמשתנים אינסטרומנטליים מועמדים ראשוניים (IVs). בהמשך, בוצע קיבושים של חוסר שיווי משקל קישורי (LD) עבור ה-IVs של כל גורם חשיפה באמצעות גודל חלון של 10,000 קילובסיסים (kb) וסף LD R² של 0.001 כדי להבטיח עצמאות בין המכשירים. עירויים נבחרים אלו שולבו לאחר מכן עם סטטיסטיקות סיכום ממחקר אסוציאציה גנומי של אי ספיקת לב (GWAS; ID: GCST90162626) על ידי שימוש בפונקציית read_outcome_data, תוך שמירה רק של SNPs שמציגים ערך P אסוציאציה מתחת ל-5×10⁻⁵ במאגר התוצאות. כדי לצמצם הטיית מכשיר חלשה, סטטיסטיקת F לכל IV חושבה כ-F = (β_exposure/SE_exposure)², ורק כלים עם F > 10 נכללו בניתוחים הבאים. להערכת אפקט סיבתי, בוצעה יישור אללים בין מערכי הנתונים של החשיפה לתוצאה באמצעות פונקציית harmonize_data מחבילת TwoSampleMR. לאחר מכן בוצעו ניתוחי MR בארבע גישות סטטיסטיות משלימות: (1) שיטת IVW, המספקת מטא-אנליזות של הערכות יחס וולד בין SNPs; (2) רגרסיית MR-אגר, שמסבירה פליאוטרופיה כיוונית על ידי שילוב איבר יירוט תחת הנחת חוזק המכשיר העצמאי מההשפעה הישירה (InSIDE); (3) שיטת החציון המשוקללת, שמניבה הערכות סיבתיות עקביות גם אם עד 50% מהכלים אינם תקפים; ו-(4) שיטת המצב המשוקלל, שמזהה את אשכול הערכת ההשפעה הסיבתית השכיח ביותר, ומציע עוצמה סטטיסטית משופרת והפחתת שגיאת סוג I ביחס ל-MR-Egger. במקרים שבהם היה רק משתנה אינסטרומנטלי יחיד זמין, שיטת יחס וולד יושמה באופן בלעדי. כדי להעריך את עמידות הממצאים, בוצעו ניתוחי רגישות מקיפים, שכללו בדיקות הטרוגניות באמצעות פונקציית mr_heterogeneity, הערכת פליאוטרופיה באמצעות mr_pleiotropy_test, וניתוחי השארת אחד בחוץ שיושמעו דרך פונקציית mr_leaveoneout, אשר מדירה באופן איטרטיבי כל SNP כדי לקבוע את השפעת הווריאנטים הבודדים על התוצאות הכוללות. אסוציאציות משמעותיות הוצגו באמצעות כלים גרפיים כמו mr_scatter_plot ו-mr_forest_plot. צינור אנליטי זה יושם באופן אחיד על מערכי הנתונים eQTL, pQTL ו-mQTL כדי לשמור על עקביות מתודולוגית לאורך כל המחקר.

ניתוח קולוקליזציה
בוצע ניתוח קולוקליזציה באמצעות שיטת Coloc, נתוני סיכום eQTL, ו-GWAS של אי ספיקת לב5. פולימורפיזם אינדקס של נוקלאוטיד יחיד (SNP) שימש לחישוב ההסתברות האחורית בתוך חלון התגבשות של 100 קילו-בייט. בניתוח הקולוקליזציה (coloc), השערת H3 מציינת את ההסתברות הפוסטריורית לכך ששתי התכונות, כלומר ביטוי גנים ואי ספיקת לב, קשורות זו לזו, אך יש להן וריאנטים סיבתיים מובחנים. לעומת זאת, השערת H4 מצביעה על הסתברות אחורית שהקשר בין שתי התכונות מיוחס לווריאנט סיבתי משותף יחיד. סף של SNP. PP. H4 הגדול מ-0.90 שימש לקביעת הקולוקליזציה.

חדירה חיסונית
שיטת CIBERSORT היא שיטה שאומצה באופן נרחב להערכת סוגי תאי מערכת החיסון בתוך מיקרו-סביבה12. באמצעות עקרונות רגרסיית וקטור תמיכה, ניתן לבצע ניתוח דה-קונבולוציה של מטריצת הביטוי של תתי-סוגי תאי החיסון. על ידי שילוב 547 סמנים ביולוגיים, CIBERSORT יכול להבדיל 22 פנוטיפים של תאי חיסון אנושיים, כולל תאי T, תאי B, תאי פלזמה ותת-אוכלוסיות תאי מיאלואידים שונות. באמצעות מערך הנתונים GSE161472, נערך ניתוח באמצעות אלגוריתם CIBERSORT יחד עם מטריצת החתימה LM22 המשולבת שלו, המאפיין את פרופילי ביטוי הגנים של 22 סוגי תאי חיסון אנושיים שונים. רמות החדירה של 22 אוכלוסיות תאי החיסון הללו נמדדו עבור כל דגימה בודדת. בהמשך, פונקציית cor.test יושמה להערכת המתאמים בין ביטוי גנים מרכזיים לבין רמות חדירת תאי החיסון המתאימים.

עיבוד נתוני ריצוף RNA תא יחיד ובקרת איכות
נתוני פרופיל הביטוי של תא יחיד עובדו באמצעות חבילת Seurat (V4.3.0) בסביבת R (V4.3.0)6. מחקר זה השתמש בזרימת עבודה קונבנציונלית לניתוח נתוני ריצוף RNA חד-תאים. בהתחלה, פרופילי הביטוי יובאו באמצעות חבילת Seurat. התאים סוננו על בסיס מספר מדדי איכות, כולל סך כל ספירת ה-UMI של כל תא, מספר הגנים המובעים, שיעור הקריאות המטוכונדריאליות ושיעור הקריאות הריבוזומיות. חריגים זוהו כערכים החורגים מהחציון ביותר משלוש סטיות מוחלטות חציוניות (MADs). ספי הסינון הספציפיים שהוחלו היו כדלקמן: nFeature_RNA ≥ 200, percent.mt ≤ 2.15718, nFeature_RNA ≤ 2840.941, ו-nCount_RNA ≤ 5194.27. בדרך כלל, תאים שהראו ספירות UMI כוללות גבוהות מדי ומספר הגנים המובעים סווגו כדאבלטים, בעוד תאים עם אחוזים גבוהים של קריאות מיטוכונדריה או ריבוזומלית נחשבו לאיכותיים נמוכים, וייתכן שעברו אפופטוזיס או פיצול. לאחר שלבי הסינון הללו, נעשה שימוש ב-DoubletFinder (גרסה 2.0.4) לזיהוי והסרת דאבלטים מכל דגימה בנפרד, ובכך להשלים את תהליך בקרת איכות התא. בתחילה, נירמול הנתונים בוצע באמצעות פונקציית normalizeData. מצב מחזור התא הוערך לאחר מכן באמצעות פונקציית CellCycleScorering, וזוהו גנים משתנים מאוד באמצעות שיטת FindVariableFeatures. מערך הנתונים הורחב לאחר מכן באמצעות ScaleData כדי לתקן את הנתונים ולהפחית את השפעת גנים מיטוכונדריאליים, גנים ריבוזומליים ואפקטי מחזור התאים על ניתוחים במורד הזרם. הפחתת ממדיות ליניארית בוצעה באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) באמצעות פונקציית RunPCA, כאשר רכיבים עיקריים משמעותיים נבחרו לניתוח נוסף. כדי להתמודד עם אפקטי אצווה בין דגימות שונות, נעשה שימוש באלגוריתם Harmony (גרסה 1.1.0). גישה זו מאגדרת באופן איטרטיבי תאים דומים מקבוצות שונות בתוך מרחב PCA, תוך שמירה על גיוון אצווה בתוך אשכולות. בהינתן השפעות האצווה המתונות יחסית שנצפו במאגר הנתונים, הוטלו פרמטרים ברירת מחדל (θ = 2). הפחתת הממד הלא-ליניארי בוצעה לאחר מכן באמצעות RunUMAP, ולאחר מכן בניית גרף שכנות תאים באמצעות FindNeighbors ואשכול תאים דרך FindClusters. לאנומנטציה של סוגי תאים, יושמה מסגרת פירוק היררכית: הערות ידניות ראשוניות התבססו על דפוסי ביטוי גנים אופייניים בהתבסס על מסד הנתונים של CellMarker והספרות הרלוונטית; זה הושלם על ידי תוצאות אנוטציה אוטומטיות שהושגו מתוכנת SingleR כהפניה. כדי להגדיל עוד יותר את הדיוק והמקיפות של זיהוי סוגי התאים, התייעצו עם מספר מסדי נתונים סמכותיים, כולל Human Primary Cell Atlas (HPCA), BlueprintEncode, MonacoImmune, DatabaseImmuneCell ו-NovershternHaematopoietic. הערות תאים בוצעה על ידי שאילתה במסד הנתונים CellMarker (http://117.50.127.228/CellMarker/CellMarkerBrowse.jsp) וסקירת הספרות, בסיוע תמיכה אוטומטית בהערות שסופקה על ידי תוכנת SingleR (V2.4.0)13. המטרה היא לזהות את סוגי התאים הנמצאים ברקמה המתאימה ואת גני הסמן הקשורים אליהם14.

ניתוח אינטראקציות בין ליגנד לקולטנים
במחקר זה, CellCall (גרסה 1.0.7) שימשה לביצוע ניתוח מקיף של רשתות תקשורת בין-תאיות15. באמצעות אנוטציות מסוג תא שמקורן ב-Seurat לצד מטריצת הספירה הגולמית, נבנה אובייקט ניתוח מנורמל עם פרמטרים שהוגדרו לגנום האנושי. פונקציית TransCommuProfile יושמה לכימות את עוצמת האינטראקציות בין תאים באמצעות אלגוריתם משוקלל, תוך יישום סף מובהקות של ערך p < 0.05 לזיהוי זוגות ליגנד-קולטנים אמינים. זוגות האינטראקציה המשמעותיים עברו לאחר מכן ניתוח העשרת מסלולי KEGG באמצעות פונקציית getHyperPathway, והקשרים בין סוגי התאים והמסלולים הוצגו באמצעות תרשימי בועות. רשת התקשורת הכוללת הוצגה בסופו של דבר באמצעות גרף מעגלי, שבו שמונה צבעים מובחנים סימנו סוגי תאים שונים. עוצמת האינטראקציה וכיווניות יוצגו על ידי תכונות חץ, וסיפקו אפיון מפורט של דינמיקת איתות בין-תאית.

ניתוח פסאודו-זמן
כדי לחקור את הרגולציה הדינמית של המקרופאגים לאורך כל התקדמות אי ספיקת הלב, המחקר השתמש באלגוריתם מונוקל לביצוע ניתוח פסאודו-זמן על תת-אוכלוסיות של מקרופאגים. מטריצת ביטוי הגנים המתאימה לתת-אוכלוסיות התאים היעד הופקה לבניית אובייקטים לניתוח מסלול תא יחיד, כאשר גנים משתנים מאוד נבחרו כתכונות סדר. באמצעות טכניקת הפחתת הממדיות DDRTree, התאים מופו למרחב דו-ממדי כדי לשחזר את מסלול ההתמיינות. בוצעו ניתוחי ויזואליזציה לקביעת התפלגות התאים לאורך ציר הפסאודו-זמן ולזיהוי גנים שהביטוי שלהם השתנה משמעותית לאורך זמן הפסאודו. ניתוחים מאוחרים יותר התמקדו בגן המרכזי DBNL ואפיינו את דינמיקת הביטוי שלו לאורך מסלול התא, והבהירו את מנגנוני התכנות מחדש של המאקרופאגים במהלך התקדמות אי ספיקת הלב16.

ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA)
במחקר זה נעשה שימוש בגישת GSEA להבהרת המנגנונים הרגולטוריים הקשורים לגנים מרכזיים המעורבים באי ספיקת לב. בשימוש בגנים מרכזיים שזוהו בעבר, הדגימות חולקו לקבוצות ביטוי גבוה ונמוך על בסיס ערך הביטוי החציוני. ניתוח ביטוי שונה בוצע באמצעות חבילת לימה, שיצרה רשימת גנים מדורגת לפי שינוי לוגרית-פול (logFC). לאחר מכן בוצע ניתוח העשרת מסלולי KEGG באמצעות כלי clusterProfiler, כאשר מערכי גנים שמקורם במאגר MsigDB שימשו כרקע ייחוס. אלגוריתם ה-GSEA יושם אז לזיהוי מסלולי איתות שהועשרו באופן משמעותי בין שתי קבוצות הביטוי, וסף ערך p מותאם של פחות מ-0.05 שימש לקביעת מובהקות סטטיסטית. כדי להמחיש את הפונקציות הרגולטוריות של הגנים המרכזיים במסלולים קריטיים, נעשה שימוש בטכניקות ויזואליזציה שונות, כולל גרפי GSEA מרובי מסלולים ודיאגרמות רשת מעגליות.

ניתוח שונות של קבוצות גנים (GSVA)
GSVA היא גישה לא-פרמטרית ובלתי מפוקחת, המשמשת להערכת העשרת קבוצות גנים בתוך נתונים טרנסקריפטומיים. שיטה זו ממירה וריאציות ברמת הגן לשונות ברמת המסלול על ידי חישוב ציונים מורכבים עבור קבוצות גנים ספציפיות, ומקלה על הערכת שינויים ביולוגיים פונקציונליים בין דגימות שונות. במחקר הנוכחי, מערכי גנים נלקחו ממאגר החתימות המולקולריות. אלגוריתם GSVA שימש לחישוב ציונים מורכבים לכל סט גנים, מה שאפשר הערכת שינויים תפקודיים ביולוגיים פוטנציאליים בין דגימות שונות. תוצאות ניתוח ההעשרה של GSVA מופיעות בחומר המשלים (טבלה משלימה 1).

חיזוי תרופות ל-CTD
גן היעד (DBNL) הוזן לשדה החיפוש של מאגר הנתונים השוואתי לטוקסיגנומיקה (CTD), נבחרה קטגוריית המחלה "מחלות לב וכלי דם", והשאילתה בוצעה כדי לאסוף נתוני חיזוי תרופות הקשורים למצב "אי ספיקת לב". תוצאות החיזוי שהושגו יובאו לאחר מכן לתוכנת Cytoscape כדי להקל על המחשת הנתונים ולאפשר בניית מפת רשת אינטראקציה גנטית-כימית.

שיטות עגינה מולקולרית
עקב המבנה הגבישי התלת-ממדי הבלתי פתור של חלבון DBNL האנושי (מזהה UniProt: Q9UJU6), מחקר זה חזה את המבנה התלת-ממדי של DBNL על בסיס AlphaFold317. חומצה פיריניקסית (WY-14643) זמינה להורדה ממסד הנתונים של PubChem (PubChem CID: 5694). לאחר מכן, מבנה החלבון עובד מראש באמצעות תוכנת MGLTools (גרסה 1.5.7)18, כולל שלבים כמו הוספת אטומי מימן. במקביל, חלבונים ומולקולות קטנות הומרו לפורמט PDBQT הנדרש לעגינה. תוכנת AutoDock Vina (גרסה 1.1.2)19 שימשה לעגינה מולקולרית גלובלית (אקסוגניות=16, num_modes=30) כדי לחקור מצבי קישור פוטנציאליים. עם סיום חישובי העגינה, יש לבחור את הקונפורמציה המורכבת עם הזיקה הגבוהה ביותר, המסומנת על ידי אנרגיית הקישור החופשית הנמוכה ביותר, כמבנה הראשוני לסימולציות דינמיקה מולקולרית עתידיות.

שיטת סימולציית דינמיקה מולקולרית
כדי לחקור באופן שיטתי את יציבות הקישור ומנגנוני האינטראקציה בין תרכובות מועמדות לחלבונים, בוצעו סימולציות דינמיקה מולקולרית קונבנציונלית (MD) באמצעות חבילת התוכנה GROMACS (גרסה 2024.03)20. פרמטרי החלבון נוצרו באמצעות שדה הכוח Amber14SB21, מודל מולקולות המים נוצר באמצעות מודל TIP3P22, ופרמטרי טופולוגיית הליגנד נוצרו באמצעות כלי Antechamber Python Parser Interface (ACPYPE), המבוסס על שדה הכוח הענבר הכללי (GAFF). מערכת הקומפלקס של הליגנד-חלבון הוצבה לאחר מכן בתוך קופסה אוקטהדרלית מחזורית מלאה במולקולות מים TIP3P. יוני נתרן (Na⁺) וכלוריד (Cl⁻) הוכנסו כדי להגיע לריכוז של 0.15 מול/ליטר ולנטרל את המטען הכולל של המערכת. עם סיום בניית המערכת, השלב הראשוני כלל מזעור האנרגיה באמצעות שיטת הירידה התלולה ביותר ל-50,000 מדרגות, במטרה למנוע כל קונפורמציה בלתי סבירה פוטנציאלית בתוך המבנה. לאחר מכן בוצעו שני שלבים של שיווי משקל מערכת: סימולציה של 100 ps NVT (מספר חלקיקים, נפח וטמפרטורה קבועים) ואחריה סימולציה של 100 ps, NPT (מספר חלקיקים קבוע, לחץ וטמפרטורה). במהלך סימולציות אלו, הוטלו מגבלות מיקום על האטומים הכבדים של עמוד השדרה של החלבון כדי לשמור על שלמות מבנית של החלבון. הטמפרטורה נשמרה על 300 K באמצעות תרמוסטט V-rescale, והלחץ הווסת ב-1 בר באמצעות ברוסטט Parrinello-Rahman לצורך חיבור לחץ. עם סיום שלב האיזון, בוצעה סימולציה של שלב ייצור באורך 100 ננו-שניות, שבמהלכה בוטלו כל מגבלות המיקום. המסלול שולב באמצעות צעד זמן של 2 פמטו-שניות, ושיטת Ewald ברשת חלקיקים (PME) שימשה לניהול מדויק של אינטראקציות אלקטרוסטטיות ארוכות טווח. המסלול נשמר כל 10 ps, וסך הכל 10,000 פריימים יצאו לניתוח הבא. בנוסף, נלקחו מסלולים יציבים בטווח של 90-100 ננו-ננושות מהסימולציה, ואנרגיית הקישור החופשית של קומפלקסי חלבוני ליגנד חושבה באמצעות כלי GMX MMPBSA23.

ניתוח סטטיסטי
תוקף ניתוח האקראיות המנדלית (MR) הזה תלוי בשלוש הנחות יסודיות. (1) רלוונטיות: המשתנים האינסטרומנטליים (IVs) חייבים להציג אסוציאציה חזקה לחשיפה. (2) עצמאות: ה-IVs חייבים להיות עצמאיים מכל גורם מבלבל שמשפיעים הן על החשיפה והן על התוצאה. (3) הגבלת הדרה: ה-IVs צריכים להשפיע אך ורק על התוצאה דרך השפעתם על החשיפה. הפרה של הנחה זו, שבה עירוי משפיע על התוצאה דרך מסלולים שאינם כוללים את החשיפה, נקראת פליאוטרופיה אופקית. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות גרסה R 4.3.0, עם בדיקות דו-צדדיות, וערך p של פחות מ-0.05 נחשב בדרך כלל כמעיד על מובהקות סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהוי DBNL כגן הקשור לסיכון לאי ספיקת לב באמצעות ניתוח אקראי מנדלי וקולוקליזציה
מזהה התוצאה לדגימות הקשורות לאי ספיקת לב, GCST90162626, התקבל ממאגר הנתונים הסטטיסטי הסיכום. נקבעו קשרים סיבתיים בין 1,247 זוגות של אתרי תכונות כמותיים (eQTLs) ותוצאות באמצעות פונקציות extract_instruments ו-extract_outcome_data (טבלה משלימה 2). ניתוח אקראי מנדלי מאוחר יותר חשף 567 זוגות גנים הקשורים לתוצאות חיוביות ל-eQTL (איור 1A). הממצאים חשפו כי 280 גנים, כולל MRPL11, CAMK2...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות שדלקת מהווה היבט יסודי בפתופיזיולוגיה של אי ספיקת לב (HF), מחקרים קודמים התמקדו בעיקר במתווכים דלקתיים כלליים ובסמני פני תא 17,18,24. מיקוד זה הגביל את הבהירות של המנגנונים התאיים הספציפיים המעורבים. כדי להתגבר על מגבלות אלו, השתמשנו בגישה אינטגרטיבית המשלבת מולטיאומיקה של רנדומיזציה מנדלית (MR) עם ניתוח טרנסקריפטומי חד-תא, דרכה זיהינו את חלבון DBNL הציטוסקלטלי כמטרה טיפולית חדשה פוטנציאלי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

תוכנית מחקר זו נתמכה על ידי קרן המדעים הטבעיים של מחוז ג'ג'יאנג בסין (LTGY24H020001), פרויקט המדע והטכנולוגיה ברפואה סינית מסורתית במחוז ג'ג'יאנג (2023ZR131, 2023ZL158), פרויקט מפתח לרווחת הציבור של נינגבו (2024S030), תוכנית המו"פ הטכנולוגית המרכזית של נינגבו (2022Z149), המעבדה המרכזית לרפואה מדויקת למחלות טרשת עורקים במחוז ג'ג'יאנג (2022E10026). ופרויקט הקרן המיוחדת למחקר רפואי קליני של האגודה הרפואית של ג'ג'יאנג (2021ZYC-A11).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסד הנתונים של CellMarkerאוניברסיטת הרבין לרפואה (CellMarker 2.0)http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/מאגר CellMarker; לשאילתת גנים לסמן סוג רקמה/תא במהלך אנוטציה של תא יחיד
מאגר טוקסיגנומיקה השוואתי (CTD)CTD (אוניברסיטת דיוק ואחרים)http://ctdbase.org/מאגר CTD; לשחזור אינטראקציות בין כימיקלים, גנים, פנוטיפים ומחלות, המשמשים לחיזוי תרופות
מערך נתונים של deCODE Plasma pQTL (2021, 4,907 אפטמרים, 35,559 דגימות אירופיות)גנטיקה של deCODEhttps://www.decode.com/summarydata/שחרור נתוני pQTL לשנת 2021; משמש כנתוני חשיפה pQTL לניתוח MR
נתוני eQTL דם מלא eQTLקונסורציום eQTLGenhttps://www.eqtlgen.org/eQTLGen שלב I/II (גרסה ספציפית לפי השימוש); משמש כנתוני חשיפה ל-eQTL לניתוח MR וקולוקליזציה
GSE161470 נתונים של RNA-seq חד-תאי GEO (רקמת לב אנושית: 4 ביקורת + דגימה פתולוגית אחת)אומניבוס ביטוי גנים של NCBI (GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161470GSE161470; כדי לקבל נתוני ריצוף RNA חד-תא של רקמת לב אנושית לניתוח במורד הזרם
קטלוג GWASNHGRI– EBIhttps://www.ebi.ac.uk/gwas/קטלוג GWAS; לשלוף מידע, הערות וניתוח עזר הקשור ל-HF GWAS
סטטיסטיקות סיכום של אי ספיקת לב ב-GWAS (GCST90162626)NHGRI– קטלוג EBI GWAShttps://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90162626הצטרפות למחקר: GCST90162626; משמש כנתוני תוצאה לניתוח MR וניתוח קולוקליזציה
מאגר החתימות המולקולריות (MSigDB) v7.0מכון ברודhttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdbMSigDB v7.0; למערכי גנים רקע והערות מסלולים של GSEA / GSVA
חומצה פיריניקסית (WY-14643) נתוני מבנה (PubChem)NCBI PubChemhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5694PubChem CID: 5694; משמש לקבלת מבנה תלת-ממדי של ליגנד לעגינה מולקולרית וסימולציה דינמית
מאגר החלבונים UniProt (DBNL, מזהה UniProt: Q9UJU6)קונסורציום UniProthttps://www.uniprot.org/uniprot/Q9UJU6UniProt: Q9UJU6; משמש לקבלת רצף חומצות האמינו של DBNL לחיזוי מבנה ועגינה
מטא-אנליזה mQTL בדם מלא (הפניה 11, 3,701 דגימות אירופאיות, 426,636 תכונות mQTL)מחברים / קונסורציום (לפי ההפניה שלך 11)מחבר ממתין להוספת כתובת URL / DOI מקורי של מסד הנתוניםהתייחסות ל-DOI או מזהה מערך נתונים; משמש כנתוני חשיפה ל-mQTL לניתוח MR

מקורות

  1. Darvish, M., et al. Heart failure: Assessment of the global economic burden. Eur Heart J. 46 (31), 3069-3078 (2025).
  2. Giambartolomei, C., et al. Bayesian test for colocalisation between pairs of genetic association studies using summary statistics. PLoS Genet. 10 (5), e1004383(2014).
  3. Ferkingstad, E., et al. Large-scale integration of the plasma proteome with genetics and disease. Nat Genet. 53 (12), 1712-1721 (2021).
  4. Yang, M., et al. No evidence of a genetic causal relationship between ankylosing spondylitis and gut microbiota: A two-sample mendelian randomization study. Nutrients. 15 (4), 1057(2023).
  5. Lee, D. S., et al. Simultaneous profiling of 3D genome structure and DNA methylation in single human cells. Nat Methods. 16 (10), 999-1006 (2019).
  6. Martini, E., et al. Single-cell sequencing of mouse heart immune infiltrate in pressure overload-driven heart failure reveals extent of immune activation. Circulation. 140 (25), 2089-2107 (2019).
  7. van der Ende, M. Y., Said, M. A., van Veldhuisen, D. J., Verweij, N., van der Harst, P. Genome-wide studies of heart failure and endophenotypes: Lessons learned and future directions. Cardiovasc Res. 114 (9), 1209-1225 (2018).
  8. Inoue, S., et al. Drebrin-like (Dbnl) controls neuronal migration via regulating N-cadherin expression in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 39 (4), 678-691 (2019).
  9. Luo, X., et al. Chamber-enriched gene expression profiles in failing human hearts with reduced ejection fraction. Sci Rep. 11 (1), 11839(2021).
  10. Lingscheid, T., et al. Pharmacokinetics of nirmatrelvir and ritonavir in COVID-19 patients with end-stage renal disease on intermittent hemodialysis. Antimicrob Agents Chemother. 66 (11), e0122922(2022).
  11. Hatton, A. A., et al. Genetic control of DNA methylation is largely shared across European and East Asian populations. Nat Commun. 15 (1), 2713(2024).
  12. Bense, R. D., et al. Relevance of tumor-infiltrating immune cell composition and functionality for disease outcome in breast cancer. J Natl Cancer Inst. 109 (1), djw192(2017).
  13. Hu, C., et al. CellMarker 2.0: An updated database of manually curated cell markers in human/mouse and web tools based on scRNA-seq data. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D870-D876 (2023).
  14. Aran, D., et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).
  15. Zhang, Y., et al. CellCall: integrating paired ligand-receptor and transcription factor activities for cell-cell communication. Nucleic Acids Res. 49 (15), 8520-8534 (2021).
  16. Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nat Biotechnol. 32 (4), 381-386 (2014).
  17. Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
  18. Morris, G. M., et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
  19. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem. 31 (2), 455-461 (2010).
  20. Abraham, M. J., et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. SoftwareX. 1, 19-25 (2015).
  21. Hornak, V., Abel, R., Okur, A., Strockbine, B., Roitberg, A., Simmerling, C. Comparison of multiple Amber force fields and development of improved protein backbone parameters. Proteins. 65 (3), 712-725 (2006).
  22. Zahn, D., Schilling, B., Kast, S. M. Enhancement of the wolf damped coulomb potential: Static, dynamic, and dielectric properties of liquid water from molecular simulation. J Phys Chem B. 106 (41), 10725-10732 (2002).
  23. Valdés-Tresanco, M. S., Valdés-Tresanco, M. E., Valiente, P. A., Moreno, E. gmx_MMPBSA: A new tool to perform end-state free energy calculations with GROMACS. J Chem Theory Comput. 17 (10), 6281-6291 (2021).
  24. Davis, A. P., Wiegers, T. C., Johnson, R. J., Sciaky, D., Wiegers, J., Mattingly, C. J. Comparative toxicogenomics database (CTD): Update 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D1257-D1262 (2023).
  25. Stiber, J. A., et al. The actin-binding protein drebrin inhibits neointimal hyperplasia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (5), 984-993 (2016).
  26. Liu, N., et al. HIP-55/DBNL-dependent regulation of adrenergic receptor mediates the ERK1/2 proliferative pathway. Mol Biosyst. 10 (7), 1932-1939 (2014).
  27. Bai, Y., et al. Identification of drug targets for Sjögren's syndrome: Multi-omics Mendelian randomization and colocalization analyses. Front Immunol. 15, 1419363(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DBNLRNAIL 6 JAK STAT3PI3K AKT mTOR
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.