Method Article

פרוטוקול מיקרוסקופ מיקום מולקולה בודדת רב-תוויות לחקר כרומטין בסביבה גרעינית צפופה

DOI:

10.3791/69868

⸱

June 5th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול צביעה וניתוח מיקרוסקופ מיקום כרומטין חד-מולקולי (SMLM) בשלושה צבעים, המאפשר מיפוי שכפול של אאוכרומטין, הטרוכרומטין ו-RNAP II לניתוח מרחבי. פרוטוקול זה מאפשר תיוג רב-צבעוני יעיל בסביבות גרעיניות צפופות, כולל מטרות הקשורות לכרומטין, ומאפשר גילוי סימולטני אמין.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה ברזולוציה על-אנושית קידמה משמעותית את יכולתנו לחקור מבנים ביולוגיים מעבר לגבול הדיפרקציה, והפכה אותה לחיונית לחקר מבנים גרעיניים צפופים כמו כרומטין, למינה גרעינית וגופים גרעיניים כמו נוקלאולים. הכרומטין מציג ארגון רב-קנה מידה – מנוקלאוזומים בגודל ננומטר ועד תחומים בקנה מידה מיקרון – המחייבים גישות דימות המסוגלות הן ברזולוציה גבוהה והן לספציפיות מולקולרית. מיקרוסקופ מיקום מולקולה בודדת (SMLM), ובמיוחד מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), מאפשר מיפוי מדויק של סימנים אפיגנטיים, ומספק תובנה קריטית למבנה ותפקוד הכרומטין. עם זאת, הדמיה רב-תווית בסביבה גרעינית מציבה אתגרים ייחודיים, כולל ירידה בנגישות נוגדנים, הגברת הקשירה הלא-ספציפית וחוסר יציבות בפלואורופורים. כדי להתמודד עם סוגיות אלו, אנו מציגים פרוטוקול תיוג חיסוני סדרתי המותאם לסביבות גרעיניות בצפיפות גבוהה, המאפשר SMLM תלת-צבעי עמיד עם מינימום דיבור צולב ופחות פגיעה באות. שיטה זו כוללת נוסחאות בופר אופטימליות, בחירת פלואורופורים ואסטרטגיות אימות נוגדנים כדי להבטיח תיוג שכפול ומדויק על פני מספר מטרות. חשוב לציין, אנו משלבים פרוטוקול זה עם צינור ניתוח חישובי שמנצל לוקליזציות ממטרה מולקולרית אחת כעוגנים מרחביים (נקודות זרע) כדי לכמת מרחקים בין מטרות, צפיפויות מקומיות ושותפות רב-תוויתית. זה מאפשר ניתוח מרחבי מפורט של רכיבי הכרומטין בקנה מידה ננומטר. פרוטוקול זה משמש כמסגרת שחזורית להדמיה רב-רכיבית וניתוח כמותי בסביבות תת-תאיות צפופות, ומציע כלי עוצמתי לחוקרים החוקרים ארכיטקטורות גרעיניות מורכבות כמו כרומטין.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הופעת מיקרוסקופ לוקליזציה חד-מולקולית (SMLM) אפשרה חקר חסר תקדים של מבנים ביולוגיים בקנה מידהננומטרי 1,2,3,4,5. מעבר להדמיה במטרה יחידה, ההרחבה ל-SMLM רב-צבעוני קידמה את התחום בכך שהיא מאפשרת הדמיה סימולטנית של מינים מולקולריים מרובים, וכן את היחסים המרחביים והזמניים בין מבני תת-דיפרקציה 6,7,8,9,10,11 . עם זאת, יישום SMLM מרובה על שינויים היסטונים המפוזרים בשפע נותר אתגר בשל אופיו הצפוף והפולימרי של DNA גרעיני והנגישות המוגבלת של נוגדנים בסביבהזו 12,13,14,15,16,17,18.

הכרומטין מציג ארגון היררכי ורב-קנה מידה המשתרע לאורך של כמה סדרי גודל, החל ממערכות נוקלאוזומים בקנה מידה ננומטרי ועד לארכיטקטורה גרעינית בקנה מידה מיקרומטר. בקני מידה הגדולים ביותר, הכרומוזומים תופסים טריטוריות כרומוזומיות מובחנות, שבתוכן הגנום מחולק עוד למחלקות A/B ולתחומים טופולוגיים (TADs) שמגבילים אינטראקציות רגולטוריות ארוכות טווח באמצעות מנגנונים כמו אקסטרוזיית לולאה 19,20,21,22. בקנה מידה מתחת ל-200 ננומטר, הכרומטין מאורגן כפולימר לא מסודר המורכב מדומיינים הטרוגניים של אריזה (PDs) ולא מבלוקי אאוכרומטין והטרוכרומטין בדידים, כאשר אזורים פעילים תעתוק מעדיפים להתמקם בגבולות PD 23,24,25,26,27,28,29. בקני מידה הקטנים ביותר (5-20 ננומטר), הכרומטין מורכב ממערכות נוקלאוזומים לא סדירות ומקטעי נוקלאוזומים, מה שמדגיש את היעדר מוטיב קיפול אחיד מסדר גבוה ומדגיש את האופי המתפתח והתלוי בקנה מידה של ארגון הגנום 24,26,30. עם ההתקדמות המהירה של גישות מבוססות ריצוף כגון ריצוף אימונופרציפיטציה של כרומטין ולכידת קונפורמציית כרומטין בקצב גבוה 19,30,31,32,33, זוהו מאפיינים שונים של מבני ארגוני מזוסקאלה כרומטין 31,32. עם זאת, טכניקות אלו, בניגוד להדמיה, אינן מצליחות ללכוד גאומטריה מרחבית שנצפית רק לאחר פתרון מבנים אלו. שיטות מיקרוסקופ אלקטרונים כגון מיקרוסקופ אלקטרוני כרומטין (ChromEM24) ומיקרוסקופיית אלקטרונים לשעבר לסריקת כרומטין (ChromSTEM25) חשפו כי כרומטין הוא הטרוגני ומאורגן לתחומי אריזה בסולמות של 50-200 ננומטר25, 28, 29. בעוד שטכניקות אלו מאפשרות רזולוציה מרשימה לזיהוי תחומי אריזת כרומטין, הן אינן מספקות מיפוי מולקולרית ספציפי כפי ש-SMLM מציעה. הצטברות נקודות DNA להדמיה בטופוגרפיה בקנה מידה ננומטרי (DNA-PAINT22) והיברידיזציה פלואורסצנטית מרובה במקום (FISH)19מאפשרות ריבוב ביצועים גבוהים; עם זאת, DNA-PAINT מושפע מאוד מרעש רקע מוגבר הנובע מאירועי קישור אקראיים בסביבה הגרעינית העשירה באוליגונוקלאוטידים12,34, בעוד ששיטות FISH מסורתיות המבוססות על דנטור חום דורשות קיפול כרומטין טבעי מופרע. מחקרים קודמים השתמשו בטכניקות דימות ברזולוציה על-אנושית כדי לחקור כרומטין בקנה מידה אורך זה וזיהו הרכב היברידי של תחומי אריזה, בניגוד למודלים של הפרדת פאזה קודמת 12,23,34,35. פרוטוקול זה נובע ממאמר שפורסם בעבר ודן במשמעות הביולוגית של ממצאים אלו.34. לכן, בהתחשב ברזולוציה הגבוהה וביכולות המולטיפלקסינג, dSTORM מבוסס צביעה חיסון נותר האסטרטגיה היעילה ביותר להדמיית כרומטין רב-צבעוני בתנאים כמעט טבעיים.

פרוטוקול זה אינו הראשון שמדגים סימון של יותר משני יעדים גרעיניים, כאשר מחקרים קודמים סימנו קומפלקסים חלבונים בודדים או גנים12,36. למרות תיוג מוצלח של שינויים בהיסטונים לאחר תרגום בנוקלאוזומים, תיוג, הדמיה וניתוח SMLM כרומטין רב-צבעוני מציבים אתגרים משמעותיים. ראשית, צביעת חיסון בסביבה כרומטינית צפופה דורשת אופטימיזציה של ריכוז הנוגדנים, רצף הדגירה והרכב הבופר כדי להבטיח חדירה וקישור מספקים ללא רקע מופרז. שנית, יש צורך בניתוח מקיף של מספר תוויות, שכן האינטראקציות בין אאוכרומטין, הטרוכרומטין ואנזימים כמו RNA פולימראז צפויות להתרחב מעבר להדרות בינאריות פשוטות. עד כה, מספר הצבעים המקסימלי המוצג בהדמיית dSTORM בכרומטין נשאר שניים 18,37,38,39.

כאן אנו מציגים פרוטוקול חזק להדמיה וניתוח SMLM של כרומטין בשלושה צבעים. תהליך הצביעה שלנו מייעל את זמן הדגירה של נוגדנים ומשתמש במאגרי הדמיה משופרים40למושב הדמיה ממושך עבור מספר תוויות. אנו מתארים עוד צינורות חישוביים לניתוח מרחק דו-צבעוני וניתוח צפיפות מפרקים תלת-צבעיים, ומאפשרים אפיון כמותי של הקשרים בין הטרוכרומטין, אאוכרומטין ומכונות שעתוק. בניגוד למחקרי SMLM כרומטין דו-צבעוניים קודמים שהצביעו על הפרדה בין הטרוכרומטין לאאוכרומטין, הדמיית כרומטין בשלושה צבעים מגלה שהגנום מאורגן לתחומי אריזה, כאשר האאוכרומטין והשעתוק הפעיל ממוקמים בשולי הליבות ההטרוכרומטיניות המרכיבות34.

פרוטוקול זה מספק לקהילה מסגרת שחזורית לביצוע SMLM כרומטין רב-צבעוני ומבסס אסטרטגיות ניתוח המתאימות למטרות גרעיניות מקונצדות פונקציונלית. על ידי גישור פערים מתודולוגיים, הוא מאפשר חקירה שיטתית של ארגון תחום הכרומטין ברמה העל-גרעינית, ומשלימה גישות ריצוף ומיקרוסקופיה אלקטרונית תוך שמירה על הארכיטקטורה הגרעינית הטבעית. מאמר זה הוא פרוטוקול מורחב של מאמרשפורסם 34.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: סעיף הפרוטוקול הבא יחולק לתהליך הצביעה ותהליך הרכישה המפורט להלן. למדריכי ניתוח נתונים, אנא עיינו בפרסוםהרלוונטי 34 שמפרט ניתוח של רב-תוויות לשינויים בהיסטונים מסומנים.

1. תהליך צביעה:

הערה: לאורך כל הפרוטוקול מוזכר צלחות 35 מ"מ או 8 לוחות עם תא היטב. אלו הם כלי הדם שהקבוצה שלנו משתמשת בהם לתרבות תאים, אך שיטות קטנות ויעילות יותר אפשריות. ודא שכאשר משתמשים בחומרים חלופיים, הריכוזים המומלצים לנוגדנים של מאגרים נשמרים. בשל אופיו הסדרתי של פרוטוקול זה, בחירת נוגדנים חשובה להצלחה בתיוג. אנו משתמשים בהיגיון סטנדרטי כדי להבטיח שנוגדני המארח שלנו ליעדים יהיו שונים, כך שהנוגדנים המשניים שלנו יוכלו לפגוע במינים שונים של מארח, ובכך למזער אפקטים מחוץ למטרה. סדר הסימון נקבע לפי מיקום היעד בתוך הגרעין. מכיוון שאנו מכוונים לדומייני אריזת כרומטין 25,28,34,35 ומבינים שמדובר בתהליך מונע דיפוזיה, אנו תמיד מסמנים מטרות הטרוכרומטיות תחילה, אחריהן אוכרומטין ולבסוף על ידי RNAPII כדי למזער הדרה סטרית באזורים הטרוכרומטיים צפופים. אופטימיזציה של מאגרים בוצעה אמפירית במהלך פיתוח הפרוטוקול. מצאנו כי הכללת סרום עזים לאחר היעד הראשון הייתה מועילה להפחתת השפעות מחוץ למטרה בשלבים הבאים.

  1. הכנת בופר
    1. רכיבי מאגר:
      הערה: למידע נוסף על הרכיבים כולל זמני אחסון והכנה, אנא עיינו בטבלת החומרים. אנו ממליצים למשתמש שכל הפתרונות יהיו מוכנים לפני תחילת הפרוטוקול כדי למנוע טעויות ניסוי. תמיסת הכיבוי צריכה להיות אחרונה.
    2. צור מאגר חסימה
    3. שקלו את אלבומין הסרום בקר (BSA) כך שהריכוז הסופי בנפח הבופר הנדרש לניסוי יהיה 3% והוסיפו לצינור צנטריפוגה. הטה את הצינור לזווית של 45° כך שגבישי BSA יתפזרו בתוך הצינור, ואז הוסיפו מי מלח עם בופר פוספט (PBS). זה נעשה כדי למנוע היווצרות גושי גבישים שלא יתמוססו.
    4. השאירו את הצינור בטמפרטורת החדר עד שכל הגבישים מומסים. אל תנער את הצינור או המערבולת - זה יגרום להיווצרות בועות שימשוך חלבונים אל פני השטח וימנע מה-BSA להתמוסס לחלוטין.
    5. לאחר המסה מלאה, מוסיפים את טריטון X-100 כך שהריכוז הסופי שלו יהיה 0.2% (v/v) בהתחשב בנפח שנבחר בשלב 1.3. אם הגבישים לא מומסים לחלוטין, יש להשתמש בפיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב את התמיסה לאט מבלי ליצור בועות.
      הערה: אם אתם מייצרים בופר מותאם, כללו בתהליך זה סרום עזים של 10%. עם זאת, יש להכין מאגרי חסימה מותאמים להיות טריים במהלך השימוש ולא לאחסן לאורך זמן, אך להבטיח שהריכוזים הסופיים יהיו זהים לטבלת החומרים - 3% BSA, 0.2% טריטון X-100.
    6. הכינו בופר כביסה:
      חזור על השלבים לחסימת בופר בגרסה 1.1.2, אבל השתמש בריכוזים המפורטים בסעיף החומרים וכאן לנוחותך (0.2% BSA, 0.1% טריטון X-100 ב-1X -DPBS, ועבור סרום עזים מותאם לכלול 1% סרום עזים)
    7. הכינו פתרון קיבעוני:
      1. הוסיפו PBS לצינור צנטריפוגה.
      2. הוסף כמות מתאימה של 16% פאראפורמלדהיד לצינור הצנטריפוגה לריכוז סופי של 4%.
        הערה: הכינו טריים ומוכנים כאשר מוציאים תאים מהאינקובטור. למרות שהתמיסה הקיבועית הנוכחית בדרך כלל אינה משתמשת בגלוטארלדהיד, ניתן לכלול אותה והיא עשויה להיות שימושית בשל קיבוע חזק יותר וקיבוע ארוך טווח יותר בהשוואה לפארפורמלדהיד. המערכת של dSTORM אינה כוללת יכולות לאותות חיים פלואורסצנטיים מגלוטרלדהיד (GA), אך משתמשים שיש להם את היכולת עשויים למצוא זאת שימושי להפריד ממבנים מסומנים בפלואורופור.
    8. הכינו תמיסת קירור:
      1. שקלו בורוהידריד נתרן על נייר שקילה.
      2. הכן צינור צנטריפוגה.
      3. הוסף בורוהידריד נתרן לצינור.
      4. הוסף PBS לצינור.
        הערה: התמיסה אמורה להכיל בועות אחרי הוספת ה-PBS.
    9. יצר בופר הדמיה:
      1. המיס 1,4-דיאזאביציקלואוקטן (DABCO) במים מנותקים מ-RNASE ללא DNASE ליצירת תמיסת DABCO של 13 מ"ל בריכוז של 1 מ'.
      2. מוסיפים 12 M HCl (~240 מיקרוליטר) עד שה-DABCO מתמוסס לחלוטין וה-pH מגיע ל-8.0.
      3. הכינו 1 מטר סולפיט נתרן על ידי המסה ב-10X PBS. DTT לא דורש שום הכנה.
      4. להכנה סופית, השתמשו במלאי הקודמים לייצור 65 מ"מ מ"ם DABCO עם 30 מ"מ סולפיט נתרן ו-30 מ"מ מ"ם DTT (1 מ' מלאי) במים דה-יוניים.
      5. כוון את ה-pH דרך טיטרציה עם HCl ו-NaOH עד שה-pH מגיע ל-8.0. האחסון מכוסה ואטום בפראפילם בטמפרטורה של 4° C לא יותר מחודשיים. עקוב אחרי ה-pH לאורך כל השימוש.
  2. פרטי תהליך הצביעה הראשונים של התווית:
    1. אובססיה:
      1. קח תאים חיים מהאינקובטור והוציא את מדיום תרבית התאים מהצלחת. השליכו את מדיום תרבית התאים במיכל פסולת ביו-מסוכנת.
      2. הוסף מספיק PBS כדי לכסות את התאים (1 מ"ל לצלחת 35 מ"מ ו-500 מיקרוליטר לזכוכית תא).
      3. סובבו את התבנית בעדינות כדי לשטוף את התאים עם PBS, ואז הסרו את ה-PBS מהצלחת. השליכו את ה-PBS במיכל פסולת ביו-מסוכנת.
      4. הוסיפו מספיק תמיסה קיבועית לכסות את התאים (1 מ"ל לצלחת 35 מ"מ ו-500 מיקרוליטר לזכוכית תא), ואז השאירו את התאים להתייצב למשך 10 דקות.
      5. בזמן שהתאים מתוקנים, שקלו את נתרן בורוהידריד לתמיסת הקירור והוספו אותו לצינור צנטריפוגה.
      6. הוציאו את תמיסת הקיבע מהכלי והשליכו אותה למיכל הפסולת הכימית המסומנת כראוי.
    2. כיבוי
      1. הוסיפו מספיק PBS לצלחת כדי לכסות את פני השטח (1 מ"ל לצלחת 35 מ"מ ו-500 מיקרוליטר לזכוכית תא), ואז הניחו את הצלחת על שייקר (כל שייקר סטנדרטי בסדר) למשך 5 דקות לשטיפת התאים.
      2. הסר את הצלחת מהשייקר, הסר את ה-PBS, וזרוק אותו במיכל הפסולת הכימית המסומנת כראוי.
      3. הוסף מספיק תמיסת קירור (250 מיקרוליטר, צלחת 8 בארות) לצלחת כדי לכסות את פני השטח (1 מ"ל לצלחת 35 מ"מ ו-500 מיקרוליטר לזכוכית תא), ואז מניחים את הצלחת על שייקר למשך 7 דקות כדי לדכא אוטופלואורסצנציה בתאים.
      4. כאשר התאים נמצאים על המנעל, השליכו את תמיסת הקירור שנותרה בצינור הצנטריפוגה במיכל פסולת כימית נוזלית המסומנת כראוי.
      5. הוציאו את הצלחת מהשייקר, הסרו את תמיסת ההקפה, והשליכו אותה למיכל הפסולת הכימית המסומנת כראוי.
      6. הוסיפו מספיק (250 מיקרוליטר, צלחת 8 בארות) PBS לצלחת כדי לכסות את פני השטח (1 מ"ל לצלחת 35 מ"מ ו-500 מיקרוליטר לזכוכית תא), ואז מניחים את הצלחת על שייקר למשך 5 דקות לשטיפת התאים.
      7. הסר את הצלחת מהשייקר, הסר את ה-PBS, וזרוק אותו במיכל הפסולת הכימית המסומנת כראוי.
      8. חזור על שלבים 1.2.2.6 ו-1.2.2.7 פעמיים נוספות (לסך הכל 3 שטיפות PBS).
    3. חסימה
      1. הוסיפו מספיק בופר חסימה לצלחת כדי לכסות את פני השטח (250 מיקרוליטר, צלחת 8 בארות, 1 מ"ל לצלחת 35 מ"מ ו-500 מיקרוליטר למחסנית זכוכית תא).
      2. הניחו את הצלחת על שייקר למשך לפחות שעה אחת כדי לחדור את ממברנות התאים ולחסום אתרי קישור (תפוסים את האתרים הלא מוגדרים, כדי שלא יפריעו לאתרים היעדים). (למרות שבדקנו מספר פעמים כדי לקבוע את משך החסימה המוצלח המינימלי כ-20 דקות, אנו ממליצים בחום לחסימה לפחות שעה או יותר עד ללילה. ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה בהתחשב במטרה ובקו התא.)
      3. בזמן שהתאים נמצאים על המנעל, יש להכין את תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית (ראו ריכוז מומלץ באתר הספק או לטבלה בסעיף החומרים).
      4. כדי לקבוע את הנפח הכולל של תמיסות הצביעה שיש ליצור, הוסיפו 0.5 מ"ל לנפח הנדרש לכיסוי התאים (לדוגמה, עבור צלחת אחת של 35 מ"מ, הכינו תמיסה של 1.5 מ"ל).
      5. הסר את הנפח שנקבע בסעיף 1.2.3.1 מהמאגר החוסם והוסף נפח זה לצינור צנטריפוגה חדש להכנת תמיסת הצביעה.
      6. הוסף נפח מתאים של מלאי נוגדנים ראשוני לבופר החוסם כדי לקבל את הריכוז הסופי הנכון. נפחי מלאי נוגדנים ראשוניים למספר נוגדנים נפוצים ניתן למצוא במדור החומרים.
      7. הסר את הכלי מהשייקר, הסר את הבופר החוסמ, וזרוק אותו במיכל הפסולת הכימית המסומנת כראוי.
    4. צביעת נוגדנים ראשונית:
      1. הוסיפו מספיק תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית לצלחת כדי לכסות את פני השטח (1 מ"ל לצלחת 35 מ"מ ו-500 מיקרוליטר למחסנית זכוכית תא), ואז הניחו את הצלחת על שייקר למשך לפחות שעה-שעתיים ועד הלילה כדי לסמן את מטרות התאים.
      2. הסר את המנה מהשייקר, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית, והשליך אותה במיכל הפסולת הכימית המסומנת כראוי.
      3. הוסיפו מספיק בופר לשטיפה לכלי כדי לכסות את פני השטח (1 מ"ל לכלי בגודל 35 מ"מ ו-500 מיקרוליטר לזכוכית תא), ואז מניחים את הכלי על שייקר למשך 5 דקות כדי לשטוף את התאים.
      4. הסר את הכלי מהשייקר, הסר את בופר הכביסה, והשליך אותו במיכל הפסולת הכימית המסומנת כראוי.
      5. חזור על שלבים 1.2.4.3 ו-1.2.4.4 עוד פעמיים (לסך הכל 3 שטיפות בופר כביסה).
      6. בזמן שהתאים נמצאים על השייקר במהלך השטיפה האחרונה, יש להכין תמיסת צביעת נוגדנים משנית (ראו ריכוז מומלץ באתר הספק או עיין בניסויים קודמים).
      7. כדי לקבוע את הנפח הכולל של תמיסות הצביעה שיש ליצור, הוסיפו 0.5 מ"ל לנפח הנדרש לכיסוי התאים (לדוגמה, עבור צלחת אחת של 35 מ"מ, הכינו תמיסה של 1.5 מ"ל).
      8. הסר את הנפח שנקבע בסעיף 1.2.4.7 מהבופר החוסם והוסף נפח זה לצינור צנטריפוגה חדש להכנת תמיסת הצביעה.
      9. הוסיפו נפח מתאים של מאגר נוגדנים משני לבופר החוסם כדי לקבל את הריכוז הסופי הנכון. נפחי נוגדנים משניים למספר נוגדנים נפוצים נמצאים בטבלת החומרים.
      10. עטוף את צינור הצנטריפוגה בתמיסת צביעת נוגדנים משנית בנייר אלומיניום עד שהוא מוכן להוספה לתאים בצלחת.
    5. צביעת נוגדנים משנית:
      1. הוסיפו מספיק תמיסת צביעת נוגדנים משנית לצלחת כדי לכסות את פני השטח (1 מ"ל לצלחת 35 מ"מ ו-500 מיקרוליטר לזכוכית תא), ואז הניחו את הצלחת על שייקר לפחות 40 דקות כדי להוסיף פלואורופורים למטרות התאיות המסומנות.
      2. ודא שהצלחת מכוסה בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנת פלואורופור.
      3. הסר את הצלחת מהשייקר, הסר את תמיסת הצביעה המשנית של נוגדנים, והשליך אותה במיכל הפסולת הכימית המסומנת כראוי.
      4. הוסיפו מספיק PBS לצלחת כדי לכסות את פני השטח (1 מ"ל לצלחת 35 מ"מ ו-500 מיקרוליטר לזכוכית תא), ואז מניחים את הצלחת על שייקר למשך 5 דקות לשטיפת התאים.
      5. הסר את הצלחת מהשייקר, הסר את ה-PBS, וזרוק אותו במיכל הפסולת הכימית המסומנת כראוי.
      6. חזרו על קטעים 1.2.5.4 ו-1.2.5.5 פעם נוספת (לסך הכל 2 שטיפות PBS).
      7. כעת ניתן לצלם או לאחסן את התאים להדמיה מאוחר יותר. אם מדובר בהדמיה מיידית, עקוב אחרי השלבים בסעיף הרכישה. אם מאחסנים להדמיה מאוחר יותר, המשיכו לעקוב אחרי השלבים הבאים.
      8. הוסף מספיק PBS לצלחת כדי לכסות את המשטח (1 מ"ל לצלחת 35 מ"מ ו-500 מיקרוליטר למחסנית זכוכית תא) לפני האחסון.
      9. עטופים את התבנית בפראפילם, ואז בנייר אלומיניום כדי למנוע גם אידוי נוזלי וגם הלבנת פלואורופור.
      10. שמור את הצלחת העטופה בטמפרטורה של 4°C עד שתהיה מוכנה לצילום.
        הערה: עבור התוויות בפרוטוקול זה, ניתן לאחסן את הכלים במשך 2-3 ימים לפני שאיכות התמונה נפגעת משמעותית; עם זאת, נוגדנים שונים עשויים להיות בעלי יציבות משתנה, אך עם אחסון נכון, הם יציבים לזמן מה לאחר סיום הפרוטוקול. אחסון של צלחת מסומנת ליותר משבוע אינו מומלץ, שכן התמיסה הקבועה אינה מרוכזת מספיק ליציבות ארוכת טווח.
  3. תהליך צביעת התווית הבא:
    1. חסימה:
      1. עיין ב-1.2.3.1 - 1.2.3.2 אך השתמש בבופר חסימה עם סרום עזים. זמן הדגירה לחסימה יכול להיות קצר עד שעה, אך אנו ממליצים על זמן ארוך יותר עם מגבלה עליונה של לילה (18-24 שעות) כדי להפחית את הקשירה מחוץ למטרה. אנא עיין בניסויים קודמים.
      2. בינתיים, יש להכין תמיסות נוגדנים ראשוניות, במקום חוסם בופר, בבופר החסימה עם סרום עזים.
    2. צביעת נוגדנים ראשונית:
      1. הכינו את בופר החסימה והשטיפה המותאם עם סרום עזים ואת בופר השטיפה עם סרום עזים כפי שמפורט בסעיף הכנת הבופר.
      2. עיין בסעיפים שלבים 1.2.3-1.2.4 (חסימה וצביעת נוגדנים ראשוניים) באמצעות בופרים ששונו לחסימה ולשטיפה:
        הערה: זמן הדגירה של נוגדן ראשוני יכול להיות קצר עד שעה אחת, וארוך עד לילה (8-24 שעות). למרות זאת, ביצועי התיוג הטובים ביותר הושגו עם זמני דגירה ארוכים יותר, במיוחד עבור ריבוי תוויות. הנתונים בפרוטוקול זה הוכנו באמצעות שלבי דגירה במהלך הלילה.
      3. זמן קצר לפני סיום זמן הדגירה, יש להכין תמיסות נוגדנים משניות בבופר החסימה המותאם 1.1.3.
    3. צביעת נוגדנים משנית:
      1. עיין בסעיף 1.2.5 (צביעת נוגדנים משנית) אך השתמש בבופר חוסם עם סרום עזים.
        הערה: שימו לב שזמן הדגירה יכול להיות קצר עד שעה, אך בדקנו זמנים ארוכים יותר (2-4 שעות) עם ביצועים דומים. לגבי התוויות הבאות, אנא חזרו על סעיף 1.3.

2. תהליך רכישה

הערה: לרכישת נתונים, השתמשו בתוכנת רכיבי Nikon Imaging Software (NIS) התואמת למיקרוסקופ שבו משתמשים. כל תוכנה שיכולה לשלוט בפילטר, מסלול האור והגדרות המצלמה מתאימה לפרוטוקול הזה. פרוטוקול ההדמיה הבא מותאם להארה של הדגימה בהחזרה פנימית מלאה (TIRF); עם זאת, פרוטוקול התיוג תואם למספר צורות הדמיה. הדמיה ללא TIRF אפשרית עם פרוטוקול תיוג זה עבור STORM והיא נחוצה ליישומי STORM תלת-ממדיים. אנא השתמשו בפרוטוקול סטנדרטי לשיטות דימות חלופיות.

  1. תהליך צביעת התווית הבא:
    1. הפעל רכיבים אופטיים נדרשים ויצר חיבור עם תוכנה מתאימה. ברוב המקרים, כמו ב-NIS, התוכנה לא תאתחל במלואה אלא אם המחשב מצליח לתקשר כראוי עם המיקרוסקופ, המצלמה ובקרת הבמה.
    2. תוכנת NIS פתוחה (או שווה ערך).
    3. הגדר תצוגה חיה: הפעל תצוגה חיה > הפעלה, שמור על קנה מידה אוטומטי > תחת הגדרות המצלמה, הגדר את זמן החשיפה ל-30 מילישניות.
    4. הגדר נתיב נתונים לרכישות.
    5. עבר ללוחית העליונה רכוש> מסלול טיים לאפס מהיר>
    6. בחר שם קובץ מתאים לרכישה הראשונה וקבע את מספר הפריימים ל-10,000.
      הערה: צעדים אלו נעשים כדי להגביל את זמן החשיפה של הדגימה למקור האור לאחר תחילת ההדמיה.
    7. ודא שהזווית הקריטית וזווית האפס של TIRF מוגדרות מראש לפני הרכישה. אנא עיין במקורות מקוונים על מדריכים כיצד להשיג זאת. כפי שנאמר קודם, אם אינך משתמש בתאורת TIRF, ניתן לדלג על שלב זה.
    8. בחר את מסלול האור הנכון למצלמה והפעיל את אפשרות Epi Illumination תחת מנורות (ב-NIS או תוכנה מקבילה) כדי לוודא שהמראה מותאמת לתאורת שדה רחב ממקור אור שאינו לייזר סטנדרטי.
  2. הכנת דוגמה:
    1. לשלוף דגימות ולהוסיף בופר הדמיה (הנוסחה המתוארת בסעיף 1.1 הכנת בופר) לדגימה. (בהתאם לבופר ההדמיה שבו משתמשים, ייתכן שיש לנקוט אמצעי זהירות שונים. להגן על דגימות מאור.)
    2. לאחר הוספת שמן לאובייקטיביה, מניחים את הדגימה על הבמה עם מחזיק נכון והפעל את Perfect Focus , ואז התמקדו בדגימה.
  3. שלבי הדמיה:
    1. מצא נקודת לייזר ונווט לנקודה על הצלחת/הפלטה ללא תאים.
    2. החלפת תאורת TIRF .
    3. החלף את המסנן כך שיתאים למסנן המתאים להעברת אור אדום (או כל לייזר ששימש לאיסוף נתונים עבור הדגימה הספציפית הזו).
      הערה: השתמש במסנן רב-חריצי כפי שמתואר בטבלת החומרים. אין צורך במסנן רב-חריצים, והמשתמשים יכולים לבצע הדמיה לקוביות סינון לא מובחנות המיועדות לפלואורופורים המשמשים בצביעה.
    4. הדלק את הלייזר בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר ~ 1 mW (זה תלוי במקור האור אך נעשה כדי למנוע הלבנה מקרית) וקבע את זווית המראה לזווית קריטית.
    5. אם אין תאים בקרבת מקום, הגבר את עוצמת הלייזר עד שנקודת הלייזר נראית בבירור בתצוגה החיה.
    6. השתמש בכלי אזור העניין (ROI), צייר, הגדר ושמור ROI במקום שבו נמצא נקודת הלייזר.
      הערה: לדגימות רב-תוויות, אנא ודאו שנקודות הלייזר לכל מקורות האור הנדרשים לדגימה מיושרות. בפרוטוקול זה אנו משתמשים בשלושה לייזרים ומוודאים שכל הנקודות מיושרות. זה חיוני כי רישום משותף של נתונים מרחביים דורש יישור לייזר.
    7. חזור להארה של אפיפין ולפילטר השדה הבהיר.
    8. באמצעות כלי הגדרת ROI, נווט כדי למצוא תא בריא מתאים (למשל, תא HCT116 מתאים צריך להיות בעל צורה דבקה, פוליגונלית או אליפטית עם גבול תא ברור).
    9. מרכז את התשואה על הגרעין ולחץ על OK כדי להתמקם למיקום ROI (בצע באמצעות תאורת שדה בהיר כי לא ניתן לקבוע את מצב התא ישירות מתמונות פלואורסצנטיות רחבות שדה של הגרעין).
    10. חזרה לתאורת TIRF באותה שיטה ששימשה בגרסה 2.3.2.
    11. בחר מסנן מתאים למטרה המסומנת באורך גל הארוך ביותר (ברוב המקרים זה אדום מאוד, כלומר יעד מסומן ב-Alexa Fluor 647). בדרך כלל, אורך הגל הארוך ביותר נבחר ראשון כדי להימנע מדגימות פוטו-הלבנת אורכי גל קצרים יותר במקרה שמטרות מסומנות כוללות משניים החופפים לספקטרות.
    12. בעוצמת לייזר נמוכה לכל לייזר נדרש (במקרה רב-תוויות זה יהיה 3 לייזרים), הדליקו את הלייזר והאירו את הגרעין כדי לוודא שהדגימה מיושרת כראוי.
    13. השתמש בבקרות TIRF כדי להבטיח שהדגימה מוארת ב-TIRF.
    14. בחר תפקיד Z מתאים לרכישה בהתאם לצרכים. עם זאת, ניתן לשנות זאת ממש לפני הרכישה.
    15. קבע את זמן החשיפה לפי הצורך של הפלואורופורים (השתמש בין 10-30 מילישניות).
    16. לחצו על רכישה> טיימלפס מהיר.
    17. הגדר פריימים ל-≥10,000 ולחץ על Apply כדי ליצור את הקובץ בתיקייה הספציפית.
    18. הפעל את עוצמת הלייזר ל-50% ודגימת הלבין פוטו.
    19. הגרעין אמור להלבין בהתחלה, אך זמן קצר לאחר מכן (שניות לאחר מכן) הוא אמור להתחיל למצמץ.
    20. חזור לזווית הקריטית הרצויה ולמיקום Z על ידי החלפת מיקומים שמורים או שליטה ידנית בזווית המראה ומיקום Z ולהשיג טיים-לפס מהיר.
    21. ודא שאין סטייה בשלב או שרישום משותף של תמונות מרובות ערוצים לא יתבצע כראוי. השתמש בסמנים נאמנות (מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים) או שמור את מיקום ה-Z בתחילת הרכישה לשימוש מאוחר יותר לתיקון סטייה באמצעות שיטת שמירת מיקום לרכישת נקודות מרובות במכשיר.
    22. שנה את המסנן (או השאר אותו אם משתמשים במקלטה רב-חריצית עם פס מעבר לפלואורופור הנדרש) וחזור על סעיף 2.3.17-2.3.20 (לתוויות הבאות, תמיד להתחיל בעוצמת לייזר נמוכה, להתאים פרמטרים ולרכוש).
  4. עיבוד נתונים:
    1. טען את ערימת התמונות הגולמיות ל-FIJI באמצעות תוסף Bio-Formats. יצר הקרנה בעוצמה מינימלית על ידי בחירת Image> Stacks> Z Project ובחירת עוצמת מינימום כסוג ההקרנה. חסר את ההקרנה המינימלית הזו מהערימת התמונה הגולמית באמצעות מחשבון תדמית > תהליך. בתמונה המתקבלת, יש לבצע חיסור רקע (תהליך > חיסור רקע) ברדיוס כדור מתגלגל של 5 פיקסלים.
    2. הגדר את אזור העניין (ROI) עבור תאים בודדים ידנית או באמצעות תוסף Nuclei Outline (Plugins > GDSC > Cells > Nuclei Outline).
    3. בצע ניתוח לוקליזציה על ערימת התמונה המעובדת מראש בתוך תשואה ה-ROI המוגדרת באמצעות תוסף ThunderSTORM (ניתוח Plugins > ThunderSTORM > Run). השתמש בפרמטרים מתאימים ללוקליזציה עמידה (למשל, מסנן תמונה: B-spline, סדר = 3, קנה מידה = 2; סף עוצמת שיא = 1.5× std (Wave.F1); שיטת לוקליזציה תת-פיקסלית: גאוסיאנית, סיגמא = 2; רדיוס התאמה = 4; שיטת התאמה: סבירות מקסימלית). הקואורדינטות המתקבלות יכולות לשמש לשחזור התמונה ברזולוציה על.
    4. לניסויים מרובי ערוצים, מיזוג ערוצים ליצירת תמונת dSTORM משוחזרת כרומטין מורכב (תמונה > צבע > ערוצי מיזוג).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמונות dSTORM בשלושה צבעים מייצגים

פרוטוקול הצביעה הסדרתי המוצע נבדק בתוקף למגוון קווי תאים, כולל פיברובלסטים של BJ, HCT116, AC16, HeLa, MCF10A ועוד. איור 1 מציג את התמונות המייצגות מתאי BJ פיברובלסטים, HeLa ו-MCF10A.

אימות צינור ניתוח באמצעות מערכי נתונים מדומים

פיתוח פרוטוקול פלואורסצנציה אימונו-תלת-צבעי חייב יצירת גישה חישובית מיוחדת המסוגלת להתמודד עם המורכבות של נתוני SMLM גרעיניים מרובי מטרות (איור 2A,2 B). בהינתן סביבת הכרומטין הצפופה שבה מספר מטרות מתקיימות בקרבה, יישמנו מסגרת ניתוח נקודות-ענן שמעבדת ישירות קואורדינטות לוקליזציה במקום תמונות משוחזרות. גישה זו מנצלת את כלי ניתוח האשכולות הנרחבים הזמינים לנתוני ענן נקודתי 40,41,42. הערכנו באופן שיטתי את יכולת צינור הניתוח להבחין בדפוסים מרחביים בעלי משמעות ביולוגית באמצעות מערכי נתונים מדומים מבוקריים. נוצרו ארבעה סוגי התפלגות לייצוג תרחישי ארגון כרומטין מובחנים: התפלגות נורמלית עבור שינויים מקובצים צפופים, התפלגות אחידה לדפוסים מפוזרים, אזורי הדרה במודל התפלגות טורואידלית, והתפלגות אקראית כבקרה ארגונית (איור 2C). דפוסים מדומים אלו היו מעוגנים למיקומים אמיתיים של אשכולות הטרוכרומטין שמקורם בנתוני H3K9me3 ניסיוניים, תוך שמירה על מגבלות מרחביות גרעיניות ריאליסטיות. מסגרת ניתוח זו משתמשת באשכול DBSCAN (epsilon = 50 ננומטר, נקודות מינימליות = 3) שהיא אחת מהשיטות הרבות לניתוח אשכולות בנתוני SMLM 40,41,42. כדי להבטיח פרמטרי אשכול נכונים, תיארנו בעבר שיטת אופטימיזציה המותאמת לזיהוי תחומי אריזת כרומטין34. שימו לב שכאשר משתמשים בזה כשלב ראשוני בניתוח, המשתמשים יצטרכו לאופטם את הפרמטרים המנחים את הבחירה דרך המבנה, הסביבה והפונקציה של היעד שלהם. כאן גבולות הצבירות נקבעים באמצעות חישובי מעטפת קמורה, מה שמבטל הנחות לגבי גאומטריית התחום. האימות שלנו הראה הבחנה ברורה בין כל דפוסי ההתפלגות המדומים דרך פרופילי היסטוגרמות מרחקים מובחנים (איור 2D). כל סוג ארגון מרחבי יצר חתימות אופייניות כאשר לוקליזציות ניתחו ביחס למרכזי הטרוכרומטין. ניתוח תפוסה משותפת נבדק באמצעות סימולציות דו-סמניות עם יחסים מרחביים מבוקרים (איור 2E). סמנים מופרדים מרחבית (קונפיגורציה נורמלית-טורואידלית) הניבו צפיפות מפרקים מינימלית כמצופה, מה שהוביל לפרופילי התפלגות שטוחים (איור 2E). דפוסי סימון חופפים (קונפיגורציה נורמלית-אקראית) יצרו ירידה בצפיפות המפרקים עם הגדלת המרחק מנקודות ייחוס, תוך התאמה לתחזיות תיאורטיות. תוצאות האימות הללו מדגימות את יכולת המסגרת שלנו לזהות ולכמת יחסי קישור מרחביים במאגרי נתונים מורכבים מרובי מטרות. למידע נוסף על אופן יצירת מערכי הנתונים המדומים הללו, אנא עיינו בפרסום המלא34.

תוצאות מייצגות מניתוח ארגון כרומטין

יישום גישת הניתוח המאומתת שלנו בדגימות ביולוגיות חושף דפוסי ארגון מרחביים אופייניים שניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה. באמצעות תאי HeLa שעובדו בתהליך הצביעה בשלושה צבעים עבור H3K9me3, H3K27ac ו-RNA Polymerase II, אנו מדגימים את היכולות האנליטיות שמאפשרת שיטה זו. H3K9me3 הטרוכרומטין משמש כמערכת ייחוס אידיאלית לאור ראיות מבוססות לארגון כרומטין קונצנטרי בקנה מידה של 200 ננומטר מחקרי סופר-רזולוציה קודמים 23,28,35. הניתוח מתחיל בזיהוי מבוסס DBSCAN של דומיינים הטרוכרומטין, אשר מסווגים לאחר מכן לפי רדיוס אפקטיבי: דומיינים קטנים (25-40 ננומטר), דומיינים בינוניים (40-80 ננומטר), ודומיינים גדולים (80-253 ננומטר). שכבות גודל זו מסבירה את ההטרוגניות המתועדת במימדי תחום אריזת ה-DNA, כאשר דומיינים ממוצעים ברדיוס25 הם כ-80 ננומטר. מדידות מרחק משתמשות בחלון חיפוש ברדיוס אשכולות פי 1.5 (איור 2B למעלה) כדי ללכוד אותות אאוכרומטין ופולימראז פרוקסימליים (איור 3A,B).

תוצאות מייצגות מראות שהן H3K27ac והן RNA פולימראז II ממקמים בעקביות את גבולות ההטרוכרומטין בכל קטגוריות התחום, בהתאם למחקרים קודמים28,44 ולמודלים של מיקום השעתוק ביחס לדומיינים כרומטין 23,35,45,46. ניתוח מרחק כמותי מגלה מיקומים ממוצעים קרובים מאוד לשולי תחום: דומיינים גדולים מראים H3K27ac ב-1.0- ננומטר ו-RNA פולימראז II ב-8.4 ננומטר מגבולות, בעוד שדומיינים קטנים יותר מציגים אסוציאציות היקפיות דומות עם הבדלים מינוריים במיקום. מדידות אלו מצביעות על כך שיסודות הכרומטין הפעילים מתרכזים בממשק שבין תחומים מדכאים למתירים במקום להיות מודרים לחלוטין. ניתוח צפיפות משותפת מדגים את יכולת הפרוטוקול לחשוף קישור מרחבי בין מטרות מסומנות במשותף (איור 3C-F). ניתוח ביחס לדומיינים ההטרוכרומטין מראה שצפיפות מפרקים שיא מתרחשת ממש מחוץ לגבולות התחום (r/r₀> 1), מה שמעיד על לוקליזציה מועדפת של H3K27ac-RNA פולימראז II באזורים היקפיים (איור 3G-I). תוצאות אלו מדגימות כיצד צינור הצביעה והניתוח הזה יכול לסייע בחקירת קשרים מרחביים מורכבים בסביבות צפופות.

figure-results-1
איור 1: שלוש תמונות צבעוניות של התאים ששימשו. תמונות בשלושה צבעים של (A) פיברובלסט BJ (B) HeLa ו-(C) MCF10A. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: מסגרת ניתוח כמותית לארגון מרחבי של מטרות ביחס לאשכולות הטרוכרומטינים. (א) צינור ניתוח לנתוני SMLM רב-ערוציים ששימשו במחקר זה. (ב) סכמטי של חישובי מרחק להיקף עבור אשכולות הטרוכרומטין מזוהים ושיטת ספירת זיקה משותפת. שתי השיטות משמשות לקביעת סידור כמותי של שני מטרות ביחס למבנה אשכול ההטרוכרומטין. (ג) דוגמאות להתפלגויות פיזור סביב אשכולות הטרוכרומטין ספציפיים ששימשו במחקר34 לקביעת ארגונים ביולוגיים מובחנים של מבנים ממוקדים (מקובצים בתוך תחום לעומת סביב תחום לעומת לא קשורים ומפוזרים באקראי). (D) מרחק להיסטוגרמה פריפרית עבור עקומות מקובצות מרכזית, התפזרות אקראית וטורואידית ו-(ה) עקומות זיקה משותפת למקרים של סימולציה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: יחסים מרחביים כמותיים של סמני שעתוק סביב תחומי היסטון. (א) תוצאות מרחק להיסטוגרמה פריפרית עבור נתונים ביולוגיים לדוגמה של תאי HeLa מרובי תוויות. לדומיינים קטנים (<40 ננומטר), בינוניים (40-80 ננומטר) וגדולים (>120 ננומטר) עבור RNAPII ו-(B) H3K27ac ביחס לאשכולות H3K9me3. (C-E) תמונות לדוגמה לתמונת dSTORM עם שלוש תוויות של תאי HeLa (H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p), עם תמונה מוקדמת ומוגדלת לתחום יחיד. (F) התאמת גוף קמור (אדום) של התחום המוצג ב-E עם אזור ניתוח באפור. (G) גרפים של זיקה ל-RNAPII ביחס ל-H3K27ac ו-H3K27ac (H) ביחס ל-RNAPII בתשואה הניתוחית לכל התחומים בנתונים בגודל בינוני במאגר הנתונים. (I) צפיפות המפרקים של RNAPII ו-H3K27ac בניתוח ROI עבור כל הדומיינים בגודל בינוני. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול SMLM בעל שלושה צבעים זה מייצג התקדמות משמעותית ביכולתנו לחקור ארגון כרומטין בסביבה גרעינית צפופה. הגישה הסדרתית לתיוג אימונופלואורסצנציה, בשילוב עם ניתוח מרחבי של ענן נקודתי, המשתמשת בהערכות לוקליזציה כבסיס לניתוח, מספקת לחוקרים כלי עוצמתי לבחינת קשרים בקנה מידה ננומטרי בין שינויים שונים בכרומטין לבין מכונות שעתוק אקטיביות שלא היו ניתנות לזיהוי בעבר בטכניקות מיקרוסקופיה קונבנציונליות.

אסטרטגיית ההצבעה הסדרתית של הפרוטוקול מתמודדת עם אתגרים יסודיים הטמונים בהדמיה גרעינית מרובת מטרות. בניגוד למבנים ציטופלזמיים או קשורים לממברנה שהם יחסית דלילים יחסית, מטרות כרומטין גרעיניות קיימות בצפיפות גבוהה מאוד עם תחומים מרחביים חופפים. שיטת החסימה המותאמת שלנו, הכוללת סרום ממיני מארחים משניים לאחר כל סבב סימון, מונעת ביעילות תגובתיות צולבת בין זוגות נוגדנים תוך שמירה על ספציפיות המטרה. דגירות הלילה בטמפרטורה של 4°C מבטיחות חדירה מלאה של נוגדנים לכל נפח הגרעין, קריטית להשגת צפיפות תיוג אחידה הנדרשת לניתוח SMLM כמותי. פרוטוקול זה מפיק באופן אמין תמונות ברזולוציה של 15-20 ננומטר במספר קווי תאים, מה שהופך אותו לרלוונטי באופן רחב למחקרי ארגון כרומטין.

להלן טיפים לפתרון בעיות למפגש ההדמיה. אם הגרעינים אינם מלבינים, הסיבה הסבירה ביותר היא עוצמת לייזר לא מספקת בדגימה, שעשויה להיגרם מהגדרת הספק נמוכה או זווית TIRF שגויה; במקרה זה, יש לפתור תקלות על ידי בדיקת יישור הלייזר, הגדלת עוצמת הלייזר וכיוון מדויק של זווית ה-TIRF. אם המצמוצים בגרעין הם מעט מאוד אך נשארים בהירים כל הזמן, הדבר מעיד שהגרעינים לא הלבינו מספיק. אם המצמוצים דלים מאוד והגרעינים אינם נראים כלל, ההסבר הסביר ביותר הוא צביעה לא מוצלחת, ויש לבדוק את הריאגנטים והנוגדנים לפני חזרה על הפרוטוקול. לעומת זאת, אם מספר המצמוצים הגרעיניים גבוה מאוד (תוצאה רצויה), נדרש זמן הלבנה ארוך יותר עד שניתן יהיה לפתור את הבהוב חד-מולקולי בודד נפרד ומופרדים היטב. בניסויים קונבנציונליים של SMLM, לעיתים קרובות ניתן להעריך צפיפות תיוג מתאימה באמצעות מבני ייחוס מוגדרים היטב כגון מיקרוטובולים; עם זאת, הכרומטין מציג ארגון הטרוגני מאוד וחסר מבנה אמת יסוד מוגדר היטב, מה שמקשה על ההערכה הזו. בהתבסס על אופטימיזציה אמפירית וניסיון קודם, אנו מבטיחים שצפיפות התיוג האפקטיבית תגיע לכ-100 לוקליזציות למיקרומטר² כדי לאפשר שחזור חזק של תחומי אריזת הכרומטין. בפרוטוקול שלנו, לא השתמשנו בסמנים נאמנים, אך המליצו אם יש למשתמשים אותם. בניסויים שלנו, ההזזות הצדדיות נשארות בתוך 0.2 פיקסלים (פחות מ~5nm), דבר שניתן להתעלם ממנו. לכן, לא השתמשנו בסמנים נאמנים.

הבחירה ב-H3K9me3, H3K27ac ו-RNA פולימראז II מספקת מידע משלים על ארגון הכרומטין ברמת הננומטר. H3K9me3 משמש כהתייחסות מרחבית אידיאלית משום שהוא יוצר אשכולות נפרדים ומוגדרים היטב המייצגים הטרוכרומטין קונסטיטוטיבי וניתן לזהותו באופן אמין באמצעות אלגוריתמים אוטומטיים לאשכולות. H3K27ac מסמן כרומטין הקשור למגביר שמשתתף באופן פעיל בוויסות גנים, בעוד ש-RNA פולימראז II מציין ישירות אתרי שעתוק פעיל. יחד, שלושת היעדים הללו מאפשרים חקירה של האופן שבו מכונות שעתוק ושינויים כרומטיני רגולציה מתארגנים ביחס לאזורים הטרוכרומטיים בתוך הארכיטקטורה הגרעינית.

מסגרת ניתוח ענן הנקודות מתמודדת עם מגבלות קריטיות של מחקרי ארגון כרומטין קודמים על ידי מתן ניתוח מרחבי מקיף בסביבות גרעיניות צפופות. שיטות השוואה זוגיות מסורתיות אינן יכולות ללכוד את הקשרים המרחביים המורכבים שמתרחשים כאשר מספר שינויים בכרומטין מתקיימים במקביל באותם אזורים גרעיניים. הגישה שלנו עושה שימוש בניתוח צפיפות משותפת כדי לחשוף היכן H3K27ac ו-RNA פולימראז II מתמקמים יחסית לאשכולות H3K9me3, ומספקת מידע כמותי שלא ניתן לקבל מניסויים נפרדים בשני צבעים.

תוצאות מייצגות מראות בעקביות מודל ארגוני מגובש ולא חלוקה מחמירה של כרומטין. גם H3K27ac וגם RNA פולימראז II מתמקמים באופן מועדף בשולי אשכולות הטרוכרומטין בגדלים שונים של תחומים, כאשר מדידות כמותיות מראות מיקום בטווח של 10 ננומטר מגבולות אשכול, מה שתומך בממצאים מקבוצות אחרות עם שיטות ומודלים דומים של שעתוק 23,28,35,45,46 . ניתוח צפיפות המפרקים מגלה שמכונות שעתוק אקטיביות וכרומטין הקשור למגביר מתחברים לרוב באזורים הסובבים אשכולות הטרוכרומטיים. ממצאים אלו מאתגרים מודלים פשוטים של הפרדת פאזות ותומכים בעקרונות ארגוניים משולבים שבהם שינויים שונים בכרומטין שומרים על קרבה מרחבית קרובה במקום ליצור תאים נפרדים.

העיצוב המודולרי של הפרוטוקול מאפשר חקירה של שאלות שונות על ביולוגיית כרומטין באמצעות החלפת מטרה, תוך שמירה על אותה מסגרת אנליטית. מחקרים על תזמון שכפול יכולים להחליף חלבוני מחזור תא כגון אנטיגן גרעיני של התרבות תאים (PCNA) ושמירה על מיני-כרומוזום (MCM), בעוד שבדיקות תגובה לנזק DNA עשויות להתמקד ב-γH2AX ובגורמי תיקון. מחקרי מחזור תא עשויים לבחון שינויים בהיסטונים שמשתנים במהלך החלוקה הזו, ומחקר התמיינות עשוי להתמקד בסימנים אפיגנטיים הקשורים למחויבות שושלת. גישת הסימון הסדרתי מתאימה כל שילוב של חלבונים גרעיניים או שינויים בכרומטין שלגביהם קיימים נוגדנים אמינים, המוגבלים בעיקר על ידי תאימות ספקטרלית ושיקולי תגובתיות צולבת. גמישות זו מאפשרת לחוקרים להתמודד עם שאלות יסודיות על דינמיקת כרומטין בתהליכים תאיים שונים, תוך שמירה על יכולות ניתוח מרחבי כמותי.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברי הפרוטוקול הזה אין גילויים או אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענקי NIH U54CA268084, U54CA261694 ו-R01CA228272, מענקי הקרן הלאומית למדע EFMA-1830961 ו-CBET-2430743, ותמיכה פילנתרופית מרוב וקריסטין גולדמן, מר דייוויד זאקס וקרן כריסטינה קרינטו.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Andor iXon Ultra 888 CCD מכפיל אלקטרונים אנדורDU-888U3-CSO-#BV NA
אלבומין סרום בקרסיגמא אולדריץ'A7030משמש לחסימה ושטיפה של בופרים. אל תאחסן בופר חסימה מבוסס BSA ליותר מחודש ב-4:00; C
צ'אנגצ'ון ניו אינדסטריז אופטואלקטרוניקס טק. בע"מ, דגם MGL-FN-532 (532 ננומטר) PSU-H-LED https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htmNA
קופסת לייזר OBIS קוהרנטית (405 ננומטר, 488 ננומטר, 532 ננומטר, 552 ננומטר, 637 ננומטר)&nb;קוהרנטי1228877 הלייזרים התאחדו עם 3– 10 kW/cm³ הספק ממוצע בדגימה, מינימום 10,000 פריימים שנאספו לכל ערוץ אורך גל עם   10– 30  ms  זמן רכישה.
DABCO (1,4-דיאזאביציקלו-(2.2.2)-אוקטן)סיגמאD27802NA
DBPS (1X)תרמו פישר14190-136NA
מים מזוקקיםNANAכל מים מזוקקים זה בסדר 
DTT (דיתיותרייטול), 1Mסיגמא43816NA
שמונה זכוכית כיסוי עם תאים היטבסלביסC8-1.5H-Nיכול להיות כל פלטת תחתית מזכוכית, אבל יש להתאים את הנפח בהתאם לכלי.
נגד עכבר עז AF568תרמו פישרA11004ריכוז המלאי: 2 מ"ג/מ"
יציבות לאחר הסימון: 2– 3 ימים
עז נגד ארנב AF647תרמו פישרA21245ריכוז המלאי: 2 מ"ג/מ"
יציבות לאחר הסימון: 4– 5 ימים
עז נגד עכברוש A488תרמו פישרA11006ריכוז המלאי: 2 מ"ג/מ"
יציבות לאחר הסימון: 2– 3 ימים
נוגדן ראשוני H3K27acתרמו פישרMA5-23516ריכוז המלאי: 1.0 מ"ג/מ"ל 
נוגדן ראשי H3K9me3  אבקאםAB1769156ריכוז המלאי: 1.287 מ"ג/מ"ל & nbsp;
צינור קונוסי פולי-פרופילן בהיר 15 מ"ל;  קורנינג 352096משמש לפתרונות קיבועים וכיבוי 
צינור קוני פולי-פרופילן בהיר 50 מ"לקורנינג352070שימש לציוד עבודה של 40 מ"ל של בופרים לחסימה ושטיפה
חומצה כלורית (HCl), 12Mסיגמא258148NA
Nikon Eclipse Ti-E עם מערכת פוקוס מושלמת נייקוןTI-DH 611392 מיקרוסקופ הפוך 
ניקון SR APO TIRF, הגדלה פי 100, 1.49 NA ניקוןhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series  NA
סרום עזים רגילאבקאםAB7481-1002משתמשים בו אחרי שהתווית הראשונה מוכנה. צריך להיות נוכח בבופרים לחסימה ושטיפה
Paraformaldehyde 16 % מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15710משמש בתמיסה קיבועית שצריכה להינצל תוך שבועיים מההכנה. שמור מוגן מאור ב-4> C
סליין מופעל פוספט (PBS) 10XאמביוןAM9625NA
טיפים של פיפטה 1000 מיקרופוןSureOne02-707-404כל קצה פיפטה בסדר כל עוד הוא' s מתאים לנפח
RNAPII-PS2אבקאםAB252855ריכוז המלאי: 0.98 מ"ג/מ"ל
נתרן בורוהידרידתרמו פישרS678-10תשתמש ב-fresh לקירור כל פעם.
נתרן הידרוקסיד (NaOH)תרמו פישר A16037.36NA
סולפיט נתרןסיגמאS0505NA
טריטון X-100 10%תרמו פישר 28314NA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Multiplexed DNA-PAINT imaging of the heterogeneity of late endosome/lysosome protein composition. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).">Bond, C., Hugelier, S., Xing, J., Sorokina, E. M., Lakadamyali, M. Multiplexed DNA-PAINT imaging of the heterogeneity of late endosome/lysosome protein composition. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).
  2. Quantitative single-molecule localization microscopy. Annu. Rev. Biophys. 52 (1), 139-160 (2023).">Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. Quantitative single-molecule localization microscopy. Annu. Rev. Biophys. 52 (1), 139-160 (2023).
  3. Single-molecule localization microscopy. Nat. Rev. Methods Primers. 1, 39(2021).">Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat. Rev. Methods Primers. 1, 39(2021).
  4. Super-resolution imaging with stochastic single-molecule localization: concepts, technical developments, and biological applications. Microsc Res Tech. 77 (7), 502-509 (2014).">Oddone, A., Vilanova, I. V., Tam, J., Lakadamyali, M. Super-resolution imaging with stochastic single-molecule localization: concepts, technical developments, and biological applications. Microsc Res Tech. 77 (7), 502-509 (2014).
  5. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).">Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  6. Super resolution imaging of chromatin in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Curr Opin Genet Dev. 46, 186-193 (2017).">Ricci, M. A., Cosma, M. P., Lakadamyali, M. Super resolution imaging of chromatin in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Curr Opin Genet Dev. 46, 186-193 (2017).
  7. Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues. Nat Biomed Eng. 7 (2), 177-191 (2023).">Heo, S. J., et al. Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues. Nat Biomed Eng. 7 (2), 177-191 (2023).
  8. Comprehensive molecular characterization of the hippo signaling pathway in cancer. Cell Rep. 25 (5), 1304-1317.e5 (2018).">Wang, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of the hippo signaling pathway in cancer. Cell Rep. 25 (5), 1304-1317.e5 (2018).
  9. Multicolor super-resolution imaging using spectroscopic single-molecule localization microscopy with optimal spectral dispersion. Appl Opt. 58 (9), 2248-2255 (2019).">Zhang, Y., et al. Multicolor super-resolution imaging using spectroscopic single-molecule localization microscopy with optimal spectral dispersion. Appl Opt. 58 (9), 2248-2255 (2019).
  10. Correlative single molecule lattice light sheet imaging reveals the dynamic relationship between nucleosomes and the local chromatin environment. Nat Comm. 15 (1), 4178(2024).">Daugird, T. A., et al. Correlative single molecule lattice light sheet imaging reveals the dynamic relationship between nucleosomes and the local chromatin environment. Nat Comm. 15 (1), 4178(2024).
  11. Active transcription and epigenetic reactions synergistically regulate meso-scale genomic organization. Nat Comm. 15 (1), 4338(2024).">Kant, A., et al. Active transcription and epigenetic reactions synergistically regulate meso-scale genomic organization. Nat Comm. 15 (1), 4338(2024).
  12. Three-dimensional spectral precision distance microscopy of chromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. J Microsc. 199 (2), 96-105 (2000).">Esa, A., et al. Three-dimensional spectral precision distance microscopy of chromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. J Microsc. 199 (2), 96-105 (2000).
  13. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Natl Acad Sci. 109 (22), 8564-8569 (2012).">Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Natl Acad Sci. 109 (22), 8564-8569 (2012).
  14. Tailoring fluorescent labels for far-field nanoscopy. Far-Field Optical Nanoscopy. , 159-188 (2015).">Yushchenko, D. A., Bruchez, M. P. Tailoring fluorescent labels for far-field nanoscopy. Far-Field Optical Nanoscopy. , 159-188 (2015).
  15. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu rev phys chem. 62, 507-530 (2011).">Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu rev phys chem. 62, 507-530 (2011).
  16. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopath. 49 (4), 406-410 (2006).">Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopath. 49 (4), 406-410 (2006).
  17. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).">Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
  18. Super resolution microscopy reveals how elongating RNA polymerase II and nascent RNA interact with nucleosome clutches. Nucl Acids Res. 50 (1), 175-190 (2022).">Castells-Garcia, A., et al. Super resolution microscopy reveals how elongating RNA polymerase II and nascent RNA interact with nucleosome clutches. Nucl Acids Res. 50 (1), 175-190 (2022).
  19. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR protocols. 2 (3), 100741(2021).">Finn, E. H., Misteli, T. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR protocols. 2 (3), 100741(2021).
  20. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc Natl Acad Sci. 115 (29), E6697-E6706 (2018).">Nuebler, J., Fudenberg, G., Imakaev, M., Abdennur, N., Mirny, L. A. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc Natl Acad Sci. 115 (29), E6697-E6706 (2018).
  21. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (7), 445-464 (2021).">Davidson, I. F., Peters, J. M. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (7), 445-464 (2021).
  22. Unraveling cellular complexity with transient adapters in highly multiplexed super-resolution imaging. Cell. 187 (7), 1769-1784.e18 (2024).">Schueder, F., et al. Unraveling cellular complexity with transient adapters in highly multiplexed super-resolution imaging. Cell. 187 (7), 1769-1784.e18 (2024).
  23. Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin. Sci Adv. 6 (39), eaba8811(2020).">Miron, E., et al. Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin. Sci Adv. 6 (39), eaba8811(2020).
  24. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction n interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), eaag0025(2017).">Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction n interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), eaag0025(2017).
  25. Analysis of three-dimensional chromatin packing domains by chromatin scanning transmission electron microscopy (ChromSTEM). Sci Rep. 12 (1), 12198(2022).">Li, Y., et al. Analysis of three-dimensional chromatin packing domains by chromatin scanning transmission electron microscopy (ChromSTEM). Sci Rep. 12 (1), 12198(2022).
  26. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front Cell Dev Biol. 8, (2020).">Penagos-Puig, A., Furlan-Magaril, M. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front Cell Dev Biol. 8, (2020).
  27. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).">Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  28. Nanoscale chromatin imaging and analysis platform bridges 4D chromatin organization with molecular function. Sci Adv. 7 (1), eabe4310(2021).">Li, Y., et al. Nanoscale chromatin imaging and analysis platform bridges 4D chromatin organization with molecular function. Sci Adv. 7 (1), eabe4310(2021).
  29. Mature chromatin packing domains persist after RAD21 depletion in 3D. Sci Adv. 11 (4), eadp0855(2025).">Li, W. S., et al. Mature chromatin packing domains persist after RAD21 depletion in 3D. Sci Adv. 11 (4), eadp0855(2025).
  30. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).">Mansisidor, A. R., Risca, V. I. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).
  31. Decoding topologically associating domains with ultra-low resolution Hi-C data by graph structural entropy. Nat Comm. 9 (1), 3265(2018).">Li, A., et al. Decoding topologically associating domains with ultra-low resolution Hi-C data by graph structural entropy. Nat Comm. 9 (1), 3265(2018).
  32. Principles of genome folding into topologically associating domains. Sci Adv. 5 (4), eaaw1668(2019).">Szabo, Q., Bantignies, F., Cavalli, G. Principles of genome folding into topologically associating domains. Sci Adv. 5 (4), eaaw1668(2019).
  33. Next-generation sequencing technology: current trends and advancements. Biology. 12 (7), 997(2023).">Satam, H., et al. Next-generation sequencing technology: current trends and advancements. Biology. 12 (7), 997(2023).
  34. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light: Sci Appl. 14 (1), 123(2025).">Acosta, N., et al. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light: Sci Appl. 14 (1), 123(2025).
  35. Chromatin conformation, gene transcription, and nucleosome remodeling as an emergent system. Sci Adv. 11 (2), eadq6652(2025).">Almassalha, L. M., et al. Chromatin conformation, gene transcription, and nucleosome remodeling as an emergent system. Sci Adv. 11 (2), eadq6652(2025).
  36. Ultrafast data mining of molecular assemblies in multiplexed high-density super-resolution images. Nat Comm. 10 (1), 119(2019).">Yin, Y., Lee, W. T. C., Rothenberg, E. Ultrafast data mining of molecular assemblies in multiplexed high-density super-resolution images. Nat Comm. 10 (1), 119(2019).
  37. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).">Xu, J., et al. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).
  38. Imaging higher-order chromatin structures in single cells using stochastic optical reconstruction microscopy. Bio-Protocol. 9 (3), e3160(2019).">Xu, J., Liu, Y. Imaging higher-order chromatin structures in single cells using stochastic optical reconstruction microscopy. Bio-Protocol. 9 (3), e3160(2019).
  39. Super-resolution microscopy reveals how histone tail acetylation affects DNA compaction within nucleosomes in vivo. Nucleic Acids Res. 47 (16), (2019).">Otterstrom, J., Castells-Garcia, A., Vicario, C., Gomez-Garcia, P. A., Cosma, M. P., Lakadamyali, M. Super-resolution microscopy reveals how histone tail acetylation affects DNA compaction within nucleosomes in vivo. Nucleic Acids Res. 47 (16), (2019).
  40. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).">Abdelsayed, V., Boukhatem, H., Olivier, N. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).
  41. Advanced image-free analysis of the nano-organization of chromatin and other biomolecules by single molecule localization microscopy (SMLM). Comput Struct Biotechnol J. 21, 2018-2034 (2023).">Weidner, J., et al. Advanced image-free analysis of the nano-organization of chromatin and other biomolecules by single molecule localization microscopy (SMLM). Comput Struct Biotechnol J. 21, 2018-2034 (2023).
  42. A framework for evaluating the performance of SMLM cluster analysis algorithms. Nat Methods. 20 (2), 259-267 (2023).">Nieves, D. J., et al. A framework for evaluating the performance of SMLM cluster analysis algorithms. Nat Methods. 20 (2), 259-267 (2023).
  43. Recent development of computational cluster analysis methods for single-molecule localization microscopy images. Comput Struct Biotechnol J. 21, 879-888 (2023).">Hyun, Y., Kim, D. Recent development of computational cluster analysis methods for single-molecule localization microscopy images. Comput Struct Biotechnol J. 21, 879-888 (2023).
  44. Functional nuclear organization of transcription and DNA replication: a topographical marriage between chromatin domains and the interchromatin compartment. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 75 (0), 475-492 (2010).">Markaki, Y., et al. Functional nuclear organization of transcription and DNA replication: a topographical marriage between chromatin domains and the interchromatin compartment. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 75 (0), 475-492 (2010).
  45. Space-time dynamics of genome replication studied with super-resolved microscopy. Postepy biochem. 70 (1), 8-21 (2024).">Gelléri, M., Sterr, M., Strickfaden, H., Cremer, C., Cremer, T., Cremer, M. Space-time dynamics of genome replication studied with super-resolved microscopy. Postepy biochem. 70 (1), 8-21 (2024).
  46. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589 (20), 2931-2943 (2015).">Cremer, T., et al. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589 (20), 2931-2943 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationChromatin StructureSuper Resolution MicroscopySequential ImmunolabelingDense Nuclear EnvironmentThree Color SMLMEpigenetic MarksAntibody StainingFluorophore SelectionSpatial Analysis Chromatin

Related Articles