Method Article

פיתוח ויעילות של ננו-חלקיקי סקוואלן-כידמידים המגיבים לאנזימים לסרטן הלבלב

DOI:

10.3791/69875

⸱

March 13th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 2Huzhou Institute for Food and Drug Control, 3Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 4Institute for Innovation in Modern Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט את הסינתזה והאפיון של ננו-חלקיקי סקוואלן-כיטוזן שעברו עיבוד חומצה פולית, מעריך את שחרור התרופות המגיב לאנזימים ואת קליטת התאים במבחנה, ומיישם אותם לשיפור הטיפול בסרטן הלבלב באמצעות מתן ממוקד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול לטיפול בחדירה המוגבלת של תרופות מולקולות קטנות לתוך-גידולי הנגרמת על ידי המטריצה החוץ-תאית הצפופה (ECM) של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC). פרו-דרגים מציעים פוטנציאל רב להתגבר על אתגר זה על ידי שיפור חדירת התרופות ויעילות השמדת גידולים. סקוואלן (SQ), קדם-טבעי לביוסינתזת כולסטרול עם בטיחות ביולוגית וביוקומפיציה מצוינת, יכול לשפר את תאימות הממברנה של תרופות הידרופיליות ולהגביר את קליטת התאים שלהן כאשר הוא משולב עם תרופות כימותרפיות או מולקולות קטנות ביואקטיביות. במחקר זה פיתחנו מערכת פרו-תרופית חדשה מבוססת SQ: התרופה האנטי-סרטנית הידרופילית Chidamide (CHI) הוצמדה ל-SQ באמצעות קשר אמיד – קישור המגיב ללבלב ולקתפסין B (אנזימים מרכזיים המוגזמים במיקרו-סביבת PDAC). הצמדה זו הניבה תרופה אמפיפילית SQ-CHI, שהורכבה בעצמה לננו-חלקיקים מותאמים על ידי חומצה פולית (FA) (FA-SQ-CHI NPs). ה-NPs האופטימליים הציגו קוטר הידרודינמי אחיד של 173.3 ±-1.5 ננומטר, מדד פולידיספיסיות (PDI) של 0.181 ± 0.18, קיבולת טעינה גבוהה של 59.0% ±-0.77%, ופוטנציאל זטה יציב של -13.10 ± 0.86 mV. מחקרי שחרור חוץ גופני הראו כי ה-NPs השיגו 80.2% ±-4.22% שחרור מצטבר בתוך 72 שעות בנוכחות 0.25% לבלב, בעוד שרק 33%-38% שחרור נצפה בבופרים מותאמים ל-pH (pH 4.5 או 7.4) ללא אנזימים. בדיקות קליטה תאית אישרו כי שינוי FA שיפר משמעותית את יעילות ההעברה התוך-תאית, עם עוצמת פלואורסצנציה גבוהה פי 1.8-2.3 בתאי PDAC (PSN-1 ו-CFPAC-1) לעומת NPs לא ממוקדים ב-12-24 שעות. הפרוטוקול הנוכחי מספק מתודולוגיה מקיפה לסינתזה ואפיון התרופה, הערכת קינטיקה משחררת אנזימים במבחנה , וניתוחים השוואתיים של יעילות טיפולית וחדירת רקמות, תוך הדגשת היתרונות המרכזיים של הננו-נשא במתן ממוקד, עומס תרופות גבוה ושחרור מבוקר מופעל על ידי אנזימים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא גידול ממאיר מאוד במערכת העיכול, עם שיעור שכיחות כמעט דומה לשיעור התמותה שלו, ושיעור הישרדות במשך 5 שנים הוא רק 8%-9%1. מיקרוסביבה מורכבת של גידול (TME) היא התכונה הבולטת של PDAC2. הוא מורכב בעיקר ממטריצה חוץ-תאית (ECM) לא תקינה, פיברובלסטים פעילים הקשורים לסרטן (CAFs), וסביבה תאית מדכאת חיסון באופן עמוק. ה-PDAC ECM עשיר בקולגן מסוג I. גם התוכן המשתנה וגם הארכיטקטורה החריגה שלו מקדמים התקדמות הגידול וקשורים לתחזית לקויה3. CAFs הם התאים הסטרומליים השכיחים ביותר ומורכבים מתת-סוגים פונקציונליים מובחנים, כגון myCAFs המייצרים מטריצה ו-iCAFs דלקתיים, המפגינים פלסטיות פנוטיפית4.

מבחינה אימונולוגית, ה-PDAC TME נשלט על ידי תאי מיאלואיד פרו-גידוליים. לימפוציטים אנטי-גידוליים נדירים או לא מתפקדים. לימפוציטים B בוגרים תורמים גם הם לדיכוי חיסון 3,4. ביחד, רכיבים אלו יוצרים מחסומים טיפוליים רבים. הסטרומה הצפופה, המאופיינת בלחץ נוזל אינטרסטיציאלי גבוה, יוצרת מחסום חדירה משמעותי שמקשה מאוד על העברת תרופות טיפוליות לאזורי הגידול העמוקים, ובכך מגביל משמעותית את היעילות הקלינית של תרופות כימותרפיות5. לכן, פיתוח מערכות מתן תרופות המסוגלות להתגבר על מחסום הסטרומלי הזה ולחדור עמוק לרקמת הגידול של הלבלב הוא קריטי.

בשנים האחרונות, סקוואלן (SQ), קדם-טבעי לביוסינתזה של כולסטרול, זכה לתשומת לב רבה בזכות בטיחותו הביולוגית המצוינת ותאימותביו-תאימות 6. בהיותו הידרופובי מאוד, SQ יכול להיות משולב עם תרופות הידרופיליות ליצירת פרותרופות אמפיפיליות, ובכך לשפר את הביו-תאימות של תרופות קטנות הידרופיליות עם ממברנות תאים ולשפראת יעילות הספיגה התאית שלהן. מחקרים קודמים הראו כי SQ יכול להיות מוצמד קוולנטית עם חומרים כימותרפיים שונים, כגון ציספלטין, פאקליטקסל וגמציטבין, וליצור ננו-חלקיקי פרו-תרופה בעלי יכולת טעינה גבוהה של תרופות, מה שמשפר את אספקת התרופות לגידולים מוצקים 8,9. תכונות אלו מדגישות את הפוטנציאל הרחב של SQ בפיתוח מערכות אספקת תרופות.

כדי לשפר את מיקוד הגידולים, מחקר זה עושה שימוש בחומצה פולית (FA) כליגנד מטרה. FA הוא ויטמין מסיס במים, חיוני למטבוליזם של פחמן אחד, ביוסינתזה10, הומאוסטזיס רדוקס11, ותגובות מתילציה12. הצמדת FA דרך קבוצות הקרבוקסיל לננו-נשא מאפשרת זיהוי ספציפי וקישור לקולטן חומצה פולית (FR), ואחריה אנדוציטוזה13 המתווכת על ידי הקולטנים. על ידי ניצול החדירות המוגברת והשפעת השימור של תאי הגידול, Zheng ואח' העריכו ביטוי α קולטני חומצה פולית (FRα) בסרטן הלבלב, לבלב תקין, רקמות סמוכות ודלקת לבלב כרונית באמצעות Western blotting ואימונוהיסטוכימיה, וניתחו את הקשר עם תכונות קליניקופתולוגיות. FRα באה לידי ביטוי ב-94.7% (72/76) ממקרי סרטן הלבלב, בקשר עם גרורות, אך נעדרה ברקמות הלבלב התקינות. ננו-חלקיקים שעברו שינוי FA יכולים להצטבר באופן סלקטיבי ברקמות חיוביות ל-FR, מה שמאפשר טיפול ממוקד מולקולרית.

צ'ידמיד (CHI) הוא מעכב היסטון דיאצטילאז חדשני. מחקרים פרה-קליניים הראו כי הוא גם מפגין פעילות אנטי-גידולית חזקה נגד גידולים מוצקים כמו סרטן הלבלב והשד, ויכול להפוך עמידות לתרופות בתאי גידול15,16. עם זאת, ההידרופיליות החזקה שלו קשורה ליעילות חדירה נמוכה למיקרו-סביבת הגידול ולחלוקה לקויה בתוך רקמות גידול מוצקות, מה שמגביל מאוד את הפוטנציאל הטיפולי הקליני שלולסרטן הלבלב. באמצעות צ'ידמיד (CHI) כתרופת מודל, מחקר זה מציע להכין ננו-חלקיקים מורכבים בעצמם באמצעות הצמדת CHI עם SQ ושינוי נוסף עם FA. אסטרטגיה זו שואפת לשפר את היעילות האנטי-גידולית של CHI נגד סרטן הלבלב על ידי התמודדות עם חדירה לקויה למיקרו-סביבת הגידול והתפלגות הלא אופטימלית בתוך רקמת הגידול המוצקה. יתרה מזאת, על ידי הערכת היעילות הפנימית של CHI בקווי תאי סרטן הלבלב, צפויה גישה זו לשפר משמעותית את החדירה וההשפעות הציטוטוקסיות של CHI – תרופה הידרופילית מייצגת עם מולקולות קטנות – בתוך מיקרו-סביבת גידול הלבלב, ובכך לספק בסיס ניסיוני להכוונת טיפול מבוסס CHI בסרטן הלבלב.

המחקר שלנו מפרט את ההליכים הניסיוניים להכנת ננו-חלקיקי פרו-תרופה מורכבים בעצמם מסוג CHI-SQ-PEG-FA לטיפול בסרטן הלבלב. באופן ספציפי, אנו מתארים את האופטימיזציה והאפיון של תהליך ההכנה לננו-חלקיקי CHI-SQ-PEG-FA, יחד עם מחקרי שחרור תרופות במבחנה . התהליך כולל: ראשית, אופטימיזציה של הנוסחה בגישה ניסויית חד-גורמית וקביעת גודל החלקיקים האופטימלי וטעינת התרופות; שנית, אפיון הננו-חלקיקים באמצעות בדיקות UPLC ו-MTS; ולבסוף, הקמת מודל ספרואיד גידול משולב במבחנה . באמצעות קומרין-6 (C6) כגלאי פלואורסצנטי בננו-חלקיקים ממוקדים, אנו מאמתים עוד יותר את החדירה וההפצה של הננו-חלקיקים בתוך ספרואידים תלת-ממדיים של הגידולים ומקבלים נתונים רלוונטיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סינתזה של SQ-CHI ו-SQ-PEG-FA

  1. סינתזה של SQ-CHI: משקל של 120.4 מ"ג (0.3 מ"מ) של חומצה 1,1',2-tris-norsqualenoic והמסה ב-1 מ"ל N, N-Dimethylformamide (DMF). הוסיפו ברצף את NHS (46 מ"ג, 0.4 מ"מ) ו-EDCI (72 מ"ג, 0.38 מ"מ) ואפשרו לתגובה להימשך 90 דקות תחת הגנה חנקנית.
  2. המיס את הצ'ידמיד (58.56 מ"ג, 0.15 מ"מ) ב-1 מ"ל DMF ומוסיפים אותו טיפה לתערובת התגובה. ערבבו את התגובה בטמפרטורת החדר תחת אטמוספירה של חנקן במשך 72 שעות.
  3. לאחר ההשלמה, מאדים את הממס בלחץ מופחת של 5-15 קילופסקל כדי לקבל את המוצר הגולמי. טיהור המוצר הגולמי באמצעות כרומטוגרפיית עמודת פלאש באמצעות שחרור גרדיאנט של DCM/MeOH (99:1, 99:5, 85:5).
  4. אימות מבני של SQ-CHI: הנח את מוצר SQ-CHI המסונתז בבקבוק זכוכית וייבש אותו בוואקום במייבש למשך 24 שעות. המיס את המוצר בכ-1 מ"ל כלורופורם דויטרט (CDCl3) והעבר אותו לצינור דגימה NMR. בצעניתוח 1H NMR לאישור המבנה הכימי של המוצר17.
  5. סינתזה של SQ-PEG-FA: המסה של 41.12 מ"ג של חומצה 1,1',2-tris-norsqualenoic ב-35 מיקרו L של DMF. בהמשך הוסיפו N-הידרוקסיסוקסינימיד (NHS, 15.71mg) ו-1-אתיל-3-(3-דימתילאמינופרופיל)קרבודימייד (EDCI, 24.59 מ"ג) לתמיסה זו.
  6. תן לתגובה להימשך 90 דקות תחת אטמוספירה מלאה בחנקן. המיס 20 מ"ג של FA-PEG-NH2 ב-35 מיקרולטר DMF והוסף אותו בטיפה לתערובת התגובה.
  7. ערבבו את התערובת המתקבלת בטמפרטורת החדר במשך 72 שעות תחת חנקן. לטהר את המוצר הגולמי עם צינור צנטריפוגה אולטרפילטרציה MWCO בהספק של 3 קילו-דלטון בעוצמה 5,200 x גרם למשך 30 דקות להסרת חומצה חופשית לא מגיבה. הניחו את התמיסה המימית המורכבת SQ-PEG-FA המטוהרת בבקבוקון זכוכית והקפאו אותה מראש בטמפרטורה של -50°C. ליופיליזציה של התמיסה המוקפאת מראש במייבש הקפאה כדי לקבל את קומפלקס SQ-PEG-FA כאבקה ליופילית.

2. אימות מבני של SQ-PEG-FA

  1. הניחו את קומפלקס SQ-PEG-FA הליופילי בצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל וייבשו אותו בוואקום במייבש למשך 24 שעות. המיס את המוצר בכ-1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד דויטרט (DMSO-d6) והעבר אותו לצינור דגימה NMR. בצעניתוח 1H NMR כדי לאשר את המבנה הכימי של הקומפלקס.
  2. אופטימיזציה של הכנה ואפיון של NPs מסוג SQ-CHI-PEG-FA
  3. שקלו 6.64 מ"ג של SQ-CHI והמסו אותו ב-2 מ"ל אתנול מוחלט להכנת תמיסת מלאי של 3.32 מ"ג/מ"ל (4.3 מיקרומון).
  4. הוסף את תמיסת המאגר האתנולי SQ-CHI (1, 0.2, 0.1 או 0.05 מ"ל) בנפילה ל-1 מ״ל מים דה-יוניים תחת ערבוב. ערבבו במשך 5 דקות, ואז הסרו את האתנול באמצעות אידוי בלחץ מופחת. סוניקציה של התערובת המתקבלת למשך 30 דקות כדי לקבל השעיית ננו-חלקיקי CHI-SQ. למדוד את קוטר ההידרודינמי ומדד הפולידיפיזוריות (PDI) של הננו-חלקיקים באמצעות זטייזר כדי לזהות את הנוסחה האופטימלית18.
  5. הוסיפו 0.1 מ"ל מתמיסת המאגר האתנולי SQ-CHI בזרם יורד ל-1 מ"ל מים דה-יוניים לאחר תקופות ערבוב שונות (0, 5, 10 או 20 דקות). לאחר תקופת הערבוב המתאימה, הסרת אתנול על ידי אידוי מפחית לחץ, ולאחר מכן סוניקציה למשך 30 דקות לקבלת מתלי ננו-חלקיקי CHI-SQ. מדוד את קוטר ההידרודינמי ואת ה-PDI כדי לקבוע את זמן הערבוב האופטימלי.
  6. הוסיפו 0.1 מ"ל מתמיסת המאגר האתנולי SQ-CHI בזרם ירידה ל-1 מ"ל מים דה-יוניים תחת ערבוב למשך 5 דקות. לאחר הערבוב, הסר את האתנול על ידי אידוי להורדת לחץ. סוניקט את התערובת המתקבלת למשך תקופות שונות (0, 5, 20 או 30 דקות) כדי לקבל תלויות ננו-חלקיקי CHI-SQ. מדוד את קוטר ההידרודינמי ואת ה-PDI כדי לקבוע את זמן הסוניקציה האופטימלי.
  7. אשר את התנאים האופטימליים בהתבסס על התוצאות הנ"ל. כאן, יחס הנפח המתקבל בין מים לתמיסת המלאי = 10:1, זמן ערבוב = 5 דקות, וזמן סוניקציה = 30 דקות. חזור על כל הניסויים באופן עצמאי בשלוש עותקים כדי להבטיח אמינות.
  8. השתמש בשיטת הגורם היחיד תוך שמירה על פרמטרים אחרים קבועים. משנים ברצף את הגורמים הבאים כדי להעריך את השפעתם על התפלגות גודל החלקיקים ועל פוטנציאל הזטה של הננו-חלקיקים: יחס מסה של רכיבים (SQ-CHI: SQ-PEG-FA = 1:0, 1:0.05, 1:0.5, 1:0.7), יחס נפח פאזה (פאזה מימית: פאזה אורגנית = 1:1, 1:5, 1:10, 1:20), וזמן סוניקציה (5, 15, 30, 45 דקות).
  9. לפי הפרוטוקול האופטימלי, מערבבים את פתרונות המלאי SQ-CHI ו-SQ-PEG-FA ביחס שנקבע. הוסף את התערובת הזו בזרם למים דה-יוניים תחת ערבוב מתמיד. המשיכו לערבב במשך 5 דקות כדי להבטיח ערבוב יסודי. הסרת אתנול על ידי אידוי מפחית לחץ, ולאחר מכן סוניקה של פרוב למשך 30 דקות כדי לקבל את השעיית הננו-חלקיקים הסופית CHI-SQ-PEG-FA.
  10. מדדו את קוטר ההידרודינמי, התפלגות הגודל (PDI) ופוטנציאל זטה של הננו-חלקיקים באמצעות פיזור אור דינמי באמצעות מנתח גודל חלקיקי לייזר. התבוננו במורפולוגיה של הננו-חלקיקים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים במעבר (TEM, הגדלה פי 150,000) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM, הגדלה פי 80,000).
  11. קביעת תכולת טעינת התרופות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים אולטרה-ביצועיים (UPLC)
  12. הגדר את תנאי הכרומטוגרפיה כך: עמודת C18 (2.1 מ"מ x 50 מ"מ, 1.7 מיקרון); פאזה ניידת: תמיסת חומצה פורמית של 0.1% - אצטוניטריל (75:25, V/V); אורך גל גילוי: 258 ננומטר; קצב זרימה: 0.2 מ"ל לדקה; טמפרטורת עמודה: 23 מעלות צלזיוס; נפח הזרקה: 5 מיקרוליטר; משך זמן: 10 דקות.
  13. משחזר את מתלה CHI-SQ-PEG-FA NP וצנטריפוגה אותו בעוצמה של 7,500 x g למשך 30 דקות. אסוף את הסופרנטנט ומסנן אותו דרך ממברנה מיקרו-נקבובלית של 0.22 מיקרון. השתמש בסינון שנוצר כפתרון לבדיקה. להזריק ולנתח את תמיסת הבדיקה בתנאים כרומטוגרפיים שנקבעו. חשב את תכולת הטעינה של הננו-חלקיקים בהתבסס על ריכוז ה-CHI הנמדד בסינון.

3. מחקר שחרור תרופות במבחנה

  1. הפיפטה מדויקת של 2 מ"ל אליקוט של תמיסת CHI טרייה או מתלה ננו-חלקיקי CHI-SQ-PEG-FA לתוך שקית דיאליזה עם סף משקל מולקולרי של 3 קילו-דלטון.
  2. טבלו את שקית הדיאליזה במדיום שחרור המכיל ריכוזים שונים של לבלב (0%, 0.05%, 0.1%, 0.25%). במרווחי זמן קבועים מראש (0.1, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 שעות), משכו דגימות של 1 מ״ל ממדיום השחרור והחליפו אותן מיד בנפח שווה של מדיום טרי מחומם מראש לשמירה על תנאי הכיור.
  3. קבעו את ריכוז ה-CHI בכל הדגימות באמצעות שיטת UPLC (תנאים כרומטוגרפיים כפי שמפורטים בסעיף 3) ומחשבו את שחרור התרופות המצטבר.
  4. השתמש בבופר אצטט אמוניום (pH 4.5) כמדיום שחרור. פיפטה מדויקת של 2 מ"ל מהמתלה של ננו-חלקיקים לתוך שקית דיאליזה (3 קילו-דלטון). הוסף יחידות פעילות שונות (0, 0.7, 1.4, 2.8 U) של קתפסין B ישירות לשקית הדיאליזה. טבלו את השקית ב-40 מ"ל של מדיום שחרור ודחפו אותו במעטפת טמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס ו-75 סל"ד. בנקודות הזמן שנקבעו מראש (0.1, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 שעות), משכו דגימות של 1 מ"ל והחליפו אותן מיד בנפח שווה של מדיום טרי, מחומם מראש, באותו pH כדי לשמור על שיווי משקל מערכת.
  5. סנן את הדגימות שנאספו דרך ממברנה מיקרונקבובלית של 0.22 מיקרון. נתח את הסינון לפי UPLC כדי לקבוע את ריכוז התרופה. חשב את אחוז השחרור המצטבר של CHI ושרטט את פרופילי שחרור התרופות.
  6. במדויק הפיפט של אליקוט של 2 מ"ל של תמיסת המקור CHI או מתלה CHI-SQ-PEG-FA NP לתוך שקית דיאליזה (3 kDa MWCO). טבלו את שקית הדיאליזה במדיום שחרור המכיל ריכוזים שונים של לבלב (0%, 0.05%, 0.1%, 0.25%). בנקודות הזמן שנקבעו מראש (0.1, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 שעות), משוך דגימות של 1 מ"ל והחלף אותן מיד בנפח שווה של מדיום שחרור טרי ומחומם מראש לשמירה על תנאי השקיעה.
  7. כמת את ריכוז התרופה בדגימות באמצעות UPLC. חשב את שחרור התרופות המצטבר ויצר את עקומות השחרור.
  8. הערכת יציבות ננו-חלקיקים ב-PBS
  9. מערבבים את NPs CHI-SQ-PEG-FA עם PBS (pH 7.4) ביחס של 1:20 (v/v). דגרו את התערובת בשייקר בטמפרטורה קבועה ב-37 ± 0.5 מעלות צלזיוס ו-100 סל"ד. קח דגימות ב-1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72, 96 שעות כדי למדוד את קוטר ההידרודינמי ואת פוטנציאל הזטה.
  10. בדיקת התרבות תאים בשיטת MTS
  11. תאי סרטן הלבלב של PSN-1 תרבדו במדיום RPMI-1640 מלא. תאים בשלב הצמיחה הלוגריתמי נקטפו בעיכול עם 0.25% טריפסין ב-37 מעלות צלזיוס והושעו מחדש לצפיפות של 4-6 x 104 תאים למ"ל בתווך מלא. התלייה הוזרעה ללוחות 96 בארות בקצב של 100 מיקרוליטר לבאר, והתרבעה מראש במשך שעתיים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2 כדי לאפשר היצמדות מלאה של התא.
  12. שאפו את מדיום התרבות המקורי. הקם קבוצת ביקורת (מדיום תרבית ריק) ומספר גרדיאנטים בריכוז של קבוצות צ'ידמידים (0.2, 2, 8, 10, 20, 80 pM), עם שלושה בארות משוכפלות בכל קבוצה. הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום ריק או מכיל תרופות לכל באר, ואז העבירו את פלטת התא לאינקובטור להמשך תרבית. לטפל בקבוצות הניסוי ב-100 מיקרוליטר של מדיום טרי המכיל ריכוזים משתנים (0.2, 2, 8, 10, 20, 80 pM) של SQ-PEG, חי חופשי, NPs של CHI-SQ-PEG, או NPs CHI-SQ-PEG-FA, בעוד שקבוצת הביקורת מקבלת נפח שווה של מדיום ריק. לאחר דגירה נוספת של 96 שעות, יש להסיר את המדיום המכיל תרופות מכל באר.
  13. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת MTS לכל באר, ואחר כך דגירה למשך 4 שעות. נער את פלטת 96 הבארות במשך 15 שניות כדי להבטיח הומוגניות, ומדוד מיד את הספיגה (ערך A) של כל באר באורך גל של 490 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. חישבו את קצב התרבות התאים על ידי חיסור ערך ה-OD של הקבוצה הריקה מערך ה-OD של קבוצת הטיפול התרופתי, חלוקת התוצאה בהפרש בין ערך ה-OD של קבוצת התווך הריק לערך ה-OD של הקבוצה הריקה, ואז הכפלה ב-100.
  14. הקמת מודל ספרואיד גידול משולב במבחנה
  15. מערבבים תאי PSN-1 בשלב הגידול הלוגריתמי עם תאי HPSC ביחס של 2:7 וזרעו אותם ללוחות 96 בארות בעלי חיבור נמוך במיוחד בצפיפות של 5,000 תאים לבאר. לאחר היווצרות ספרואיד גידול, יש לטפל בספרואידים בפורמולציות ננו-שונות (קומרין 6-מסומן CHI-SQ-PEG/C6 NPs ו-CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs) או DMSO (כביקורת) ויש לדגור אותם יחד במשך 48, 96 ו-144 שעות להערכת יעילות התרופה.
  16. לאחר הדגירה, הוסף נפח שווה של תגובת בדיקת חיוניות תאים לכל באר. מניחים את הפלטה על מנער אורביטלי ונערו במשך 15 דקות כדי להבטיח פירוק מלא, ולאחר מכן דגירה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות.
  17. העבר את הליזאט של התא ללוח שחור עם 96 בארות. מדוד את אות הכימילומינסנציה באורך גל של 562 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט רב-תכליתי לכמת את חיוניות התא.
  18. חקר קליטת ננו-חלקיקים תאית
  19. הכינו ננו-חלקיקים ממוקדים (CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs) וננו-חלקיקים לא ממוקדים (CHI-SQ-PEG/C6 NPs) הכוללים את Coumarin-6 (C6) כגלאי פלואורסצנטי. תרב באופן שגרתי תאי PSN-1 בשלב הגדילה הלוגריתמי למשך 24 שעות ליצירת שכבה מונולרית. המיס קומרין 6 באתנול להכנת תמיסה של 200 מיקרוגרם/מ"ל. מערבבים 10 מיקרוליטר מהתמיסה עם SQ-CHI ו-SQ-PEG-FA (או SQ-PEG) ביחס של 1:0.7, ואז מזריקים טיפה למים דה-יוניים תחת ערבוב. ערבב במשך 5 דקות, הסר אתנול באידוי, וסוניקט 30 דקות. לבסוף, טיהר באמצעות אולטרפילטרציה (3 קילו-דלטון, 12,000 סל"ד, 20 דקות) כדי לקבל את הפריטים.
  20. לטפל בתאים כך: קבוצות הניסוי מקבלות מדיום חופשי ללא סרום המכיל NPs חופשי של C6, CHI-SQ-PEG/C6, או CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs (עם ריכוז CHI סופי של 5 מיקרומול/ליטר וריכוז C6 של 2.6 מיקרומול/ליטר), בעוד שקבוצת הביקורת מקבלת נפח שווה של מדיום ריק.
  21. לאחר דגירה למשך 4 שעות, 12 שעות ו-24 שעות, שאיפו את המדיום המכיל תרופה. גרעיני תאי צבע באמצעות 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)19.
  22. לבצע תצפיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה (40x, אורך גל עירור Ex=360 ננומטר, אורך גל פליטה Em=477 ננומטר). הערך את קליטת הננו-חלקיקים התאית על ידי מדידת עוצמת הפלואורסצנציה של קומרין-6.

4. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע את כל הניסויים עם מינימום 3 שכפולים כדי לקבל את הנתונים שהוצגו במחקר זה. ניתוח סטטיסטיקות באמצעות תוכנת GraphPad Prism. הצג נתונים ניסיוניים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SD), והשווה בין קבוצות באמצעות מבחן Student's t, ANOVA חד-כיווני או מבחן וילקוקסון במידת הצורך. קבע את סף המובהקות הסטטיסטית ב-P < 0.05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה תכנן והעריך באופן שיטתי מערכת חדשה לממוקדת להעברת ננו-תרופות — Chidamide Squalenylation Prodgrofi מבוסס ננו-חלקיקים מורכבים בעצמם (CHI-SQ-PEG-FA NPs; איור 1). סינתזנו NPs CHI-SQ-PEG-FA (איור 2) והערכנו באופן שיטתי את השפעות הפרמטרים השונים, כולל יחס פאזה בין שמן למים (איור 3A), משך הערבוב (איור 3B), ותנאי סוניקציה (איור 3C), על גודל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מספק מדריך מעשי שלב אחר שלב ליישום מערכת במותן נמוכה המבוססת על הרכבה עצמית של ננו-חלקיקים. הננו-חלקיקים שהורכבו בעצמם שהתקבלו במחקר זה הציגו צורה כדורית סדירה, פיזור טוב, גודל חלקיקים אחיד, יעילות גבוהה בעומס תרופות ובקפסולציה, והפגינו יציבות מספקת21. מודל קו-קולטורציה תלת-ממדי של ספרואיד גידול (PSN-1/HPSC) שימש להערכת חדירת ננו-חלקיקים, וחשף כי NPs CHI-SQ-PEG-FA שעברו שינוי חומצה פולית יכולים לחדור בצורה יעילה יותר לליבת הספרואידים של הגידול. יתרה מזאת, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי קרן המדע הטבעי של מחוז ג'ג'יאנג (LZ23H290001, LY19H280001); מענקי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82474338 ו-82274364); תוכנית שיתוף הפעולה של שלושה אזורים כפריים ותשעה מפלגות במחוז ג'ג'יאנג (2025SNJF075); וכן פרויקט מחקר רווחת הציבור של Huzhou Science and Technology Grand (2021GZ261); וכן פרויקט המחקר המדעי הכללי של מחלקת החינוך של מחוז ג'ג'יאנג (Y202456442, 2025YKJ10).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAגיבקו (ארה"ב)25200072
1-אתיל-3-(3-דימתילאמינופרופיל)קרבודימייד הידרוכלוריד (EDCI)סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)E6383
בקבוקונים קריוגניים בנפח 2 מ"לקורנינג (ארה"ב)430488
לוחות תרבית תאים עם 96 בארותקורנינג (ארה"ב)3598
אתנול מוחלטקבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם)100092680
אצטוןקבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם)32201-2.5L
אצטוניטרילטדיה (ארה"ב)A998-4דרגת HPLC
אצטט אמוניוםקבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם)10002861
סולפט נתרן חסר מיםסיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)31481
ארון בטיחות ביולוגיתתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב1380, 1332, 1356
בקבוקי תרבית תאיםקורנינג (ארה"ב)CLS430372
חממת תרביות תאיםתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"בHERA51901126
צ'ידמיד (צ'י)שנזן מיקרוקור ביוטכנולוגיה בע"מ (סין)טוהר >95%
קורא מיקרופלט רב-מצבי Cytation 5ביוטק, ארה"בCYT5MV
מערבל חימום מגנטי תרמוסטטי DF-101Sחברת הכלים ג'נגג'ואו קצ'ואנג, סין
דיכלורומתאןקבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם)80047318
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)D2650
דיאוקסןאלאדין (סין)D116156-5 מ"ל
מדיום DMEMגיבקו (ארה"ב)12100046
המלח המאופר בפוספט של דולבקו (DPBS)גיבקו (ארה"ב)14040141
אתיל אצטטקבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם)10009460
אתיל אתרקבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם)
FA2004B איזון אלקטרוניחברת שנגחאי טיאנמיי בלנס אינסטרומנט בע"מ, סיןFA2004B
סרום בקר עוברי (FBS)גיבקו (ארה"ב)10099141C
פולאט-פולי(אתילן גליקול)-אמין (FA-PEG-NH2)חברת Shanghai Pengshu Biological Technology בע"מ (סין)PS2-NFA-2000
חומצה פורמיתאלאדין (סין)F112034דרגת HPLC
מייבש הקפאהתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב
קתפסין אנושי Bסיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)SRP0289
קווי תאי סרטן הלבלב האנושיים (PSN-1, CFPAC-1)אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית (ATCC)CRL-3211, CRL-1918
תאי כוכב לבלב אנושיים (HPaStec, HPSC)אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית (ATCC)
טריפסין אנושיסיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)
חומצה כלוריתקבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם)CFSR-10011008
מיקרוסקופ הפוךאולימפוס, יפןIX83
מדיום דולבקו המשופר של איסקוב (IMDM)גיבקו (ארה"ב)12440053
מיקסר מערבל IX 1000  חברת הנגג'ואו רויצ'נג אינסטרומנט בע"מ, סיןIX 1000
מתנולקבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם)M433287-10L
מתנול טדיה (ארה"ב)MS1922-001דרגת HPLC
צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.5/2.0 מ"ל)אקסיגן (ארה"ב)MCT-150-C
מיקרופיפטות (20, 100, ו-1000 & mu; L)תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב4642050, 4642070, 4642090
מערכת טיהור מים של Mill-Q מיליפור, ארה"בZR0Q00800
  ערכת בדיקת MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-סולפופניל)-2H-טטראזוליום)פרומגה (ארה"ב)G3582
N,N-דימתילפורמיד (DMF)אלאדין (סין)
N-ברומוסוקינימיד (NBS)סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)B81255
N-הידרוקסיסוקינימיד (NHS)סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)56480
Optima Max אולטרה-צנטריפוג בקמן, ארה"ב393490
תמיסת פניצילין/סטרפטומיציןגיבקו (ארה"ב)15140-122
חומצה מחזוריתסיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)P7875
אתר נפטקבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם)
פנאזין מתוסולפט (PMS)סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)3180806
תמיסת מלח מפוזרת-פוספט (PBS)גיבקו (ארה"ב)70011069
פולי(אתילן גליקול)-אמין (PEG-NH2)חברת Shanghai Pengshu Biological Technology בע"מ (סין)PG2-AM-20k
RPMI-1640 בינוניגיבקו (ארה"ב)31800022
אבקת סיליקה ג'לסיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)53698רשת 300
נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)401676
כלוריד נתרןקבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם)10019318
נתרן דיכרומט דיהידראטסיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)1.93689
סקוואלןסיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)Y0002131
צינורות צנטריפוגה סטריליים (15 ו-50 מ"ל)קורנינג (ארה"ב)430791, 430828
חומצה גופרתיתקבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם)10021618
טטרהידרופורןקבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם)34865-4X4Lדרגה אנליטית
צינורות צנטריפוגליים אולטרפילטרציה (חיתוך משקל מולקולרי: 3.5 קילו-דלטון)בקמן, ארה"ב344088

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., et al. Role of the microbiome in occurrence, development and treatment of pancreatic cancer. Mol Cancer. 18, 173(2019).
  2. Chen, K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic change in tumor microenvironment during pancreatic ductal adenocarcinoma malignant progression. EBioMedicine. 66, 103315(2021).
  3. Mascharak, S., et al. Desmoplastic stromal signatures predict patient outcomes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Rep Med. 4 (11), 101248(2023).
  4. Fu, Y., et al. Unbiasedly decoding the tumor microenvironment with single-cell multiomics analysis in pancreatic cancer. Mol Cancer. 23 (1), 140(2024).
  5. Helms, E., Onate, M. K., Sherman, M. H. Fibroblast heterogeneity in the pancreatic tumor microenvironment. Cancer Discov. 10, 648-656 (2020).
  6. Navarro Chica, C. E., et al. Design and characterization of squalene-Gusperimus nanoparticles for modulation of innate immunity. Int J Pharm. 590, 119893(2020).
  7. Rodríguez-Nogales, C., et al. Squalenoylgemcitabine/edelfosine nanoassemblies: anticancer activity in pediatric cancer cells and pharmacokinetic profile in mice. Int J Pharm. 582, 119345(2020).
  8. Emamzadeh, M., et al. Dual controlled delivery of squalenoyl-gemcitabine and paclitaxel using thermo-responsive polymeric micelles for pancreatic cancer. J Mater Chem B. 6, 2230-2239 (2018).
  9. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabinelipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. Chemplus chem. 85, 1283-1291 (2020).
  10. Yang, H., et al. High-level 5-methyltetrahydrofolate bioproduction in bacillus subtilis by combining modular engineering and transcriptomics-guided global metabolic regulation. J Agric Food Chem. 70 (19), 5849-5859 (2022).
  11. De Santis, M. C., et al. Signaling pathways regulating redox balance in cancer metabolism. Front Oncol. 8, 126(2018).
  12. Rushing, B. R., et al. Exploratory metabolomics underscores the folate enzyme ALDH1L1 as a regulator of glycine and methylation reactions. Molecules. 27 (23), 8394(2022).
  13. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
  14. Zheng, H. Expression and significance of molecular imaging marker folate receptor α in pancreatic cancer. J Shandong Uni Health Sci. 48 (3), 83-85 (2010).
  15. Zhang, N., et al. Chidamide combined with paclitaxel effectively reverses the expression of histone deacetylase in lung cancer. Anticancer Drugs. 31, 702-708 (2020).
  16. He, M., et al. Chidamide Inhibits Aerobic Metabolism to Induce Pancreatic Cancer Cell Growth Arrest by Promoting Mcl-1 Degradation. PLoS ONE. 11 (11), e0166896(2017).
  17. Chen, Q. B., et al. Extraction and Structural Characterization of Squalene from Siraitia grosvenorii Seeds. Guangxi Zhiwu. 26 (6), 687-689 (2006).
  18. Xu, M. Y., et al. Application Study of Nano Laser Particle Size Analyzer in Silica Sol Particle Size Testing. Diamond Abrasives Eng. 35 (02), 55-58 (2015).
  19. Shen, Z., et al. Study on the binding characteristics of 4',6-diamidino-2-phenylindole to DNA. Acta Biophysica Sinica. (03), 352-356 (1991).
  20. Mahajan, R. R., et al. Oral Administration of Neratinib Maleate-Loaded Lipid-Polymer Hybrid Nanoparticles: Optimization, Physical Characterization, and In Vivo Evaluation. Pharmaceutics. 17 (2), 221(2025).
  21. Ouyang, P., Lu, Y. Research progress on dispersion stability of nanoparticles in lubricating oil. Appl Chem Ind. 51 (6), 1843-1847 (2022).
  22. Xiao, S., et al. Development and application of folic acid-conjugated starch nanoparticles as a tumor-targeting drug delivery carrier. Chin Sci Bull. 51 (10), 1151-1155 (2006).
  23. Song, Y., Shi, W., Chen, W. Fluorescent carbon nanodots conjugated with folic acid for distinguishing folate-receptor-positive cancer cells from normal cells. J Mater Chem. 22 (25), 12568-12573 (2012).
  24. Tie, Y., et al. Targeting folate receptor β positive tumor-associated macrophages in lung cancer with a folate-modified liposomal complex. Signal Transduct Target Ther. 5, 6(2020).
  25. Li, C., et al. Small molecule nanodrug assembled of dual-anticancer drug conjugate for synergetic cancer metastasis therapy. Bioconjug Chem. 29, 3495-3502 (2018).
  26. Dormont, F., et al. Squalene-based multidrug nanoparticles for improved mitigation of uncontrolled inflammation in rodents. Sci Adv. 6, eaaz5466(2020).
  27. Jiang, W., et al. Intravenous delivery of enzalutamide based on high drug loading multifunctional graphene oxide nanoparticles for castration-resistant prostate cancer therapy. J Nanobiotechnol. 18, 50(2020).
  28. Yong, T. Y. Exocytosis of porous silicon nanoparticles and their application in deep tumor penetration and cancer stem cell therapy. [Doctoral dissertation]. , Huazhong Univ Sci Technol. (2017).
  29. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabine lipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. ChemPlusChem. 85, 1283-1291 (2020).
  30. Zhang, W., et al. Prodrug-like acetylmannosamine modified liposomes loaded with arsenic trioxide for the treatment of orthotopic glioma in mice. J Pharm Sci. 109, 2861-2873 (2020).
  31. Fan, X. X., et al. ROS-responsive berberine polymeric micelles effectively suppressed the inflammation of rheumatoid arthritis by targeting mitochondria. Nano-Micro Lett. 12, 76(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enzyme Responsive NanoparticlesSqualene Chidamide ProdrugPancreatic CancerExtracellular MatrixDrug PenetrationFolate Modified NanoparticlesControlled Drug ReleaseCellular UptakeTumor TargetingProdrug Synthesis

Related Articles