פרוטוקול זה מפרט את הסינתזה והאפיון של ננו-חלקיקי סקוואלן-כיטוזן שעברו עיבוד חומצה פולית, מעריך את שחרור התרופות המגיב לאנזימים ואת קליטת התאים במבחנה, ומיישם אותם לשיפור הטיפול בסרטן הלבלב באמצעות מתן ממוקד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
* These authors contributed equally
פרוטוקול זה מפרט את הסינתזה והאפיון של ננו-חלקיקי סקוואלן-כיטוזן שעברו עיבוד חומצה פולית, מעריך את שחרור התרופות המגיב לאנזימים ואת קליטת התאים במבחנה, ומיישם אותם לשיפור הטיפול בסרטן הלבלב באמצעות מתן ממוקד.
כאן אנו מציגים פרוטוקול לטיפול בחדירה המוגבלת של תרופות מולקולות קטנות לתוך-גידולי הנגרמת על ידי המטריצה החוץ-תאית הצפופה (ECM) של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC). פרו-דרגים מציעים פוטנציאל רב להתגבר על אתגר זה על ידי שיפור חדירת התרופות ויעילות השמדת גידולים. סקוואלן (SQ), קדם-טבעי לביוסינתזת כולסטרול עם בטיחות ביולוגית וביוקומפיציה מצוינת, יכול לשפר את תאימות הממברנה של תרופות הידרופיליות ולהגביר את קליטת התאים שלהן כאשר הוא משולב עם תרופות כימותרפיות או מולקולות קטנות ביואקטיביות. במחקר זה פיתחנו מערכת פרו-תרופית חדשה מבוססת SQ: התרופה האנטי-סרטנית הידרופילית Chidamide (CHI) הוצמדה ל-SQ באמצעות קשר אמיד – קישור המגיב ללבלב ולקתפסין B (אנזימים מרכזיים המוגזמים במיקרו-סביבת PDAC). הצמדה זו הניבה תרופה אמפיפילית SQ-CHI, שהורכבה בעצמה לננו-חלקיקים מותאמים על ידי חומצה פולית (FA) (FA-SQ-CHI NPs). ה-NPs האופטימליים הציגו קוטר הידרודינמי אחיד של 173.3 ±-1.5 ננומטר, מדד פולידיספיסיות (PDI) של 0.181 ± 0.18, קיבולת טעינה גבוהה של 59.0% ±-0.77%, ופוטנציאל זטה יציב של -13.10 ± 0.86 mV. מחקרי שחרור חוץ גופני הראו כי ה-NPs השיגו 80.2% ±-4.22% שחרור מצטבר בתוך 72 שעות בנוכחות 0.25% לבלב, בעוד שרק 33%-38% שחרור נצפה בבופרים מותאמים ל-pH (pH 4.5 או 7.4) ללא אנזימים. בדיקות קליטה תאית אישרו כי שינוי FA שיפר משמעותית את יעילות ההעברה התוך-תאית, עם עוצמת פלואורסצנציה גבוהה פי 1.8-2.3 בתאי PDAC (PSN-1 ו-CFPAC-1) לעומת NPs לא ממוקדים ב-12-24 שעות. הפרוטוקול הנוכחי מספק מתודולוגיה מקיפה לסינתזה ואפיון התרופה, הערכת קינטיקה משחררת אנזימים במבחנה , וניתוחים השוואתיים של יעילות טיפולית וחדירת רקמות, תוך הדגשת היתרונות המרכזיים של הננו-נשא במתן ממוקד, עומס תרופות גבוה ושחרור מבוקר מופעל על ידי אנזימים.
אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא גידול ממאיר מאוד במערכת העיכול, עם שיעור שכיחות כמעט דומה לשיעור התמותה שלו, ושיעור הישרדות במשך 5 שנים הוא רק 8%-9%1. מיקרוסביבה מורכבת של גידול (TME) היא התכונה הבולטת של PDAC2. הוא מורכב בעיקר ממטריצה חוץ-תאית (ECM) לא תקינה, פיברובלסטים פעילים הקשורים לסרטן (CAFs), וסביבה תאית מדכאת חיסון באופן עמוק. ה-PDAC ECM עשיר בקולגן מסוג I. גם התוכן המשתנה וגם הארכיטקטורה החריגה שלו מקדמים התקדמות הגידול וקשורים לתחזית לקויה3. CAFs הם התאים הסטרומליים השכיחים ביותר ומורכבים מתת-סוגים פונקציונליים מובחנים, כגון myCAFs המייצרים מטריצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
1. סינתזה של SQ-CHI ו-SQ-PEG-FA
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מחקר זה תכנן והעריך באופן שיטתי מערכת חדשה לממוקדת להעברת ננו-תרופות — Chidamide Squalenylation Prodgrofi מבוסס ננו-חלקיקים מורכבים בעצמם (CHI-SQ-PEG-FA NPs; איור 1). סינתזנו NPs CHI-SQ-PEG-FA (איור 2) והערכנו באופן שיטתי את השפעות הפרמטרים השונים, כולל יחס פאזה בין שמן למים (איור 3A), משך הערבוב (איור 3B), ותנאי סוניקציה (איור 3C), על גודל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מחקר זה מספק מדריך מעשי שלב אחר שלב ליישום מערכת במותן נמוכה המבוססת על הרכבה עצמית של ננו-חלקיקים. הננו-חלקיקים שהורכבו בעצמם שהתקבלו במחקר זה הציגו צורה כדורית סדירה, פיזור טוב, גודל חלקיקים אחיד, יעילות גבוהה בעומס תרופות ובקפסולציה, והפגינו יציבות מספקת21. מודל קו-קולטורציה תלת-ממדי של ספרואיד גידול (PSN-1/HPSC) שימש להערכת חדירת ננו-חלקיקים, וחשף כי NPs CHI-SQ-PEG-FA שעברו שינוי חומצה פולית יכולים לחדור בצורה יעילה יותר לליבת הספרואידים של הגידול. יתרה מזאת, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי קרן המדע הטבעי של מחוז ג'ג'יאנג (LZ23H290001, LY19H280001); מענקי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82474338 ו-82274364); תוכנית שיתוף הפעולה של שלושה אזורים כפריים ותשעה מפלגות במחוז ג'ג'יאנג (2025SNJF075); וכן פרויקט מחקר רווחת הציבור של Huzhou Science and Technology Grand (2021GZ261); וכן פרויקט המחקר המדעי הכללי של מחלקת החינוך של מחוז ג'ג'יאנג (Y202456442, 2025YKJ10).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.25% trypsin-EDTA | גיבקו (ארה"ב) | 25200072 | |
| 1-אתיל-3-(3-דימתילאמינופרופיל)קרבודימייד הידרוכלוריד (EDCI) | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | E6383 | |
| בקבוקונים קריוגניים בנפח 2 מ"ל | קורנינג (ארה"ב) | 430488 | |
| לוחות תרבית תאים עם 96 בארות | קורנינג (ארה"ב) | 3598 | |
| אתנול מוחלט | קבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם) | 100092680 | |
| אצטון | קבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם) | 32201-2.5L | |
| אצטוניטריל | טדיה (ארה"ב) | A998-4 | דרגת HPLC |
| אצטט אמוניום | קבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם) | 10002861 | |
| סולפט נתרן חסר מים | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | 31481 | |
| ארון בטיחות ביולוגית | תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב | 1380, 1332, 1356 | |
| בקבוקי תרבית תאים | קורנינג (ארה"ב) | CLS430372 | |
| חממת תרביות תאים | תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב | HERA51901126 | |
| צ'ידמיד (צ'י) | שנזן מיקרוקור ביוטכנולוגיה בע"מ (סין) | טוהר >95% | |
| קורא מיקרופלט רב-מצבי Cytation 5 | ביוטק, ארה"ב | CYT5MV | |
| מערבל חימום מגנטי תרמוסטטי DF-101S | חברת הכלים ג'נגג'ואו קצ'ואנג, סין | ||
| דיכלורומתאן | קבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם) | 80047318 | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | D2650 | |
| דיאוקסן | אלאדין (סין) | D116156-5 מ"ל | |
| מדיום DMEM | גיבקו (ארה"ב) | 12100046 | |
| המלח המאופר בפוספט של דולבקו (DPBS) | גיבקו (ארה"ב) | 14040141 | |
| אתיל אצטט | קבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם) | 10009460 | |
| אתיל אתר | קבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם) | ||
| FA2004B איזון אלקטרוני | חברת שנגחאי טיאנמיי בלנס אינסטרומנט בע"מ, סין | FA2004B | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | גיבקו (ארה"ב) | 10099141C | |
| פולאט-פולי(אתילן גליקול)-אמין (FA-PEG-NH2) | חברת Shanghai Pengshu Biological Technology בע"מ (סין) | PS2-NFA-2000 | |
| חומצה פורמית | אלאדין (סין) | F112034 | דרגת HPLC |
| מייבש הקפאה | תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב | ||
| קתפסין אנושי B | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | SRP0289 | |
| קווי תאי סרטן הלבלב האנושיים (PSN-1, CFPAC-1) | אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית (ATCC) | CRL-3211, CRL-1918 | |
| תאי כוכב לבלב אנושיים (HPaStec, HPSC) | אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית (ATCC) | ||
| טריפסין אנושי | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | ||
| חומצה כלורית | קבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם) | CFSR-10011008 | |
| מיקרוסקופ הפוך | אולימפוס, יפן | IX83 | |
| מדיום דולבקו המשופר של איסקוב (IMDM) | גיבקו (ארה"ב) | 12440053 | |
| מיקסר מערבל IX 1000 | חברת הנגג'ואו רויצ'נג אינסטרומנט בע"מ, סין | IX 1000 | |
| מתנול | קבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם) | M433287-10L | |
| מתנול | טדיה (ארה"ב) | MS1922-001 | דרגת HPLC |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.5/2.0 מ"ל) | אקסיגן (ארה"ב) | MCT-150-C | |
| מיקרופיפטות (20, 100, ו-1000 & mu; L) | תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב | 4642050, 4642070, 4642090 | |
| מערכת טיהור מים של Mill-Q | מיליפור, ארה"ב | ZR0Q00800 | |
| ערכת בדיקת MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-סולפופניל)-2H-טטראזוליום) | פרומגה (ארה"ב) | G3582 | |
| N,N-דימתילפורמיד (DMF) | אלאדין (סין) | ||
| N-ברומוסוקינימיד (NBS) | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | B81255 | |
| N-הידרוקסיסוקינימיד (NHS) | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | 56480 | |
| Optima Max אולטרה-צנטריפוג | בקמן, ארה"ב | 393490 | |
| תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין | גיבקו (ארה"ב) | 15140-122 | |
| חומצה מחזורית | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | P7875 | |
| אתר נפט | קבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם) | ||
| פנאזין מתוסולפט (PMS) | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | 3180806 | |
| תמיסת מלח מפוזרת-פוספט (PBS) | גיבקו (ארה"ב) | 70011069 | |
| פולי(אתילן גליקול)-אמין (PEG-NH2) | חברת Shanghai Pengshu Biological Technology בע"מ (סין) | PG2-AM-20k | |
| RPMI-1640 בינוני | גיבקו (ארה"ב) | 31800022 | |
| אבקת סיליקה ג'ל | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | 53698 | רשת 300 |
| נתרן ביקרבונט | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | 401676 | |
| כלוריד נתרן | קבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם) | 10019318 | |
| נתרן דיכרומט דיהידראט | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | 1.93689 | |
| סקוואלן | סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב) | Y0002131 | |
| צינורות צנטריפוגה סטריליים (15 ו-50 מ"ל) | קורנינג (ארה"ב) | 430791, 430828 | |
| חומצה גופרתית | קבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם) | 10021618 | |
| טטרהידרופורן | קבוצת התרופות הלאומית של סין (סינופארם) | 34865-4X4L | דרגה אנליטית |
| צינורות צנטריפוגליים אולטרפילטרציה (חיתוך משקל מולקולרי: 3.5 קילו-דלטון) | בקמן, ארה"ב | 344088 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.