מאמר שיטה

שיטה סטנדרטית לזיהוי ננו-צינורות מנהורים בתאי עור אנושיים ליישומים הנדסת רקמות

790 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69883

⸱

13 בינואר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital, 4Department of Urology, the Affiliated People's Hospital of Ningbo University

במאמר זה

סיכום

כאן מוצג פרוטוקול סטנדרטי להמחשת ננו-צינורות מנהורים בין קרטינוציטים אפידרמליים אנושיים לפיברובלסטים דרמליים באמצעות תיוג ממברנה ו-F-אקטין באמצעות הדמיה קונפוקלית z-stack, עם צביעת α-tubulin אופציונלית, המאפשרת גילוי שכפול ואפיון ציטוסקלטלי ליישומים של הנדסת רקמות.

תקציר

ננו-צינורות מנהורים (TNTs) הם תעלות בין-תאיות דקות המבוססות על אקטין, המאפשרות העברה ארוכת טווח של אברונים ומטען איתות. למרות שדיווחו נרחב על פני סוגי תאים שונים, נוכחותם בתאי עור אנושיים לא תוארה היטב. מאמר זה מתאר פרוטוקול סטנדרטי לזיהוי ואפיון TNTs במבחנה בין קרטינוציטים אפידרמליים אנושיים לפיברובלסטים דרמליים. השיטה כוללת הכנת קו-קלטורה של תאים ראשוניים, קיבוע עדין לשימור TNTs שבירים, תיוג ממברנה עם אגלוטינין של נבט חיטה, צביעת F-actin עם פאלואידין, ודימות שיטתי של Z-stack במיקרוסקופיה קונפוקלית הפוכה, להבחנה בין TNTs התלויים מעל השכבה לבין פילופודיה דביקה. צביעת חיסון אופציונלית ל-α-טובולין מאפשרת הערכה של שילוב מיקרוטובולים. TNTs מוגדרים על ידי שלושה מאפיינים: בליטות דקות וישרות שמחברות בין שני תאים או יותר, נוכחות של F-אקטין, והמשכיות בין זוגות תאים בחתכים אופטיים סדרתיים. תוצאות מייצגות מראות TNTs המקשרים בין זוגות דרמיים-דרמליים, אפידרמליים-אפידרמליים ודרמליים-אפידרמליים, עם הרכב ציטוסקלטלי משתנה (F-actin לבדו או F-actin בתוספת α-tubulin). שלבים קריטיים כוללים קיבוע עדין, שימוש בחומרים טריים, ורכישת מספיק מישורי Z כדי למנוע סיווג שגוי, בעוד שפריטים נפוצים כוללים שבירת TNT וכתמים לא שלמים. ביחד, השלבים האופטימליים הללו מאפשרים זיהוי TNT ניתן לשחזור במערכות תאי עור ומספקים בסיס מתודולוגי לחקר עתידי של תקשורת מתווכת TNT בביולוגיה ובהתחדשות של העור.

מבוא

ננו-צינורות מנהורים (TNTs) הם תעלות בקנה מידה ננומטרי מבוססי אקטין, המאפשרים העברה ישירה בין תאים של אברונים ומולקולות איתות. אורכם בדרך כלל 6-100 מיקרון וקוטר 50-500 ננומטר, כאשר חלקם מגיעים עד 700 ננומטר בעובי1. בניגוד לבליטות ממברנה ריקות, TNTs מכילים סיבים ציטוסקלטליים, לרוב F-אקטין, שמספק קשיחות מבנית ותומך בהובלה מיטוכונדרית 2,3,4. בתרבות דו-ממדית, TNTs מוגדרים על ידי שלושה מאפיינים: בליטות דקות (20-700 ננומטר), ישרות התלויות מעל השכבה המחברות בין שני תאים או יותר; נוכחות סיבי F-אקטין; והיכולת להעביר מטען.

מאז זיהותם הראשון בתאי PC-12 על ידי Rustom ואח' 5, TNTs נחקרו במערכות רבות, כולל מערכות הלב וכלי הדם6, מערכת החיסון7 ומערכת הנשימה8, אפיתל הקרנית9, גידולים10 ומערכת העצבים11,12. הם תורמים לתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים כגון איתות חיסוני, אפופטוזיס, הובלת חומרים ואנגיוגנזה 13,14,15. TNTs יכולים לתווך העברה ארוכת טווח של מטענים מגוונים, כולל מיטוכונדריה, רשתית אנדופלזמית, חומצות גרעין, יונים ואפילו וירוסים 5,16,17.

העור הוא איבר מורכב מבחינה מבנית, כאשר האפידרמיס והדרמיס נשענים על תקשורת מתמדת לצורך הומאוסטזיס, ריפוי פצעים והתחדשות גפיים 18,19,20. למרות ש-TNTs תוארו ברקמות רבות, כולל מערכת החיסון, מערכת העצבים ואפיתל הקרנית 7,9,12, נוכחותם בתאי עור אנושיים לא דווחה בספרות שפורסמה. בהתבסס על המסגרת המתודולוגית שתוארה על ידי סאנס-דה-סנטה-מריה ואח' 21, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי ואופטימלי לזיהוי TNTs בין קרטינוציטים אפידרמליים לפיברובלסטיםדרמליים 22 באמצעות צביעת אימונופלואורסצנציה בשילוב מיקרוסקופיה קונפוקלית הפוכה.

בהשוואה לגישות חלופיות לזיהוי TNT, פרוטוקול זה מציע איזון מעשי בין רגישות לנגישות. הדמיית תאים חיים יכולה ללכוד את דינמיקת TNT אך מוגבלת על ידי פוטוטוקסיות ואופיים הקצר מועד של TNTs 1,23. מיקרוסקופ אלקטרונים מספק פרטים אולטרסטרוקטוריאליים אך לעיתים קרובות אינו מצליח לשמר טווחי TNT ארוכים ואינו מעשי לניתוח שגרתי של תאי עור ראשוניים24,25. מערכות ננו-צינורות מבוססות דיווח מאפשרות מעקב בזמן אמת אך דורשות מניפולציה גנטית, שלרוב אינה יעילה בקרטינוציטים ופיברובלסטים ראשוניים24,26. לעומת זאת, הפרוטוקול הנוכחי עושה שימוש באימונופלואורסצנציה סטנדרטית ובמיקרוסקופיה קונפוקלית, המאפשר זיהוי TNT שניתן לשחזור על תרביות תאי עור שהוכנו באופן עצמאי, תוך שמירה על תאימות לתאים ראשוניים שבירים.

שיטה זו מתאימה במיוחד לניתוח מדגם קבוע שבו הרכב שלד הציטוסקלטלי ושכיחות TNT מעניינים. מכיוון ש-TNTs שבריריים מאוד, שלבי קיבוע וטיפול הם מגבלות מרכזיות, והגישה אינה יכולה ללכוד דינמיקת TNT בזמן אמת. עם זאת, עבור מעבדות העובדות עם תאי עור אנושיים ראשוניים, זרימת העבודה הסטנדרטית הזו מספקת דרך נגישה ועקבית להמחשת TNTs ותומכת במחקרים בהמשך של תפקידיהם הפוטנציאליים בהנדסת רקמות והתחדשות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל תאי העור ששימשו במחקר זה היו בעבר תאים ראשוניים מוקפאים שבודדו מרקמות עור אנושיות שהתקבלו כדגימות עורלה שהושלכו בהליכי ברית מילה, והיו מזוהים לחלוטין22. רכישת דגימות עור אנושי בוצעה במחלקה לאורולוגיה, בית החולים העממי המסונפ לאוניברסיטת נינגבו, ופרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית (פרוטוקול מס' 2024104; תאריך אישור: 30 באוקטובר 2024).

1. זיהוי TNTs בקרטינוציטים אפידרמליים ראשוניים בעור אנושי ובפיברובלסטים דרמליים

  1. הכנת תמיסה
    1. הכינו תמיסה קיבועית 1 (200 מיקרוליטר) על ידי הוספת 4% PFA (100 מיקרוליטר), 2.5% גלוטראלדהיד (4 מיקרוליטר), 1 מיליון HEPES (40 מיקרוליטר) ו-1x PBS (56 מיקרוליטר). הכינו טרי וחמם מראש ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    2. הכינו תמיסה קיבועית 2 (200 מיקרוליטר) על ידי הוספת 8% PFA (100 מיקרוליטר), 1 מטר HEPES (0.4 מיקרוליטר), 1x PBS (99.6 מיקרוליטר). הכינו טרי וחמם מראש ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    3. הכינו תמיסה קיבועית 3 (200 מיקרוליטר) על ידי הוספת 8% PFA (100 מיקרוליטר), 2.5% גלוטראלדהיד (4 מיקרוליטר), 1x PBS (96 מיקרוליטר). הכינו טרי וחמם מראש ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  2. תרבית תאים
    1. הפשרה ותרבות של קרטינוציטים אפידרמליים ופיברובלסטים דרמליים בצלחות בגודל 60 מ"מ באמצעות מדיום גדילה מתאים. הוסיפו תרביות קרטינוציטים עם Y-27632 בריכוז סופי של 5 מיקרומום במהלך ההחייאה. שמרו על תרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עד שהתאים מגיעים ל-~80% קונפלוקציה.
    2. הסר את המדיום ושוטף לזמן קצר את התאים ב-1 מ״ל של 1x PBS (המשמש לשמירה על pH פיזיולוגי ואוסמולריות במהלך השטיפה). שאפו את ה-PBS.
    3. הוסיפו 1 מ״ל של 0.05% טריפסין-אדטה, פזרו באופן שווה ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 1.5-2.5 דקות.
    4. החזירו בעדינות את התאים על ידי פיפטינג. הוסף 2 מ"ל מדיום גידול, העבר לצינור של 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. זרוק את הסופרנטנט ותלה את הכדור ב-1-2 מ"ל של חומר בינוני. ספירת תאים באמצעות מונה אוטומטי.
    6. זרעו 12,000 פיברובלסטים דרמליים או 20,000 קרטינוציטים בכל באר של סלייד תא בן 8 בארות בנפח סופי של 400 מיקרוליטר. לאחר הזריעה, נערו את התא היטב כדי לפזר את התאים באופן שווה. דגרו ~24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    7. לאחר כ-24 שעות של דגירה, ניתן לצפות במפגש התאים תחת מיקרוסקופ. אם זה מגיע ל-~80%, יש להמשיך לשלב הקיבוע הבא.
  3. קיבוע
    1. כאשר התרביות מגיעות ל-~80% התנגשות, הוסיפו בעדינות כמה טיפות של תמיסת קיבוע 1 ישירות לבאר התא כדי להצמיד את התאים. דגרו במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. ודא שהקיבע מתפזר באופן שווה מבלי להפריע לתאים.
      זהירות: יש לטפל בזהירות כדי למנוע הפרעה ל-TNTs. מכיוון שתמיסות הקיבע מכילים רכיבים רעילים כמו PFA וגלוטראלדהיד, תמיד לבש כפפות מגן, בגדים מגנים ומסכה, ולטפל בהם במכסה אדים. הקפידו לשטוף ידיים היטב לאחר מכן. איסוף פסולת קיבוע של PFA וגלוטראלדהיד בנפרד במיכלים מסומנים לצורך הטמנה של כימיקלים מסוכנים.
    2. שואף את הקדם-קיבוע והחליפו ב-140 מיקרוליטר של תמיסה קיבועית טרייה 1, כדי להבטיח שכל הבאר מכוסה. דגרו 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    3. הסר את התמיסה הקיבועית 1 והוסף 140 מיקרוליטר של תמיסה קיבועית 2. דגרו 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ודא שהתמיסה מכסה את התאים במלואו כדי לשמור על קיבוע אחיד.
    4. הסר את הקיבוע, ואז הוסף 140 מיקרוליטר של 100 מ"מ NH₄Cl כדי לכבות אלדהידים שאריתיים. דגרו 10-30 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. שטוף את הדגימות 3 פעמים עם 1x PBS למשך 30 שניות כל אחת בטמפרטורת החדר, תוך פיפטור עדין לאורך קיר התא כדי למנוע שטיפת תאים או שבירת TNTs.
  4. צביעת ממברנה ושלד
    1. דגרו תאים עם 140 מיקרוליטר של 1:300 (v/v) WGA (Wheat Germ Agglutinin)-Alexa Fluor conjugate, שמסמן גליקופרוטאינים של ממברנת הפלזמה לצורך ויזואליזציה של TNTs שמקורם בממברנה, ב-1x PBS למשך 20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
      הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע בסביבה חשוכה.
    2. שטוף 3 פעמים עם 1 PBS (30 שניות כל אחד). דגרו עם 140 מיקרו ליטר של פאלואידין קונגוגט מדולל ב-1:250 (v/v) ב-1% BSA למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
    3. שטוף 3 פעמים עם 1 PBS (30 שניות כל אחד). דגרו עם 140 מיקרוליטר של תמיסת DAPI למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    4. שטוף 3 פעמים עם 1× PBS. הוסיפו 2-3 טיפות של מדיום התקנה, דגרו 20 דקות בטמפרטורת החדר, ואחסנו לפחות 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך עד להדמיה.
  5. הדמיה
    1. לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם אובייקטיב 40x. בחר שדות אקראיים ואסף ערימות Z (10-20 שכבות) מלמטה ועד למעלה של התאים. הפרמטרים הספציפיים למיקרוסקופ המשמשים לרכישת תמונה מפורטים להלן:
      מיקרוסקופ סורקת לייזר קונפוקלי: ZEISS LSM 900
      קווי לייזר: מסילה 1 (561 ננומטר, 4.0%), מסילה 2 (488 ננומטר, 16.0%), מסילה 3 (405 ננומטר, 60.0%)
      רווח הגלאי: 525 וולט
      גודל שלב Z: 20 חתכים אופטיים (עומק כולל: 5.32 מיקרון)

2. קו-קולטורה של תאים אפידרמליים ודרמליים

  1. הכינו קרטינוציטים ופיברובלסטים בשלבים 1.2.1-1.2.5.
  2. זרע 10,000 קרטינוציטים ו-6,000 פיברובלסטים בכל תא היטב ב-400 מיקרוליטר של מדיום. לאחר הזריעה, נערו את התא היטב כדי לפזר את התאים באופן שווה. דגרו במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר כ-24 שעות של דגירה, ניתן לצפות במפגש התאים תחת מיקרוסקופ. אם זה מגיע ל-~80%, יש להמשיך לשלב הקיבוע הבא.
  4. קבע וצבע ממברנות כפי שמתואר בשלבים 1.3-1.4.
  5. חדירת תאים עם 0.1% טריטון X-100, כדי לאפשר גישה לנוגדנים למטרות תוך-תאיות, למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, ואז לשטוף 3 פעמים עם 1x PBS.
    הערה: טריטון X-100 עם 0.1% יש להכין טרי לפני השימוש.
    אזהרה: טריטון X-100, המזיק לחיים ימיים, חייב גם הוא להיפטר מפסולת כימית ולעולם לא להישפך לניקוז.
  6. חסימה עם 140 מיקרוליטר של 2% BSA ב-PBS כדי להפחית קישור נוגדנים לא ספציפיים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: 2% BSA צריך להיות מוכן טרי לפני השימוש.
  7. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדן אנטי-ציטוקרטין 5 מדולל ב-1:200 (v/v) ב-2% BSA.
  8. שטפו 3 פעמים עם 1x PBS, ואז דגרו עם נוגדן משני מצורף Alexa Fluor 594 למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.
  9. שטוף 3 פעמים עם 1× PBS. צבע גרעיני צבע עם DAPI ותמונה כפי שבשלבים 1.4.5-1.5.2.

3. זיהוי רכיבים ציטוסקלטליים של TNTs

  1. תרבית תאים
    1. תרבית ותיקון תאים כמו בשלבים 1.2-1.3. פרמייביליז עם 0.1% טריטון X-100 למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, ואז שטוף עם 1x PBS.
    2. חסום עם 2% BSA למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. דגרו במשך לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדן אנטי-α טובולין.
    3. שטוף 3 פעמים עם 1x PBS ודגר עם נוגדן משני מצומד אלקסה פלואור למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.
      הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע בסביבה חשוכה.
    4. שטוף 3 פעמים עם 1x PBS. תייג את F-actin עם פאלואידין ותמונה כפי שבשלבים 1.4.3-1.5
  2. קו-קולטורציה של תאים
    1. הכינו קו-תרביות כפי שבשלבים 2.1-2.2. תקן עם תמיסה קיבועית 3 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. החליפו ל-140 מיקרוליטר של 100 מ״מ NH4Cl ודגרו 10-30 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף 3 פעמים עם 1x PBS.
    3. ראשית, לזהות תאי אפידרם על ידי ביצוע חדירה, חסימה וצביעת CK5 בדיוק כפי שמתואר בשלבים 2.4-2.8.
    4. לאחר מכן, בצע צביעת חיסון α-טובולין בהתאם לשלבים 3.1.2-3.1.4.
    5. לבסוף, יש לצבוע F-actin בפאלואידין ולהמשיך בהדמיה כפי שמתואר בשלבים 1.4.2-1.5.2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול סטנדרטי זה, זוהו בהצלחה ננו-צינורות מנהורים (TNTs) בתאי עור אנושיים הן בתנאי תרבית יחידה והן בתנאי קו-קולטורציה. כדי לאמת את ספציפיות הנוגדנים, בוצעו צביעות חיוביות ושליליות לכל הנוגדנים לפני הניתוחים הניסיוניים, כפי שמוצג באיור משלים 1, איור משלים 2, איור משלים 3 ואיור משלים 4. תמונות מייצגות מדגימות את הזיהוי החוזר של TNTs כערוצים דקים ומכילים אקטין המחברים תאים.

זיהוי TNTs באוכלוסיות תא בודדות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא שימור TNTs במהלך קיבוע וצביעה, שכן מבנים אלו שבריריים מאוד וניתנים להפרעה בקלות. טיפול עדין במהלך הקיבוץ, תזמון נכון ושימוש בקיבועים טריים הם חיוניים לשמירה על שלמות ה-TNT. השימוש בהדמיה קונפוקלית מסוג Z-stack חשוב לא פחות להבחין בין TNTs התלויים מעל השכבה התחתית לבין פילופודיה או בליטות דביקות אחרות, שעלולות להוביל לפרשנות שגויה. שיקולים אלו מדגישים את הצורך בהליכים סטנדרטיים להשגת ויזואליזציה ניתנת לשחזור של TNT במעבדות, במיוחד בתאי עור, המציגים הידבקות חזקה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים להצהיר עליהם.

תודות

הפרויקט מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 82273554). המחברים מודים למעבדת הנדסת חומרים ביולוגיים והתחדשות רקמות בבית החולים לסטומטולוגיה בנינגבו על התמיכה המתמשכת ומודים לחברי הצוות הנוכחיים והקודמים על דיונם החשוב. המחברים מודים גם למורה פנג לי ממרכז המחקר והניסויים של בית הספר לרפואה של האנגג'ואו על הסיוע הנדיב והתמיכה החזקה בגישה למיקרוסקופ הקונפוקלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור 15 מ"לקירגןKG2611סטרילי, RNase/Dnase וללא פירוגני
37 & deg; חממת Cתרמו-סיינטיפיק51032877חממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות מספקת סביבה אידיאלית במבחנה.
אקטין-טרקר רד-רודמיןביוטייםC2207sאקטין-טראקר רד-רודמין הוא פאלואידין המסומן בצבע הפלואורסצנטי רודמין, עם אורך גל עירוי מרבי של 540 ננומטר ואורך גל פליטה מרבי של 565 ננומטר.
אלקסה פלואור קונגוגט של אגלוטינין נבט חיטה (WGA)גשושיות מולקולריותW11261  Alexa Fluor 488 Conjugate
נוגדן אנטי-אלפא לטובוליןאבקאםab7291נוגדן אנטי-אלפא טובולין - בקרת טעינה (ab7291) הוא נוגדן מונוקלונלי לעכברים המזהה טובולין אלפא. מתאים לאדם, עכבר, חולדה.
נוגדן אנטי-ציטוקרטין 5 אבקאםAB52635נוגדן אנטי-ציטוקרטין 5 - סמן שלד ציטוקלטוני (ab52635) הוא נוגדן מונוקלונלי של ארנב המזהה ציטוקרטין 5. מתאים לאדם, עכבר, חולדה.
אקווה-פולי/מאונטמדעים פולי-מדעיים18606מדיום הרכבה מסיס במים, לא פלואורסצי, מנוסח להרכבת חלקים מתמיסת מים. שימושי לטכניקות אימונופלואורסצנטיות כי הוא משפר ושומר על כתמים פלואורסצנטיים.
מונה סלולרי אוטומטיקאונטסטארIC1000מונה תאים אוטומטי לספירת תאים מהירה ומדויקת
צנטריפוגה על ספסלביורידג'TD5צנטריפוגה על הספסל להפרדה מהירה ויעילה של דגימות במעבדה
ארון בטיחות ביולוגיתתרמו-סיינטיפיק1379ארון בטיחות ביולוגי הוא מכשיר בידוד סטרילי המגן על מפעילים, דגימות וסביבות מפני סיכונים ביולוגיים על ידי סינון פתוגנים באוויר ומניעת זיהום צולב במהלך עבודה מיקרוביולוגית.
אלבומין סרום בקר (BSA)יוביביוU5010-10gBSA הוא גלובולין בסרום בקר המכיל 583 שאריות חומצות אמינו במשקל מולקולרי של 66.430 kDa ונקודה איזואלקטרית של 4.7
צלחת תרבית תאים (60X15 מ"מ)אפנדורף30701119תרבית רקמה מטופלת סטרילית, ללא פירוגנים ניתנים לזיהוי, RNase ו-RNase DNase, DNA.
תא סלביס סלייד-8סלביסC8-1.5H-Nתוכנן להדמיה ברזולוציה גבוהה כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית.
פתרון צביעת DAPIביוטייםC1006-10 מ"לתמיסת צביעת DAPI מתאימה לצביעה גרעינית של כל התאים והרקמות הנפוצות.
עזים נגד עכבר IgG H& L (אלקסה פלואר 405) אבקאםab175660עזים נגד עכבר IgG H& L (Alexa Fluor 405) הוא נוגדן משני עם אורך גל ספיגה מרבי של 401 ננומטר ואורך גל פליטה מרבי של 421 ננומטר.
עז אנטי-ארנב IgG H& L מצורף לאלקסה פלואר 405אבקאםab175652עז אנטי-ארנב IgG H& L (Alexa Fluor 405) הוא נוגדן משני עם אורך גל ספיגה מרבי של 401 ננומטר ואורך גל פליטה מרבי של 421 ננומטר.
עז אנטי-ארנב IgG H& L מצומד לאלקסה פלואר 594אבקאםAB150080IgG H&, אנטי-ארנב עזים L (Alexa Fluor 594) הוא נוגדן משני עם אורך גל ספיגה מקסימלי של 590 ננומטר ואורך גל פליטה מרבי של 617 ננומטר.
מיקרוסקופ פלואורסצנציה קונפוקלי הפוךלייקהTCS SP8 Xמיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר Leica SP8 X מספק הדמיה ברזולוציה גבוהה שאין לה מתחרים עם יכולות מתקדמות לזיהוי פלואורסצנציה וניתוח תאים חיים.
מיקרוסקופ פלואורסצנציה קונפוקלי הפוךאנדורBC43ה-Andor BC43 הוא מיקרוסקופ קונפוקלי קומפקטי ומהיר המציע הדמיה מהירה פי 10 ממערכות מסורתיות עם יכולת הדמיה דו-ממדית/תלת-ממדית בלחיצה אחת
NH4Cl MedChemExpressHY-Y1269 כלוריד אמוניום כתרכובת קוטבית לוויסות ה-pH.
פאלואידין קונוגאטים אורגון גריןTM488טכנולוגיות חייםO7466צבע: ירוק. טווח אורך גל עירור: 496/520.
מלח זרחן (PBS)Viva Cell BiosciencesC3582-0500תפקידו הוא לשמור על ה-pH של התווך בטווח הפיזיולוגי ולשמור על איזון הלחץ האוסמוטי בתוך ומחוץ לתא.
טריטון-X 100סולרביולוגיהT8200-100mlזהו חומר פעיל לא יוני רב-שימושי המשמש לשיקום רכיבי ממברנה בתנאי שינוי קלים.
פתרון Trypsin-EDTAGIBCO25300054בשל חוזק העיכול שלו, טריפסין משמש באופן נרחב לפירוק תאים, מעבר שגרתי בתרבות תאים, ופירוק רקמות ראשוניות.
Y-27632MedChemExpressHY-10071Y-27632 הוא מעכב פעיל אוראלית, תחרותי ATP של ROCK-I ו-ROCK-II

מקורות

  1. Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Commun Integr Biol. 7 (1), e27934(2014).
  2. Liu, Z., Sun, Y., Qi, Z., Cao, L., Ding, S. Mitochondrial transfer/transplantation: an emerging therapeutic approach for multiple diseases. Cell Biosci. 12 (1), 66(2022).
  3. Yang, F., et al. Tunneling Nanotube-Mediated Mitochondrial Transfer Rescues Nucleus Pulposus Cells from Mitochondrial Dysfunction and Apoptosis. Oxid Med Cell Longev. 2022, 3613319(2022).
  4. Yang, C., et al. Mitochondria transfer from early stages of erythroblasts to their macrophage niche via tunnelling nanotubes. Br J Haematol. 193 (6), 1260-1274 (2021).
  5. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  6. Alarcon-Martinez, L., et al. Pericyte dysfunction and loss of interpericyte tunneling nanotubes promote neurovascular deficits in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (7), 2110329119(2022).
  7. Zhu, C., Shi, Y., You, J. Immune Cell Connection by Tunneling Nanotubes: The Impact of Intercellular Cross-Talk on the Immune Response and Its Therapeutic Applications. Mol Pharm. 18 (3), 772-786 (2021).
  8. Zhang, F., et al. TFAM-Mediated mitochondrial transfer of MSCs improved the permeability barrier in sepsis-associated acute lung injury. Apoptosis. 28 (7-8), 1048-1059 (2023).
  9. Jiang, D., et al. Mitochondrial transfer of mesenchymal stem cells effectively protects corneal epithelial cells from mitochondrial damage. Cell Death Dis. 7 (11), e2467(2016).
  10. Zheng, Y., et al. Tunneling nanotubes mediate KRas transport: Inducing tumor heterogeneity and altering cellular membrane mechanical properties. Acta Biomater. 185, 312-322 (2024).
  11. Dilsizoglu Senol, A., et al. α-Synuclein fibrils subvert lysosome structure and function for the propagation of protein misfolding between cells through tunneling nanotubes. PLoS Biol. 19 (7), e3001287(2021).
  12. Scheiblich, H., et al. Microglia rescue neurons from aggregate-induced neuronal dysfunction and death through tunneling nanotubes. Neuron. 112 (18), 3106-3125.e8 (2024).
  13. Solimando, A. G., et al. Tunneling nanotubes between bone marrow stromal cells support transmitophagy and resistance to apoptosis in myeloma. Blood Cancer J. 15 (1), 3(2025).
  14. Korenkova, O., et al. Tunneling nanotubes enable intercellular transfer in zebrafish embryos. Dev Cell. 60 (4), 524-534 (2025).
  15. Ma, L., et al. Dynamic three-dimensional culture enhances tunneling nanotubes-mediated mitochondrial transfer in mesenchymal stromal cells to accelerate wound healing. J Nanobiotechnol. 23 (1), 559(2025).
  16. Sahinbegovic, H., et al. Intercellular Mitochondrial Transfer in the Tumor Microenvironment. Cancers (Basel). 12 (7), 12071787(2020).
  17. Gurke, S., Barroso, J. F., Gerdes, H. H. The art of cellular communication: tunneling nanotubes bridge the divide. Histochem Cell Biol. 129 (5), 539-550 (2008).
  18. Kobielak, K., Pasolli, H. A., Alonso, L., Polak, L., Fuchs, E. Defining BMP functions in the hair follicle by conditional ablation of BMP receptor IA. J Cell Biol. 163 (3), 609-623 (2003).
  19. Nowak, J. A., Polak, L., Pasolli, H. A., Fuchs, E. Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis. Cell Stem Cell. 3 (1), 33-43 (2008).
  20. Woo, W. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26 (11), 1235-1246 (2012).
  21. Sáenz-de-Santa-María, I., Henderson, J. M., Pepe, A., Zurzolo, C. Identification and Characterization of Tunneling Nanotubes for Intercellular Trafficking. Curr Protoc. 3 (11), e939(2023).
  22. Liu, Z., et al. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J Vis Exp. (138), e57784(2018).
  23. Dupont, M., Souriant, S., Lugo-Villarino, G., Maridonneau-Parini, I., Vérollet, C. Tunneling Nanotubes: Intimate Communication between Myeloid Cells. Front Immunol. 9, 43(2018).
  24. Gerdes, H. H., Rustom, A., Wang, X. Tunneling nanotubes, an emerging intercellular communication route in development. Mech Dev. 130 (6-8), 381-387 (2013).
  25. Sartori-Rupp, A., et al. Correlative cryo-electron microscopy reveals the structure of TNTs in neuronal cells. Nat Commun. 10 (1), 342(2019).
  26. Dagar, S., Pathak, D., Oza, H. V., Mylavarapu, S. V. S. Tunneling nanotubes and related structures: molecular mechanisms of formation and function. Biochem J. 478 (22), 3977-3998 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

F Actin

מאמרים קשורים