מאמר שיטה

הדמיה סופר-רזולוציה ספקטרוסקופית של מולקולות DNA באמצעות ניגוד פנימי

DOI:

10.3791/69917

⸱

6 במרץ 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern Memorial Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק פעולות מפורטות על הכנת דגימות, איסוף נתונים וניתוח ספקטרום פלואורסצנציה פנימי של DNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה ברזולוציה על-אנושית חוללה מהפכה במחקר הביולוגי בכך שחשפה פרטים מבניים בקנה מידה ננומלי. רוב שיטות הסופר-רזולוציה האופטית מסתמכות על תיוג פלואורסצנטי של מולקולות ביולוגיות, מה שמאפשר תיוג ספציפי של מינים מולקולריים אך עלול להפריע לתפקודי התאים, להכניס אי-דיוקים במולקולות מקשר, ולהיכשל לספק את צפיפות הסימון הגבוהה העקבית הנדרשת להדמיית כרומטין בקנה מידה של מולקולות DNA בודדות. טכנולוגיה שתאפשר הדמיה גנומית ללא תוויות וברזולוציה ננומטרית תשפיע עמוקות על הביולוגיה. כאן אנו מציגים פרוטוקול שמנצל את הפלואורסצנציה הפנימית של DNA לביצוע מיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת ספקטרוסקופית (sSMLM). הפרוטוקול מפרט הכנת דגימות, איסוף נתונים וניתוח ספקטרלי. בקצרה, ג'ל DNA דק נוצר על ידי הפקדת תמיסת פולינוקלאוטידים על זכוכית ומתן התייבשות למשך שעות. לאחר יצירת הג'ל, הדגימה מצולמת בנוכחות בופר הדמיה באמצעות sSMLM. מאגר הנתונים המוקלט כולל תמונה מסדר אפס, המספקת לוקליזציות מרחביות, ותמונה מסדר ראשון, המקודדת את ספקטרום הפליטה של כל לוקליזציה. שחזורים מרחביים נוצרים מהנתונים מסדר אפס, ולאחר מכן הספקטרום המתאים מופק מהאות מסדר ראשון. לבסוף, אנו מדגימים את היתכנות הגישה הזו באמצעות אורכי גל עוררות מרובים ומולקולות DNA באורכים, רצפים והרכבים משתנים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנציה ברזולוציה על-אנושית – כולל מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM), מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה (STED) ומיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת (SMLM) כמו מיקרוסקופ לוקליזציה פוטואקטיבציונית (PALM) ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM) – דחפו את הרזולוציה של מיקרוסקופיה אופטית הרבה מעבר לגבול הדיפרקציה 1,2,3,4,5,6,7, מה שמאפשר גישה חסרת תקדים לארגון הננומטרי של כרומטין 8,9,10,11,12. עם זאת, שיטות הצביעה הנוכחיות להמחשת מבני חומצות גרעין מתבססות על תיוג חלבונים הקשורים ל-DNA ולא על DNA עצמו, או משתמשות בצבעי מולקולות קטנות שיכולים להפריע לתצורת הכרומטין הטבעית ולפגוע בחיוניות התא13,14. עקב מגבלות אלו, פיתוח שיטות הדמיה אופטית סופר-רזולוציה ללא תוויות בתנאים טבעיים וללא הפרעה הוא רצוי מאוד. הפרוטוקול המוצג כאן מיועד לנוקלאוטידים DNA חד-גדיליים או דו-גדיליים סינתטיים מטוהרים, שבהם ניתן לזהות פלואורסצנציה פנימית באופן אמין; הוא אינו מותאם להדמיית מולקולות DNA גרעיניות בתאים קבועים או בתא חי.

מכיוון שחומצות גרעין נחשבו זמן רב ללא פלואורסצנטיות בשל התפוקה הקוונטית הנמוכה מאוד שלהן (בסדר גודל של 10−4 תחת עירור UV) ודעיכת פלואורסצנציה אולטרה-מהירה בטמפרטורתהחדר 15, מחקרים על הפלואורסצנציה הפנימית של DNA (בעיקר אורך החיים הפלואורסצנטי) היו נדירים עד שפותחה ספקטרוסקופיית הפמטו-שניות. הוכר היטב כי נוקלאוטידים זוהרים חלשים תחת תאורה UV, בעוד שספיגתם בטווח הנראה חלשה בהרבה. עם זאת, נצפה לאחרונה כי קיימת פלואורסצנציה מעוררת אור נראה של חומצות גרעין לא מותאמות בריכוזים פיזיולוגיים רלוונטיים16. תופעה זו ככל הנראה הוזנחה, שכן רוב המחקרים הפוטוכימיים של נוקלאוטידים בוצעו בתמיסות מדוללות (10-100 מיקרומון)17,18,19,20, בעוד שבגרעינים וכרומוזומים, ריכוזי ה-DNA יכולים להגיע ל-0.1-1 M 21,22,23. חשוב יותר, נצפה החלפת פלואורסצנציה סטוכסטית תחת תאורה נראית16, מה שהניח את היסודות לשימוש בחומצות גרעין לא מעודדות כסוכני ניגוד אנדוגניים למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה מבוססת לוקליזציה.

המאפיינים הפוטוכימיים של מונומרים נוקלאוטידים ומולקולות DNA חד-גדיליות עם רצפים פשוטים בריכוזים פיזיולוגיים תחת עירור באור נראה נחקרו24. הוכח גם שמולקולות DNA אלו מחזיקות בתכונות החלפה פלואורסצנטיות סטוכסטיות, מה שמתאים היטב לתיאוריה של דלדול מצב קרקע (GSD)6,7 על ידי בחינת התאוששות הפלואורסצנציה של נוקלאוטידים בתנאי התרוקנות משתנים. יתרה מזאת, מכיוון שנוקלאוטידים מציגים תפוקות קוונטיות גבוהות יחסית והסתברויות חציית מערכות נמוכות, ספירת הפוטונים ומשך ההבהוב של אירועי פליטה של מולקולה בודדת דומים לאלו של צבעים אקסוגניים פופולריים ב-STORM (למשל, Alexa Fluor 647), ומציגים ספקטרום מובחן25,26 והופכים את ה-DNA לסוכן ניגוד פנימי אידיאלי להדמיה ברזולוציה גבוהה. בנוסף, יישום אלגוריתם הרגרסיה הספקטרלית שתואר בסעיף הקודם מאפשר הדמיה ברזולוציה על-גבוהה של פולינוקלאוטידים וסיבי DNA חד-גדילייםליניאריים 27.

כדי ללכוד את כל ספקטרום הפלואורסצנציה הפנימית של DNA, השתמשנו בפריזמה דו-טריזית (DWP) לזיהוי ספקטרלי, המאפשרת ניתוח ודימות ספקטרוסקופי חד-מולקולי בתפוקה גבוהה עם אובדן שידור מינימלי ושגיאות חזיתגל 28,29,30, ותוכנת ניתוח SMLM ספקטרוסקופית בקוד פתוח (RainbowSTORM) לעיבוד נתונים אוטומטי 31,32. בהתבסס על יכולת זו, פיתחנו פלטפורמת SMLM רב-לייזרית המשולבת עם זיהוי ספקטרוסקופי וצינור ניתוח ספקטרלי ייעודי. הפרוטוקול שאנו מציגים כאן כולל הכנת דגימות, רכישת נתונים וניתוח, ומספק תהליך עבודה שניתן לשחזר לניצול פלואורסצנציה פנימית של DNA במיקרוסקופ מיקום מולקולה יחידה. מעבר לאפשרות מחקרי הוכחת היתכנות על הדמיית אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים ומולקולות DNA דו-גדיליות עם ניגודיות פנימית, הגישה הניחה בסיס ליישומים רחבים יותר בהדמיית DNA בתנאים טבעיים וללא תווית, כגון חיזוי רצפים המבוססים על פלואורסצנציה פנימית של DNA בשילוב עם שיטות חישוביות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת דגימות ג'ל DNA (איור 1A)

  1. המיס את דגימת ה-DNA (או אוליגונוקלאוטיד או DNA דו-גדילי) במים דה-יוניים ללא נוקלאז לריכוז סופי של 100 מ"מ מול, ואחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורה של -4 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו 5 מיקרו-ליטר אליקווטים כדי למזער מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים. אם משתמשים באליקווטים קפואים, הפשיר אותם בטמפרטורת החדר למשך 5-15 דקות, תלוי בנפח.
  3. נקה בעדינות מגבון זכוכית עם מגבון מעבדה. פיפט 5 מיקרוליטר מתמיסת מולקולת ה-DNA של 100 מ"מ על סלייד הזכוכית הנקייה הטרייה ומאפשר לה להתאדות במשך 1-3 שעות, ליצירת ג'ל DNA.
  4. הפעל את המדרגה הזו בתוך מכסה אדים למען הבטיחות. הכינו בופר הדמיה לפי טבלת החומרים. גם בופר β-מרקפטואנול וגם בופר DABCO אושרו לתמיכה בפוטו-סוויצ'ינג סטוכסטי של מולקולות DNA.
  5. הפעל את המדרגה הזו בתוך מכסה אדים למען הבטיחות. הוסיפו 5 מיקרוליטר של בופר הדמיה לג'ל ה-DNA והניחו קופסליפ מעליו מיד לפני ההדמיה. יכול להיות שיש בועות בתוך הדגימה המכוסה. השתמש בפינצטה כדי להסיר את הבועות בתוך הדגימה המכוסה,

2. כיול מערכת sSMLM ורכישת נתונים (איור 1B)

  1. הכינו מערך ננו-חורים מיוצר בקוטר חור של 100 ננומטר ומרווח של 4 מיקרון, המסודרים ב-8 שורות x 5 עמודות לכיול הבא של מערכת SMLM ספקטרוסקופית33.
    הערה: לחילופין, ניתן גם להשתמש במפת הרזולוציה של חיל האוויר האמריקאי (USAF) משנת 1951 (R3L1S4N) לכיול ספקטרלי33.
    1. הפקת מערך הננו-חורים על ידי התזת מתכת רציפה וחריטה בקרן יונים ממוקדת (FIB). ראשית, הנחת סרט אלומיניום בעובי 150 ננומטר על כיסוי זכוכית בורוסיליקט בגודל 22 על 22 מ"מ באמצעות ספאטינג DC בעוצמה של 75 וואט עם זרימת ארגון סטנדרטית של 20 סנטימטרים מעוקבים לדקה (SCCM) במהירות 3 mTorr.
    2. דפוס מערך 5 על 8 ננו-חורים בשכבת האלומיניום באמצעות מילינג FIB הפועל במתח תאוצה של 30 קילווולט.
  2. הפעל את מערכת SMLM הספקטרוסקופית (איור 2), הכנס מסנני רוחב פס צר (532 ננומטר, 580 ננומטר, 633 ננומטר, 680 ננומטר ו-750 ננומטר) ישירות מול המצלמה, והשתמש במקור אור לבן (למשל, מנורת המיקרוסקופ) כדי להאיר את דגימת הכיול.
  3. אסוף 10 פריימים מכל פילטר. קבע את זמן החשיפה ל-532 ננומטר, 580 ננומטר, 633 ננומטר ו-680 ננומטר ל-2000 ננומטר ל-750 ננומטר, בשל עוצמת המנורה הנמוכה והיעילות הנמוכה של המצלמה באזור האינפרא-אדום הקרוב (איור 3).
  4. טעין את דגימת הג'ל של ה-DNA על המיקרוסקופ, ודא שצד הכיסוי פונה לאובייקטיבי, ופתח את תוכנת המצלמה לאיסוף נתונים.
  5. זהה את מיקום ה-z המתאים בעזרת מערכת מעקב פוקוס אוטומטית, כדי להבטיח שהבהוב סטוכסטי ברור נראה. שלב זה קריטי ודורש סבלנות, שכן דגימות ג'ל DNA חסרות רמזים מורפולוגיים ברורים כמו מבני תאים, מה שמקשה על ניווט לאות תקין.
  6. ודאו שהאובייקטיב אינו נוגע בקצה הכיסוי, שכן הדבר עלול לגרום לדליפת בופר לשמן הטבילה ולהפריע למעקב.
  7. רכוש 10,000-30,000 פריימים עם הספק תאורה טיפוסי של 5 קילוואט/סמ"ר וזמן חשיפה של 30 מילישניות. התאימו את מספר הפריימים, עוצמת התאורה וזמן החשיפה לפי הצורך. לאחר הרכישה, התוכנה תשמור את הנתונים בפורמט nd2 כברירת מחדל.
  8. לאחר סיום הניסוי, יש להשליך את מחסנית הזכוכית במיכל פסולת חדה מאושר (למשל, פח פינוי זכוכית שבורה או חדות), ולזרוק את כל המחסומים שנותרו למיכל הפסולת הכימית המיועדת בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות.

3. ניתוח נתוני כיול וספקטרוסקופיה (איור 1C)

  1. טען את ערימת התמונה הגולמית שנרכשה של דגימת ה-DNA ל-FIJI (Windows 64-bit), באמצעות תוסף Bio-Formats.
  2. הפך את ההקרנה המינימלית מהמחסנית כדי לקבל מערך נתונים שנחסר ברקע ולשמור אותו לניתוח ספקטרלי. עבור ערימת התמונה הגולמית הטעונה, בחר ב-Image > Stacks > Z Project ובחר Min intensity בסוג ההקרנה. לאחר מכן בחר ב-Process > מחשבון תמונה כדי להפחית את ההקרנה המינימלית מערימת התמונה הגולמית ולשמור אותה כ-TIFF.
  3. בצע זיהוי לוקליזציה על מחסנית התמונות הגולמיות מסדר אפס באמצעות תוסף ThunderSTORM (גרסה 1.3). השתמש בפרמטרים מתאימים (למשל, סף = 1.2 x std (Wave.F1), סיגמה = 1.5, רדיוס התאמה = 3) כדי לשחזר את התמונה מסדר אפס ולחלץ את קואורדינטות אירוע הפליטה (יחידות: ננומטר). עבור מחסנית התמונה הגולמית מסדר אפס, בחר ב-Plugin > ThunderSTORM > ניתוח Run.
  4. השתמש ב-FIJI ובתוכנת הקוד הפתוח RainbowSTORM (קישור GitHub בגרסה32, עם גרסת MATLAB חדשה מ-2020b) כדי לעבד את נתוני הכיול ולקבל את הקשר בין הזזות אופקיות ואנכיות ואורכי הגל 31,32.
    1. בצע זיהוי לוקליזציה על תמונות הכיול של 5 אורכי הגל באמצעות תוסף ThunderSTORM. השתמש בפרמטרים מתאימים (למשל, סף = 5 x std (Wave.F1), סיגמא = 1.5, רדיוס התאמה = 3) כדי לשחזר את הלוקאליזציות של הננוחורים בסדר אפס ואת הלוקאליזציות הספקטרליות המתאימות להם בסדר הראשון.
    2. כוון את הסף (למשל, בטווח של 5-10 x std (Wave.F1)) עד שיש 80 לוקליזציות לכל תמונת כיול.
    3. הרץ את RainbowSTORM ולחץ על כיול ספקטרלי > דפדף וטעין את קבצי CSV עבור כל אורך גל כיול (532 ננומטר, 580 ננומטר, 633 ננומטר, 680 ננומטר, 750 ננומטר) מהשלב הקודם. לחץ על שמירת קובץ כיול.
  5. המרו את הקואורדינטות מבוססות ננומטר לקואורדינטות פיקסל ומפות אותן לחלון הספקטרום המתאים בהתבסס על ההזזות האופקיות והאנכיות מסדר האפס לסדר הראשון, שנקבעו בכיול (איור 4), כדי למדוד את כל ספקטרום הפלואורסצנציה הפנימית של DNA.
    1. השתמש בסקריפטים מותאמים אישית של פייתון34 (גרסה 3.11.7) כדי לחלץ את נתוני הספקטרום המלא עם השלבים הבאים.
    2. הגדר נתיבי קובץ נכונים עבור מחסנית התמונה (.tiff) שהופקה ברקע משלב 3.2, קובץ CSV של הלוקליזציה (.csv) שנוצר משלב 3.3, וקובץ הכיול משלב 3.4 (.mat).
    3. השתמש ב-900-950 פיקסלים כהזזה אופקית עבור הנתונים של 488 ננומטר שנרכשו עם ה-DWP התלת-ממדי, התואם לחלון ספקטרלי של 484-588 ננומטר, מעט רחב יותר מטווח המסננים של 500-550 ננומטר כדי להבטיח כיסוי.
    4. השתמשו ב-925-984 פיקסלים כהזזה אופקית לנתוני 532 ננומטר המתקבלים ב-DWP התלת-ממדי, התואם לחלון ספקטרלי של 525-750 ננומטר, שנבחר שוב להיות רחב יותר מטווח המסננים של 590-650 ננומטר.
    5. השתמש ב-23 פיקסלים כהזזה אנכית גם לנתוני 488 ננומטר וגם ל-532 ננומטר עם ה-DWP התלת-ממדי.
      הערכים לעיל נגזרו מעקומת הכיול הספקטרלית שהושגה באמצעות RainbowSTORM. סקריפטים בפייתון למדידת הספקטרום המלא נמצאיםב-34.
  6. ליניאריזציה של הספקטרום הלא-ליניארי לניתוח עתידי (השוואה, סיווג וכו') באמצעות התאמה פולינומיתמסדר 3 (איור 3).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התהליך המלא – מהכנת דגימה ועד איסוף וניתוח נתונים – עבור ערימת תמונה אחת של דגימת DNA אורך כ-120 דקות, בהנחה שיצירת ג'ל DNA דורשת שעה אחת (איור 1). הזמן המשולב להפשרה, יצירת ג'ל וכיול ספקטרלי נקבע בכ-90 דקות, ללא קשר למספר התמונות או הדגימות בניסוי. כדי למקסם יעילות, אנו ממליצים לאסוף מספר ערימות תמונות על פני מספר דגימות במפגש אחד.

תמונות מייצגות בזמן אמת שהושגו לאחר ה-DWP מוצגות באיור 1B ואיור 3A, כאשר אותות הפלואורסצנציה מחולקים לסדר אפס (שמאל, המכיל מידע מרחבי) והסדר הראשון (מימין, המכיל מידע ספקטרלי). באיור 1B, התמונות צולמו באמצעות תצורת DWP דו-ממדית, שבה ההפרדה בין תמונות מסדר אפס לתמונות מסדר ראשון קטנה יחסית. לעומת זאת, איור 3A מציג נתונים שנאספו באמצעות DWP תלת-ממדי, כאשר שני סדרי הדיפרקציה מופרדים יותר בשל הפרש מסלול אופטי מהונדס הנדרש להדמיה תלת-ממדית דו-כנפית. כל הנתונים שהוצגו באיור 1C, איור 3 ואיור 4 נאספו באמצעות תצורת DWP תלת-ממדית. הבחירה בין הדמיה דו-ממדית לתלת-ממדית תלויה במטרה הניסויית: למדידות ספקטרליות פלואורסצנציה פנימיות של דגימות DNA מסונתזות, ה-DWP דו-ממדי מועדף בדרך כלל משום שלדגימות אלו חסרות תכונות מבניות תלת-ממדיות רלוונטיות, אם כי ניתן להשתמש בתצורת DWP תלת-ממדית גם כאשר נדרשים מידע אקסיאלי.

יחד, תוצאות מייצגות אלו מדגימות את היכולת המרכזית של פלטפורמת ההדמיה מבוססת DWP לפתור בו-זמנית את מיקום הספקטרום המרחבי והפליטה של מולקולות DNA בודדות בזמן אמת. הביצועים הנכונים של המערכת מסומנים על ידי ההפרדה הברורה והיציבה בין התמונה המרחבית מסדר אפס לתמונה המפוזרת ספקטרלית מסדר ראשון, כאשר כל לוקליזציה של מולקולה בודדת בסדר אפס מתאימה למסלול ספקטרלי מובחן בסדר ראשון. ניתוח ספקטרום כמותי מתבצע על ידי זיהוי אירועים בודדים מבודדים בתמונה מסדר אפס, מדידת היסט הפיקסל היחסי של אות מסדר ראשון המתאים, והמרת היסט זה לאורך גל באמצעות פונקציית מיפוי מכוילת. מכיוון שהקשר בין הזזת הפיקסלים לאורך גל הפליטה הוא לא ליניארי, מיושם התאמת פולינום מסדר שלישי כדי לשחזר במדויק ספקטרום פליטה ליניארית מנתונים גולמיים28. הספקטרום החד-מולקולי שנוצר ניתן להשתלב עוד בצינורות ניתוח חישובי, כולל מודלים של למידת מכונה או למידה עמוקה, כדי לאפשר סיווג ספקטרלי והסקה של הרכב רצף ה-DNA או המבנה המולקולרי בהתבסס על חתימות פלואורסצנציה פנימיות בתנאי תאורה שונים ובמצבים פוטופיזיים שונים.

כל הנתונים המוצגים בפרוטוקול זה נאספו באמצעות מאגר הדמיה מבוסס β-מרקפטואנול35. בעיקרון, כל בופר הדמיה שמגביר את התנהגות החלפת הפוטו-ציור של הפלואורופור צריך להיות תואם לגישה זו, לדוגמה, בופר הדמיה מבוסס DABCO36. מולקולות ה-DNA שנבדקו כוללות 20 בסיסים חד-גדיליים A, G, C, T; שרשרת AC חד-גדילית עם 40 בסיסים (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20); גואנין חד-גדילי עם 5, 8, 12, 16 בסיסים; GC ו-AT דו-גדיליים עם זוג 20 בסיסים (ראו טבלת חומרים למידע מפורט). הבחירה במבני DNA בני 20 ו-40 בסיסים מבוססת על התצפית ששרשרת DNA בת 40 בסיסים מאמצת קונפורמציה קומפקטית בגודל אפקטיבי של פחות מ-40 x 3.4 = 13.6 ננומטר, מה שממקם אותה מתחת לגבול הרזולוציה של תמונת SMLM משוחזרת. אורכי הגל של העירור (488 ננומטר ו-532 ננומטר) לא היו מותאמים באופן ייחודי לרצפים ספציפיים, אלא נבחרו כדי להראות כי פלואורסצנציה פנימית של DNA ניתן לזהות בצורה יציבה על פני הרכבי בסיסים ומצבים קונפורמציה שונים באמצעות כל אחד מאורכי הגל. בדקנו את בופר ההדמיה כפי שמוצג באיור המשלים 1 ומצאנו שכמעט ולא זוהו אותות מצהובים סטוכסטיים, מה ששלל רכיבי בופר וטיפולי משטח זכוכית. רק ג'ל DNA + בופר הדמיה הציג מספר משמעותי של מצמוצים. מחסניות הזכוכית והכיסוי היו נקיים ומטופלים בקפידה, בעוד שהג'ל לדוגמה נוצר בסביבה סגורה. לכן, האותות שזוהו ככל הנראה לא יגיעו מזיהומים או מאוטופלואורסצנציה של המצע. מדדנו גם את האות מג'ל הייבוש ומהתמיסה DNA, שניהם, ומצאנו שלא היה הבדל משמעותי, כך שפריטים פוטוכימיים במהלך הייבוש אינם המקור העיקרי לאותות. מוצרי פוטוגרדציה בדרך כלל מציגים ספקטרום רחב ואין להם תכונות מהבהוב, דבר שמעולם לא נצפה במחקר שלנו. הגבולות הכמותיים של גילוי, המשתקפים על ידי ספירת הפוטונים המינימלית של מיקומים, הם 30 - 50 [ספירת פוטונים]. ערך זה נשאר זהה עבור דגימות DNA ומערכות מסומנות, כגון H3K9me3 המסומן AF647 בתאים קבועים. דיוק המיקום הממוצע של הפלואורסצנציה הפנימית של ה-DNA הוא כ-15 - 25 ננומטר, בעוד שה-AF647 הוא כ-10 - 15 ננומטר.

בתרחיש דו-ממדי, התמונה המחודשת של SMLM היא בגודל פיקסל של 22 ננומטר. דיוק המיקום של פליטות סטוכסטיות הוא בממוצע ~20 ננומטר, המתאר את מרווח האמון של המקום שבו המולקולה הבודדת מתמקמת. עם זאת, הדגימות שנבדקו לפלואורסצנציה פנימית אינן כוללות מבנים ביולוגיים, ולכן לא ניתן לפרש את רזולוציית המבנים. מיקרוסקופיית הפיזור הקוהרנטית של רמאן מדווחת ברזולוציה של 250 - 300 ננומטר37, ולמיקרוסקופ הפוטון האולטרה-סגול דו-פוטון יש רזולוציה של 300 ננומטר38. יחס האות לרעש של הדמיית פיזור רמאן קוהרנטית הוא בעוצמה של 10 - 10039, בעוד שהוא 2 - 20 (לעיתים מבוטא כאות לסטיית תקן שניהם, SSDR) עבור מיקרוסקופיית UV 2 פוטון 40,41. ה-SNR לפלואורסצנציה פנימית של DNA באמצעות sSMLM הוא כ-5 בשל ספירת פוטונים נמוכה ומגבלות שמוטלות על ידי רעש זיהוי מצלמה.

figure-results-1
איור 1: תהליך עבודה עם משך זמן משוער. (א) הכנת הדגימה כוללת הפשרת המלאי, הכנת ג'ל ה-DNA והוספת בופר הדמיה. הזמן הכולל משתנה בין 1 ל-3 שעות בהתאם למדגם ולסביבה. (B) כל רכישה דורשת תהליך כיול עם דגימת מערך ננו-חורים שתוכננה במיוחד. זמן הכיול הכולל יהיה כ-20 דקות, וזמן איסוף הנתונים עבור ערימת תמונה אחת יהיה כ-10 דקות, כולל חיפוש דגימות (10,000 פריימים ו-50 מילישניות חשיפה). (ג) צינור הניתוח כולל עיבוד מוקדם של FIJI וניתוח ספקטרלי בפייתון. העיבוד המוקדם בפיג'י אורך כ-10 דקות, בעוד שהניתוח הספקטרלי מהיר עם הקודים המוכרים. הספקטרום שהוצגו נאספו מגואנין בעל 16 בסיסים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: סכמטיקה אופטית. ארבעת קווי הלייזר (405 ננומטר, 488 ננומטר, 532 ננומטר, 647 ננומטר) מופנים אל המיקרוסקופ ההפוך באמצעות יישור לייזר, מה שהופך את המערכת ליציבה וקלה לתפעול. ה-DWP ממוקם ממש לפני מצלמת sCMOS, ומאפשר זיהוי ספקטרוסקופי של מולקולה בודדת. בעת כיול ל-DWP, יוכנס גלגל סינון בין המצלמה ל-DWP. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: כיול ספקטרלי. אורכי הגל בכיול הם 532 ננומטר, 580 ננומטר, 633 ננומטר, 680 ננומטר ו-750 ננומטר. על ידי הצבת מסנני רוחב פס צרים ברצף עם אורכי גל מרכזיים אלה אחרי ה-DWP ולפני המצלמה, ניתן למדוד את ההזזות האופקיים והאנכיות המתאימים של אורכי גל שונים, מה שמאפשר מיפוי עקומת כיול בין מיקום הפיקסל לאורך הגל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: ספקטרום של מולקולות DNA דו-גדיליות וחד-גדיליות נבחרות תחת עירור של 532 ננומטר ו-488 ננומטר, בהתאמה. (A - B) הספקטרום הלא-ליניארי והליניארי של GC_alter, המתייחס לסוג של מולקולת DNA דו-גדילית, כאשר שני הגדילים הם 20-בסיס 5'-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-3'. הספקטרום הירוק המודגש מציג את העקומה הממוצעת. (C - D) הספקטרום הלא-ליניארי והליניארי של A10C10, המתייחס לסוג של מולקולת DNA חד-גדילית, באורך 40 בסיסים וחזרה על עצמה 10 אדנין ו-10 ציטוזין (5'- AAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3'- AAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCC-3'). הספקטרום הכחול המודגש מציג את העקומה הממוצעת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: ניסויי בקרה לפלואורסצנציה פנימית של DNA. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, לראשונה, אנו מציגים פרוטוקול ללכידת כל ספקטרום הפלואורסצנציה הפנימית של DNA הן ממולקולות DNA חד-גדיליות והן כפולות, המכסה את תהליך העבודה מהכנת דגימה ועד לאיסוף נתונים וניתוח חישובי. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה סופר-רזולוציה ללא תוויות של מולקולות DNA על ידי ניצול פלואורסצנציה פנימית במקום גלאים חיצוניים. בעיקרון, גישה זו יכולה להיות מורחבת גם לתאים קבועים ואולי גם להדמיית תאים חיים, שכן היא נמנעת מתיוג כימי והגברה מבוססת נוגדנים. הכרומטין בתוך הגרעין כולל DNA, RNA וסוגים שונים של חלבונים, שזהו מערכת הרבה יותר מורכבת מהג'ל של ה-DNA. כיום, בשל ספירת פוטונים נמוכה ממולקולות DNA, פליטות סטוכסטיות מתוך הגרעין בתאים קבועים/חיים הן אתגר. אך עבור הכרומוזומים המבודדים, או הגרעין, דווח על אות הפלואורסצנציה הפנימי של ה-DNA 16,24,27. עם זאת, בצורתו הנוכחית, הפרוטוקול מוגבל לסביבות חוץ גופיות המשתמשות בדגימות DNA מסונתזות. בהשוואה, תיוג DNA גרעיני או כרומטין באמצעות צביעת חיסון בדרך כלל כולל הליכים מרובי שלבים ארוכים – כולל כיבוי, חסימה ודגירה ראשונית ומשנית של נוגדנים – שיכולים להימשך כמה שעות (לעיתים ~5 שעות למטרה)12,42, מה שמכניס מורכבות ניסויית והפרעות פוטנציאליות למבנה הכרומטין הטבעי. על ידי ביטול תוויות חיצוניות, הדמיה מבוססת פלואורסצנציה פנימית לא רק מקצרת משמעותית את זמן הכנת הדגימה, אלא גם מונעת הפרעות מבניות ושגיאות קישור הקשורות לגשושי פלואורסצנטיות ונוגדנים כבדים, ובכך מאפשרת מיקום נאמן יותר בקנה מידה ננומטרי של DNA.

למרות אופיו ללא תוויות ופשטותו המושגית, היישום המוצלח של פרוטוקול זה דורש תשומת לב קפדנית למספר פרטים ניסיוניים קריטיים. לדוגמה, במהלך הכנת הדגימה, חוסר זמן ליצירת ג'ל DNA מפחית את מספר הלוקאליזציות הניתנות לזיהוי של מולקולה בודדת בהשוואה לג'לים שלמים. בדרך כלל לוקח בערך שעה וחצי עד שהג'ל נוצר. אם התמיסה לא יבשה לגמרי, פשוט חכה עוד קצת. לכיסוי בגודל 22 על 22 מ"מ, 5 מיקרוליטר של בופר הדמיה מספיקים, בעוד שנפח גדול יותר של בופר עלול לגרום לדליפה, מה שעלול לשבש את ממשק הטבילה בשמן של האובייקטיב ולהשפיע לרעה על ביצועי ההדמיה. אם מתרחשת דליפה, ניתן להסיר אותה בזהירות באמצעות מגבון מעבדה. בזמן ריכוז, העלה בהדרגה את המטרה מהמיקום הנמוך ביותר של z. לאחר שהמטרה מפעילה את שמן ההטבילה, השתמש במצב התאמה עדינה לזיהוי מישור המוקד עם אירועי פליטה סטוכסטיים תכופים של מולקולה בודדת. אם אשכולות ג'ל גדולים מייצרים אותות מצטברים עם ספקטרום מסדר ראשון חופף, בחרו אזור הדמיה חלופי.

למרות יתרונותיו, לפרוטוקול זה יש מספר מגבלות חשובות שיש לקחת בחשבון בעת הערכת היישום והביצועים שלו. ראשית, חילוץ ספקטרלי מדויק תלוי בהפרדה מרחבית מספקת בין אירועים בודדים בודדים; צפיפויות לוקליזציה גבוהות, כמו אלו הנובעות מאשכולות ג'ל DNA גדולים או הרכבות מקרומולקולריות צפופות, עלולות להוביל לעקבות ספקטרליות חופפות מסדר ראשון שמסבכות או מונעות שחזור ספקטרום אמין. שנית, השיטה רגישה ליישור אופטי וליציבות מיקוד, שכן סטיות קטנות של פריזמת הדו-יתד או סטיות ממישור המוקד האופטימלי עלולות לגרום לשגיאות שיטתיות בכיול אורכי הגל ולהפחית את יחס האות לרעש. שלישית, הפרוטוקול כיום אינו מיישם דה-מיקסינג ספקטרלי, ומגביל את השימוש בו בדגימות עם צפיפות מולקולרית גבוהה או מינים חופפים ספקטרלית מרובים. ביחד, גורמים אלו מגדירים את משטר הפעולה המעשי של השיטה ויש לשקול אותם בקפידה בעת הרחבת הפרוטוקול למערכות ביולוגיות מורכבות או צפופות יותר.

בפרוטוקול זה, RainbowSTORM משמש רק לכיול ספקטרלי, אם כי התוכנה מספקת גם כלים רבי עוצמה לכיול דו-ממדי/תלת-ממדי, ניתוח נתוני sSMLM ושחזור תמונה. כלי ניתוח כאלה מתאימים במיוחד לקישור מידע לוקליזציה מרחבית לקריאות ספקטרליות בהדמיה סופר-רזולוציה ספקטרוסקופית וניתן לנצל אותם בהרחבות עתידיות של פרוטוקול זה. לבסוף, פרוטוקול זה אפשרי לסוגים אחרים של מקרומולקולות ביולוגיות 43,44,45, כגון RNA, טובולין ועוד. הספקטרום שזוהה יכול להיות מוזן עוד למודלים חישוביים, כמו מודלים של למידהעמוקה 46, כדי לבצע סיווג, ובכך לחזות רצף או מבנה מולקולרי מספקטרות פנימיות תחת תאורה ותכונות פוטופיזיות שונות. מחקר זה גם סולל את הדרך להדמיית כרומטין מולקולרית ייחודית ללא תוויות, שמונעת תיוג חיצוני או דה-דנטוריזציה של מבנים טבעיים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך במענקים R02CA225002, U54CA261694, R01CA289294 ו-U54CA268084 מהמכונים הלאומיים לבריאות ומענק CBET-2430743 מקרן המדע הלאומית. אנו מודים למעבדתו של פרופ' האו פ. ג'אנג באוניברסיטת נורת'ווסטרן על מכשיר הפריזמה הדו-טריזי שלהם כחלק מרכזי במערכת SMLM הספקטרוסקופית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסנן פליטה 488 ננומטר להדמיהChroma Technology Corp.ET525/50M
מסנן פס 532 ננומטר לכיולThorlabsFL532-3
מסנן פליטה 532 ננומטר להדמיהChroma Technology Corp.ET620/60M
מסנן פס 580 ננומטר לכיולThorlabsFB580-10
מסנן פס 633 ננומטר לכיולThorlabsFL632.8-3
מסנן פס 680 ננומטר לכיולThorlabsFB680-10
מסנן פס 750 ננומטר לכיולThorlabsFB750-10
בטא-מרקפטואנול סיגמאM6250
בופר הדמיה BMENANA7 & mu; L GLOX, 7 & mu; L בטא-מרקפטואנול ו-690 & mu; בופר גלוקוז L
קטלאז מכבד בקרסיגמאC100
DABCO (1,4-די-אזוביציקלו-(2.2.2.)-אוקטן)סיגמאD27802
בופר הדמיה של DABCONANA65 mM DABCO+30 mM סולפיט נתרן + 30 mM DTT 1 M  ב-DNAse, RNAse מים דה-יוניים חופשיים. סולפיט הנתרן צריך להיות מומס ב-PBS 10&; ל-1 M לפני יצירת בופר ההדמיה.
דיפלקס DNA עבור SMLM ספקטרוסקופיIDTNAזוג 20 בסיסים GC_alter, GC_conti, AT_alter ו-AT_conti.
לדוגמה GC_alter עם שני הגדילים בגודל 5' - GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC - 3'; GC_conti יש לו חוט אחד בגודל 5' - GGGGGGGGGGGGGGGGGG - 3' והשנייה כ-5' - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3'
כל הדגימות הן בתקן HPLC.
DNA אוליגונוקלאוטיד/DNA דו-גדיליIDTNA
אוליגוסי DNA ל-SMLM ספקטרוסקופיIDTNA20 בסיסים A, G, C, T; שרשרת AC חד-גדילית עם 40 בסיסים (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20);   גואנין בסיסי חד-גדילי 5, 8, 12, 16.
לדוגמה: A10C10 הוא
5'- AAAAAAAAACCCCC
CCCCCAAAAAAAA
AACCCCCCCCCC - 3'
כל הדגימות הן בתקן HPLC.
מים מזוקקים ללא DNase/RNaseInvitrogen10977015
DTT (DL-דיתיותרייטול)סיגמא43816
GLOXNANA14 מ"ג גלוקוז אוקסידאז, 50 & mu; L קטלז (17 מ"ג/מ"ל) + 200 & mu; בופר L A, שהוא 10 mM Tris (pH 8.0) ו-50 mM NaCl. 
בופר גלוקוזNANA50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM NaCl ו-10% גלוקוז.
גלוקוז אוקסידאזסיגמאG7141
גלוקוז, אבקהתרמו פישר15023021
PBS (10X)תרמו פישרJ62036. K3
PBS (1X)גיבקו10010023
כלוריד נתרןתרמו פישר424290010
סולפיט נתרן  סיגמאS0505
טריס (1M) pH 8.0InvitrogenAM9856

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellis, R. J., Minton, A. P. Join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
  2. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780(1994).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  5. Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  6. Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorescence microscopy: a concept for breaking the diffraction resolution limit. Appl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
  7. Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
  8. Ricci, M., Manzo, C., García-Parajo, M. F., Lakadamyali, M., Cosma, M. Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo. Cell. 160 (6), 1145-1158 (2015).
  9. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), eaau1783(2018).
  10. Matsuda, A., et al. Condensed mitotic chromosome structure at nanometer resolution using PALM and EGFP-histones. PLoS One. 5 (9), e12768(2010).
  11. Bohn, M., et al. Localization microscopy reveals expression-dependent parameters of chromatin nanostructure. Biophys J. 99 (5), 1358-1367 (2010).
  12. Acosta, N., et al. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light Sci Appl. 14, 7(2025).
  13. Almassalha, L. M., et al. Label-free imaging of the native, living cellular nanoarchitecture using partial-wave spectroscopic microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (42), E6372-E6381 (2016).
  14. Beerman, T. A., et al. Effects of analogs of the DNA minor groove binder Hoechst 33258 on topoisomerase II and I mediated activities. Biochim Biophys Acta. 1131 (1), 53-61 (1992).
  15. Cadet, J., Anselmino, C., Douki, T., Voituriez, L. New trends in photobiology. J Photochem Photobiol B. 15 (4), 277-298 (1992).
  16. Dong, B., et al. Superresolution intrinsic fluorescence imaging of chromatin utilizing native, unmodified nucleic acids for contrast. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (35), 9716-9721 (2016).
  17. Vayá, I., Gustavsson, T., Miannay, F., Douki, T., Markovitsi, D. Fluorescence of natural DNA: from the femtosecond to the nanosecond time scales. J Am Chem Soc. 132 (34), 11834-11835 (2010).
  18. Anders, A. DNA fluorescence at room temperature excited by means of a dye laser. Chem Phys Lett. 81 (2), 270-272 (1981).
  19. Plessow, R., Brockhinke, A., Eimer, W., Kohse-Höinghaus, K. Intrinsic time- and wavelength-resolved fluorescence of oligonucleotides: a systematic investigation using a novel picosecond laser approach. J Phys Chem B. 104 (15), 3695-3704 (2000).
  20. Takaya, T., et al. UV excitation of single DNA and RNA strands produces high yields of exciplex states between two stacked bases. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10285-10290 (2008).
  21. Bancaud, A., et al. A fractal model for nuclear organization: current evidence and biological implications. Nucleic Acids Res. 40 (18), 8783-8792 (2012).
  22. Daban, J. R. High concentration of DNA in condensed chromatin. Biochem Cell Biol. 81 (3), 91-99 (2003).
  23. Bohrmann, B., et al. Concentration evaluation of chromatin in unstained resin-embedded sections by means of low-dose ratio-contrast imaging in STEM. Ultramicroscopy. 49 (1-4), 235-251 (1993).
  24. Dong, B., et al. Stochastic fluorescence switching of nucleic acids under visible light illumination. Opt Express. 25 (7), 7929-7944 (2017).
  25. Gong, R., et al. DNA spectroscopic intrinsic-contrast photon-localization optical nanoscopy. Proc SPIE. 13326, 133260F(2025).
  26. Wang, G., et al. Label-free DNA spectroscopic photon-localization nanoscopy. Optica Biophotonic Congress. , (2025).
  27. Eshein, A., et al. Sub-10-nm imaging of nucleic acids using spectroscopic intrinsic-contrast photon-localization optical nanoscopy (SICLON). Opt Lett. 43 (23), 5817-5820 (2018).
  28. Song, K. H., et al. Monolithic dual-wedge prism-based spectroscopic single-molecule localization microscopy. Nanophotonics. 11 (8), 1527-1535 (2022).
  29. Song, K. H., Sun, C., Zhang, H. F. Design strategy for a dual-wedge prism imaging spectrometer in spectroscopic nanoscopy. Rev Sci Instrum. 94 (2), 023702(2023).
  30. Yeo, W. H., Sun, C., Zhang, H. F. Physically informed Monte Carlo simulation of dual-wedge prism-based spectroscopic single-molecule localization microscopy. J Biomed Opt. 29 (S1), S11501(2023).
  31. Davis, J. L., et al. RainbowSTORM: an open-source ImageJ plug-in for spectroscopic single-molecule localization microscopy (sSMLM) data analysis and image reconstruction. Bioinformatics. 36 (19), 4972-4974 (2020).
  32. Davis, J. L., et al. RainbowSTORM v2 (MATLAB app). , https://github.com/FOIL-NU/sSMLM-protocol (2020).
  33. Brenner, B., et al. Implementation and calibration of spectroscopic single-molecule localization microscopy. BMC Methods. 2 (1), 2(2025).
  34. sSMLM for DNA intrinsic fluorescence (Python scripts). , Backman Lab. https://github.com/BackmanLab/sSMLM-for-DNA-intrinsic-fluorescence (2025).
  35. N-STORM protocol. , Molecular Vista. Available from: https://www.mvi-inc.com/wp-content/uploads/N-STORM+Protocol.pdf (2014).
  36. Abdelsayed, V., Boukhatem, H., Olivier, N. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).
  37. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys Rev Lett. 82 (20), 4142(1999).
  38. Benninger, R. K. P., Piston, D. W. Two‐photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 59 (1), 4-11 (2013).
  39. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Ann Rev Biomed Eng. 17 (1), 415-445 (2015).
  40. Song, J., et al. SNR enhanced high-speed two-photon microscopy using a pulse picker and time gating detection. Sci Rep. 13 (1), 14244(2023).
  41. Luu, P., Fraser, S. E., Schneider, F. More than double the fun with two-photon excitation microscopy. Comm Biol. 7 (1), 364(2024).
  42. Van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  43. Wang, D., et al. Research progress on the luminescence of biomacromolecules. J Mater Sci Technol. 76, 60-75 (2021).
  44. Varejão, N., Reverter, D. Using intrinsic fluorescence to measure protein stability upon thermal and chemical denaturation. Methods Mol Biol. 2581, 229-241 (2023).
  45. Sindrewicz, P., et al. Intrinsic tryptophan fluorescence spectroscopy reliably determines galectin-ligand interactions. Sci Rep. 9 (1), 11851(2019).
  46. Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nat Commun. 10 (1), 4927(2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNADNAThunderSTORMRainbowSTORM

מאמרים קשורים