מאמר שיטה

הליך אטימת שבב-לממברנה מסיליקון נגיש לקישור גמיש ואמין

818 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69980

⸱

20 במרץ 2026

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Medical Biology, EXPIRE Lab, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 2GRIAC Research Institute, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Department of Biomaterials and Biomedical Technology, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Tissue Engineering and Cells Therapy Group (GITTC), School of Medicine, University of Antioquia, Alma Mater Hospital of Antioquia, 5Department of Pulmonary Diseases, University Medical Center Groningen, University of Groningen

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול אטימה חדשני לייצור אטמים אטומים מבוססי סיליקון עבור ממברנות של מכשירי שבב פולידימתילסילוקסן (PDMS). מיועד למעבדות להרכבת דגמי שבבים ופיתוח פלטפורמות שבב בקנה מידה קטן. אנו מדגימים את הפרוטוקול באמצעות ממברנות פלסטיק ורקמות מקומיות. הליך זה דורש רק PDMS, טולואן, עובש, ממברנה ותא ואקום.

תקציר

פלטפורמות איבר-על-שבב הן היבט מתפתח במהירות במחקר ביו-רפואי. התרחבות התחום הזה יצרה מגוון חומרים ומתודולוגיות שונות לבנייתם ויישומם. בעוד שמספר המכשירים השונים - בין אם מסחריים או מפותחים באקדמיה - ממשיך לגדול, בדרך כלל נותר צעד משמעותי עבור חוקרים חדשים הנכנסים לתחום האורגן על השבב. אחת הבעיות המרכזיות בטכנולוגיות שבב חדשניות ומתמשכות היא יצירת אטימה מאובטחת וללא דליפות של מכשירי שבב. במאמר זה אנו מציעים מסלול חדש לפיתוח שבבים על ידי הצגת תהליך איטום שבבים שמייצר חיבורים אמינים ואטומים למים בין שבבי סיליקון לשלושה ממברנות תרבית מחומרים שונים. ההליך המוצג נגיש לפיתוח שבבים חדשים עם חומרים מוגבלים ומספק ממשק אוויר-נוזל (ALI) איבר על שבב. שבבים אלו מיועדים לתרבות תאים המוזנת דרך ממברנה נקבובית וחשופה לאוויר בקצה הראש, כמו במעי, עור, או, כפי שמוצג כאן, דרך אוויר על שבב. אנו מספקים שני עיצובים תלת-ממדיים שונים של תבנית שבב, המציגים את הקשר שלהם לממברנות פלסטיק מסחריות וכן לפיגומים חיצוניים (ECM) של מטריצת חזיר. ניתן לייצר את ה-Airway-on-Chip הזה בתוך החברה; המכשולים השונים שעשויים להיתקל בהם מוצגים כאן, ומציגים את השימוש הקודם בהם כ-Airway-on-chip. הליך האיטום החדש כולל שאיבת אבק של מלט פולידימתילסילוקסן (PDMS) מדולל בטולואן כדי להסיר את הטולואן שמוביל לשכבת סיליקון דקה וחזקה המוטמעת בפלסטיק הנקבובי או במשטח ממברנת ECM המקומי. החידוש השני בתהליך זה הוא תהליך התייבש בטמפרטורת החדר של טיט ה-PDMS כדי למנוע הפרעות בממברנות עקב התפשטות תרמית שונה בין החומרים האטומים יחד. דבר זה מוביל לטכניקה רחבה לקישור החומרים שנבדקו, ליצירת שבבי PDMS רב-תאיים עם ממברנות תרבית פנימיות.

מבוא

מכשירי איבר על שבב הופכים לאבן יסוד במחקר הביו-רפואי, עם מגוון רחב של מודלים מסחריים ונגישים פתוחים המפותחים במעבדותברחבי העולם. ככל שמודלים אלו הופכים לחלק מרכזי במחקר, וממשיכים להחליף דגמים מסורתיים של פלסטיק סטטי ודגמי בעלי חיים 2,3, חשוב יותר ויותר שמודלים אלו נגישים בקלות לחוקרים מרקעים שונים ברחבי העולם. מרכזי לכך הוא הנגישות להשגת פיתוח מותאם אישית, באצווה קטנה, ללא תלות בעלות קלט וייצור4, במיוחד במודלים לא מסחריים או אקדמיים1.

אחד האתגרים הגדולים ביותר בטכנולוגיות On-Chip הוא יצירת אטימה מאובטחת של שבבים ללא דליפות במהלך הזרימה. סקירה עדכנית על בדיקות דליפה במכשירי שבב זיהתה דליפה בין התאים או לסביבה כמצב מוביל לכישלון מודל וניסויי, הן בתעשייה והן באקדמיה 5,6. ישנן מספר סיבות לכישלון בהשגת אטימה מוצלחת: הממדים הקטנים של המכשירים, הזרימה והלחץ המופעלים, ובעיקר העובדה שמכשירים אלו מורכבים מחומרים שונים שנאטמו יחד בשכבות ומחוברים לתהליכים שונים6. טווח החומרים השונים המשמשים כממברנות תרבית בפלטפורמות שבבים רחב כמו טווח היישומים שלהם, כולל פוליאתילן טרפתלט (PET), פוליקרבונט (PC), PDMS ו-ECM ממברנות1. כתוצאה מכך, קיימות שיטות וטיפולים רבים לחיבור החומרים השונים הללו למכשירים הסופיים. הליכים אלו כוללים דחיסה באמצעות דבק/PDMS, כימיה של סילאן מתווכת פלזמה, פונקציונליזציה כימית של מבנים, אלקטרוספינינג וקשרי ממס מאודים, בהתאם לחומרים המעורבים בדגם7. העובדה שתהליכים אלו דורשים מערכי מיומנויות וסביבות מעבדה שונות מטילה מגבלות מסוימות על הנגישות האקדמית של מחקר On-Chip. נמצא כי בעוד שהעלויות והמגבלות של השתתפות במערכות מסחריות מגבילות את הגישה האקדמית, תהליכי בניית השבבים והציוד הנדרש מגבילים את ההתפתחות האקדמית העצמאיתשלהם 1,8,9. בחזית המחקר הזה, אחת הסוגיות הנוכחיות היא בסטנדרטיזציה ואימות של מודלים ליכולת השחזור שלהם10,11. אבל עדיין יש פער בהגעה לנקודה הזו עבור מעבדות רבות שמנסות להתחיל בפיתוח שבבים כדי לענות על שאלות מחקר ספציפיות, להחליף עבודה עם בעלי חיים ולעבוד במודלים ביולוגיים רלוונטיים יותר12.

במאמר זה אנו מציגים תהליך איטום שבבים שדורש רק מיומנויות וציוד הזמינים לרוב סביבות המחקר. הליך זה מייצר ממשקי שבב-ממברנה PDMS אטומים למים עבור שלושה חומרים שונים של ממברנה. התהליך דורש זמן עבודה פעיל מוגבל בלבד, ניתן לעסוק בו בסביבות מעבדות שאינן שבב, וניתן להרחיב אותו מייצור שבבים באצווה קטנה לבינונית בכמויות קטנות.

הליך האיטום המוצג ניתן לבצע באמצעות ממברנות פלסטיק נקבוביות או ממברנות ECM; השבבים לדוגמה שנבנו עם הליך זה ליישום כהתקן נתיב אוויר על שבב עם חשיפה לאוויר. הליך זה יכול לשמש גם במכשירים דומים, בתנאי שהממברנות מכילות נקבוביות, החיוניות לתהליך. היישום העיקרי של השבבים המסופקים הוא לתאבי אפיתל ALI ודרכי הנשימה, אך ניתן להשתמש בהם גם ליישומים אחרים ולמודלים של קו-קולטורציה עם תאי מזנכימיה או תאי מעיים, לדוגמה 8,13. השבב הראשון המסופק הוא נתיב אוויר סטנדרטי על שבב עם שטח תרבית בקנה מידה גדול (92 מ"מ 2) ושני תאי תרבית, כולל תא אפיקלי לחשיפת אוויר המופרד על ידי ממברנה נקבובית מהתא הבסיסי המכיל מדיום ואופציונלית סוג תא טבול נוסף (למשל, פיברובלסטים, תאי אנדותל). ליישומי ALI חיוני שתאי הזריעה האפיקית יוכלו לשמור על מחסום הדוק כדי למנוע דליפת מדיה לערוץ העליון. השבב השני בעיצוב זהה לראשון, עם שני תאים נוספים משני צידי הממברנה, כאן באמצעות ECM חזירי, כדי להקל על מתיחת ממברנת התרבית באמצעות הפעלת לחץ שלילי, המדמה את מתיחת נתיב האוויר הטבעי.

תהליך האיטום שלנו מאחד מספר אלמנטים מתחום פיתוח שבבי PDMS עם הוספת תנאים חדשים, שהם כפולים. ראשית, יישום מהיר של ואקום על טיט PDMS מדולל בטולואן, שמונע התקפה כימית של הטולואן על הממברנות, מעודד חדירת סיליקון לנקבוביות או למאפייני פני השטח של הממברנה, ומוביל למשטח דק עמיד להזזה. טולואן גורם לנפיחות ועיוות למשטחים מוצקים של PDMS, אך בריכוזים גבוהים משמש כממס, ולכן משמש לדילול PDMS נוזלי בתהליך זה. עבור פלסטיקים כמו ממברנות PC ו-PET כאן, הטולואן יגרום לעיוות ולסדקים במתח אם לא יוסר במהירות. חשוב להיזהר בעת יישום ידני של המלט כדי למרוח רק על דופן החצי השבב המובנה מראש ולא להיכנס לאזור התרבית, שכן זה יחסום את הנקבוביות של התרבית וייצור אזורים של PDMS שיגרמו להפרעה ולשינויים ביכולת תרבית התאים. שנית, ייבוש מלט PDMS בטמפרטורת החדר (RT) מעל 72 שעות מונע הזזת הממברנה גם מהשבב-חצי וגם מהטיט, דבר שיכול לקרות כאשר החומרים מתכווצים למעלות שונות לאחר התפשטות תרמית.

אנו מספקים שני עיצובים לתבניות שבב שניתן להכין באמצעות מדפסת תלת-ממד או מיקרו-מיל (כפי שמתואר בתיק המשלים 1, קובץ משלים 2), וכן שיטה ליצירת טיט דק מ-PDMS וטולואן14. שימוש בשיטה זו מאפשר איטום של ממברנות פלסטיק מסחריות (PET, PC) בתוך המכשיר. בנוסף, בדקנו את טווח היישום של תהליך זה על ידי יצירת אותו שבב עם ממברנת ECM טבעית מחזיר ליצירת שבב ביולוגי עם יכולת מתיחה מחזורית. מכיוון ש-Organ-on-Chips מיועדים לשחזר את התכונות הפיזיולוגיות של הסביבה ה-in-vivo , אייר-און-שבבים שיש להם את היכולת לייצר את הכוחות המכניים שחווים בגוף במהלך הנשימה, כמו מאמצי גזירה מאוויר זורם והנוף המכני של דרכי הנשימה המצמצמות, הם בעלי חשיבות ביולוגית גבוהה16. הממברנה בשימוש מורכבת מממברנת הבסיס, למינה פרופריה, וכן קולגן, למינין וחלבוני מטריצה נוספים מסביב. למיטב ידיעתנו, זהו השבב הראשון המבוסס ממברנה בבסיס בסיסי טבעי, והראשון עם אפשרות למתיחה, מה שמקל על חיקוי המתח המכני של למשל נשימה, על ממברנת ECM15 שאינה סיליקון. היישום החדשני הזה מדגיש את תפקיד תהליך האיטום שלנו עם פלסטיק ו-ECM. לבסוף, אנו מציגים את יישום הליך אטימת השבבים והממברנה הזה כ-Airway-on-Chip שניתן להשתמש בו לתרבות תא ALI8.

פרוטוקול

מחקר זה היה פטור מאישור ועדת האתיקה לפי חוק ניסויים על בעלי חיים, שכן החומרים נאספו לאחר המוות ולא הוקרב בעלי חיים למטרות מדעיות (Wet op de dierproeven). פרוטוקול הבידוד של תאי האפיתל הראשוניים בדרכי הנשימה האנושיים היה בהתאם לקוד המחקר של המרכז הרפואי האוניברסיטאי בגרונינגן (https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg הגישה ב-14 בינואר 2025) ולהנחיות המקצועיות הלאומיות והאתיות לשימוש בחומר בגוף האדם (https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf נגיש ב-14 בינואר 2025). מחקר זה היה פטור מדרישת אישור ועדת האתיקה, שכן רקמת טרכאאוברונכיאל נותרה מהשתלות ואנונימית לחלוטין בהתאם לקוד האזרחי ההולנדי ולחוק Wet op de orgaandonatie (חוק התורמים).

1. הכנת חצי שבב וממברנה

  1. ייצור שבבים
    1. הורדה . קבצי עיצוב STL עבור החצאים העליון והתחתון של השבב מתוך קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2 של מאמר זה. התבנית העליונה מייצרת חצי שבב בעומק 5 מ"מ, והתבנית התחתונה חצי שבב בעומק 3 מ"מ; שני חצאי השבב כוללים תאי תרבית בעומק של 1 מ"מ. חלופה נוספת היא ליצור עיצוב שבב באמצעות תוכנת CAD מתאימה.
    2. הכין או קובץ חיתוך להדפסת תלת-ממד או מסלול מילינג למיקרומילינג של תבניות השבב. תבניות מיקרו-טחנה יהיו מוכנות לשימוש; תבניות מודפסות בשרף ידרשו שתי שטיפות של 24 שעות עם 99.9% אתנול לפני קישור צולב UV כדי להכין אותן כראוי לשימוש כתבנית PDMS.
  2. ייצור חצי שבב PDMS (איור 1)
    1. ערבבו היטב את בסיס ה-PDMS הנוזלי עם חומר הקיבוש ביחס של 10:1 והסרו גזים בתא ואקום עד שכל בועות האוויר מוסרות.
    2. מלא תבניות עם מזרק רחב, מנקה גזים ~10 דקות בתא ואקום עד שכל הבועות מוסרות. הניחו את התבניות בתנור יבש עד שיתייבשו במשך שעתיים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
    3. הסר חצאי שבבים מוצקים מהתבניות עם סכין מנגל וחתוך את הפלאשינג מהקצוות. הוסיפו ארבעה פתחים לחצי העליון בכל קצה של התא ואת שתי הטבעות הסמוכות שמצביעות על מיקום פתחי התא התחתון באמצעות מאגר ביופסיה.
      הערה: לתוצאות שהוצגו השתמשו בחור ביופסיה של 2 מ"מ, והוכנס צינור סיליקון בקוטר 2 מ"מ לזרימת המדיום והאוויר במהלך התרבית. כניסות 1 מ"מ ו-2 מ"מ מקלות על זריעת תאים באמצעות פיפטה, בגודל של קצות של 200 ו-1000 מיקרון, בהתאמה. גדלים נוספים של חורים יכולים לשמש למערכות צינורות או משאבות שונות.
  3. הכנת ממברנה (איור 2)
    1. הורדה . קבצי עיצוב STL עבור שבלון הממברנה מתוך קובץ משלים 3 במאמר זה. הכינו את השבלונה באמצעות הדפסה תלת-ממדית או שיטת ייצור מקבילה כדי להבטיח צורת ממברנה אחידה.
    2. הנח את השבלונה מעל ממברנת ה-PET או ה-PC, והחזק אותה בחוזקה בזמן שהממברנה נחתכת לצורה באמצעות סכין מנתח.
      הערה: בשלב זה, ניתן לצפות ממברנות בחלבוני מטריצה לתרבות תאים בצלחת פטרי מבלי להפריע לקשירת ממברנה. זה יבטיח שרק הממברנה תהיה פונקציונלית לצמיחת תאים, וישאיר את דפנות ה-PDMS נקיות מהתאים כפי שתואר קודם8.

2. קשרי ממברנה

  1. הכנת מרגמות PDMS
    1. מערבבים PDMS נוזלי (שלב 1.2.1) עם טולואן ביחס 7:5 וערבבו היטב על ידי מזרק מעלה ומטה עם מזרק רחב כפי שתוארקודם 14. רק 8 טיפות נדרשות לכל שבב; מומלץ ל-1.4 מ"ל PDMS עם 1 מ"ל טולואן לכל אצווה של טיט, וזה מספיק ל-8 שבבים בקנה מידה זה. ערבוב עקבי של טיט חשוב לקשירת ממברנה אמינה.
      אזהרה: טולואן הוא תנודתי ודליק מאוד. חשיפה עלולה לגרום לנזק למערכת העצבים והנשימה. השתמש אך ורק במכסה אדים, הרחק מכל מקור הצתה, והתמודד עם דליפות עם חומר סופג ואוורור. במהלך הטיפול, יש להרכיב משקפי מגן כדי להגן מפני התזות וכפפות חסינות (ניטריל). יש לאפשר לכל חומרי המעבדה (קצות פיפטה, מיכלים וכו') לשמש 24 שעות במכסה האדים, לאחר מכן הטולואן יתאדה, וכל החומרים יושלכו במיכלים מאושרים ומסומנים באמצעות שירותי פסולת מקצועיים. לעולם אל תזרוק טולואן בכיור. לעיין בגיליון הנתונים לבטיחות (SDS) למידע נוסף.
      הערה: הכינו את המלט בנקודת השימוש כדי למנוע אידוי מוקדם של טולואן וזיהום פלסטיק, במיכל שאינו מזכוכית, רצוי חד-פעמי, והשליכו אותו ישירות לאחר השימוש. PDMS תקבע את פני השטח של הזכוכית ותהיה חלקית בלתי ניתנת להסרה; טולואן ימס ויפגע ברוב הפלסטיקים המשמשים בדרך כלל במעבדה.
  2. חיבור ממברנה של PET/PC (איור 2)
    1. מרחו במהירות את המלט על פני השטח של חצי השבב של PDMS, שם הממברנה תונח עם קצה פיפטה.
      הערה: כל האזור מתחת לממברנה חייב להיות רטוב בטיט. יש להפעיל אחיזה יציבה עם הקצה כדי ליצור את השכבה הדקה ביותר האפשרית. מיקרוסקופיה מצביעה על שכבות שבין 3 ל-5 מיקרון.
    2. החזק את הממברנה המוכנה (שלב 1.3) בקצה אחד עם זוג מלקחיים נקיים, מניח את הקצה על המלט הרטוב במיקום הנכון לשבב, ותן לממברנה ליפול למקומה.
      הערה: אל תאפשר לממברנה לזוז לאחר נקודה זו; PDMS רטובים הנכנסים לתא ייצרו דפנות לא סדירות ובלתי שמישות על הממברנה. אם מתרחשת הזזה, הסיליקון יכסה את אזור התרבית, מה שיפריע לפוטנציאל תרבית התאים משני צידי הממברנה, יזרוק את הממברנה ויחזור על השלב הקודם.
    3. החזק בעדינות את הממברנה במקום עם המלקחיים ומרח שוב את מלט PDMS מעל גבי הממברנה, תוך התרחקות עדינה מהתא בכל תנועה כדי להסיר בועות ולהבטיח את הממברנה מבלי להזיז אותה ממקומה המקורי.
      הערה: יש להיזהר לא להחיל PDMS לאזור התרבית הפנימי של הממברנה; זה חיוני כי הסיליקון מונע הידבקות תאים ומפריע למשטח הטבעי של ממברנת התרבית.
    4. מניחים חצאי שבב עם ממברנות מיד לאחר חיבור המלט הרטוב לתא ואקום ומקבשים אותם בטמפרטורת החדר תחת ואקום של 25 mBar למשך 72 שעות.
      הערה: חצאי שבב עם ממברנות מחוברות חייבים להיות מתייבשים בטמפרטורת החדר. PET/PC ו-PDMS חווים דרגות שונות של התפשטות תרמית, והתייבשות בחום גורמת לסיליקון להתרחב ואז להתכווץ כשהוא מתקרר, וליצור ממברנה נפוחה (איור 3).
  3. בניית שבבים מלאה
    1. כעת ניתן לחבר חצאי שבב קשורים לממברנה לחלק השני של השבב. לתוצאות העקביות ביותר, חשפו את שני החצאים לטיפול פלזמה O2 (320 מ"בר, 30 שניות) ולוחצים אותם במהירות בלחץ קל ביד.
      זהירות: תנורי פלזמה לחמצן יוצרים סביבות רוויות חמצן, תחמוצות מסוכנות כמו אוזון וקרינת UV עזה. יש להתקין תנורים באזור מאוורר היטב או במכסה אדים. חלון התנור אמור לחסום את כל קרינת ה-UV, אך מומלץ להשתמש במשקפי מגן (gggles). יש לשמור על חומרים ומתכות דליקים מחוץ לאזור פלזמת החמצן כדי למנוע בעירה מואצת או שחרור אדים רעילים. התייחסות למסמך SDS של פלזמת חמצן חיונית לשימוש עם כל חומר שאינו מוזכר בפרוטוקול זה.
      הערה: אם אין תנור פלזמה זמין, ניתן להשיג חיבור דומה באמצעות שרביט פלזמה או על ידי מריחת טיט PDMS על החלק השני וקיבוש החצאים יחד בטמפרטורת החדר תחת דחיסה קלה למשך 72שעות ו-13 שעות. למרות שפחות יעילים בהשוואה לתנור פלזמה מלא עם O2 , ניתן להשתמש באפשרויות אלו כאשר תנורים אינם זמינים.

תוצאות

בדיקת שלמות אטם ממברנה
כדי לבדוק את שלמות השבב האטום, תא התרבות העליון ממולא בדמי-ווטר עם צבע כחול, והתחתון בדמי-מים טהורים. השבבים נשארים ללילה כדי להעריך דליפה אפשרית של צבע כחול מהתא העליון סביב הממברנה אל התא התחתון.

שבבי סיליקון מוכנים במלואם שהוכנו בשיטה שלנו יכולים להיות מעוותים לאורך עד 35° מבלי לפגוע בשלמות הממברנה, וכעת הם עטופים וקשורים לחלק העליון עם טיט PDMS גמיש משני הצדדים. עיוות שבבי PDMS הוא חלק רגיל בשימוש, לדוגמה, כאשר החצאים או הצ'יפים נדבקים לצלחת פטרי.

השבבים היו מחוברים למערכת משאבת מזרק דו-כיוונית כדי לבדוק את ביצועיהם באמצעות לחץ זרימה. שבבים עם ממברנות PET ו-PC יכולים להיות מופעלים ללא דליפה בין התאים או קרע של השבבים עד 30 קילופסקל (הלחץ המרבי שמספקת המשאבות). במחקרים קודמים, השבבים פועלים באופן סטנדרטי במהירות של 150 מיקרוליטר לשעה, כלומר 0.7 פסקל לחץ על תאי כל מכשיר8.

הדמיית קישור לממברנה
כדי להמחיש את חדירת טיט PDMS הנוזלי לנקבוביות 0.4 מיקרון של הממברנה תחת המיקרוסקופ כתוצאה מאיטום הוואקום RT, טיט PDMS נצבע בצבע נילוס אדום. ניל רד נבחר כי הוא צבע הידרופובי ויתערבב היטב עם PDMS בצורתו הנוזלית. הכתם הוכן על ידי ערבוב יסודי של 1% נילוס אדום ב-PDMS נוזלי ליצירת צבע אדום תחת מיקרוסקופיה אורה. הליך הריפוי ב-RT חזר על עצמו כפי שתואר לעיל. ממברנות עם טיט צבוע הוטמעו בפרפין וחתכו באמצעות מיקרוטום. פרוסות ממברנה הותקנו על שקופיות זכוכית וצולמו באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 4). כדי לאמת את הצורך בדילול PDMS למלט עם טולואן ויישום ואקום לחדירת ה-PDMS לנקבוביות ממברנה, ניתן לראות השוואה בין ממברנות עם ובלי שיטות אלו באיור המשלים 3.

מבחן כחיות תאים
במחקר קודם, נבדקה רעילות כימית פוטנציאלית משימוש בטולואן בבניית המכשירים. השבבים הוכנו עם ובלי טולואן במכתש PDMS, תאי Calu-3 אפיתל של אדנוקרצינומה ריאתית אנושית גודלו למפגש במשך יומיים, וגודלו במשך יום אחד בשבבים כפי שתוארקודם 8. מוות התאים הוערך על ידי צביעת כחול טרייפן, הסרת כל התאים מהמכשיר, וספירת תאים מתים (כחולים) מול תאים בריאים שלא צובעו. ההתרבות הוערכה על ידי דגירה של התגובות במדיום השבב לפני ביצוע בדיקת AlamarBlue, תוך קריאת ספיגת הפלואורסצנט באמצעות קורא לוחות, המשקפת התרבות (איור 5)8.

חיבור ממברנת הבסיס של ECM
כדי להראות את היישום הכללי של הליך זה ביצירת קישור חזק וגמיש עם מגוון ממברנות, הפרוטוקול חזר על עצמו עם ממברנה מבוססת מטריצה חוץ-תאית (ECM) מלאה (איור 6). ממברנת הבסיס המכילה פיגומי ECM הוכנו משלפוחית שתן חזירית כפי שתואר קודם17. בקצרה, שלפוחית שתן מחזיר מבעלי חיים נקבות בגיל 4 עד 8 חודשים נאספו בבית מטבחיים מקומי (Kroon Vlees b.v., גרונינגן, הולנד) ועובדו תוך 3 שעות לאחר האיסוף. רקמת חיבור ושומן הוסרו מהשלפוחית, שלפוחית השתן הופכה הפוך החוצה, ושכבת האפיתל נותרה באופן קהה, תוך שמירה על הרקמה ב-PBS בטמפרטורת החדר. פיגומי ECM יובשו לצורך הליך חיבור ממברנה17. פיגומים מוכנים נחתכו ונקשרו לחצאי שבב PDMS כפי שמתואר בפרוטוקול לעיל. יוצר תבנית חדשה עם תאים נוספים למתיחה של הממברנה בתוך המכשיר, כדי להראות כי קשרי הסיליקון השואבים יכולים גם לעמוד במאמץ מכני אופקי (קובץ משלים 2).

בדיקת שלמות ממברנה של ECM
בדיקת שלמות אטם הממברנה בוצעה כפי שצוין לעיל. לאחר מכן, שבב המתיחה חובר למשאבות מזרק, שמשכו ואקום בתאי הצד של המכשיר כדי לייצר 1 מ"מ של מתיחה אופקית על ממברנת ה-ECM במהלך הלילה (איור 7).

התמיינות של תאי אפיתל ותרבות משולבת של פיברובלסטים בממברנת ה-Airway-on-Chip הסטנדרטית עם PET
כדי לאמת את ביצועי השבב שסופק כ-Airway-on-Chip לתאי ALI, תאי Calu-3 אפיתל של אדנוקרצינומה ריאתית אנושית (ATCC, מנאסס, וירג'יניה, ארה"ב) גודלו למפגש ולחשוף אוויר במכשיר, במחקרקודם 8. לאחר 10 ימים של חשיפה לאוויר אפיקלי, ניתן לראות תאי אפיתל של Calu-3 מתמיינים לתאים מייצרי ריר, כפי שמודגם בייצור הריר, הנמדד על ידי צביעת כחול אלציאנית (איור 8)8.

כדי לאמת את ההליך שלנו לזרימה ממושכת ללא דליפות ולתרבות משותפת, ניתן לראות דוגמה מפרסום קודם; למתודולוגיה מלאה של תרביות תאים, ראו מאמר8. תאי האפיתל של דרכי הנשימה האנושיים תורבדו בתא התרבית האפיקלית של השבב תחת זרימת אוויר קבועה במשך 21 ימים, כאשר פיברובלסטים ראשוניים של דרכי הנשימה הורכבו הפוך בצד הנגדי של הממברנה. בקיצור, תאי אפיתל ראשוניים בדרכי הנשימה בודדו באמצעות טיפול בפרוטאז (0.2 מ"ג/מ"ל ב-HBSS, שעתיים, 37 מעלות צלזיוס), גירוד תאים, ושימור קירור של תאים שהוסרו מרקמת טרכאוברונכיאלית שנותרה משלושה תורמי ריאה בריאים, מהם לא היה מידע נוסף. פיברובלסטים בדרכי הנשימה (AFs) של בני אדם בודדו באותו אופן מרקמת הסימפונות של רקמת ריאות של COPD שהושתלה מתורם יחיד.

באיור 9 ניתן לראות גרפיקה של השבב וכיצד התאים שהוזכרו לעיל נראים הן דרך והן לאורך תאי המכשיר.

תרבית תאי אפיתל בתרבות משותפת עם פיברובלסטים על ממברנת ה-ECM
הפיגום המכיל ממברנת הבסיס מסייע לתרבות תאים אפיתליים ומזנכימליים. קרטינוציטים אנושיים שהונצחו (תאי HaCaT) נזרעו בצפיפות של 60 x 103 תאים לס"מ רבוע בצד האפיתל (הפנימי) של הממברנה, והקיימות הייתה 95% לאחר 24 שעות לעומת 91% בבקבוק תרבית תאים פלסטיים (איור 10A). לאחר מכן, פיברובלסטים בריאים MRC-5 בריאותיים אנושיים הוזרעו בצפיפות של 60 x 103 תאים לס"מרבוע בצד הסטרומלי (החיצוני) וגודלו בקוקולטורה עם תאי HaCat במשך 14 ימים כדי להעריך את הקיימות ארוכת הטווח של קו-קולטורה אפיתליאלית-מזנכימלית על ממברנת ECM המקומית (איור 10D). תאי האפיתל יצרו שכבה מונופלואנטית בצד הפנימי של הממברנה, בעוד שהפיברובלסטים התפזרו בצפיפות נמוכה יותר על פני השטח החיצוני של ממברנת ה-ECM אך שמרו על המורפולוגיה האופיינית שלהם לצורת ציר (איור 10C). סרטון השחזור התלת-ממדי ניתן לראות בקובץ המשלים 417.

המחקר הנוכחי הציג תהליך שיפור באיטום ממברנה שמייצר חיבור חזק בין ממברנה ל-PDMS, המסוגל לעמוד בפני הפרעות הנגרמים מטיפול ידני בשבב, ומאפשר תרבית ממושכת בזרימה באמצעות לחצים של עד 0.7 Pa. הראינו שהממברנות הללו קשורות בסיליקון שחדר לקרומי התרבית דרך הנקבוביות, ומקל על קשרי סילאן קוולנטיים בין שני חצאי השבב לבין טיט ה-PDMS השואב. בנוסף, ההליך המוצג אינו גורם לציטטוטוקסיות, בתנאי שהטיט מיושם כראוי. יתרה מזאת, השבבים שיוצרו סייעו בתרבויות משותפות ארוכות טווח של מונו-אתליל ואפיתל מזנכימלי. למרות שההליך הזה חל רק על ממברנות נקבוביות, הוא נותר תהליך בעל קלט נמוך לייצור שבבי ALI אמינים ומוכנים לתרבות תאים.

figure-results-1
איור 1. גרפיקה של ייצור חצי שבב PDMS והכנת ממברנה. לייצור חצי שבב של PDMS (שלב 1.2), תבניות שבב ממולאות ב-PDMS נוזלי עם מזרק דיזה רחב, 4.4 מ"ל בתבנית העליונה ו-2.4 מ"ל בתבנית התחתונה. חצאי PDMS מתייבשים למשך שעתיים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 4 פתחים בחצי הצ'יפ-החלק העליון מחוררים בקצות התא ובנקודות המסומנות בתבנית. להכנת ממברנה (שלב 1.3) סטנסיל הממברנה המודפס מוחזק היטב על פני הממברנה. באמצעות להב חדש, חותכים סביב השבלונה ומסירים את ממברנת השבבים מהחומר שמסביב. ממברנות יכולות להיות מצופות לתרבות תאים או לשימוש ישיר בשלב 2. נוצר ב-BioRender. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2. הליך קשירת ממברנה. מרגמת PDMS מעורבבת כפי שתואר לעיל מיד לפני השימוש. הטיט מטפטף על ארבע הפינות סביב תא התרבית ומפזר בעדינות סביב נקודת הקישור של הממברנה עם קצה הפיפטה בזווית. קצה אחד של הממברנה מונח על הטיט, ואז, לאחר מיושר עם תא התרבות, נותנים לו בעדינות להיכנס למקומו. המלט מוחל מחדש בטפטוף ונצבע על קצוות הממברנה בזהירות רבה כדי לא לאפשר לסיליקון לגעת במשטח הממברנה בתוך אזור התרבית. ממברנות קשורות לחצי שבב מונחות מיד בתא ואקום כדי להסיר מיקרובועות, להבטיח חדירת סיליקון לפני השטח ולנקבוביות, ולהסיר טולואן כדי למזער התקפה כימית על הממברנה. נוצר ב-BioRender. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3. דוגמאות למיקום ממברנה. (א) מיקום מוצלח של הממברנה, התייבשות ב-RT. (ב) קשירת ממברנה בתנור (65°C במקום ב-RT), ניתן לראות שהממברנה התרחבה לתוך התא כאשר הסיליקון התכווץ לאחר החימום. (ג) שבבים שלמים עם מיקום נכון של ממברנת PET ו-PC. (ד) מיקום לא נכון של הממברנה יגרום לנפח של כל צד של השבב להשתנות עם תנועת הממברנה, מה שיגרום לזרימה משתנה, ומפעיל לחץ על התאים בתוך השבב וכן על המשאבות המחוברות לשבב. נוצר ב-BioRender. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4. תמונות מיקרוסקופ אור של ממברנות PET ו-PC חתוכות ומותקנות. מראים חדירת סיליקון לנקבוביות הממברנה כתוצאה מהתהליך שלנו עם ריפוי RT. (א) תמונות של אותה ממברנה ללא PDMS על הממברנה, ניתן לראות נקבוביות שקופות, וכן משטח נקי בתמונה המקוטבת. (B) טיט PDMS צופה באדום נילוס, וניתן לראות בסיליקון במג'נטה כמי שחלחל בהצלחה לנקבוביות וציפה דק את פני השטח תחת ואקום. מודגש בצורות לבנות/מג'נטה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5. הקיימות של התאים במכשירי השבב לא השתנתה על ידי בנייה עם או בלי טולואן כסוכן דילול במלט PDMS. תאי Calu-3 נזרעו ב-6.5 ×-104 תאים לשבב, ובהגיעו למפגש הם דוגרו במהלך הלילה לפני שבוצעה בדיקת AlamarBlue על הסופרנטנט ו-TrypanBlue על התאים. הבדלים בין קבוצות (n=4) שהוכנו עם ובלי טולואן נבדקו במבחן t של סטודנט לא מזווג, p > 0.05 = ns (לא מובהק)8. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-6
איור 6. שבבי ממברנה במרתף. (א) שלמות הממברנה נכשלה מאחר שמלט ה-PDMS/טולואן לא נשאב מספיק מהר; דבר זה פגע בחלבוני המטריקס והפריע לאטימת השבבים. (ב) אטימת הממברנה והשבב הצליחה, אך הממברנה נאטמה במצב רופף. (ג) אטימה מוצלחת של ממברנה ושבב, השבב פונקציונלי לזרימה ומתיחה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-7
איור 7. שתי תמונות של שבב ה-ECM תחת מתיחה. (א) שבב במנוחה. (ב) שבב מתחת למתיחה אופקית של 1.2 מ"מ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-8
איור 8. אלציאן בלו (גרעינים במג'נטה, ריר בכחול) צביעת תאי אפיתל קלו-3 הריאות האנושיים שגדלו בשבבים לאחר חשיפת אוויר במכשיר. תאי Calu-3 גודלו עד למפגש וגודלו במשך 10 ימים בקצב זרימה רציפה של 150 מיקרוליטר/שעה בתא הבסיסי וחשופים במידה בינונית או באוויר מהצד האפיקלי. הזרימה הופקה באמצעות משאבה פריסטלטית בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2. בסיום הגידול, הממברנות הוסרו וצבעו. מבט רוחבי על צביעת אלציאן בלו של תאי Calu-3 שגדלו במשך 10 ימים מתחת למים (A) וחשופים לאוויר (B)8. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-9
איור 9. הדמיה של תאי אפיתל אנושיים ראשוניים ופיברובלסטים בתרבות ממושכת בתוך המכשיר. פיברובלסטים של דרכי הנשימה הוזרעו לתוך המכשיר והורשו להיצמד למשך הלילה לפני שהפכו את המכשיר וזרעו תאי אפיתל בצד השני של הממברנה. התאים גדלו למתח, נחשפו לאוויר ותרבתו במשך 21 ימים בקצב זרימה רציף של 150 מיקרוליטר/שעה, שנוצר במשאבה פריסטלטית בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. הממברנות הוסרו לאחר התרבות, קיבעו, הוטבעו והורכבו על שקופיות לפני הצביעה. תאי אפיתל צובעו עבור Mucin 5AC (MUC5AC)18, רכיב בריריה, וחלבון forkhead box J1 (FOXJ1)19, גורם שעתוק המעורב באיתות לייצור ריסים. פיברובלסטים צולמו באגלוטינין של נבט חיטה (WGA) כדי להמחיש את שכבות הפוספוליפידים התאיות. התאים דוגרו ב-5 מיקרוגרם/מ"ל ב-HBSS למשך 15 דקות ונשטפו שלוש פעמים עם PBS לפני ההדמיה. כל גרעיני התאים הוצגו באמצעות DAPI. (A) תצוגת חתך רוחב: נוצרת מהקרנת Z-stack של תמונות של (B) ו -(C). (ב) צביעת אפיתל MUC5AC/FOXJ1/DAPI על ממברנת שבב. (ג) מבנה חיצוני מלא של שכבת הפיברובלסטים בתא הבסיסי8. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-10
איור 10. חיוניות תאים וקוקולטורה על פיגום ממברנת הבסיס. (א) חיוניות חיים/מתים של תאי HaCaT שזרעו בצד האפיתליאלי, נבדקו 3 דגימות בלתי תלויות, ונאספו 3 שדות אקראיים מכל דגימה (n = 3). בוצע מבחן ANOVA חד-כיווני רגיל עם תיקון טוקי. הגרף מציג את הממוצע עם סטיית תקן. קוקולטורה של (B) תאי HaCaT בצד האפיתל ו-(C) פיברובלסטים ריאתיים MRC-5 בצד הסטרומלי של הפיגום המכיל ממברנת הבסיס מוקף בסיבי קולגן, מוטות הקשקשים הם 50 מיקרומטר. (D) תצוגה תלת-ממדית של הקוקולטורה ממבט איזומטרי למעלה ולמטה, פסי הסולם הם 100 מיקרון, הדמיה מונפשת ניתן למצוא באיור משלים 4. (ה) עובי הפיגום של ממברנת הבסיס לפני ואחרי דה-סלולריזציה, נמדדו 14 ריריות, ומתוכם נלקחו 6 (המיוצגים במשולשים) לדה-סלולריזציה. בכל אחת מהדגימות נסרקו שלושה שדות אקראיים ולפחות 10 נקודות לכל שדה נמדדולפי מידה 17. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1. עיצובי תבנית שבב לחלקים העליונים והתחתונים של שבב PET/PC הסטנדרטי. (א) תמונה של התבנית התחתונה של השבב שניתן לייצר מה-. STL בקובץ משלים 1. (ב) תמונה של התבנית העליונה של השבב שניתן לייצר מה-. STL בקובץ המשלים 2. (ג) תמונה של שבלונה הממברנה לחיתוך ממברנות לשבב שניתן לייצר מה-. STL בקובץ המשלים 3. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2. עיצובים של תבנית שבב לחלקים העליון והתחתון של שבב ממברנת ECM מתוח. (א) תמונה של התבנית התחתונה של השבב שניתן לייצר מה-. STL בתיק המשלים 4. (ב) תמונה של התבנית העליונה של השבב שניתן לייצר מה-. STL בקובץ המשלים 5. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3. אימות תהליך האיטום: השוואת חדירת PDMS לנקבוביות ללא טולואן להורדת צמיגות המלט והתקשות ב-RT ללא ואקום. כל התנאים הם באמצעות ממברנות PET (נקבוביות 0.4 מיקרון), לאחר טיפול ב-PDMS (ניל אדום 1%), הממברנות הוטבעו בפרפין לפני ההרכבה ודימות מיקרוסקופ אור. (א) PDMS לא מדולל שואב על ממברנת PET. שכבה עבה של PDMS נראית על פני הממברנה, בעוד שלא נצפה PDMS שנכנס לנקבוביות (מודגשים בקופסאות לבנות). (ב) טיט PDMS מדולל שנשאב על ממברנת PET. שכבת PDMS נראית על פני הממברנה, בעוד שלא נמצא PDMS שנכנס לנקבוביות (מודגשים בקופסאות לבנות). (ג) טיט PDMS מדולל שנשאב על ממברנת PET. שכבה דקה של PDMS נראית על פני הממברנה וכן חדירה לנקבוביות לאורך הממברנה (מודגשות בקופסאות לבנות). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 4. 3D המחשה של תאי HaCat (אפיתליאלי) ו-MRC-5 (סטרומליים) בקו-קולטורה על פיגום ECM של חזיר. תצוגה תלת-ממדית מונפשת של הקוקולטורה מתצוגות איזומטריות למעלה ולמטה, שתמונותיה נראות באיור 10D, פסי קנה מידה בגודל 100 מיקרון. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

קובץ משלים 1. 3D. קובץ STL של התבנית התחתונה. ניתן להשתמש בתבנית לייצור החצי התחתון של השבב הסטנדרטי באמצעות הדפסת תלת-ממד או שיטת ייצור מקבילה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 2. 3D. קובץ STL של התבנית העליונה. ניתן להשתמש בתבנית לייצור החצי העליון של השבב הסטנדרטי באמצעות הדפסה תלת-ממדית או שיטת ייצור מקבילה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 3. 3D. קובץ STL של שבלונה הממברנה. השבלונה יכולה לשמש לייצור ממברנות בגודל הנכון לשבב המסופק, וניתן לייצר אותה בהדפסה תלת-ממדית או בשיטת ייצור מקבילה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 4. 3D. קובץ STL של התבנית התחתונה של שבב המתיחה. ניתן להשתמש בתבנית לייצור החצי התחתון של שבב המתיחה באמצעות הדפסה תלת-ממדית או שיטת ייצור מקבילה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 5. 3D. קובץ STL של התבנית העליונה של שבב המתיחה. ניתן להשתמש בתבנית לייצור החלק העליון של שבב המתיחה באמצעות הדפסה תלת-ממדית או שיטת ייצור מקבילה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

פרוטוקול איטום השבבים שאנו מספקים כאן מייצג דרך חדשה לייצר אטמי שבב מסוג PDMS אטומים למים, המתאימים לתרבות ארוכת טווח תחת זרימה, ניתנים לייצור עם ציוד מוגבל, ואינם דורשים מיומנויות מיוחדות להתקרב. אנו מראים את ההליך לייצור וופרים שבבים עם ממברנות (PET, PC, ECM) המחוברות לפני השטח באמצעות טיט סיליקון, ומראים כי יישום מהיר של ואקום מקל על חדירת ה-PDMS אל הנקבוביות ועל פני השטח של ממברנות פלסטיק. אנו גם מראים שהשבבים המתקבלים אטומים היטב ויכולים לבצע מגוון רחב של יישומים בתרבית.

ישנן מספר דרכים שונות לגשת לקשר PDMS-פלסטיק, אסטרטגיית קישור נפוצה בשל התכונות המועילות לתרבות תאים של PDMS, כגון חדירות גזים או דפוסיות, ולממברנות פלסטיק לחיוניות תרבית התאים7. אלה כוללים הפעלה על פני השטח באמצעות פלזמה של O2 , טיפול בקורונה או אוזון, שמקל על יצירת קשרים קוולנטיים בין סיליקון לזכוכית20. אחרת, טכניקות הדבקה כימית המשתמשות באורגנוסילנים כמו APTES ((3-אמינופרופיל) טריאתוקסילן) או MPTMS ((3-מרקפטופרופיל)טרימתוקסילן) כדי לתפקד את פני השטח של שני החומרים על ידי הוספת קבוצות תגובתיות21. לחילופין, ניתן להדביק PDMS ותת-קרקעי פלסטיק בשיטת דבק הכוללת אפוקסי אודבקים אחרים. אנו מציגים היבריד בין הפעלה על פני השטח להדבקה כימית, עם שימוש בממברנות נקבוביות ווואקום ליצירת חיבור פיזי דרך הממברנה שניתן לקשור באמצעות הפעלת משטח פלזמה של O2 בלבד. על ידי דילול ה-PDMS עם טולואן, אנו מאפשרים את חדירת ה-PDMS דרך נקבוביות ממברנה תחת ריק, מה שמאפשר לקשור קוולנטית של ממברנות שונות דרך קשרי PDMS-PDMS בין חצאי השבב וממברנת הטיח. על ידי יצירת רשת סיליקון פיזית דרך נקבוביות אלו, אנו נמנעים מהצורך בטיפול כימי על פני השטח או בחום ולחץ שמספקת מכונת החרטה חמה, שלרוב מסייעת לטכניקות אלו23.

במחקר הנוכחי, מסופק שבב דו-תאי בקנה מידה גדול (קובץ משלים 1) שיכול לכלול מגוון פונקציות. שנית, שבב שמסוגל למתיחה אופקית מחזורית (קובץ משלים 2). מכשירים אלו פועלים כ-Airway-on-chip, בעוד שהדגם יכול לשמש גם כ-gut-on-chip, כפי שהוצגקודם 13. בעיקר, מדריך שלב אחר שלב מסופק עם מגוון אפשרויות שונות לייצור תבניות, הכנת ממברנה ובניית שבבים, שניתן ליישם על פלטפורמות שבב חדשניות נוספות בהתאם ליישום הרצוי של החוקרים. מומלץ להשתמש בתנור פלזמה O2 לאטימה הסופית. עם זאת, מכשיר פלזמה נייד או דחיסה ידנית עם מרגמה PDMS נצפה כמוצלח גם הוא בשלב24 זה. בפרוטוקול זה לתהליך האיטום הזה, מודגשים מכשולים מרכזיים ומפרטים בכל נקודה. אלה כוללים את האפשרות לצפות מראש את הממברנות, חשיבות השימוש המיידי במלט PDMS/טולואן, החשיבות שהמלט לא ייכנס לאזור הגידול, וכמה חשוב שהממברנה לא תזוז לאחר החיבור למלט.

שחזור של הליך האיטום הזה בוצע שוב ושוב על ידי חוקרים באמצעות פרוטוקול כתוב; רק ההבהרות הבאות נדרשו להצלחה באיטום בניסיון שני. עם הופעת דליפות במהלך בדיקות מאמץ או תרבית תאים מורחבת, ניתן לבחון מספר אפשרויות. ראשית, החוקר צריך לוודא שהטיט מיוצר טרי מנוזל PDMS שעדיין לא החל להתייבש ומעורבב היטב עם טולואן. הצמיגות הנמוכה של המלט היא מה שמאפשר שכבה דקה וחלקה שיכולה לזרום אל נקבוביות הממברנה כאשר האוויר נשאב. שנית, יש למרוח מספיק טיט כדי לכסות את כל החלק התחתון והחלק העליון של הממברנה, בעוד שכמות מופרזת תגרום לו לזרום לאזור התרבית תחת דחיסה, מעט מדי ישאיר רווחים שיספקו נתיב לדליפה בין-תאית. שלישית, הממברנות חייבות להיות שטוחות לפני ובמהלך ההצמדה. לבסוף, למרות המאמץ הידני הנדרש, השבבים חייבים להישאר ברובם נקיים מלכלוך כדי להבטיח הדבקה סופית מלאה, ולכן עבודה מהירה ונקייה היא חיונית.

בעוד שהראינו במאמר זה את ההצמדה של שלושה סוגים שונים של ממברנות נקבוביות, לא ניתן לחיזוי את תפקיד השיטה הזו עבור ממברנות אחרות. הסיבה לכך היא שעמידות כימית שונה לטולואן, כמו גם צפיפויות וגדלים אחרים של נקבוביות, משפיעות על תוצאת הליך האיטום הזה. עם זאת, אנו מציגים את קישור הממברנה הראשון המתוח במלואו מבוסס ECM, מה שמרמז על גמישות גבוהה של הפרוטוקול. עם זאת, עקביות ביצועי המתיחה לא נבדקה באופן אמין, שכן אזורים, איברים ומקורות שונים בבסיס יוצרים הבדלים מכניים. בנוסף, הכדאיות לתרבות תאים של ממברנות ECM גם היא נוטה להשתנות לאורך זמן, הן בתרבות והן באחסון19. למרות שההליך הזה עובד עבור ממברנות שונות ומערכות שבבים, הוא דורש צביעה ידנית של המלט כדי להיות יעילה, דבר שדורש מעט זמן יחסית אך יצליח יותר עם דגמים בקנה מידה גדול יותר כמו אלה שאנו מספקים. לבסוף, בעוד שתהליך קישור הממברנה דורש רק PDMS, טולואן, ממברנה ותא ואקום, האיטום הסופי של השבב תלוי ביישום פלזמה O2 , שאינה זמינה באופן אוניברסלי.

למרות המגבלות, הפרוטוקול שניתן הוא חדשני ואינו דורש מיומנות מיוחדת לגישה אליה. למיטב ידיעתנו, ייצור רשתות סיליקון דרך נקבוביות הממברנה באמצעות שאב אבק של טיט PDMS בעל צמיגות נמוכה הוא הראשון מסוגו. בניגוד לגשר כימי או מכני אחר בין החומרים השונים שמאחורי שבב פונקציונלי, פתרון זה אפשרי ברוב סביבות המעבדה.

גילויים

למחברים אין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קונסורציום Precision Medicine for More Oxygen (P4O2) וכן מימון מ-Stichting Proefdiervrij. תודתי העמוקה לאיזדורה קרגוליאק על הרעיון להשתמש בצבע נייל אדום, שכן הוא יתערבב עם ה-PDMS להמחשת רשתות הסיליקון, ולמרג'אן ריינדרס-לוינגה על החיתוך וההרכבה המוכשרים שלה של הממברנות. המחברים מביעים את תודתם העמוקה למחלקת ניתוח התרופות ולסאבת' ורפורטה על מתן גישה לתנור הפלזמה החמצני שלהם, התהליך לא היה מתאפשר בלעדיו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק רחב של 2 מ"לBD אמרלד307727
אגרוף ביופסיה 2 מ"מKAI רפואיBP-20F
קו התאים Calu-3ATCCHTB-55RRID:  CVCL_0609
HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס)גיבקו14170112
O2 תנור פלזמההאריק פלזמהPDC-002
ממברנות תרבית תאים חרוטות בעקבות PCipCELLCULTURE1000M25/620N403/47
ממברנות תרבית תאים חרוטות בעקבות PETipCELLCULTURE2000M23/610N403/47
פולידימתילסילוקסן/סילגארד 184 בסיס וסוכן ריפוי אלסטומר סיליקוןדאו קורנינגDOWC25100445
פולימתיל מתקרילט (8 מ"מ)קולטקלא זמין
שרף פוטופולימר סטנדרטי (אפור) (1 ק"ג)אלגולא זמין
טולואןמרק 1,08,325
תא ואקוםפישר-סיינטיפיק12080253

מקורות

  1. Ugodnikov, A., Persson, H., Simmons, C. A. Bridging barriers: advances and challenges in modeling biological barriers and measuring barrier integrity in organ-on-chip systems. Lab Chip. 24 (13), 3199-3225 (2024).
  2. Singer, M., Akhtar, A. With What Should We Replace Nonhuman Animals in Biomedical Research Protocols. AMA J Ethics. 26 (9), E701-E708 (2024).
  3. Reardon, S. Beyond lab animals. Science. 389 (6761), 676-679 (2025).
  4. Qiu, J., Li, J., Guo, Z., Zhang, Y., Nie, B., Qi, G., et al. 3D Printing of Individualized Microfluidic Chips with DLP-Based Printer. Materials (Basel). 16 (21), 6984(2023).
  5. Survey on reliability of microfluidics-based devices and components. , The Microfluidics Association. https://microfluidics-association.org (2025).
  6. Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. , (2022).
  7. Nahak, B. K., Mishra, A., Preetam, S., Tiwari, A. Advances in organ-on-a-chip materials and devices. ACS applied bio materials. 5 (8), 3576-3607 (2008).
  8. Rae, B., Vasse, G. F., Mosayebi, J., van den Berge, M., Pouwels, S. D., Heijink, I. H. Development of a Widely Accessible, Advanced Large-Scale Microfluidic Airway-on-Chip. Bioengineering (Basel). 12 (2), 182(2025).
  9. Nizamoglu, M., Joglekar, M. M., Almeida, C. R., Larsson Callerfelt, A. K., Dupin, I., et al. Innovative three-dimensional models for understanding mechanisms underlying lung diseases: powerful tools for translational research. Eur Respir Rev. 32 (169), 230042(2023).
  10. Piergiovanni, M., Leite, S. B., Corvi, R., Whelan, M. Standardisation needs for organ on chip devices. Lab Chip. 21 (15), 2857-2868 (2021).
  11. Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. 10, 958582(2022).
  12. Cameron, T. C., Randhawa, A., Grist, S. M., Bennet, T., Hua, J., Alde, L. G., et al. PDMS Organ-On-Chip Design and Fabrication: Strategies for Improving Fluidic Integration and Chip Robustness of Rapidly Prototyped Microfluidic In Vitro Models. Micromachines (Basel). 13 (10), 1573(2022).
  13. Rae, B., Bood, V., Dijk, H. J., Vasse, G. F., Melgert, B. N., Nagelkerke, A., et al. Interorgan Communication Between Lung and Colorectal Epithelial Cells Studied Using a Novel Multi-Organ-On-Chip System. Compr Physiol. 15 (5), e70051(2025).
  14. van der Helm, M. W., Odijk, M., Frimat, J. P., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C. T., van den Berg, A., et al. Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance. J Vis Exp. (127), e56334(2017).
  15. Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Mater Today Bio. , (2022).
  16. Nawroth, J. C., et al. Breathing on chip: Dynamic flow and stretch accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. Materials Today Bio. 21, 100713(2023).
  17. Ramirez, J. A., Estrada, S., Harmsen, M. C., Sharma, P. K. Development of an in vitro platform for epithelial-stromal interactions: A basement membrane-containing scaffold from decellularized porcine bladders. Matrix Biol Plus. 26, (2025).
  18. Bonser, L. R., Erle, D. J. Airway mucus and asthma: the role of MUC5AC and MUC5B. Journal of clinical medicine. 6 (12), 112(2017).
  19. Yu, X., et al. Foxj1 transcription factors are master regulators of the motile ciliogenic program. Nature genetics. 40 (12), 1445-1453 (2008).
  20. Lu, C. Surface modification of polyimide fibers for high-performance composite by using oxygen plasma and silane coupling agent treatment. Textile Research Journal. 92 (23-24), 4899-4911 (2022).
  21. Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. F. Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).
  22. Borók, A., Kristóf, L., Attila, B. PDMS bonding technologies for microfluidic applications: A review. Biosensors. 11 (8), 292(2021).
  23. Tang, L., Nae, Y. L. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab on a Chip. 10, 1274-1280 (2010).
  24. Young, A. T., et al. Simple design for membrane-free microphysiological systems to model the blood-tissue barriers. Organs-on-a-Chip. 5, 100032(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PDMS
הליך אטימת שבב-לממברנה מסיליקון נגיש לקישור גמיש ואמין
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.