מאמר שיטה

שיטת האינטראקציה של כרומטין DNA-DNA המקושר ל-RNA

DOI:

10.3791/70090

⸱

30 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללכידת אינטראקציות בין DNA-DNA כרומטין ל-RNA למיפוי ארגון הגנום התלת-ממדי הקשור ל-RNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת האינטראקציה של DNA-DNA עם כרומטין קשור ל-RNA (RDD) היא אסטרטגיה ממוקדת למיפוי אינטראקציות כרומטין המעוגנת על ידי RNA ספציפי. הוא מזהה בו-זמנית לוקוסי גנומיים הקשורים ל-RNA הרלוונטי ומפתור מגעים ארוכי טווח בין DNA-DNA בין לוקוסי אלו, ומאפשר הסקת ארגון מרחבי ויחסים רגולטוריים. ב-RDD, גשושי אנטיסנס ביוטיניליים המשלימים את ה-RNA המטרה משמשים להעשיר קומפלקסים של RNA-כרומטין. תאים מקושרים מוצלב, הכרומטין מתפצל ומתוקן בקצה, וביצוע קרבה קרבה באמצעות מקשר מתוכנן לחיבור קטעי DNA הסמוכים במרחב בתוך הקומפלקסים שנלכדו. מוצרי הליגציה מטוהרים, מומרים לספריות ריצוף, ומנותחים באמצעות רצף בתפוקה גבוהה ליצירת מפות אינטראקציה מעוגנות ב-RNA. RDD רלוונטי ל-RNA אנדוגני וכן ל-RNA חיצוני שמקורם במיקרואורגניזמים ווירוסים מדביקים את המארח, והוא תואם לסוגי תאים ותנאים ניסיוניים מגוונים. השיטה מספקת פרופילי מגע ברזולוציה גבוהה ספציפיים ללוקוס, המתאימים לניתוח זיווג מגביר-מקדם, ויסות לטווח ארוך וארכיטקטורת גנום תלת-ממדית הקשורה ל-RNA מקודד רגולטורי ולא-מקודד. על ידי שילוב העשרה ביוכימית עם קשירת קרבה וריצוף מהדור הבא, RDD מספק תהליך עבודה חזק וניתן לשחזור כדי לחשוף כיצד RNA מארגנים כרומטין ומשפיעים על ביטוי גנים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hi-C ו-ChIA-PET שינו מחקרים על ארגון הגנום התלת-ממדי (3D) על ידי המרת קרבה מרחבית בין קטעי כרומטין לצמתים קוולנטיים של DNA שניתן לרצפם כדי להסיק מגעים פיזיים בקנה מידה מלולאות לתא 1,2. מעבר לחלבונים, RNA רבים משתתפים באינטראקציות כרומטין, המשפיעים על תקשורת בין מגביר/מדכא-מקדם וארגון כרומטין מסדר גבוה3; עם זאת, למרות התקדמות בבדיקות מעוגנות חלבון, עדיין קשה לקבוע ישירות כיצד RNA מסוים מארגן אינטראקציות DNA-DNA ארוכות טווח בין הלוקסים הקשורים שלו. המטרה הכוללת של שיטת האינטראקציה בין כרומטין ל-DNA-DNA (RDD)4 היא ליצור מפות אינטראקציה כרומטיניות ברזולוציה גבוהה ומעוגנת על ידי RNA, המגלות כיצד מין RNA מוגדר מתקשר עם כרומטין ומתאם מגעים עם DNA בתוך שכונתו המקומית, מה שמאפשר הסקה מכנית על תקשורת מגביר/מדכא-מקדם וארכיטקטורת גנום מסדר גבוה המתמקדת ב-RNA5. מתודולוגית, RDD מעשיר קומפלקסים RNA-כרומטין מקושרים עם גשושי אנטיסנס ביוטיניליים נגד ה-RNA הרלוונטי, מבצע קשירת קרבה על קומפלקס עם מקשר מתוכנן לחיבור קטעי DNA סמוכים במרחב, ובונה ספריות ריצוף ליצירת פרופילי מגע ספציפיים ללוקוס המתאימים לניתוחים מונחי השערות בסוגי תאים ותנאים מגוונים, כולל הקשרים הכוללים RNA חיידקיים או ויראליים חיצוניים במארחים נגועים. תכונות אלו ממקמות את RDD כמקבילה המעוגן ב-RNA לשיטות קונפורמציה מוכרות, ומספקות מידע קשר ניתן לפרשנות ברזולוציות המתאימות לניתוח רגולטורי.

ההיגיון ב-RDD נובע ממגבלות של אסטרטגיות מיפוי RNA-כרומטין קיימות. שיטות לכידה ממוקדות כמו ChIRP-seq ו-CHART-seq מזהות תפוסה DNA כלל-גנומי של RNA יחיד, RNA אחד לכל פרדיגמת ה-DNA שמדווחת על קשר אך לא על מגעים פיזיים בין לוקוסים 6,7 המאוכלסים. בדיקות גלובליות, כולל GRID-seq ו-MARGI, התרחבו לכל ה-RNA לכל ה-DNA, תוך קטלג קרבת RNA-DNA בכל הגנום אך חסרות רזולוציה מפורשת של מגעי DNA-DNA בתוך קומפלקסים ממוקדי RNA 3,8. שיטות מולטי-פלקס כמו RD-SPRITE מדווחות על קו-לוקליזציה מסדר גבוה יותר בין RNA ולוקוסי DNA רבים ומעבירות היבטים של טופולוגיית גרעין9, אך האותות נשלטים בדרך כלל על ידי RNA בשפע, שיכולים להסתיר RNA רגולטורי בעלי שפע נמוך ולהגביל את העומק הממוקד עבור רשת אינטראקציה של RNA בודד. אסטרטגיות העשרה וקישור מבוססות חלבון או סימן, כמו ChIA-PET10, PLAC-seq11 ו-HiChIP12, מפות למעשה לולאות ממוקדות פקטורים אך אינן מעגנות אינטראקציות ל-RNA מוגדר ללא מודול לכידה ייעודי ל-RNA, ומשאירות את ממד ה-DNA-DNA המעוגן ב-RNA לא פתור. על ידי שילוב העשרה ביוכימית ממוקדת עם קשירת קרבה על קומפלקס, RDD לוכדת ישירות מגעים עם DNA בין מקטעי כרומטין המאוכלסים יחד עם ה-RNA הרלוונטי4, מגבירה רגישות וסגוליות ל-RNA בעלי שפע נמוך עד בינוני, ומייצרת מפות מגע ברזולוציה גבוהה, ספציפיות ללוקוס, המשלימות את שיטות הממוקדות תפוסה (ChIRP/CHART)6,7 ושיטות גלובליות ממוקדות קרבה (GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE)3, 8,9 תוך כדי מקביל רעיוני לאסטרטגיות קשירה מבוססות פקטורי חלבון (ChIA-PET/PLAC-seq/HiChIP)10,11,12. הקוראים צריכים לשקול RDD כאשר שאלה ביולוגית דורשת פתרון יחסים מרחביים בין לוקוסי כרומטין הקשורים במיוחד ל-RNA מטרה – במיוחד כאשר ה-RNA הזה משער שיגדיל, יגשר או יגביל אינטראקציות גנומיות ארוכות טווח כדי לכוון את השעתוק – או כאשר מעדיפים מטרות רגולטוריות פוטנציאליות מקבוצת הקישור של ה-RNA, תוך הבחנה בין מרכזים ישירים ממוקדי RNA לבין תפוסה משותפת בלבד, סימון רשתות מגביר/מדכא עבור RNA ספציפי, או מעקב אחר חיווט מחדש של מגעים מעוגנים ב-RNA בין הפרעות, שלבי התפתחות או זיהומים. בתרחישים כאלה, RDD מתמודד עם צורך לא מסופק על ידי מתן מידע על אינטראקציות DNA-DNA המעוגן ב-RNA עם רגישות, ספציפיות ורזולוציה הנדרשים למחקרים מכניים קפדניים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: בשיטת RDD זו, המערכת לדוגמה משתמשת בתאי Drosophila S2 וב-ncRNA של roX2 ו-7SK ; תגובות תגובה מפורטות בטבלה 1, הרכבי הבופר מופיעים בטבלה 2, פרטי המגיב ופרטי המכשירים נמצאים בחומרים . איור 1 מספק סקירה של הפרוטוקול ליצירת ספריות RDD. פרוצדורות הכוללות סיבוב (F8) משתמשות בפרמטרים הבאים: F8, 20 סל"ד, uu20 ו-UU30. לכל הבופרים המשמשים משלב 2 עד שלב 10, יש להוסיף טרי עם מעכב חלבון (PI) ומעכב RNase (RI, 0.05 U/μL).

עקרונות תכנון הגשושים: עבור RNA חדש שלא דווח, מסננים רצפים לא ספציפיים באמצעות כלי יישור (למשל, יישור דמוי BLAST) או UCSC BLAT, ואחריהם ביוטינילציה של 3′ של הגשושים הנבחרים. ל-RNA יעד חדש, רצפי עיצוב התואמים ל-RNA המטרה כדי לשמש כבקרות שליליות, שגם הם עברו ביוטינילציה של 3′. בקרת איכות כוללת תכנון פריימרים לשעתוק הפוך מול ה-RNA היעד לאימות שעתוק ופריימרים ממוקדי DNA גנומיים ל-qPCR להערכת זיהום; כוללים פריימרים המאתרים אתרי קישור גנומיים ואזורים שאינם קשורים להערכת ספציפיות הקשר. פרובים הקשורים ל-roX2 ו-7SK מוצגים בטבלה 1.

1. קצירת תאים וקישוריות כפולה

  1. תרבית תאי דרוזופילה S2 בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס. שאף לאסוף בסך הכל כ-3 על10 תאים . החזירו את התאים למדיום התרבית ישירות, ואחרי ספירת Trypan-blue, יש להוסיף 8 x 108 תאים לכל צינור צנטריפוגה קוני בגודל 50 מ"ל.
    1. מערבבים 2 מיקרוליטר תאים עם 8 מיקרוליטר DPBS, מוסיפים 10 מיקרו-ליטר של Trypan Blue, ואז טעינו על ההמוציטומטר לספירת תאים.
      הערה: תאי דרוזופילה S2 מוצגים כדוגמה. בדרך כלל, 8 x 10 תאיםבגודל 8 מתאימים לכ-40 מ"ל של נפח תרבית המעובד בצינור קוני אחד בגודל 50 מ"ל. משתמשים יכולים להתאים את תנאי התרבית ולקטוף כמויות התאים בהתאם לסוג התא ובשפע ה-RNA היעד.
  2. הוסף פורמלדהיד לריכוז סופי של 1% (w/v) וסובב בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    הערה: יש לבצע קיבוע בטמפרטורת התרבית או בטמפרטורת החדר (RT; 20-25°C). אלא אם צוין, סובב את המיקסר (F1, 12 סל"ד). לתאים דביקים, השתמשו בשייקר אורביטלי (50 סל"ד).
    אזהרה: פורמלדהיד הוא רעיל; תשתמש במכסה אדים.
  3. תאי כדור במשקל 845 x גרם למשך 5 דקות ב-RT; להשליך את הסופרנטנט לפסולת הכימית/ביולוגית המתאימה. כדור התאים מ-8 x 108 S2 הוא בדרך כלל בנפח של כ-1 ס"מ 3 .
  4. החזירו את הכדור בנפח 2 מ"מ EGS שהוכנו זה עתה לנפח כולל של 40 מ"ל ב-DPBS, וסובבו בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
    הערה: לפרק את EGS ב-DMSO ולהעביר ל-DPBS (ראו טבלה 2). EGS ב-DMSO מסוכן.
  5. הכיבוי על ידי הוספת 2 מ"ל של 2.5 מיליון גליצין (0.125 מ' סופי); סובב בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. פלט ב-845 x g למשך 5 דקות ב-RT; להשליך את הסופרנטנט לפסולת הכימית/ביולוגית המתאימה. שטוף כדור פעמיים עם 40 מ"ל DPBS מחומם מראש בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס.
  7. פלט ב-845 x g למשך 5 דקות. החזירו את כדור התא ל-10 מ"ל של DPBS וספרו את התאים. מספר התאים עשוי לרדת במהלך שלב הקישור, בדרך כלל בכ-30%.
  8. Aliquot 1 x 109 תאים לכל צינור של 50 מ"ל; כדור ב-845 x g למשך 5 דקות ב-RT; להשליך סופרנטנט. אחסן את הכדורים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.
    הערה: כל שלבי התגובה הבאים הם עבור ספריית RDD אחת.

2. ניתוק תאים וחדירות גרעינים

  1. קחו תאים 1 ×10 9 S2 כפול-מקושרים מהמקפיא בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. הפשרה על מים קרים למשך 30 דקות.
  2. להחזיר את התאים ל-50 מ"ל DPBS, לצנטריפוגה ב-845 x g למשך 5 דקות ב-RT ולזרוק את הסופרנטנט.
  3. ניתוק תאים: החזירו את כדור התא ל-20 מ"ל של בופר FA 0.1% (ללא טריטון X-100). סובב ב-RT במשך 15 דקות. בדיקה במיקרוסקופיה; התאימו את הזמן לפי סוג התא. פירוק מוצלח מסומן על ידי חדירות ממברנת הפלזמה ושחרור ציטופלזמי, כך שגרעינים הופכים לגלויים בקלות כמבנים מובחנים תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי (איור 2A).
  4. חדירות גרעינים: מוסיפים 1.8 מ"ל של 10% SDS (1% אחרון). סובב ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. צנטריפוגה ב-3,200 x g למשך 20 דקות ב-RT וזרקו את הסופרנטנט. בדיקה במיקרוסקופיה (איור 2B); התאימו את הזמן לפי סוג התא. הגרעינים נראים כהים יותר, דמויי וילון ממברנה, או חלקם מנותקים. חזור על זה עד שהליזיס מסתיים.
  5. שטיפת הגרעין: החזירו את הכדור ל-20 מ"ל בבופר ליזיס של 0.1% FA (ללא טריטון X-100), סובבו ב-RT למשך 10 דקות, ואז צנטריפוגה ב-3,200 x g למשך 20 דקות ב-RT, השליכו את הסופרנטנט, וסמנו את גודל כדורי הגרעין. אחסן את כדור הגרעינים בטמפרטורה של −80°C לשימוש מאוחר יותר.

3. פיצול הכרומטין

  1. החזירו את כדור הגרעינים ל-15 מ"ל של בופר פירוק FA 0.1% (עם טריטון X-100). עליקווט 1.5 מ"ל של מתלי הגרעין לכל מבחנה עגולה באורך 14 מ"ל, כדי למנוע בועות.
    1. סמן את גודל הכדור לפני הסוניקציה להשוואה וחזור על סוניקציה אם הכדור נשאר גדול לאחר הסוניקציה.
  2. סוניקט בעוצמה של 38% למשך 4.5 דקות, עם מחזורים של 30 שניות הפעלה / 30 שניות הפסקה. אסוף את כל הכרומטין הסוניקני לצינור וצנטריפוגה של 15 מ"ל ב-3,200 x g למשך 20 דקות ב-RT, ואז העבר את הסופרנטנט (~13 מ"ל) לצינור חדש של 15 מ"ל.

4. כרומטין פרקליר עם חרוזי C1

  1. הכינו חרוזי סטרפטווידין C1: 400 מיקרוליטר של חרוזי סטרפטווידין C1 לתוך צינור בנפח 1.5 מ"ל (100 מיקרוליטר ל-1 × 109 S2), הנח על מגנט למשך 30 שניות, והסר סופרנאנט. שטוף פעמיים עם 200 מיקרוליטר של בופר ליזיס של 0.1% FA (עם טריטון X-100), ואז תלייה מחדש ב-100 מיקרוליטר של בופר ליזיס של 0.1% FA (עם טריטון X-100).
  2. פרקליר כרומטין: הוסף את 100 מיקרוליטר של חרוזי סטרפטווידין C1 מוכנים לצינור המכיל ~13 מ"ל של סופרנטנט כרומטין סוניקייטד (משלב 3.2); סיבוב 20 דקות ב-RT; מניחים אותו על מתקן מגנטי למשך דקה והעבירו את הסופרנטנט (כרומטין נקי מראש) לצינורות חדשים בנפח 50 מ"ל; קחו 10 מיקרוליטר ואחסנו בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס עבור QC1 (איור 3A).

5. היברידיזציה של גלאי ה-RNA עם הכרומטין המאושר מראש

  1. הוסף 2 נפחים (26 מ"ל) של בופר היברידיזציה טרי לנפח אחד (13 מ"ל) של כרומטין מנוקה מראש; סיבוב 30 דקות ב-RT.
  2. מחלקים את התערובת לשלושה צינורות של 15 מ"ל; הוסף 6 מיקרוליטר של גשושי ביוטינילציה של 100 מיקרומום (אוליגונוקלאוטיד DNA, טבלה 1) לכל דגימה (2 מיקרוליטר לצינור של 15 מ"ל); סובב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. לאטום את פקקי הצינור עם סרט.

6. קיבוע גלאי - קומפלקס כרומטין על חרוזי C1

  1. בלום חרוזי סטרפטווידין C1 עם בופר חסימה: קחו 400 מיקרוליטר של חרוזי סטרפטווידין C1 טריים ושטפו פעמיים עם 800 מיקרוליטר של בופר ליזיס של 0.1% FA (ללא טריטון X-100); הוסיפו 400 מיקרוליטר של בופר חוסם ודגרו על מערבל (F8) למשך 30 דקות ב-RT. הניחו אותו על מגנט ל-10 דקות והשליכו את הסופרנטנט; שטוף שלוש פעמים עם 800 מיקרוליטר של בופר ליזיס של 0.1% FA (ללא Triton X-100). בכל שטיפה, יש פיפטה עדינה לערבוב, להניח על המגנט לפחות 30 שניות, ואז להשליך את הסופרנטנט.
  2. החזירו את חרוזי ה-C1 ל-400 מיקרוליטר של בופר היברידיזציה.
  3. הקישו את קומפלקס הפרוב-כרומטין בחרוזי סטרפטווידין C1: הוסיפו את חרוזי סטרפטווידין C1 שטופלו בבופר חסימה לכרומטין ההיברידי המתאים וסובבו במשך 2.5 שעות ב-RT.
  4. העבר את תגובת הקיבוע מצינורות של 15 מ"ל לצינור של 1.5 מ"ל באמצעות מתקן מגנטי. הניחו כל צינור בנפח 15 מ"ל על מתקן מגנטי למשך 5 דקות; הסר את הסופרנטנט. תלה מחדש חרוזים עם 1 מ"ל של בופר ווש והעבר לצינור חדש של 1.5 מ"ל.
  5. שטוף את החרוזים חמש פעמים עם 800 מיקרוליטר של בופר ווש, ואז פעמיים עם בופר TE. לכביסה, מוסיפים בופר, דגרו על מיקסר (F1, 12 סל"ד) במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הניחו על מתקן מגנטי למשך 30 שניות, והשליכו את הסופרנטנט.
  6. החזק את החרוזים ב-1,000 מיקרוליטר של בופר TE (1x PI) ב-RT.

7. חסימת אתרים פנויים בחרוזי C1 באמצעות יודואצטיל-PEG2-ביוטין (IPB) מנותק

  1. המיס 4.8 מ"ג IPB ב-400 מיקרוליטר של בופר שטיפת IPB; סובב ב-RT ל-15 דקות.
  2. פתרון β-ME: מוסיפים 1 מיקרוליטר של β-ME ל-312 מיקרו-ליטר של H₂O; מערבב וסובב ב-RT במשך 15 דקות.
  3. Denature IPB: הוספת 44 מיקרו-ליטר מתמיסת β-ME ל-400 מיקרו-ליטר IPB; מערבב וסובב ב-RT במשך 15 דקות.
  4. חסום חרוזי C1: הוסף 220 מיקרו-ליטר מ-IPB המנוטר לחרוזי C1 הקשורים למורכב הפרוב-כרומטין (ב-1,000 מיקרוליטר TE); סובב ב-RT ל-15 דקות.
  5. שטוף את חרוזי ה-C1 עם TE חמש פעמים. הוסיפו בופר, דגרו על מיקסר (F8) במשך 5 דקות ב-RT, ואז מניחים על מתקן מגנטי למשך 30 שניות, וזרוק את הסופרנטנט.

8. תיקון קצה כרומטין (על חרוזים)

  1. הוסיפו 693 מיקרולטר של תערובת תיקון קצה לכרומטין שבחרוזי C1 וערבבו היטב; לאחר מכן מוסיפים 7 מיקרוליטר של T4 DNA פולימראז.
  2. דגרו על תרמומיקסר (800 סל"ד) בטמפרטורה של 12 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; ואז על המיקסר (F8) בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  3. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 800 מיקרוליטר של בופר ChIA-PET קר, ואז פעם אחת עם TE. בכל שטיפה, יש פיפטה עדינה לערבוב, להניח על המגנט לפחות 30 שניות, ואז להשליך את הסופרנטנט.

9. זנב כרומטין A (על חרוזים)

  1. הוסיפו 693 מיקרוליטר של תערובת זנב A לכרומטין על חרוזי C1 וערבבו היטב, ואז מוסיפים 7 מיקרוליטר של קטע קלנו (3'-5' exo-).
  2. דגרו במיקסר (F1, 12 סל"ד) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 800 מיקרוליטר של בופר ChIA-PET קר כקרח, ואז פעם אחת עם בופר שחרור.

10. קשירת קרבה כרומטין (על חרוזים)

  1. הוסף 1,390 מיקרוליטר של תערובת קשירת קרבה לכרומטין על חרוזי C1. תדגר על המיקסר (F8) ב-RT למשך 5 דקות.
  2. לאחר מכן מוסיפים 10 מיקרוליטר של ליגז DNA מסוג T4. סובב את המיקסר (F8) ב-RT ל-5 דקות, ואז לעבור ל-F1 (12 סל"ד) ב-RT ל-50 דקות, ואחר כך ל-16 מעלות צלזיוס בלילה.
  3. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 800 מיקרוליטר של בופר ChIA-PET קר, ואז פעמיים עם בופר TE.

11. שחרור ה-DNA הכרומטין הקשור לקרבה מחרוזי C1

  1. הוסף 480 מיקרוליטר של בופר שחרור LC ChIP לכרומטין על חרוזי C1, ערבב היטב, והוסיף 20 מיקרוליטר של 20 מ"ג/מ"ל פרוטינאז K לצורך דה-קרסלינינג.
  2. דגרו על תרמומיקסר (950 סל"ד) בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.

12. טיהור DNA קשור לקרבה (עם פנול: כלורופורם: תגובות IAA)

  1. סובבו את צינור נעילת הפאזה בצפיפות גבוהה ב-13,500 x g למשך 2 דקות ב-RT. הוסף מוצרים מנותקים (500 מיקרוליטר) לצינור נעילת הפאזה בצפיפות גבוהה.
  2. הוסף 500 מיקרוליטר של פנול:כלורופורם:IAA (באמצעות קצה פיפטה של 5 מ"ל) לצינור נעילת הפאזה בצפיפות גבוהה. מערבבים בעדינות ביד.
    אזהרה: הופיעו עם קפוצ'ון אדים.
  3. צנטריפוגה ב-13,500 x g למשך 6 דקות ב-RT. במהלך הצנטריפוגה, יש להכין צינור בנפח 1.5 מ"ל על ידי הוספת 52 מיקרו-ליטר של אצטט נתרן 3M (pH 5.5) לתחתית. הנח 1 מיקרולטר גליקוגן עם צבע כחול על הכיסוי. אין לערבב או לסגור את הצינור בשלב זה.
  4. העבר במהירות את הסופרנטנט מצינור נעילת הפאזה בצפיפות גבוהה לצינור ה-1.5 מ"ל המוכן.
  5. הוסיפו 520 מיקרוליטר איזופרופנול קר לקרח לצינור בנפח 1.5 מ"ל. מערבבים בעדינות, ואז מניחים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  6. הסר את הצינור מ-80°C והפשר ב-RT (~10 דקות). צנטריפוגה ב-13,500 x גרם למשך ~1 שעה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשיקוע DNA. כדור כחול יהיה בתחתית הצינור.
  7. שטפו את כדור ה-DNA עם 75% אתנול והסירו בזהירות את הסופרנטנט. הוסף 800 מיקרוליטר של 75% אתנול קר, צנטריפוגה ב-13,500 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והסר את הסופרנטנט. חזור על שטיפת האתנול פעם אחת.
    זהירות: הסר את הסופרנטנט מיד לאחר הצנטריפוגה: תחילה עם קצה של 1 מ"ל, ואז עם קצה של 100 מיקרוליטר. צינורות חמים עלולים להזיז את הכדור הכחול.
  8. לאחר שטיפת האתנול האחרונה, יש צנטריפוגה ב-13,500 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף שאריות אתנול בתחתית, ואז להסיר בזהירות את שארית האתנול.
  9. ייבשו את כדור ה-DNA בוואקום (בדרך כלל דקה ו-30 עד 2 דקות). החזירו את כדור ה-DNA ל-10 מיקרו-ליטר של בופר שחרור ודגרו ב-RT למשך כ-2 שעות. כמת את ה-DNA באמצעות מדד חומצות גרעין והערכת איכות באמצעות מערכת אלקטרופורזה קפילרית אוטומטית (איור 3B-C).

13. תיוג DNA Tn5 קשור לקרבה

  1. בדיקת תיוג Tn5: הכינו נפח תגובה כולל של 50 מיקרוליטר לפי טבלה 1. בצינור PCR על קרח, מוסיפים ברצף 50 ng של DNA QC1, ddH₂O, ו-12.5 מיקרוליטר של בופר תייג 4x. לבסוף, הוסף את הכמות הנדרשת של אנזים Tn5. ערבבו בעדינות על ידי פיפיפטרינג למעלה ולמטה 10 עד 20 פעמים אחרי כל הוספה, כדי להימנע מבועות. סובב בקצרה את הצינור לפי הצורך.
    הערה: ערבוב עדין והימנעות מבועות הוא קריטי לתיוג. בנוסף, יש לאופטימיזציה אמפירית של כמות Tn5 כדי להשיג את התפלגות החלקים הרצויה (בעיקר 200 bp-1 kb), ומשתמשים יכולים להתאים את טווח הגודל על ידי כוונון קלט Tn5.
  2. תגובת תיוג: דגרו את התגובה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במכשיר PCR כאשר המכסה מוגדר ל-70 מעלות צלזיוס, ואז החזקו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. שחרור Tn5 וטיהור DNA: מוסיפים 50 מיקרוליטר של בופר ChIP Elution ו-1 מיקרוליטר פרוטינאז K ל-DNA המסומן (לריכוז סופי של SDS של 0.5%). ערבבו ודגרו על התרמומיקסר בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס ו-900 סל"ד למשך 30 דקות. לטהר את ה-DNA עם ערכת טיהור DNA וכימות DNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה קפילרית אוטומטית (איור 3D).
    הערה: בשלב זה, קטעי ה-DNA צריכים לנוע בעיקר בין 200 ל-1 קילו-בייל. יש לייעל את יחס האנזים ל-DNA בין Tn5 ל-DNA באופן אמפירי.
  4. הגדלת הגדלת תיוג Tn5: בהתבסס על תוצאות בדיקות Tn5, הגדלת התגובה ל-DNA קשור לקרבה באמצעות אותם תנאים. לאחר התיוג, מוציאים את הדגימה ממכשיר ה-PCR ומניחים אותה על קרח. סובבים לרגע, דגרו ב-RT למשך 2 דקות, ואז מוסיפים 5.5 מיקרוליטר של 10% SDS (בלי v; ריכוז SDS סופי: 1%). ערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 עד 20 פעמים, הימנעות מבועות, וסובב למטה לזמן קצר. דגמו דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במכשיר PCR למשך לפחות 15 דקות. DNA מסומן ניתן לאחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך מספר ימים.

14. חסימת חרוזי M280

  1. קח 20 מיקרוליטר של חרוזי M280 ושטוף פעמיים עם 200 מיקרוליטר של בופר שחור-לבן 1x. לשטיפה, הוסיפו בופר, החזירו את החרוזים על ידי פיפטינג, סובבו לזמן קצר, הניחו על מגנט למשך 30 שניות, והסרו את הסופרנאנט.
  2. חסימת חרוזים עם בופר חסימה: החזר את חרוזי ה-M280 ב-100 מיקרוליטר של בופר חסימה; סובב את המיקסר (F8) ב-RT למשך 45 דקות.
  3. שטיפת חרוזים: סובב לרגע למטה, הנח על מגנט למשך 10 דקות, וזרוק את הבופר החסימה. שטוף חרוזים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של בופר שחור-לבן כפול.
  4. חסימת חרוזים עם DNA גנומי: החזירו חרוזים ל-100 מיקרוליטר של 2x בופר שחור-לבן, מוסיפים 100 מיקרוליטר DNA גנומי שנגזר (~500 ng, 300-500 bp), ערבבו היטב, וסובבו על המיקסר (F8) ב-RT למשך 30 דקות.
  5. להשליך את תערובת ה-DNA הגנומית ולשטוף חרוזים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של בופר שחור-לבן 1x.

15. קיבוע DNA קשור על חרוזי M280

  1. קישור DNA קשור לחרוזי M280: זרוק 1x בופר שחור-לבן. הוסף את כל ה-DNA הקשור המקוטע לחרוזי M280, ערבב וסובב על המיקסר (F8) ב-RT למשך 45 דקות.
  2. סובב לרגע למטה, מניח את המגנט וזרוק את הסופרנטנט. חרוזי שטיפה חמש פעמים עם 500 מיקרוליטר של בופר שטיפה מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס; פעם אחת עם 500 מיקרוליטר של 1x שחור-לבן; ופעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 1x שחור-לבן. מניחים על מגנט למשך דקה, ערבבו בעדינות בתחתית הצינור, וזרקו את הסופרנטנט. הוסף 30 מיקרולטר של בופר שחרור לחרוזים (אל תערבב).
    1. לכביסה, מוסיפים בופר, דגרו 5 דקות על המיקסר (F8), הניחו על מגנט 30 שניות, ואז זרקו סופרנטנט. חרוזים עם DNA קשור יכולים להיאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

16. הגברה של DNA קשור על חרוזי M280

  1. הכינו תגובת PCR (לפי ערכת ההכנה של ספריית ה-DNA). העבר את צינורות ה-PCR למכונת ה-PCR והגדר את התוכנית.
    הערה: מחזורי הגברה של PCR הם קריטיים לאיכות הספרייה הסופית; הגדלת מספר המחזורים מפחיתה את מורכבות הספרייה. אופטימיזציה אמפירית של מספר המחזורים ובדרך כלל לא עולה על 15 מחזורים.
  2. מוצר Purify PCR באמצעות חרוזים מגנטיים (איור 3E). בחירת גודל: השתמש בחרוזים מגנטיים (0.8-0.61) כדי לבצע בחירה כפולה של ספריית RDD.
    1. ספריית ה-DNA הסופית צריכה לנוע בעיקר בין 250 ל-600 נקודות בסיס (איור 3F). ודא שנמדד 10-30 ng של DNA ספרייה באמצעות כמת חומצות גרעין לצורך ריצוף.
  3. רצף: נושא לריצוף Illumina עם 2x150 bp. עומק הריצוף תלוי בביטוי ה-RNA, בצפיפות באתר הקישור ובדפוסים הגנומיים הרחבים. כאן, roX2 רווי ב-~23M קריאות ו-7SK ב-~8M קריאות, כך שהאחרון צריך פחות עומק. התחל לפי מין, ואז העריך את העודף לעומק נוסף: ~5M לדרוזופילה, ~20M לאדם/עכבר, בהתאם למדדי בקרת איכות (QC).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט את שיטת RDD לזיהוי אינטראקציות DNA-DNA של כרומטין הקשור ל-RNA. תהליך העבודה מתחיל בהעשרה ביוכימית של קומפלקסים של RNA-כרומטין באמצעות גשושים ביוטיניליים, ולאחר מכן קשירת קרבה לקישור קטעי DNA סמוכים במרחב. לאחר בניית ספריות ריצוף, מתבצע ריצוף בתפוקה גבוהה.

ניתוח ביואינפורמטי של נתוני RDD מיועל על ידי פלטפורמת ChIA-PIPE13. השלבים המרכזיים בצינור האנליטי הזה כוללים: חיתוך קישורי רצף מקריאות גולמיות, מיפוי קריאות בקצה הזוגי לגנום ההתייחסות, סינון זוגות קריאה ממופים באופן ייחודי, הסרת כפילויות PCR, והקצאת אינטראקציות לאתרי RNA ממוקדים בהתבסס על קואורדינטות הגשושים. בדרך כלל, כ-50% מהקריאות הרציפות נשמרות בהצלחה לאחר סינון מקשר ואיכות. אירועי אינטראקציה תקפים אוגדו לאחר מכן ליצירת מפות מגע ספציפיות למוקדים, המספקות פרופילים מפורטים של ארכיטקטורת כרומטין מונחית RNA. לנתוני RDD, יישמנו שלושה התאמות ChIA-PIPE: רצף הקישור RDD ("ACGCGATATCTTATCTGACT") שימש במקום קישור ברירת המחדל ChIA-PET ("ACGCGATGGCTACTTGACTGACT"); קיבוץ הלולאות בוצע עם הארכת PET מקוצרת של 50 bp בנוסף ל-500 bp ברירת המחדל, כדי להגדיל את דיוק המיקום של אתרי אינטראקציה RNA; וכיסוי העשרת RNA חושב באמצעות deepTools (bamCoverage v3.5.1) באמצעות גודל מיכל של 1 bp. תצורת הקישורים של שינויים אלו, הפחתת הרחבת PET לאשכול עדין יותר, ו-ChIA-PIPE ברזולוציה גבוהה מותאמת לכיסוי עבור ספריות RDD.

איור 4 מציג תוצאות RDD מייצגות עבור שני RNA שאינם מקודדים: roX214 (איור 4A,C; ירוק), RNA קומפלקס פיצוי מינון המעורב בוויסות מבנה וביטוי גנים של כרומוזום X בדרוזופילה, ו-7SK15 (איור 4B,D; סגול), RNA גרעיני קטן שמור מאוד המווסת את הארכת השעתוק על ידי ויסות פעילות P-TEFb במטאזואנים. קישור RNA ואינטראקציות כרומטין שזוהו על ידי RDD מוצגים יחד עם נתוני RNAPII ChIA-PET (קשתות כחולות), המדגישים את הקשר המבני בין לולאות הקשורות ל-RNA לבין אלמנטים רגולטוריים מרכזיים כגון פרומטורים (P), משפרים (E) ואתרי התחלה או סיום שעתוק (TSS/TES). שיאי אינטראקציה בולטים בנתונים המצטברים תומכים במודל שבו גם roX2 וגם 7SK מתווכים מגעים קריטיים-מקדמים או מגעי כרומטין לטווח ארוך.

ניתוח רב-ממדי מושג על ידי שילוב אינטראקציות מעוגנות RDD עם מפות קונפורמציית כרומטין רחבי הגנום Hi-C (מפות חום אדומות בפאנל התחתון) וסימנים אפיגנומיים (H3K27ac, H3K27me3), שעתוק ראשוני (RNA-seq), ונתוני RNAPII ChIA-PET (איור 4C,D). באזורים אלו, תחומי אסוציאציה טופולוגית (TADs) מוצגים בבירור, כאשר לולאות כרומטין מונחות RNA ממוקמות לעיתים קרובות בגבולות TAD או משתרעות על פני מספר TADs. הערות נוספות עם שינוי היסטונים ונתוני שעתוק מאפשרים הבחנה בין אזורי כרומטין פעילים ולא פעילים. מרכזי רגולציה מרכזיים ממוקדי RNA מסומנים באיור.

דפוסים מובחנים מתגלים עבור ncRNA שונים. roX2 מאופיין בקישור באזורים TES ולולאה ל-TSSs, לעיתים קרובות ממוקם בגבולות TAD ויצירת מגעים לטווח ארוך שיכולים לעבור מספר TADs. לעומת זאת, 7SK נקשר בעיקר למגברים ויוצר לולאות קצרות טווח עם פרומטורים שכנים, בדרך כלל מבלי לחצות גבולות TAD.

ביחד, תוצאות אלו מאשרות ש-RDD הוא שיטה אמינה וברזולוציה גבוהה לפירוק ארגון כרומטין תלת-ממדי ספציפי ל-RNA. גישה זו מאפשרת חקירה ישירה של התפקידים המרחביים של RNA רגולטורי בארכיטקטורת הגנום ובביטוי גנים בהקשרים ביולוגיים מגוונים.

figure-results-1
איור 1: סכמטי של תהליך יצירת ספריות RDD. שלבי זרימת העבודה המרכזיים ליצירת ספריות RDD מוצגים ברצף ומלווים באיורים סכמטיים מתאימים. ההליך מתחיל בקישור כפול ותייג כרומטין, ואחריו היברידיזציה עם גלאי RNA מותאם לביוטין וקיבוע באמצעות סטרפטווידין. השלבים הבאים כוללים A-tailing, קשירת קרבה עם מקשרים שעברו עיבוד ביוטין, ובניית ספריות. לאחר קישור ה-DNA, מתבצעים טיהור, פיצול בתיווך Tn5, העשרת ביוטין והגברה בספרייה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של תאי דרוזופילה S2 המדגימות קריטריונים לבקרת איכות ויזואלית לליזת תאים וחדירות גרעינים. (א) ניתוק תאים מוצלח מאופיין בחדירות ממברנת הפלזמה ושחרור ציטופלזמי, מה שהופך את הגרעינים לגלוי בקלות. (B) חדירות גרעינים מוצלחת מתבצעת על ידי נפיחות תאים, ניתוק חלקי של ממברנת הפלזמה, וגרעינים שלמים ונראים בבירור. פס קנה מידה = 100 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

figure-results-3
איור 3: ניתוח אלקטרופרוגרם של הכנות כרומטין. צילום מסך של מערכת אלקטרופורזה קפילרית המפריילת דגימות כרומטין שונות. (א) מציג כרומטין מפורק (סוניקציה) בגודל הנע בין כ-1000 ל-3000 bp, מה שמעיד על פיצול מוצלח. (B) ממחיש כרומטין הקשור ל-RNA (גלאים קשורים ל-RNA + לא קשורים), עם פסגה קטנה יותר המייצגת גלאים לא קשורים, כפי שמציין החץ. (C) מציג כרומטין מקושר ל-RNA, שגם הוא מציג טווח ריכוז בין 1000 ל-3000 bp, המשקף קומפלקסים של RNA-חלבונים. (D) מציג כרומטין מתויג ב-Tn5, וחושף טווח המציין יעילות תיוג. (ה) מציג את התפלגות גודל הקטעים בספריית הריצוף לאחר ההגברה, המשתרעת על כ-180-1000 bp. (ו) מציג את התפלגות גודל הקטעים בספריית הרצף לאחר בחירת הגודל, כאשר הקטעים מועשרים בעיקר בטווח ~250-600 bp. ערכי RFU (יחידות פלואורסצנציה יחסיות) מוצגים עבור כל דגימה, ומדגימים כימות יעיל של שלמות וגודל הכרומטין. הפסגות הסגולות מייצגות את הסימן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: תוצאות מייצגות של RDD עבור אינטראקציות כרומטין הקשורות ל-ncRNA. (א-ב) מציג את מיקומי הגנום של הקשר ncRNA roX2 (ירוק) ו-7SK (סגול), יחד עם לולאות האינטראקציה הכרומטיניות המרוחקות המתאימות. נתונים מ-RNAPII ChIA-PET (כחול) מגלים קשר רגולטורי ברור בין ncRNA אלו לביטוי גנים, כאשר שיאים מצביעים על עוצמת אינטראקציה. קיצורים: TSS = אתר התחלת השעתוק; TES = אתר סיום השעתוק; P = מקדם; E = משפר. (C-D) מספק מבט מממד גבוה יותר על הקשר בין לולאות הכרומטין הקשורים ל-nRNA roX2 ו-7SK ו-TADs (אדום), וכן על הבדלים בין מצבי הכרומטין הפעיל והלא פעיל ורמות ביטוי הגנים. מעגלים מדגישים אזורים עם אינטראקציות משמעותיות בין ה-TADs. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1: תגובות תגובה RDD. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2: הרכבי בופר RDD. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים בשיטה
הערכת כמות חיישני ה-RNA ורמות ה-RNA המתאימות בכרומטין היא קריטית. גשושים עודפים עלולים לגרום לגשושים לא קשורים לתפוס אתרי סטרפטווידין במהלך שלב הקיבוע את הקיבוץ, מה שעלול להפריע ללכידה המיועדת של אינטראקציות RNA עם המטרה. בנוסף, הוספת יותר מדי סטרפטווידין מבזבזת חומרים ודורשת יותר IBP מנותק לחסימה יעילה של אתרים ריקים. חסימה לא מספקת עלולה להשפיע לרעה על יעילות קשירת הקרבה הבאה, במיוחד מכיוון שמקשר קרבה כולל גם שינויים בביוטין. אם החסימה לא מתבצעת כראוי, חלקים מהקישור עלולים להיקשר ישירות לחרוזי הסטרפטווידין, מה שמסבך את התוצאות. יתרה מזאת, יש להעריך בקפידה את היחס בין מקשר לכרומטין – כמות מופרזת של קישור עלולה לגרום לשני קצות DNA הכרומטין להיות מתויגות, מה שעלול למנוע קשירת קרבה יעילה.

שינויים בשיטה
במחקר זה, אנו ממחישים את שיטת ה-RDD באמצעות תאי Drosophila S2 עם ncRNA של roX2 כדוגמה. נפחי התגובה דורשים התאמה בהתאם לסוג התא ורמות הביטוי של ncRNA; אם ביטוי ncRNA גבוה, ניתן להפחית את כמות התא או להעלות את ריכוז גלאי ה-RNA, ולהפך. למרות שפרוטוקול זה משתק כרומטין על חרוזים, גישה חלופית כוללת ביצוע קשירת קרבה במקום ואחריו העשרה עם גשושי RNA.

ספציפיות, בקרות ובקרת איכות
תיארנו ואימתנו בעבר RDD וביצענו RDDs מקבילים על מספר RNAs, והראו ספציפיות חזקה; הקוראים יכולים לעיין ביצירה הקודמת 4,16. RDD דורש העשרה תלויה בבדיקה וספציפית ללוקוס, שניתן לשחזר וכאשר ניתן, מאומת באופן אורתוגוני. אינטראקציות אמיתיות עומדות בשלושה קריטריונים: העשרה באתרים ממוקדים על ידי הגשוש לעומת אזורים סמוכים שאינם קשורים; תלות בפרוב (חסרה או הופחתה משמעותית בבקרות שליליות); ויכולת שכפול בין שכפולים ביולוגיים ואימות עצמאי (למשל, RT-qPCR). גשושי אנטיסנס תוכננו עם Stellaris, נבדקו על ידי BLAST/BLAT להסרת מטרות לא מדויקות, הוזמנו עם 3'-ביוטין, ואומתו על ידי RT ו-qPCR (כולל בדיקות זיהום DNA והעשרה באתר לעומת לא-אתר). אנו ממליצים על שלושה ביקורים – ללא פרוב, סקרמבל/לא מיקוד, וגשואי RNA לא קשורים או אזורים שאינם קשורים – ומעריכים את הספציפיות על ידי השוואת qPCR או כיסוי ריצוף בין דגימות מטרה וביקורת, דיווח על העשרת קיפול ורקע. עבור RNA בעלי שפע נמוך, יש להגדיל את צפיפות הגשוש (במסגרת מגבלות מחוץ למטרה), להעלות את עומק הריצוף, ולבצע אימות אורתוגונלי.

פתרון תקלות בשיטה
אם אינטראקציות RNA-כרומטין שנלכדו נמוכות במיוחד, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה של יעילות הליגציה של קרבה באמצעות התאמות של כמויות מקשר וכרומטין. בנוסף, נצפו שיאים גבוהים של גשושים לא קשורים באמצעות אלקטרופרוגרמות קפילריות אוטומטיות. התוצאות מצביעות על כך שנוספו יותר מדי גששים, שניתן לתקן על ידי הפחתת כמות השימוש.

מגבלות השיטה
יתרון מרכזי של שיטת RDD הוא היעילות שלה בלכידת אינטראקציות ספציפיות עם כרומטין RNA, כלומר כל ניסוי יכול להתמקד רק ב-RNA ספציפי אחד בכל פעם. יתרה מזאת, מאחר שקשירת קרבה נועדה לזהות אינטראקציות זוגיות, לא ניתן להעריך אינטראקציות מרובות אתרים בו-זמנית.

חשיבות השיטה
שיטת RDD לא רק חושפת אתרי קישור RNA אלא גם מבהירה את יחסי האינטראקציה בין אותם אתרים, ומעשירה את הבנתנו את ארכיטקטורת הכרומטין.

שימושים מעשיים ופוטנציאל עתידי של RDD
RDD מתאים למגוון RNA הקשורים לכרומטין, כולל RNA מארח אנדוגני ו-RNA חיצוני מווירוסים או מיקרואורגניזמים אחרים, מה שמדגיש את יישומו הרחב בתחומי מחקר שונים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פטנט (פטנט סיני מס' ZL202210182253. X) הקשורה לטכנולוגיית RDD המתוארת בפרוטוקול זה אושרה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענקים מתוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2022YFC3400400 ו-2022YFC3400401) ומהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32170644).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 מיליון EDTAInvitrogenAM9260G
1 M מגנזיום אצטטסיגמא-אלדריץ'63052-100ML
1 מטר טריס-HCl pH 7.0InvitrogenAM9851
1 מטר טריס-HCl pH 8.0InvitrogenAM9856
צינורות בנפח 1.5 מ"לאפנדורף30108051
10 mM dATPInvitrogen18252015
10% SDS (משקל/נפח)InvitrogenAM9822
10× בופר זנב ANEBB7002S
10× בופר סופי לתיקוןNEBB6002S
10× בופר ליגאזות DNA של T4NEBB0202S
10× בופר TBEInvitrogenAM9863
מבחנות 14 מ"ל עם תחתית עגולהקורנינג352057
2× מיקס מאסטר PCRNEBM0541
20&00; בופר SSCInvitrogenAM9770
200-μ צינורות PCR Lסאנגון ביוטקF611541-0010
בקבוקי אחסון Square PET בנפח 250 מ"לקורנינג431531
2-מרקפטואנול (β-ME)סיגמא-אלדריץ'M6250-100mL! זהירות ו-ME רעיל; תמיד תשתמש בזה במכסה אדים.
צינורות 2 מ"לאפנדורף22431048
3 M נתרן אצטט pH 5.5InvitrogenAM9740
5 גברים NaCl InvitrogenAM9759
5 מ' אצטט אשלגןסיגמא-אלדריץ'95843-100ML-F
בקבוקי אחסון PET Square בנפח 500 מ"לקורנינג431532
איזון אנליטיסארטוריוסBP211D
מונה סלולרי אוטומטיקאונטרסטארIC1000
מערכת אלקטרופורזה קפילרית אוטומטיתביופטיקהC100100
גשושי ביוטינילציהג'נוויזעיין ב-טבלה 1
אבקת חוסםInvitrogenT2015
אוליגוס מקשר גשרג'נוויזעיין ב-טבלה 1
חממת CO2תרמו-סיינטיפיק51033549
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אלדריץ'D2650-100mL
ערכת הכנת ספריית DNA V2 עבור IlluminaואזימהTD501
ערכת טיהור DNAזימוD4013
דולבקו' s פספט מפופר מלח (DPBS) (1×)גיבקו14190250
קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTAרוש11836170001
EGS (אתילן גליקול ביס[succiniMidylsuccinate])תרמו-סיינטיפיק21565
בופר השטפהקיאגן19086
אלכוהול אתילי, טהורסיגמא-אלדריץ'E7023-500mL
תמיסת פורמלדהידסיגמא-אלדריץ'47608-250mL-F! אזהרה: פורמלדהיד הוא רעיל; תמיד תשתמש בזה במכסה אדים.
פורמידInvitrogenAM9342
מערכת הדמיית ג'לטנון3500R
גליציןInvitrogen50046-1 ק"ג
גליקוגן עם צבע כחולInvitrogenAM9516
מחסנית רגישות גבוההביופטיקהC105105
צינורות נעילת פאזה בצפיפות גבוהה (1.5 מ"ל)קיאגן129046
ערכת בדיקה פלואורומטרית של dsDNA ברגישות גבוההInvitrogenQ32851
ערכת אינדקס V2 ל-IlluminaואזימהTD202
יודואצטיל-PEG2-ביוטין (IPB)תרמו-סיינטיפיק21334
אלכוהול איזופרופילסיגמא-אלדריץ'I9030! אזהרה: אלכוהול איזופרופיל הוא רעיל; תמיד תשתמש בזה במכסה אדים.
מחסנית בסיס קילוביופטיקהC105106
קטע קלנואו (3'→ 5' exo-) NEBM0212L
חרוזים מגנטייםבקמןA63881
מתקן הפרדה מגנטית  לצינור 15 מ"לInvitrogen12301D
מתקן הפרדה מגנטית  לצינור בגודל 2 מ"לInvitrogen12321D
מתקן הפרדה מגנטית לצינור PCRNEBS1515S
חממה מיקרוביולוגיתתרמו-סיינטיפיקIMH180
מיקרוסקופניקוןאקליפס TS2
מיקסראלמיRM-2L
N,N-דימתילפורמיד (DMF)סיגמא-אלדריץ'227056-100ML! זהירות: DMF הוא רעיל; תמיד תשתמש בזה במכסה אדים.
מיקרוצנטריפוגה לא מקוררתאפנדורף5405000204
מים ללא נוקלאז (לא מטופלים ב-DEPC, 1000 מ"ל)InvitrogenAM9932
מים ללא נוקלאז (לא מטופלים ב-DEPC, 50 מ"ל)InvitrogenAM9937
כמת חומצות גרעיןInvitrogenQ33226
מתנער מסלוליקריסטלSYC-2102
פנול: כלורופורם:IAAסולרביולוגיהP1012-100mL
תמיסת פרוטאנאז KInvitrogenAM2548
צנטריפוגה מקוררתאפנדורף22628180
חממה מקוררתתרמו-סיינטיפיקIMP180
מיקרוצנטריפוגה מקוררתאפנדורף5404F1621754
מקררהיירDW-25L262
מעכב RNaseאמביוןAM2696
צינורות 15 מ"ל ללא RNaseInvitrogenAM12500
צינורות 50 מ"ל ללא RNaseInvitrogenAM12502
סוניקטורסוניקס & חומריםVCX130
חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין C1Invitrogen65001
חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין M-280 Invitrogen11205D
T4 DNA ליגאז NEBM0202S
פולימראז DNA של T4NEBM0203S
pH של מאגר TE 8.0InvitrogenAM9849
מחזור תרמיביו-ראד1851148
תרמומיקסראפנדורף5382000023
טריטון X-100אקרוס אורגניקס327371000-100 מ"ל
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחדתרמו-סיינטיפיק995
מרוכז ואקוםטומיMV-100

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  3. Li, X., et al. GRID-seq reveals the global RNA-chromatin interactome. Nat Biotechnol. 35 (10), 940-950 (2017).
  4. Tian, S. Z., et al. 3D chromatin structures associated with ncRNA roX2 for hyperactivation and coactivation across the entire X chromosome. Sci Adv. 10 (30), eado5716(2024).
  5. Rinn, J., Guttman, M. RNA and dynamic nuclear organization. Science. 345 (6202), 1240-1241 (2014).
  6. Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions. Mol Cell. 44 (4), 667-678 (2011).
  7. Simon, M. D., et al. The genomic binding sites of a noncoding RNA. Proc Natl Acad Sci. 108 (51), 20497-20502 (2011).
  8. Yan, Z., et al. Genome-wide colocalization of RNA-DNA interactions and fusion RNA pairs. Proc Natl Acad Sci. 116 (8), 3328-3337 (2019).
  9. Quinodoz, S. A., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 184 (23), 5775-5790 (2021).
  10. Li, X., et al. Long-read ChIA-PET for base-pair-resolution mapping of haplotype-specific chromatin interactions. Nat Protoc. 12 (5), 899-915 (2017).
  11. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  12. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nat Meth. 13 (11), 919-922 (2016).
  13. Lee, B., et al. ChIA-PIPE: A Fully Automated Pipeline for Comprehensive ChIA-PET Data Analysis and Visualization. Sci Adv. 6 (28), eaay2078(2020).
  14. Meller, V. H., et al. Ordered Assembly of roX RNAs into MSL Complexes on the Dosage-Compensated X Chromosome in Drosophila. Curr Biol. 10 (3), 136-143 (2000).
  15. Egloff, S., Studniarek, C., Kiss, T. 7SK small nuclear RNA, a multifunctional transcriptional regulatory RNA with gene-specific features. Transcription. 9 (2), 95-101 (2018).
  16. Tian, S. Z., et al. Landscape of the Epstein-Barr virus-host chromatin interactome and gene regulation. EMBO J. 44 (13), 3872-3915 (2025).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA

מאמרים קשורים