הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מטגנומיקה של DNA ויראלי בדגימות צואה אנושית

389 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70187

⸱

24 במרץ 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול גמיש ליצירת מטגנומים איכותיים של שבר בגודל ויראלי (וירומים) מדגימות צואה אנושיות. הפרוטוקול פותח במקור לווירומיקה בקרקע, וכאן יושם בהצלחה על דגימות צואה, מה שאפשר אפיון חזק של וירוספירת המעי האנושית.

תקציר

הבנת הווירוספירה האנושית הבריאה (הרכיב הוויראלי של המיקרוביום) דורשת מדידות מדויקות של הרכב קהילת הווירוסים במגוון רחב של סוגי ויראליים. בהתבסס על ניסיון קודם בשיטות אקולוגיה של קהילות וירוסיות קרקע, אנו מדגים כאן סדרת גישות מעבדה להעשרת והפקת DNA מווירוסי DNA חוץ-תאיים בדגימות צואה אנושית. מוצג פרוטוקול ראשי עובד, יחד עם אפשרויות לסטיות בשלבים שונים. הגישה הכללית כוללת הוספת בופר נוזלי (ברירת מחדל: מלח מפופר פוספט מוגבר בחלבון, PPBS) כדי להקל על הסרת חלקיקי ויראליים חופשיים ממטריצת הצואה, צנטריפוגה להפרדת החלק הנוזלי המכיל חלקיקי ויראליים, סינון (ברירת מחדל: 0.2 מיקרון) להסרת רוב התאים, ריכוז חלקיקי ויראליים (ברירת מחדל: אולטרה-צנטריפוגה), הסרת חומצות גרעין חופשיות עם נוקליאז לפני פירוק הוויריון, ואז חילוץ DNA לריצוף. טכניקות חלופיות, כולל מאגרים שונים, גדלי מסננים ושיטות ריכוז שונים, צוינו גם כן. בסך הכל, מוצעות מספר אפשרויות ליצירת DNA וירומי איכותי לריצוף. במקום להתאים את הגישה לציוד ומשאבים ספציפיים, הגמישות של הפרוטוקול צריכה להפוך אותו ליישום רחב במעבדות עם ציוד ביולוגיה מולקולרית סטנדרטי משתנה.

מבוא

וירומיקה, או ריצוף מטגנומי לא ממוקד של שיעור גודל הווירוס בקהילות מעורבות, יכול לספק תובנות לגבי הגיוון, האבולוציה והאקולוגיה של וירוסים לא מתורבתים. מאז המאמצים הראשונים לקטלג קהילות ויראליות במעי לפני למעלה מ-20 שנה, שהשתמשו במיוחד בשיטות שפותחו לדגימות סביבתיות כמו מי ים1, גישות וירומיקה ממשיכות לאפשר גילויים באקולוגיה ויראלית בתוךהמיקרוביום האנושי. עם זאת, אין פרוטוקול וירומיקס אוניברסלי אחד, והבדלים בטכניקות יכולים להשפיע על תוצאות הריצוף 3,4, ובסופו של דבר להשפיע על פרשנות דינמיקת קהילות ויראליות ולפגוע בהשוואות בין מחקרים. פרוטוקולים אופטימליים, בשילוב עם הבנה מעמיקה של האופן שבו בחירות מתודולוגיות מעצבות את פרופילי הווירומים, נדרשים כדי לאפיין בצורה חזקה את הווירוספירה האנושית.

למרות שאין פרוטוקול וירומיקה אוניברסלי, הבסיס הכללי של שיטות וירומיקה כולל הפרדה פיזית וריכוז של חלקיקים דמויי וירוס חוץ-תאיים (ויריונים) בהתאם לגודלם ו/או צפיפותם, הסרת חומצות גרעין חופשיות (שמקורן חלקית בפסולת תאית או קפסידים ויראליים פגועים) לפני פירוק הוויריון, והפקת DNA ו/או RNA לצורך ריצוף. חלק מהטכניקות הווירומיקס בוחרות בעד או נגד סוגי ויראליים מסוימים, בין אם כבחירה מכוונת של חוקרים או כמגבלה מתודולוגית לא מכוונת. סינון באמצעות מזרק או ואקום משמש לעיתים קרובות להסרת תאים מיקרוביאליים ופסולת אחרת, וגודל המסנן משפיע באופן מהותי על איכות והרכב הווירום שניתן לשחזר. לדוגמה, סינון יכול להעלות את טוהר הווירום5, אך עשוי להוציא חלקיקים ויראליים גדוליםיותר 6,7. שיטות ריכוז ויריון, כגון אולטרה צנטריפוגה, משקעים מפוליאתילן גליקול (PEG), אולטרה-צנטריפוגציה בגרדיאנט צפיפות ואולטר-פילטרציה, גם הן כוללות פשרות בין טוהר, תפוקה ועלויות ציוד 3,8. כימיות בופר מרובות ידועות כיעילות עבור וירומיקה. ייתכן שאין להן השפעות גדולות על אפיון הווירום9, אך בופרי אחסון והשעיה מחדש עדיין יכולים להשפיע על התאוששות הווירוס ועל פרופילי הווירום שנוצרו מניתוח ביואינפורמטי10,11. לבסוף, מאחר שריכוזי חומצות גרעין ויראליות יכולים להיות נמוכים בדגימות טבעיות, מחקרים רבים בוחרים להגביר DNA ויראלי לפני בניית ספרייה (למשל, באמצעות הגברה בתזוזה מרובה (MDA) או הגברה בלתי תלויה ברצף עם פריימר יחיד (SISPA)). עם זאת, חלק מהטכניקות הללו מציגות הטיה משמעותית12,13. בסך הכל, בעוד ששיטות וירומיקה רבות יכולות לייצר וירומים בהצלחה, פרוטוקולים מותאמים שמכירים בהטיות וסטנדרטיים במידה מסוימת יאפשרו מחקר וירום מדויק וניתן לשחזור.

מאמר זה מציג זרימת עבודה גמישה ליצירת וירומים מדגימות צואה אנושיות. מותאם מטכניקות וירומיקס קרקעמוכחות 14,15,16, פרוטוקול זה כולל מספר שלבים שמאפשרים שינוי, ומאפשרים לחוקרים להתאים אותו לציוד ולצרכי המחקר שלהם. שיטת הווירומיקה הסטנדרטית של הקרקע המתוארת להלן, המיושמת בהצלחה הן על דגימות קרקע והן על דגימות צואה קפואה, מייצרת וירומים איכותיים ללא שלב הגברת DNA ויראלי לפני בניית הספרייה. ההצעות לשינויים בפרוטוקול נבדקו במידה משתנה במחקרים אחרים, אך ההשפעות הספציפיות שלהן על רצפי וירום בצואה אנושית לא נבדקו כאן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנבדקים שגויסו לאיסוף דגימות צואה נתנו הסכמה מדעת. פרוטוקולי איסוף הדגימות אושרו על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, והמחקרים תואמים להצהרת הלסינקי. פרוטוקול זה מבוסס על אמרסון ואח' (2022)17.

1. הכנת חומרים

  1. הכינו תמיסת מלח מועשרה על ידי פוספט (PPBS, 10x PBS, 1% K-ציטראט, 150 mM MgSO4, 2% אלבומין סרום בקר (BSA))18.
    הערה: מאגרים נפוצים נוספים בפרוטוקולי וירומיקה הם מגנזיום מלח (SM)19 ובופר11 מתוקן של אשלגן-ציטראט פריים (AKC').
    1. הוסיפו 10 מ"ל 10x PBS, 10 גרם K-ציטראט, 18.05 גרם MgSO4 חסר מים לבקבוק זכוכית של 1 ליטר ומלאו עד 1 ליטר במים טהורים במיוחד במעבדה. כוון את ה-pH ל-6.5 (בדרך כלל דורש כ-50 מיקרוליטר של 6 M HCl או כ-100 מיקרוליטר של 2 M HCl). השאירו מוט ערבוב בתוך הבקבוק לשימוש בשלב 1.1.2.
    2. אוטוקלב את הבקבוק עם בופר ובקבוק זכוכית ריק בנפח 1 ליטר מזכוכית. לאחר האוטוקלב, לאחר שהבופר מתקרר לטמפרטורת החדר, מניחים אותו על צלחת ערבוב מגנטית ומוסיפים לאט לאט 20 גרם BSA ישירות לבקבוק, תוך הוספת כ-5 גרם BSA בכל פעם (כדי למנוע קצף, למזער ערבוב מוגזם של התמיסה, למשל להתחיל בקצב ערבוב איטי ולהגדיל בהדרגה).
    3. סנן את כל נפח הבופר דרך מסנן ואקום סטרילי של 0.22 מיקרון אל תוך בקבוק ריק של 1 ליטר מאוטוקלף משלב 1.1.2. אחסן את הבופר בטמפרטורה של 4°C עד השימוש.
      הערה: ניתן לאחסן את בופר PPBS בטמפרטורה של 4°C למשך כ-3 חודשים, אך אינו יציב לטווח ארוך כאשר הוא מאוחסן מעל נקודת האפסה.
  2. הכינו את צינורות הצנטריפוגה האולטרה-צנטריפוגה.
    הערה: פרוטוקול זה משתמש באולטרה-צנטריפוגציה כדי לרכז ויריונים. גישות נפוצות נוספות כוללות שקיעת פוליאתילן גליקול (PEG), אולטרה-צנטריפוגציה בגרדיאנט צפיפות (למשל, גרדיאנטים של כלוריד צזיום), ואולטרה-פילטרציה.
    1. כדי לנקות את צינורות הצנטריפוגות האולטרה-צנטריפוגות, תחילה שפשף את הצינורות באמצעות מים טהורים במיוחד במעבדה. לאחר מכן שטוף את הצינורות במי מעבדה טהורים במיוחד.
    2. מלאו את הצינורות ב-1 מיליון NaOH ותנו להשרות לפחות שעה (אפשר להשרות ללילה). נקה את הפקקים הפלסטיים/הגומי האולטרה-צנטריפוגה ואת טבעות ה-O שלהם על ידי טבילה ב-1 M NaOH.
      הערה: אל תטבלו את הפקקים העליונים עם הברגים המתכתיים ב-NaOH.
    3. לאחר השריה, שטוף שלוש פעמים במי מעבדה טהורים במיוחד, ואחר כך שטיפה אחת במים נטולי נוקלאז ובדרגת ביולוגיה מולקולרית. ייבשו את הצינורות על ידי הפיכה ונקישה עדינה, או תנו להם להתייבש לגמרי למשך הלילה. יש לסמן כל צינור אולטרה-צנטריפוגה עם מזהה דגימה.
  3. קרר מראש את רוטור האולטרה-צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על ידי השארת הרוטור במקרר או בחדר הקר ללילה.

2. טיהור וריכוז ויריונים

  1. שקלו את הצואה לצינור קונוסי סטרילי, DNase-, RNase ו-DNA בגודל 50 מ"ל.
    הערה: כמות הצואה שבה משתמשים עשויה להיות תלויה בכמות חומר הדגימה הזמינה. כאן השתמשו ב-2 גרם צואה. אם חומר דגימה לא מנוצל צריך לאחסן קפוא, שקול להפריט את כל הדגימה לפני ההקפאה כדי למזער מחזורי הקפאה והפשרה עתידיים.
  2. הוסף 8 מ"ל של בופר PPBS ישירות לצינורות הקוניים המכילים את הצואה (קוני #1). השעיה מחדש לחלוטין על ידי מערבולת (וורטקס).
  3. נער את הצינורות ב-300 סל"ד ב-4°C למשך 10 דקות.
    הערה: במידת הצורך, ניתן לבצע את הנער בטמפרטורת החדר, אך מומלץ לנער בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. דגימות צנטריפוגה בקונוס #1 בעומק 4,000 x גרם בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות.
    הערה: השתמש ברוטור דלי מתנדנד, אם אפשר, כדי להקל על הפרדת צפיפות אנכית ולהקל על הצעדים הבאים.
  5. דקאנט בזהירות את הסופרנטנט לקונוס חדש סטרילי של 50 מ"ל (קוני #2) ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (הסופרנאנט כאן מכיל את הוויריונים). אל תזרוק את הצינור הקוני שמכיל את הכדור (קוני #1), שכן הוא משמש שוב בשלב 2.6.
  6. חזור על השלבים 2.2-2.5 עוד פעמיים (כך שהדגימה בקוניקל #1 עברה סך הכל 3 פעמים השעיה מחדש עם בופר, 3 פעמים רעידה, ו-3 פעמים צנטריפוגה) והמשך לאגד את הסופרנטנט לקוניקל #2.
    הערה: שלושה כדורים אמורים לצבור ~24 מ"ל סופרנטנט בסך הכל.
  7. צנטריפוגה את הצינור הקוני בקוטר 50 מ"ל המכיל סופרנטנט מצטבר (קונוסי #2) למשך 8 דקות בעוצמה של 10,000 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  8. בצע סבב שני של צנטריפוגה. ראשית, דקאנט את הסופרנטנט מהקוניקל #2 לצינור קוני חדש בנפח 50 מ"ל (קוני #3). צנטריפוגה קונית #3 למשך 8 דקות בעוצמה של 10,000 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  9. באמצעות סינון במזרק, סנן את הסופרנטנט ברצף מהצינור הקוניקלי #3, תוך הימנעות מהפלט בתחתית הצינור. מסנן מקדים באמצעות מסנן מזרק סטרילי של 5.0 מיקרון פוליאתרסולפון (PES), ואחריו מסנן PES סטרילי של 0.20 מיקרון, ישירות לצינור אולטרה-צנטריפוגה.
    הערה: מטרת הסינון המוקדם עם מסנני 5.0 מיקרון היא להפחית סתימה של מסנני 0.20 מיקרון. ייתכן שעדיין יהיה צורך להשליך ולהחליף את מסנני המזרקים אם הם נסתמים. הסינון ניתן לבצע בשלב אחד על ידי ערימת מסנן 5 מיקרון מעל מסנן 0.20 מיקרון, מחובר למזרק יחיד, וישירות לצינור אולטרה-צנטריפוגה. ממברנות PES מועדפות, שכן חומרים ממברנתיים אחרים יכולים לשמור ויריונים (למשל, סיבי זכוכית) או להיסגר מהר יותר (למשל, פוליווינילידן פלואוריד, PVDF). 0.45 מיקרון הוא גודל פילטר נפוץ נוסף.
  10. בדוק את המסה של כל צינורות האולטרה-צנטריפוגה עם תכולת הדגימה שלהן, וחבר את הצינורות באולטרה-צנטריפוגה לפי מסה. אם יש צורך, להוסיף PPBS לצינור הקל יותר של כל זוג כדי לאזן את המשקל (בתוך טווח שגיאה של 0.05 גרם עבור צינורות זוגיים).
  11. אולטרה-צנטריפוגה בעוצמה 112,000 x g בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בוואקום למשך שעתיים ו-25 דקות.
    הערה: בהתאם לרוטור שבו משתמשים, משך הסיבוב ישתנה (בהתאם למקדם המשקעים = 58). עיין בטבלת החומרים של הרוטור שבו השתמשו כאן. לפני הסרת הצינורות מהאולטרה-צנטריפוגה, שימו לב לכיוון כל צינור ברוטור כדי לסייע באיתור הכדור הוויראלי. לפעמים, לאחר אולטרה-צנטריפוגה, הכדור הנגיפי אינו נראה, ויש לנקוט זהירות רבה בעת הסרת הסופרנטנט בשלב הבא.

3. השעיית כדורים ויראליים וטיפול ב-DNase

  1. הסר את הסופרנטנט, בין אם על ידי דקנטינג או שימוש בפיפטה, תוך היזהרות שלא להפריע לכדור, שיכול להיות שביר (הכדור מכיל את הוויריונים המרוכזים).
    הערה: כפי שצוין בשלב 2.11, הכדור עשוי להיות גלוי או לא, אך לעיתים קרובות ניתן לראות כדור חום או צהוב בגודל חור.
  2. טפל בדגימות ב-DNase.
    הערה: אם בוחרים לא לטפל בדגימות DNase, המשיכו לשלב 4 ופעל לפי "אם לא בוצע טיפול ב-DNase". עיין בדיון לשיקולים על ביצוע טיפול ב-DNase.
    1. החזירו את הכדור ל-100 מיקרו-ליטר מים נטולי נוקלאז, ברמת ביולוגיה מולקולרית, לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה מסומן בנפח 1.5 מ"ל.
    2. יש ליצור את תערובת הטיפול הראשית של DNase על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של בופר תגובה DNase ו-10 מיקרוליטר DNase לכל דגימה לטיפול. פיפטה לערבב היטב.
      הערה: הכינו מספיק תערובת ראשית לטיפול ב-DNase לתגובות נוספות כדי לקחת בחשבון פוטנציאל לאובדן נפח במהלך פיפטינג בשלב 3.2.3.
    3. הוסף 20 מיקרו ליטר של תערובת הטיפול הראשית של DNase לוויריונים התלויים מחדש. ערבב היטב על ידי פיפטינג עדין. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    4. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת עצירת DNase כדי לנטרל את הנוקליאזים. מערבולת קצרה.

4. חילוץ חומצות גרעין ויראליות

  1. בצע את חילוץ ה-DNA באמצעות ערכת חילוץ ה-DNA המופיעה בטבלת החומרים.
    הערה: בצע שני שינויים בהוראות היצרן. 1) לאחר שלב 1 בהליך הערכה, חממו את צינור החרוזים המכיל את הוויריונים בבופר CD1 בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז ממשיכים בהוצאה לפי הוראות היצרן. 2) במהלך שלב שחרור ה-DNA (שלב 16 בתהליך הערכה), דגרו את העמודות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לאחר הוספת C6.
    1. אם בוצע טיפול ב-DNase: לאחר שהנוקליאז הושבתה (בשלב 3.2.4), השתמשו בנפח כולו כקלט להפקת ה-DNA (כלומר, בשלב 1 של הליך ערכת חילוץ DNA, הוסף נפח זה לצינור החרוזים המכיל 800 מיקרוליטר CD1). תוודא לא להשאיר שום תמיסה מאחור (התמיסה הזו מכילה את הוויריונים).
    2. אם לא בוצע טיפול ב-DNase: הוסף 100 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז, בדרגה מולקולרית, לצינור האולטרה-צנטריפוגה המכיל את הכדור משלב 3.1. גרד בעדינות את הכדור ותשהה מחדש. השתמש בכדור התלוי מחדש כקלט להפקת DNA.

5. כימות DNA

  1. כמת את ה-DNA המופק באמצעות שיטת הפלואורסצנציה המועדפת.
    הערה: תפוקות DNA של וירום לעיתים נדירות גבוהות מספיק לכימות מבוסס ספיגה; עם זאת, זה עדיין יכול לסייע בזיהוי מזהמים כימיים.
  2. לאחסון קצר טווח, יש לאחסן DNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לאחר הכמות. לאחסון ארוך טווח, יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. ה-DNA מוכן כעת להכנה וריצוף בספרייה. עיין בטבלת החומרים עבור ערכת ההכנה לספרייה ולפלטפורמת הרצף שבה משתמשים כאן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מאמץ חקרני שהחלה פרוטוקול זה על דגימת צואה קפואה אחת (שעובדה בשלושה עותקים טכניים לוירומים) לצד שתי דגימות קרקע הוכיח את יעילותו בייצור וירומים איכותיים מסוגי דגימות שונים. באמצעות נתוני ריצוף מסוננים באיכות וקונטיגים מורכבים ב-de novo שנוצרו על ידי פרוטוקול זה, זוהו רצפי ויראליים משוערים באמצעות כלי זיהוי וירוסים בקוד פתוח20. קריאות שמופו לקונטיגים הוויראליים שזוהו שימשו כהערכה לשפע הווירוסי היחסי בכל מדגם. וירומי הצואה הועשרו ברצפים ויראליים, כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה וגמישה יחסית ליצירת וירומים. הוכח בקרקעות 14,15,16,21, והוא מיושם בהצלחה כאן על דגימות צואה אנושיות. פרוטוקול זה ישחזר בצורה הטובה ביותר וירוסי DNA חוץ-תאיים ושלמים, ואינו מיועד לשחזר בכוונה וירוסים תוך-תאיים או פרופאג' (אם כי חלקם עשויים להימצא מתאים מזהמים), וירוסי DNA גדולים מאוד או וירוסי RNA. יצירת חלקי תאים זוגיים או מטה-גנומים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

אנו מודים לד"ר שון אדמס, טרינה נוטס ומוחמד ר. עלי (אוניברסיטת קליפורניה, בית הספר לרפואה דייוויס) על איסוף ומתן דגימת הצואה בהתאם לפרוטוקולי IRB ולסטנדרטים אתיים. אנו מודים לד"ר מתיו ר. אולם (אוניברסיטת קולורדו, בולדר) על שיתוף הפעולה בניתוחי דגימת הצואה. מחקר זה נתמך על ידי קרן NIH Common Fund (תוכנית הווירום האנושי), פרס # U01DE034198. LSH זכה גם לתמיכה חלקית ממשרד האנרגיה של ארה"ב (DOE), משרד המדע, משרד המחקר הביולוגי והסביבתי (BER), תוכנית מדעי הגנום, מספר פרס DE-SC0023127 (מענק ל-JBE, מענק PI סידני גלאסמן).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אבקת DNase וללא פרוטאז לסרום בקר (BSA)פישר ביוריאגנטיםBP9706100למתכון PPBS (שלב 1.1)
ערכת DNeasy PowerSoil ProQIAGEN47016ערכת חילוץ DNA (שלב 4.1)
ערכת ספריית KAPA DNA HyperPrepרושלא זמיןהספריות שנוצרו על ידי ערכה זו סודרו באמצעות פלטפורמת Illumina NovaSeq 6000 (2 x 150 bp).
מגנזיום סולפט (MgSO4), חסר מים, ≥ 99.5%סיגמא-אלדריץ'M7506למתכון PPBS (שלב 1.1)
סליין ממוגן בפוספט (PBS), 10x, pH 7.4, ללא RNaseInvitrogenAM9624למתכון PPBS (שלב 1.1)
מסנני מזרק ממברנה של פוליאתרסולפון (PES), סטרילי, 28 מ"מ, 0.2 & mu; mקורנינג431229לסינון במזרק (שלב 2.9)
צינורות צנטריפוגה קונית פוליפרופילן, סטריליים, 50 מ"לאולימפוס פלסטיקס28-108
אשלגן ציטראט מונוהידרט (גביש/מוסמך)פישר כימיקלP222למתכון PPBS (שלב 1.1)
Qubit  צינורות בדיקהInvitrogenQ32856לכימות DNA (שלב 5.1)
פלואורומטר קיוביט 4InvitrogenQ33238לכימות DNA (שלב 5.1)
ערכות בדיקת כימות קיוביט dsDNAInvitrogenQ32850לכימות DNA (שלב 5.1)
RQ1 DNase ללא RNaseפרומגהPR-M6101כולל את מאגר התגובה, DNase ותמיסת עצירה
מסנני מזרק ממברנלית של פוליאתרסולפון הידרופילי (PES), סטרילי, 32 מ"מ, 5.00 ומיקרו; m ציטיבה (לשעבר Pall Lab)28150-956לסינון במזרק (שלב 2.9)
רוטור אולטרה-צנטריפוגה: רוטור Type 50.2 Ti עם זווית קבועה, 50,000 סל"ד, 302.000 x g, 12 x 39 מ'בקמן קולטר337901אנחנו גם משתמשים ברוטור טיטניום בזווית קבועה מסוג Beckman Coulter Type 70 Ti (קטגוריה 337922). צנטריפוגה ל-3 שעות אם משתמשים ב-70 Ti.
צינורות אולטרה-צנטריפוגה: בקבוק פוליקרבונט בנפח 26.3 מ"ל עם מכלול פקקים, 25 על 89 מ"מבקמן קולטר355618תואם לדיסק 50.2 Ti (קטגוריה 337901) ו-Type 70 Ti (קטגוריה 337922) של Beckman Coulter
אולטרה-צנטריפוגה: Beckman Instruments Optima LE-80K אולטרה-צנטריפוגה רצפתיתבקמן קולטר365668אנחנו גם משתמשים ב-Beckman Coulter L8-70M Recurgerated Ultracentrifuge (קטגוריה 344196)

מקורות

  1. Breitbart, M., et al. Metagenomic Analyses of an Uncultured Viral Community from Human Feces. J Bacteriol. 185 (20), 6220-6223 (2003).
  2. Liang, G., Bushman, F. D. The human virome: assembly, composition and host interactions. Nat Rev Microbiol. 19 (8), 514-527 (2021).
  3. Callanan, J., Stockdale, S. R., Shkoporov, A., Draper, L. A., Ross, R. P., Hill, C. Biases in Viral Metagenomics-Based Detection, Cataloguing and Quantification of Bacteriophage Genomes in Human Faeces, a Review. Microorganisms. 9 (3), 524(2021).
  4. Garmaeva, S., Sinha, T., Kurilshikov, A., Fu, J., Wijmenga, C., Zhernakova, A. Studying the gut virome in the metagenomic era: challenges and perspectives. BMC Biol. 17 (1), 84(2019).
  5. Lewandowska, D. W., et al. Optimization and validation of sample preparation for metagenomic sequencing of viruses in clinical samples. Microbiome. 5 (1), 94(2017).
  6. Conceição-Neto, N., et al. Modular approach to customise sample preparation procedures for viral metagenomics: a reproducible protocol for virome analysis. Sci Rep. 5 (1), 16532(2015).
  7. Palermo, C. N., Shea, D. W., Short, S. M. Analysis of Different Size Fractions Provides a More Complete Perspective of Viral Diversity in a Freshwater Embayment. Appl Environ Microbiol. 87 (11), e00197-e00221 (2021).
  8. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16 (1), 7(2015).
  9. Fudyma, J. D., et al. Exploring viral particle, soil, and extraction buffer physicochemical characteristics and their impacts on extractable viral communities. Soil Biol Biochem. 194, 109419(2024).
  10. Zhai, X., et al. The impact of storage buffer and storage conditions on fecal samples for bacteriophage infectivity and metavirome analyses. Microbiome. 11 (1), 193(2023).
  11. Trubl, G., Solonenko, N., Chittick, L., Solonenko, S. A., Rich, V. I., Sullivan, M. B. Optimization of viral resuspension methods for carbon-rich soils along a permafrost thaw gradient. PeerJ. 4, e1999(2016).
  12. Roux, S., et al. Towards quantitative viromics for both double-stranded and single-stranded DNA viruses. PeerJ. 4, e2777(2016).
  13. Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7668(2011).
  14. ter Horst, A. M., et al. Minnesota peat viromes reveal terrestrial and aquatic niche partitioning for local and global viral populations (vol 9, 233, 2021). Microbiome. 9 (1), (2021).
  15. Sorensen, J., Zinke, L., ter Horst, A., Santos-Medellín, C., Schroeder, A., Emerson, J. DNase Treatment Improves Viral Enrichment in Agricultural Soil Viromes. mSystems. 6 (5), e00614-e00621 (2021).
  16. Santos-Medellín, C., Estera-Molina, K., Yuan, M., Pett-Ridge, J., Firestone, M. K., Emerson, J. B. Spatial turnover of soil viral populations and genotypes overlain by cohesive responses to moisture in grasslands. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (45), e2209132119(2022).
  17. Emerson, J. B., Geonczy, S. E., Santos-Medellín, C., ter Horst, A. M., Fudyma, J. D. Soil Viromics Protocol - Emerson Lab v1. Protocols.io. , https://protocols.io/view/soil-viromics-protocol-emerson-lab-v1-b7nyrmfw/v1 (2022).
  18. Göller, P. C., Haro-Moreno, J. M., Rodriguez-Valera, F., Loessner, M. J., Gómez-Sanz, E. Uncovering a hidden diversity: optimized protocols for the extraction of dsDNA bacteriophages from soil. Microbiome. 8 (1), 17(2020).
  19. Larsen, F. SM buffer. , Protocols.io. https://www.protocols.io/view/sm-buffer-8epv5967jg1b/v1 (2021).
  20. Camargo, A. P., et al. Identification of mobile genetic elements with geNomad. Nat Biotechnol. , (2023).
  21. Santos-Medellín, C., Blazewicz, S. J., Pett-Ridge, J., Firestone, M. K., Emerson, J. B. Viral but not bacterial community successional patterns reflect extreme turnover shortly after rewetting dry soils. Nat Ecol Evol. 7 (11), 1809-1822 (2023).
  22. Halary, S., Temmam, S., Raoult, D., Desnues, C. Viral metagenomics: are we missing the giants. Curr Opin Microbiol. 31, 34-43 (2016).
  23. Williamson, S. J., et al. Metagenomic exploration of viruses throughout the Indian Ocean. PLoS One. 7 (10), e42047(2012).
  24. Liang, G., et al. The stepwise assembly of the neonatal virome is modulated by breastfeeding. Nature. 581 (7809), 470-474 (2020).
  25. Hillary, L. S., Knotts, T. A., Adams, S. H., Ali, M. R., Olm, M. R., Emerson, J. B. DNA extraction and virome processing methods strongly influence recovered human gut viral community characteristics. bioRxiv. , (2025).
  26. Santos-Medellín, C., Zinke, L. A., ter Horst, A. M., Gelardi, D. L., Parikh, S. J., Emerson, J. B. Viromes outperform total metagenomes in revealing the spatiotemporal patterns of agricultural soil viral communities. ISME J. 15 (7), 1956-1970 (2021).
  27. Gregory, A. C., Zablocki, O., Zayed, A. A., Howell, A., Bolduc, B., Sullivan, M. B. The Gut Virome Database Reveals Age-Dependent Patterns of Virome Diversity in the Human Gut. Cell Host Microbe. 28 (5), 724-740 (2020).
  28. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Methods. 7 (12), 943-944 (2010).
  29. Kosmopoulos, J. C., Klier, K. M., Langwig, M. V., Tran, P. Q., Anantharaman, K. Viromes vs. mixed community metagenomes: choice of method dictates interpretation of viral community ecology. Microbiome. 12 (1), 195(2024).
  30. Zhai, X., Gobbi, A., Kot, W., Krych, L., Nielsen, D. S., Deng, L. A single-stranded based library preparation method for virome characterization. Microbiome. 12 (1), 219(2024).
  31. Hillary, L. S., Adriaenssens, E. M., Jones, D. L., McDonald, J. E. RNA-viromics reveals diverse communities of soil RNA viruses with the potential to affect grassland ecosystems across multiple trophic levels. ISME Commun. 2, 34(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNAShotgun
מטגנומיקה של DNA ויראלי בדגימות צואה אנושית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.