מאמר מחקר

הקמת תרבויות ראשוניות מועשרות אזורים מקורטקס אדרנל העכברים

DOI:

10.3791/70403

⸱

8 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Endocrinology, Boston Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 3Harvard Stem Cell Institute, 4Institute of Biomedical Science, University of São Paulo, 5Broad Institute of MIT and Harvard

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פותחה גישה איתנה וניתנת לשחזור להקמת תרביות ראשוניות דו-ממדיות של תאי גלומרולוזה וזונה פאסיקולטה מועשרים לקורטקס האדרנל של העכבר. מערכת זו שומרת על תכונות מולקולריות ותפקודיות מרכזיות של כל אזור, ומאפשרת חקירה ממוקדת של מסלולי איתות, ייצור הורמונים והתנהגות תאי אדרנל קורטיקס מחוץ לחיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בלוטת האדרנל של העכבר מוקפת בשכבת תאים מזנכימלית (קפסולה) ומכילה קליפת מוח תחתית המאורגן לאזורים קונצנטריים מובחנים עם פונקציות אנדוקריניות מיוחדות: הזונה גלומרולוזה (zG), שמייצרת אלדוסטרון, וזונה פאסיקולטה (zF), שמייצרת קורטיקוסטרון. המדולה האדרנלית, הממוקמת במרכז הבלוטה, מייצרת קטכולאמינים. מחקרים מכניים של תאים מכל אזור אדרנוקורטיקלי הוגבלו בשל היעדר מודלים במבחנה השומרים על מאפיינים מולקולריים, תאיים ותפקודיים ספציפיים לאזור. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחה גישת פרקציה באמצעות מיקרודיסקציה של בלוטות יותרת הכליה של העכברים הבוגרים. שיטה זו מפרידה בין תאי יותרת הכליה מעכברים זכרים לחלק חיצוני מועשר ב-zG, הכולל תאי קפסולה ותאי zG, וחלק פנימי מועשר ב-zF (IF), המכיל zF ותאי מדולרי. שברים אלו שימשו ליצירת תרביות ראשוניות דו-ממדיות (2D) מועשירות לתאי zG או zF. ניתוח ביטוי גנים אישר כי התרביות המועשירות ב-zG מבטאות רמות גבוהות של סמנים של zG (Cyp11b2, Dab2 ו-Shh), יחד עם עלייה בסמני מסלול Wnt/β-catenin (Wnt4, Lef1). לעומת זאת, תרבויות מועשירות ב-zF הציגו ביטוי גבוה יותר של סמני zF (Cyp11b1 ו-Akr1b7) ורמות נמוכות יותר של סמני מסלול Wnt/β-catenin, בהתאם לחתימת שעתוק zF. ביטוי של סמנים סטרואידוגניים (Nr5a1, Star) אישר את המקור האדרנוקורטי של שני חלקי התא. טירוזין הידרוקסילאז מציין נוכחות של תאי אדונל מדולריה בתרביות מועשרות ב-zF. פונקציונלית, תרביות מועשירות ב-zG ייצרו אלדוסטרון בתנאים בסיסיים והראו ייצור מוגבר בתגובה לאנגיוטנסין II, אשלגן והורמון אדרנוקורטיקוטרופי (ACTH). לעומת זאת, תרביות מועשירות ב-zF ייצרו קורטיקוסטרון בתחילת הדרך והראו תפוקה מוגברת בתגובה לגירוי ACTH. בסך הכול, פרוטוקול זה מייצג מודל חוץ-גופי עמיד, ניתן לשחזור ורלוונטי ביולוגית לחקר ביולוגיית קורטקס יותרת הכליה. מערכת זו מאפשרת חקירה ספציפית לאזור של מסלולי איתות, מנגנונים מולקולריים ותגובות פיזיולוגיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קפסולה מזנכימלית דקה עוטפת את בלוטת יותרת הכליה של העכבר, המורכבת משני תאים עיקריים: הקורטקס החיצוני והמדולה הפנימית. קליפת יותרת הכליה של העכבר הבוגר מחולק לאזורים מובחנים: zona glomerulosa (zG) ו-zona fasciculata (zF), שלכל אחד מהם תכונות מורפולוגיות ותפקודיות ייחודיות 1,2,3,4. הפונקציה העיקרית של קליפת יותרת הכליה היא ייצור הורמוני סטרואידים, כולל מינרלוקורטיקואידים (אלדוסטרון) וגלוקוקורטיקואידים (קורטיקוסטרון בעכברים). ה-zG הוא האזור החיצוני והקומפקטי ביותר ומורכב מתאים אובואידים המאורגנים במבני רוזטה שמבטאים אלדוסטרון סינתאז (CYP11B2), מה שמאפשר ייצור אלדוסטרון 2,3,5,6,7. הפרשת אלדוסטרון מוסדרת בעיקר על ידי מערכת הרנין-אנגיוטנסין-אלדוסטרון (RAAS), אשלגן, ובמידה פחותה יותר ACTH 5,8. ה-zF מורכב מתאים גדולים יותר המסודרים בחוטי רדיאל/פאסיקלות, מהווה את רוב (~85%) הקורטקס, ומוסדר בעיקר על ידי ACTH 2,3,5,9. מסלולי איתות מרובים מתכננים התפתחות, תחזוקה ותפקוד בלוטות יותרת הכליה על ידי ויסות דינמיקת תאי האב, זונציה ופעילות סטרואידוגנית. מתוכם, SF-1 (פקטור סטרואידוגני-1, Nr5a1) הוא רגולטור ראשי חיוני להגדרת האדרנוקורטיקה, התרבות וייצור הורמונים10. איתות הקיפוד הסוניקי (Shh), הפעיל ב-zG, מקדם את התרחבות תאי הקדמון ותומך בחידוש הקורטיקה ב-zG 11,12,13.

איתות Wnt, במיוחד דרך מסלול הקנוני β-קטנין, הוא חיוני לאזור האדרנל ולשלמות הקורטיקה. בעכבר, גודל האדרנוקורטיקלי התקין והאזורים מווסתים על ידי גרדיאנט של פעילות איתות WNT המשתרע מהקפסולה ועד ל-zF. גרדיאנט זה נתמך על ידי ביטוי מקומי של ליגנדים ומחזקים של WNT, בעיקר WNT4 ב-zG, ו-WNT2B ו-R-spondins (RSPO1 ו/או RSPO3) בקפסולה 7,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . קליפת האדרנל נשמרת על ידי זרימת התאים הצנטריפטלית מתאי אב מתרבות הממוקמים באזור ה-zG התת-קפסולרי/החיצוני, ויוצרים תאי zG מובחנים הנודדים פנימה לכיוון ה-zF. כאשר התאים עוברים מה-zG ל-zF, הם עוברים שינויים בביטוי ובתפקוד הגנים הנקראים טרנס-דיפרנציאציה. מודל זה נתמך בחוזקה על ידי מחקרי מעקב שושלת באמצעות קו העכבר הטרנסגני ASCre/+, שמכוון במיוחד לתאים המייצרים אלדוסטרון ב-zG 23,24,25.

מספר גישות במבחנה שימשו לחקר ביולוגיית יותרת הכליה בהתבסס על פירוק כל בלוטת יותרת הכליה 26,27,28. לדוגמה, מחקר תיאר דיסוציאציה של קליפת יותרת הכליה בניתוחי אלקטרופיזיולוגיה וניתוחי פאץ'-קלאמפ27, ומחקר אחר השתמש בתאי קורטיקה אדרנליים מפורקים כדי לחקור מנגנוני איתות הקשורים לפיזיולוגיה של יותרת הכליה ולוויסות לחץ דם26. בעוד ששיטות אלו סיפקו תובנות פונקציונליות חשובות, הן מסתמכות על תאים מהכנות של כל האדרנל ולא על הפרדת אזורי הקורטקס לפני תרבית התאים.

בהינתן המורכבות והמגוון ההיסטולוגי של בלוטת יותרת הכליה, הבנת התפקידים הייחודיים של מחלקות התא שלה חיונית להבהרת המנגנונים שמאחורי תפקוד יותרת הכליה. במחקר זה, הוכחו תרביות תאי אדרנוקורטיקה ראשוניות של עכברים המועשרות לתאי zG או zF. יתרון מרכזי של שיטה זו הוא יצירת תרביות תאים מועשירות ב-zG, המאפשרת מודולציה ניסיונית של מסלולי איתות וגורמים סביבתיים כדי לחקור טוב יותר את תפקידה הספציפי בביולוגיה של קליפת יותרת הכליה. זה כולל חקר תחזוקת תאי האבות, המנגנונים שמאחורי הפלסטיות הזונלית וההתמיינות לכיוון ה-zF, ומידול הרכב המטריצות החוץ-תאי. במקביל, שיטה זו מייצרת תרביות תאי zF מועשרות מאוד, ומספקת פלטפורמה משלימה למחקרים פונקציונליים ואיתות ספציפיים לאזור. ביחד, תכונות אלו מספקות מערכת חזקה ומבוקרת ניסיונית לקידום ההבנה של ביולוגיית יותרת הכליה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים של בית החולים לילדים של בוסטון (IACUC) תחת מספר אישור 00002611. רשימה מלאה של כל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה, כולל מגבים, צרכנים וציוד, מסופקת בטבלת החומרים, יחד עם מספרי היצרנים והקטלוג המתאימים כדי להבטיח שחזוריות.

תרביות ראשוניות של תאי האדרנל גלומרולוזה וזונה פאסיקולטה של עכברים
השיטות ששימשו לקביעת תרביות ראשוניות של תאי אדרנוקורטיקה של זכרים בוגרים מסוג בר (Mus musculus, C57BL/6) במחקר זה הותאמו מהליך שפותח במקור עבור חולדות ספרג-דולי28. כדי לאשר את ההפרדה והזהות של אוכלוסיות תאי zona glomerulosa ו-zona fasciculata, נעשה שימוש במודל מעקב שושלת באמצעות עכברי Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+ (המכונים גם Cre) 1,2,3,4 ועכברי Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J (המכונים גם ROSAmT/mG)29.

הכנה לפני ההליך
חומרים
שתי קבוצות מלקחיים ומספריים לחתכים שטחיים ועוד סט לחתך בחלל הבטן (איור משלים 1A). חמם את מדיום הגידול ו-PBS (37 מעלות צלזיוס). הכנתי 2 מנות (P60) עם DMEM/F-12. הכנתי 3 מנות (P60) עם PBS מחומם לשטיפת הבלוטות ברצף (אמבטיה 1, 2 ו-3) (איורים משלימים 1B, 1–3), ומנה אחת לשמירת האדרנל בתמיסה (איורים משלימים 1B, 4). הוכנו 2 מנות (P60) עם נייר סינון סטרילי על פני השטח (איורים משלימים 1C, 1–2). הכנתי 2 מנות P60 עם 500 מיקרוליטר של תמיסת עיכול וסימנו אותן לגלומרולוזה (zG) או לפאסיקולטה (zF) (איורים משלימים 1D, zG, zF). הכנתי 2 צינורות, סומנו כ-zG ו-zF, והוספתי 4.5 מ"ל של תמיסת עיכול.

פתרונות
כדי להכין את תמיסת העיכול, קולגנאז סוג I (ריכוז סופי 4 מ"ג/מ"ל) ו-DNase I (ריכוז סופי 0.04 מ"ג/מ"ל) הומסו ב-5 מ"ל של מדיום DMEM/F-12 טהור. סיננתי את התמיסה לצינור של 50 מ"ל באמצעות מזרק ומסנן 0.22 מיקרומטר. תמיסת העיכול צריכה להיות מוכנה טרייה בכל פעם.

בעלי חיים
כדי לקבל תרביות ראשוניות מועשירות לתאי גלומרולוזה וזונה פאסיקולטה של האדרנל בעכברים, השתמשו ב-10–15 עכברים צעירים בוגרים זכרים, בגיל כ-6–7 שבועות. לנקבות יש בלוטות יותרת הכליה מעט גדולות יותר מזו של זכרים, וניתן להשתמש בשני המינים בפרוטוקול זה. עם זאת, במחקר זה, רק זכרים שימשו כדי למנוע הפרעות אפשריות מאזור ה-X הקיים אצל נקבות צעירות, ובכך להבטיח הפרדה אזורית מדויקת. עכברים הושמתו באמצעות שאיפת CO₂ בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים המוסדיים. המוות אושר על ידי היעדר נשימה וחוסר תגובה רפלקסית. בלוטות יותרת הכליה נותקו מיד, בתוך 3–5 דקות לאחר אישור המוות, כדי לשמור על חיוניות הרקמה.

מיקום וחשיפת הבטן
העכבר הוצב במצב דקוביטוס גבי על משטח סטרילי שטוח (איור 1A). פרוות החיה חוטאה ב-70% אלכוהול. מלקחיים ומספריים שימשו לחתכים העוריים, והסט השני לחתך חלל הבטן. בוצעה חתך ראשוני באזור המפשעה של הבטן, שהשתרע לרוחב לכיוון החזה משני הצדדים כדי לחשוף את הפריטונאום (איור 1B). העור נמשך בזהירות, ואחריו שרירי הבטן, כדי לחשוף את חלל הבטן (איור 1C). החתך הראשוני צריך להיות שטחי כדי למנוע נזק לאיברים הפנימיים. התקדמו לשכבת השרירים עם חתך זהיר, ואז חשפו את חלל הבטן. הימנע מקרע כלי דם, שכן דימום עלול להקשות על מיקום בלוטות יותרת הכליה ולעכב את ההצטברות. החלפת כלי ניתוח כדי למזער זיהום מיקרוביאלי.

זיהוי ואיסוף בלוטת האדרנל השמאלית
בלוטת יותרת הכליה השמאלית ממוקמת מדיאלית ומעל הכליה השמאלית ברטרופריטונאום, עם צורה אליפטית וצבע ורוד, מוקפת ברקמת שומן לבנה (איורים 1D–G). בעת הזזת איברים סמוכים בזהירות עם מלקחיים קהים לשיפור הדמיה, השתמשו במספריים להסרת רוב רקמת השומן באמצעות חתכים קצרים ומבוקרים, ומבודדים את בלוטת יותרת הכליה. הימנעו מאחיזה ישירה בבלוטת יותרת הכליה כדי למנוע נזק לקפסולה. הבלוטה הונחה מיד לאחר הבידוד בצלחת תרבית P60 עם 10 מ"ל DMEM/F-12 מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (איור 1F).

זיהוי ואיסוף בלוטת יותרת הכליה הימנית
בלוטת יותרת הכליה הימנית ממוקמת לרוחב ומעל הכליה הימנית ברטרופריטונאום, עם צורה אליפטית וצבע ורוד (איורים 1E–H). זיהוי בלוטת יותרת הכליה הזו עשוי להיות מאתגר יותר בשל קרבתה לאיברים אחרים, כמו הכבד והמעי הגס העולה, וכן לכלי דם סמוכים. בעת הזזת איברים סמוכים בזהירות עם מלקחיים קהים לשיפור הדמיה, השתמשו במספריים להסרת רוב רקמת השומן באמצעות חתכים קצרים ומבוקרים, בידוד בלוטת יותרת הכליה, תוך שמירה על נזק לקפסולה. הבלוטה הונחה מיד לאחר הבידוד בצלחת תרבית P60 עם 10 מ"ל DMEM/F-12 מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. האדרנלים משולבים באותה מנה (איור 1F). במהלך ההליך, חשוב לטפל בכלי הדם המרכזיים באזור בזהירות כדי להימנע מחתכים מקריים, שעלולים לגרום לדימום ולהקשות על תהליך האיסוף. כלי הדם העיקריים שיש להיזהר מהם כוללים את הוורידים הכלייתיים והעורקים הכלייתיים. אספתי את בלוטת יותרת הכליה עם רקמת שומן דביקה מסוימת. זה מקל על הטיפול בבלוטה ומגן מפני נזק לקפסולה וזיהום (איור 1I).

עבודה במכסה זרימה למינרי סטרילי
לפני העברת הבלוטות למכסה הזרימה הלמינרי, הצלחת נוקה ב-70% אלכוהול. האדרנלים נשטפו עם PBS שלוש פעמים בטמפרטורת החדר (25°C) (במנות 1, 2 ו-3 ונאספו במנה 4) (איור משלים 1B). נייר המסנן עוזר להידבקות בשומן ומבטיח תוצאות טובות יותר. במהלך הכנת מספר בלוטות, יש לשמור את הרקמות המופרדות ב-DMEM מחומם מראש כדי לשמור על חיוניות. בלוטת יותרת הכליה נתפסה על ידי רקמת השומן הדבוקה (איורים 1I–J), והשומן ננתך בזהירות על נייר הסינון (איור משלים 1C, צלחת 1), באמצעות מלקחיים עדינים ותנועות מבוקרות כדי למנוע נזק לקפסולה. התוצאה הצפויה היא בלוטה חלקה, שלמה, נקייה מעודפי שומן ורקמת חיבור, כפי שמוצג באיור 1K. בלוטות יותרת הכליה הועברו בזהירות לנייר סינון טרי (איור משלים 1C, צלחת 2) כדי לאפשר מיקרודיסציה מדויקת. הקפסולה נלחצה בעדינות עם מלקחיים דקים, ובאמצעות להב הסקלפל נעשה חתך רדיאלי בבלוטה מבלי לחתוך לחלוטין את הרקמה.

התוכן הפנימי של הקורטקס נחשף בעדינות על ידי הוצאתם החוצה דרך החתך באמצעות הפעלת לחץ מכני קל עם המלקחיים. הקפסולה וה-zG נשארו מחוברים לקצה המלקחיים, בעוד שהחומר הבלוטותי הפנימי שנפלט התאים ל-zF ולמדולה. עיכול אנזימטי צריך להתחיל רק לאחר שכל הבלוטות עובדו (איור 1L), עקב הפרדה מכנית בין האזורים החיצוניים לפנימיים.

עיכול
שני צינורות סומנו כ-OF (שבר חיצוני: קפסולה ו-zG) או IF (שבר פנימי: zF ומדולה) (איור 1M). בסך הכול נוספו 4.5 מ"ל של תמיסת עיכול מחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס), וה-OF וה-IF הועברו לצינורות המתאימים. הדגימות נדגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO₂ למשך 30 דקות, והצינורות סובבו בעדינות כל 10 דקות, על ידי הפיכתם ידנית 2–3 פעמים כדי להבטיח חשיפה אחידה לתמיסת האנזים. הזמן הנדרש לעיכול עשוי להשתנות בהתאם לאיכות, פעילות ותנאי האחסון של הקולאז'. לאחר 30 דקות, הרקמה התפרקה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 40 פעמים במכות איטיות ומבוקרות, תוך שימוש בפיפטה סרולוגית של 5 מ"ל ליצירת תערובת תא יחידה. לאחר ניתוק הרקמה, רצוי שלא יישארו שברים נראים לעין, והתווך ייראה עכור. אם שברים עדיין קיימים, ניתן לשקול עיכול נוסף של 15 דקות.

שטיפה וציפוי
לאחר העיכול, התאים נשטפו על ידי הוספת 45 מ"ל DMEM/F-12 להסרת שאריות האנזים (איור 1 M). הדגימות צונו בצנטריפוגה ב-150 × גרם למשך 12 דקות בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס). לאחר הצנטריפוגה, צפוי כדור קטן ודחוס עם מראה מעט ורוד עד צהוב בהיר, בעוד שהסופרנטנט אמור להישאר צלול וללא חלקיקים גלויים. הסופרנטנט הוסר בזהירות והושלך, תוך זהירות שלא להפריע לכדור. הכדור הושמד מחדש במדיום תרבית מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) בהתאם לנפח הסופי הנדרש לציפוי (ראו להלן). צפיפות ציפוי אופטימלית של כ-70% נשמרה כדי להבטיח חיוניות וחיוניות של התכלית. מספר התאים הוערך באמצעות תא ספירת נויבאואר לפני הציפוי, ומספר התאים שהוזרעו הותאם בהתאם לאזור הצלחת של התרבית כדי להשיג את ההתאמה הרצויה. הפלטה את תאי השבר החיצוניים (OF) העשירים ב-zG בצפיפות של כ-10 תאים אחד בכל באר (בדרך כלל מניבה ~1.5–2.5 × 104 תאים) ואת תאי השבר הפנימיים העשירים ב-zF (IF) בממוצע ~0.63 בעלי חיים לבאר (בדרך כלל מניבים ~2.5–4.0 × 104 תאים) בפלטת 48 בארות.

תחזוקת תרבית תאים
התאים גודלו במדיום התרבית שתואר לעיל ונשמרו בתנאים סטנדרטיים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. לאחר 24 שעות של תרבית, המדיום הוחלף להסרת פסולת ותאי דם שנותרו. שלב זה מקדם צמיחה מיטבית. הצלחת נשמרה בקפידה, והוספה בינונית טרייה מחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס). המתן לפחות 48 שעות לפני הערכת התאים בניסויים פונקציונליים. מומלץ להמתין שלושה ימים לפני ביצוע ניסויים פונקציונליים כדי לוודא שהתרביות מבוססות היטב. תרבית ממושכת מעבר לתקופה זו עשויה לדרוש טריפסיניזציה ומעבר לשימוש, מה שעלול להוביל לבחירת תאים ואובדן מאפייני התרבית הראשונית.

ניתוח נתונים ונהלים תומכים
הכנת תרביות ראשוניות של תאי יותרת הכליה
תרביות ראשוניות של בלוטות יותרת הכליה השלמות הוקמו בהתאם לאותם הליכים לאיסוף רקמות, עיכול, שטיפה וציפוי, ושימשו כאמצעי בקרה סטנדרטיים לבדיקות מולקולריות ותפקודיות.

ניתוח ביטוי גנים
כדי לטהר את כל ה-RNA מתאי OF ו-IF, התאים המתרבתים עברו הומוגניזציה ב-TRIReagent באמצעות ערכת ה-RNA, בהתאם לפרוטוקול היצרן. שלמות וריכוז ה-RNA הוערכו באמצעות ספקטרומטריה. עיבוד נוסף של כל ה-RNA כלל שעתוק הפוך ל-cDNA באמצעות ערכת שעתוק ההפוכה cDNA בעלת קיבולת גבוהה. ניתוח ביטוי גנים בוצע באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) באמצעות התרמחזור. השתמשו בכפילויות טכניות לשליטה על שונות. נעשה שימוש בפריימרים TaqMan Universal PCR Master Mix ועכבר (טבלה 1). ערך סף מחזור (CT) נבחר בטווח ההגברה הלינארי עבור כל דגימה שהופעלה בכפלות. הוא נורמל על ידי גני בקרה אנדוגניים β-אקטין וחלבון ריבוזומי 18S (Rps18). רמות הביטוי היחסיות חושבו באמצעות שיטת 2–ΔΔCt 30. הנתונים משלושה ניסויים שונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). ביצענו שלושה ניסויים עצמאיים.

גירוי הפרשת אלדוסטרון וקורטיקוסטרון בתרביות ZG ו-ZF ראשוניות
תרביות ראשוניות של תאי גלומרולוזה (ZG) ותאי פאסיקולטה (ZF) הוקמו ונשמרו בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂. כ-5 ×-104 תאים צופו בכל באר בפלטת 48 בארות באמצעות מדיום גדילה מלא. לאחר ארבעה ימים של תרבית רציפה, מדידות ההפרשה הבסיסית שיקפו את ייצור ההורמונים המצטבר בתקופה זו. לצורך בדיקות גירוי, המדיום נשאף, והתאים נשטפו פעם אחת עם מי מלח מפוזר פוספט (PBS) להסרת גורמים שאריתיים. בהמשך, נוספו 200 מיקרוליטר של מדיום טרי לכל באר, והבדיקות הבאות מייצגות הפרשה מגורה חריפה בתוך חלון זמן מוגדר. לבדיקות גירוי אלדוסטרון, התווך התווסף לאנגיוטנסין II (אנג II, 10 ננומטר), אשלגן (K+), כלוריד אשלגן (KCl, 10 מילימטר), ו-ACTH (10 ננומטר). נתרן כלוריד (NaCl, 10 mM) שימש כבקרת הרכב. בבדיקות גירוי קורטיקוסטרון, ננקטו אותם פרוצדורות, אך המדיום הושלם עם ACTH (10 ננומטר), פורסקולין (10 מיקרומון) או NaCl (10 מ"מ) ככלי בקרה. לאחר 6 שעות של דגירה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂, נאספו ואוחסנו הסופרנטנטים בתרבות בטמפרטורה של −80°C לצורך כימות הורמונלי נוסף, כפי שתוארקודם 31. התאים הדבקים הנותרים עברו ליזציה לצורך הפקת חלבון, ורמות ההורמונים נורמל לתכולת החלבון הכוללת של הליזאט המתאים.

הפקת חלבון ונירמול מדידות אלדוסטרון וקורטיקוסטרון
הפקת חלבון בוצעה באמצעות פירוק RIPA ובופ חילוץ, בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז הפסקה פעמיים. התאים הושעו מחדש על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 15 פעמים באמצעות קצה פיפטה P200 ולאחר מכן סוניקציה באמצעות סוניקטור פרוב. ריכוז החלבון נקבע באמצעות ערכת בדיקת החלבון BCA לפי הוראות היצרן.

מדידת אלדוסטרון באמצעות רדיואימונואסיי (RIA)
ריכוז האלדוסטרון בסופרנטנטים של תרביות תאים נקבע לפי הפרוטוקול של היצרן. בקיצור, נוספו 50 מיקרוליטר של סופרנטנט ו-150 מיקרוליטר של 1% BSA ב-PBS, יחד עם 500 מיקרוליטר של מעקב רדיואקטיבי אלדוסטרון, לצינורות מצופים נוגדנים אלדוסטרון. לאחר הערבוב, הצינורות דוגרו בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) למשך 18 שעות. לאחר מכן, תערובת האינקובציה פורקה, והרדיואקטיביות בצינורות נספרה באמצעות מונה אוטו-גמא Cobra II31. רמות האלדוסטרון נורמל לחלבון כולל, כפי שתואר קודם.

מדידת קורטיקוסטרון
ריכוזי הקורטיקוסטרון בסופרנטנטים של תרביות תאים נמדדו באמצעות ערכת ELISA תחרותית לבדיקת אימונוסורבנט (ELISA) הספציפית לעכברים וחולדות, בהתאם לפרוטוקול היצרן. רמות הקורטיקוסטרון נורמלו לחלבון כולל, כפי שתואר קודם32.

צביעת חיסון
אימונופלואורסצנציה בוצעה הן על חתכי יותרת הכליה המוטבעים בפרפינים והן על תאים מתורבתים שגודלו על כיסויי זכוכית מטופלים מראש מצופים בפולי-אל-ליזין. לכל הדגימות, בוצעה חסימה עם 5% סרום עזים תקין (NGS) ב-PBS, והגרעינים צובעו נגד DAPI (4′, 6-דיאמידינו-2-פנילינדול, 1:1000). המגלשות והכיסוי נשטפו שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 0.1% Tween-20 ב-PBS בין שלבי הדגירה. לאחר הצביעה, דגימות הותקנו עם Antifade Mountant ואוחסנו בחושך עד להדמיה. חתכי רקמה: קטעי הפרפין של יותרת הכליה עברו פרפין מקסילן, ואז נשטפו בסדרת אתנול מדורגת (100%, 95%, 70%), ולבסוף נשטפו ב-PBS. שליפת האנטיגנים בוצעה בבופר Tris-EDTA (בסיס של 10 מ"מ טריס, 1 מ"מ EDTA, 0.05% טווין-20, pH 9.0) על ידי חימום בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הקירור לטמפרטורת החדר, החלקים נשטפו ב-PBS וחסמו ב-5% NGS ב-PBS למשך שעה. החתכים נדגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כאשר הנוגדנים הראשוניים הבאים מדוללים ב-1:100 ב-5% NGS ב-PBS: עכבר אנטי-Dab2, תרנגול נגד GFP, ואנטי-RFP של ארנב. נוגדנים משניים שימשו (1:300): אלקסה פלואר 594 אנטי-עכבר IgG, אלקסה פלור 594 אנטי-עכבר לעזים IgY, ואלקסה פלור 647 אנטי-ארנב IgG.

תאים מתורבתים: אימונופלואורסצנציה על כיסויי כיסוי בוצע ארבעה ימים לאחר הציפוי. התאים הוצבו עם פאראפורמלדהיד (PFA) מחומם מראש ב-4% בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות ונשטפו שלוש פעמים ב-PBS. החסימה בוצעה באמצעות 5% NGS ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר. כיסויי כיסוי דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם עכבר אנטי-Dab2 (1:100 ב-5% NGS/PBS), ואחריו אלקסה פלואור 488 נגד עכבר עזים (1:500).

רכישת תמונה: תמונות פלואורסצנציה (mGFP ו-mTomato) של תאים מתורבתים צולמו באמצעות מערכת מיקרוסקופ. פלואורסצנציה של mGFP נלכדה באמצעות מסנן לפלואורסצנציה ירוקה (עירור: 470 ננומטר, פליטה: 525 ננומטר), ופלואורסצנציה של mTomato נלכדה באמצעות מסנן לפלואורסצנציה אדומה (עירור: 585 ננומטר, פליטה: 624 ננומטר).

תוכנה וניתוח סטטיסטי
סיכומים ויזואליים, דיאגרמות סכמטיות ואיורים נוצרו באמצעות Adobe Illustrator 2023 (Adobe Inc., https://www.adobe.com/products/illustrator.html) ו-BioRender (https://www.biorender.com), וניגשו במאי 2025. הנתונים נותחו באמצעות גרסה 10.0 של GraphPad Prism. זמין בכתובת: https://www.graphpad.com. כל הניסויים בוצעו לפחות בשלושה עותקים ובאופן עצמאי כדי להבטיח שחזוריות התוצאות. להשוואות בין שתי קבוצות, נעשה שימוש במבחן t של הסטודנט (זוגי או לא מזווג, לפי הצורך). בהשוואות של שלוש קבוצות או יותר, בוצע ניתוח שונות (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט-הוק מתאים כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין קבוצות. התוצאות מוצגות כממוצע ± SD. ערך p של פחות מ-0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקמה ואפיון של תרביות תאי יותרת הכליה הראשוניות המועשרות אזורים
תרביות ראשוניות של תאי יותרת הכליה הוקמו בהצלחה מתוך ה-OF, הועשרו לתאי zG, וה-IF, מועשר לתאי zF. תמונות מייצגות של התאים המתורבתים מוצגות באיור 2A (OF–zG) ואיור 2B (IF–zF). להערכת העשרת תאי zG ותאי לא-zG בתרביות אלו, נעשה שימוש במודל העכבר ASCre/+:: ROSAmTmG/+ (איור 2C). בעכברים אלו, Cre recombi...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה הוצג פרוטוקול משופר שמייצר תרביות ראשוניות של תאי אדרנל עכברים המועשרות לתאי zG (OF) ו-zF (IF), אשר מסכמים בנאמנות את הזהות האזורית והתפקוד הסטרואידוגני של כל אזור. פרוטוקול זה אמור לאפשר חקירה מפורטת של הביולוגיה התאית והמולקולרית של קליפת יותרת הכליה בהקשר ספציפי לאזור, ולתמוך בלימוד חלבונים, מסלולי איתות ומנגנונים המעורבים בהתפתחות, התמיינות, תפקוד והתחדשות קליפת יותרת הכליה, עם הפחתת הפרעות מאזורים רקמתיים אחרים, במיוחד בחלק החיצוני. תרביות תאי יותרת הכליה הראשוניות הדו-ממדי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים הקשורים למחקר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי FAPESP (קרן המחקר של סאו פאולו, ברזיל), מספר פרויקט 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L), ותמיכה מ-2R01DK123694 (ל-DTB) וכספים מהמחלקה לאנדוקרינולוגיה בבית החולים לילדים של בוסטון (DTB).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Conical Tube (50 mL )Corning (Corning, NY, USA)352070סטרילי
0.22 µm Syringe FilterMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)SLGV033RSסינון פתרון עיכול
10 mL Disposable SyringeBD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA)300912סטרילי
5 mL Serological PipetteCorning (Corning, NY, USA)4487סטרילי
10 mL Serological PipetteCorning (Corning, NY, USA)4488סטרילי
Filtered Pipette Tips (P200)Axygen (Union City, CA, USA)TF-200-R-Sסטרילי
Filtered Pipette Tips (P1000)Axygen (Union City, CA, USA)TF-1000-R-Sסטרילי
P60 Culture DishCorning (Corning, NY, USA)430166טיפול תרבות רקמות
48-well PlateCorning (Corning, NY, USA)3527טיפול תרבות רקמות
Sterile Filter PaperN/AN/Aהסרת שומן ותמיכה בניתוח
DMEM/F-12 MediumGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)11320033פורמולציה 1:1
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10082147Heat-inactivated
ITS SupplementGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)41400045100X
GlutaMAX SupplementGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)35050061100X
Penicillin-Streptomycin (100X)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)15140122אנטיביוטיקה
PBS 1XGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10010023pH 7.4
Collagenase Type IGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)17100-017עיכול רקמות
DNase ISigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)DN25-1עיכול רקמות
Angiotensin II (Ang II)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A9525גירוי הורמונלי
Adrenocorticotropic Hormone (ACTH)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A0298גירוי הורמונלי
ForskolinSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)F6886גירוי cAMP
Potassium Chloride (KCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)P9541גירוי אלדוסטרון
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)S7653בקרת רכב
Small Surgical ScissorsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)14060-09ניתוח
Scalpel with Disposable BladeFine Science Tools (Foster City, CA, USA)10003-12מיקרודסקציה
Fine ForcepsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11252-00ניתוח
Curved ForcepsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11251-10ניתוח
Laminar Flow HoodThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/Aעיבוד רקמות סטרילי
IncubatorThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/Aגידול תאים
CentrifugeEppendorf (Hamburg, Germany)N/Aפילוט תאים
Neubauer Counting ChamberHausser Scientific (Horsham, PA, USA)1490ספירת תאים
RIPA Lysis and Extraction BufferThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)89901חילוץ חלבון
Halt Protease Inhibitor CocktailThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)87786חילוץ חלבון
Fisherbrand Model 120 Sonic DismembratorThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)FB120סוניקציה
RIA SystemTecan (Männedorf, Switzerland)MG13051כימות הורמונים
Cobra II Auto-Gamma CounterBerthold Technologies (Bad Wildbad, Germany)N/Aמדידת רדיואקטיביות
Corticosterone ELISA Kit (96-well)Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)55-CORMS-E01כימות הורמונים
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)P36930מדיום הרכבה
Mouse anti-Dab2BD Biosciences (San Jose, CA, USA)610464נוגדן ראשוני
Chicken anti-GFPAves Labs (Tigard, OR, USA)GFP-1020נוגדן ראשוני
Rabbit anti-RFPRockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA)600-401-379נוגדן ראשוני
Alexa Fluor 594 Goat anti-MouseInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11005נוגדן משני
Alexa Fluor 594 Goat anti-ChickenInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11042נוגדן משני
Alexa Fluor 647 Goat anti-RabbitInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-21244נוגדן משני
Alexa Fluor 488 Goat anti-MouseThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)A-11001נוגדן משני
EVOS Microscope SystemThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/Aהדמיה
TRI ReagentSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)T9424חילוץ RNA
Direct-zol RNA KitZymo Research (Irvine, CA, USA)R2050טיהור RNA
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zelander, T. The ultrastructure of the adrenal cortex of the mouse. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 46 (6), 710-716 (1957).
  2. Nishimoto, K., et al. Adrenocortical zonation in humans under normal and pathological conditions. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (5), 2296-2305 (2010).
  3. Freedman, B. D., et al. Adrenocortical zonation results from lineage conversion of differentiated zona glomerulosa cells. Dev. Cell. 26 (6), 666-673 (2013).
  4. Leng, S., Carlone, D. L., Guagliardo, N. A., Barrett, P. Q., Breault, D. T. Rosette morphology in zona glomerulosa formation and function. Mol. Cell. Endocrinol. 530, 111287(2021).
  5. Gwynne, J. T., Strauss, J. F. The role of lipoproteins in steroidogenesis and cholesterol metabolism in steroidogenic glands. Endocr. Rev. 3 (3), 299-329 (1982).
  6. Zhu, Y., Zhang, X., Hu, C. Structure of rosettes in the zona glomerulosa of human adrenal cortex. J. Anat. 243 (4), 684-689 (2023).
  7. Leng, S., et al. β-Catenin and FGFR2 regulate postnatal rosette-based adrenocortical morphogenesis. Nat. Commun. 11 (1), 1680(2020).
  8. Rainey, W. E. Adrenal zonation: clues from 11β-hydroxylase and aldosterone synthase. Mol. Cell. Endocrinol. 151 (1-2), 151-160 (1999).
  9. Rebuffé-Scrive, M., Krotkiewski, M., Elfversson, J., Björntorp, P. Muscle and adipose tissue morphology and metabolism in Cushing’s syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 67 (6), 1122-1128 (1988).
  10. Luo, X., Ikeda, Y., Parker, K. L. A cell-specific nuclear receptor is essential for adrenal and gonadal development and sexual differentiation. Cel. l. 77 (4), 481-490 (1994).
  11. Huang, C. C. J., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. C. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by Sonic Hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
  12. King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 106 (50), 21185-21190 (2009).
  13. Ching, S., Vilain, E. Targeted disruption of Sonic Hedgehog in the mouse adrenal leads to adrenocortical hypoplasia. Genesis. 47 (9), 628-637 (2009).
  14. Kim, A. C., et al. Targeted disruption of β-catenin in Sf1-expressing cells impairs development and maintenance of the adrenal cortex. Development. 135 (15), 2593-2602 (2008).
  15. Berthon, A., et al. Constitutive β-catenin activation induces adrenal hyperplasia and promotes adrenal cancer development. Hum. Mol. Genet. 19 (8), 1561-1576 (2010).
  16. Basham, K. J., et al. A ZNRF3-dependent Wnt/β-catenin signaling gradient is required for adrenal homeostasis. Genes Dev. 33 (3-4), 209-220 (2019).
  17. Finco, I., Lerario, A. M., Hammer, G. D. Sonic Hedgehog and WNT signaling promote adrenal gland regeneration in male mice. Endocrinology. 159 (2), 579-596 (2018).
  18. Heikkilä, M., et al. Wnt-4 deficiency alters mouse adrenal cortex function, reducing aldosterone production. Endocrinology. 143 (11), 4358-4365 (2002).
  19. Drelon, C., et al. PKA inhibits WNT signalling in adrenal cortex zonation and prevents malignant tumour development. Nat. Commun. 7 (1), 12751(2016).
  20. Heaton, J. H., et al. Progression to adrenocortical tumorigenesis in mice and humans through insulin-like growth factor 2 and β-catenin. Am. J. Pathol. 181 (3), 1017-1033 (2012).
  21. Borges, K. S., et al. Wnt/β-catenin activation cooperates with loss of p53 to cause adrenocortical carcinoma in mice. Oncogene. 39 (30), 5282-5291 (2020).
  22. Borges, K. S., et al. Non-canonical Wnt signaling triggered by WNT2B drives adrenal aldosterone production. bioRxiv. , (2024).
  23. Sasano, H. Cell proliferation and apoptosis in normal and pathologic human adrenal. Mod. Pathol. 8 (1), 11-17 (1995).
  24. Chang, S. P., Morrison, H. D., Nilsson, F., Kenyon, C. J., West, J. D., et al. Cell proliferation, movement, and differentiation during maintenance of the adult mouse adrenal cortex. PLoS One. 8 (12), e81865(2013).
  25. Mitani, F. Functional zonation of the rat adrenal cortex: the development and maintenance. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, 90 (5), 163-183 (2014).
  26. Dinh, H. A., Volkert, M., Secener, A. K., Scholl, U. I., Stölting, G. T- and L-type calcium channels maintain calcium oscillations in the murine zona glomerulosa. Hypertension. 81 (4), 811-822 (2024).
  27. Penton, D., et al. Task3 potassium channel gene invalidation causes low renin and salt-sensitive arterial hypertension. Endocrinology. 153 (10), 4740-4748 (2012).
  28. Mattos, G. E., Lotfi, C. F. P. Differences between the growth regulatory pathways in primary rat adrenal cells and mouse tumor cell line. Mol. Cell. Endocrinol. 245 (1-2), 31-42 (2005).
  29. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  30. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  31. Berber, M., et al. Rho/ROCK signaling and α-catenin mediate β-catenin-driven hyperplasia in the adrenal cortex via adherens junctions. J. Clin. Invest. , (2026).
  32. Smith, T. T. G., et al. Forced treadmill running reduces systemic inflammation yet worsens upper limb discomfort in a rat model of work-related musculoskeletal disorders. BMC Musculoskelet. Disord. 21 (1), 57(2020).
  33. Kremer, J. L., et al. Extracellular matrix protein signatures of the outer and inner zones of the rat adrenal cortex. J. Proteome Res. 23 (8), 3418-3432 (2024).
  34. Pignatti, E., Leng, S., Carlone, D. L., Breault, D. T. Regulation of zonation and homeostasis in the adrenal cortex. Mol. Cell. Endocrinol. 441, 146-155 (2017).
  35. Pignatti, E., et al. Beta-catenin causes adrenal hyperplasia by blocking zonal transdifferentiation. Cell Rep. 31 (3), 107524(2020).
  36. Romero, D. G., et al. Disabled-2 is expressed in the adrenal zona glomerulosa and is involved in aldosterone secretion. Endocrinology. 148 (6), 2644-2652 (2007).
  37. Sahut-Barnola, I., Lefrancois-Martinez, A. M., Jean, C., Veyssiere, G., Martinez, A. Adrenal tumorigenesis targeted by the corticotropin-regulated promoter of the aldo-keto reductase AKR1B7 gene in transgenic mice. Endocr. Res. 26 (4), 885-898 (2000).
  38. Vidal, V., et al. The adrenal capsule is a signaling center controlling cell renewal and zonation through Rspo3. Genes Dev. 30 (12), 1389-1394 (2016).
  39. Dörner, J., et al. GLI1+ progenitor cells in the adrenal capsule of the adult mouse give rise to heterotopic gonadal-like tissue. Mol. Cell. Endocrinol. 441, 164-175 (2017).
  40. Guo, Y., et al. 3D culture system for human adrenal glands that uses a sequential processing medium to facilitate cortical-medullary cell development. Clin. Lab. 70 (12), (2024).
  41. Friedrich, L., Schuster, M., Rubin de Celis, M. F., Berger, I., Bornstein, S. R., et al. Isolation and in vitro cultivation of adrenal cells from mice. STAR Protoc. 2 (4), 100999(2021).
  42. Mattos, G. E., Jacysyn, J. F., Amarante-Mendes, G. P., Lotfi, C. F. P. Comparative effect of FGF2, synthetic peptides 1–28 N-POMC and ACTH on proliferation in rat adrenal cell primary cultures. Cell Tissue Res. 345 (3), 343-356 (2011).
  43. Gazdar, A. F., et al. Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses multiple pathways of steroid biosynthesis. Cancer Res. 50 (17), 5488-5496 (1990).
  44. Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Mol. Cell. Endocrinol. 351 (1), 58-65 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Wnt Beta Catenin

מאמרים קשורים