מאמר שיטה

שיפור הספיגה של וירוס אדנו-מקושר למערכת העיכול באמצעות נוסחת רפואה סינית מסורתית

130 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70413

⸱

24 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Traditional Chinese Medicine, Naval Medical University, 2Oncology Department of Traditional Chinese Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University, 3State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Zhongshan Hospital, Fudan University, 4Shanghai Key Laboratory of Gene Editing and Cell Therapy for Rare Diseases, Engineering Research Center of Gene Technology (Ministry of Education), Fudan University, 5Institutes of Integrative Medicine, Fudan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת מודל שקי מעי מחובר להערכת אינטראקציות בין הרפואה הסינית המסורתית (TCM) לווירוס אדנו-מקושר רקומביננטי (rAAV) במהלך הספיגה במעי, ומספק פלטפורמה אקס-ביבו לאופטימיזציה של אסטרטגיות העברת גנים דרך הפה.

תקציר

העברת וירוס אדנו-מקושר (rAAV) דרך הפה מחזיקה בפוטנציאל תרופיטי משמעותי אך מוגבלת על ידי ספיגת מעיים לא יעילה. הרפואה הסינית המסורתית (TCM), הנפוצה בנוסחאות אוראליות, מהווה מקור מבטיח למשפרי ספיגה. עם זאת, השפעותיה הפוטנציאליות על קליטת rAAV והעברה נותרות ברובן לא נבדקות. מודל שקית המעי המוצא מספק פלטפורמה כמותית אקס-ביבו לחקירת אינטראקציות אלו. כאן מוצג פרוטוקול מפורט המשתמש במודל שקית המעי המוציא להערכת כמותית של העברת וירוס אדנו-קשור (rAAV) דרך אפיתל המעי והעברת גנים ברקמת המעי בתנאים ניסיוניים מבוקרים. שלבים מרכזיים כוללים קצירת מקטעי מעי דק ממכרסמים במעבדה, העברת הקטעים ליצירת שקיות, ומילוי כל שק בבופר מחומצן. השקיים שיצאו מוצאים טובלים בבופר מחומצן המכיל חלקיקי rAAV ומודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר חשיפה לומינלית והעברה וקטורית. ניתוחי נקודת הקצה כוללים דגימה של הנוזל הפנימי (הסרוסלי) למדידת חלקיקי rAAV שחצו את האפיתליום, וכן ניתוח רקמת השק לביטוי גנים טרנסדקטיביים לקביעת יעילות הטרנסדוקציה. על ידי בדיקת אזורים מרובים במעיים, הפרוטוקול מספק תובנות לגבי הבדלים ספציפיים לספיגת rAAV ספציפית למקטעים. יתרה מזאת, הכללת GZNG, נוסחה קלאסית ל-TCM במהלך הדגירה מאפשרת הערכת השפעתו על קליטת וקטורים והעברה. הגישה של שקית המעי המוצאת מספקת פלטפורמה חשובה לסינון סרוטיפים של rAAV, משפרי אספקה ואינטראקציות בין וקטורי rAAV לרכיבי TCM. העיצוב הפשוט והמקביל מאפשר גם סינון בתפוקה גבוהה במחקרים פרה-קליניים.

מבוא

וירוס אדנו-מקושר רקומביננטי (rAAV) מהווה פלטפורמה מבטיחה לטיפול גנטי מערכתית, כאשר שלושה מסלולי מתן עיקריים נחקרים כיום: הזרקה תוך-ורידית1, הזרקה תוך-פריטוניאלית2, ומתן דרך הפה3. בעוד שנחקרו מסלולי הזרקות תוך-ורידיות ותוך-קרחיות נבדקו לעומק, מתן דרך הפה, גישה לא פולשנית, נותר פחות נחקר יחסית. היתכנות מתן rAAV דרך הפה הוכח לראשונה על ידי Xin ואחרים, שדיווחו על העברת רירית המעי בהצלחה והשראת תגובה חיסונית אנטי-HIV לאחר מתן rAAV2 דרך הפה. באופן דומה, Hara ואח' 3,5 הראו כי rAAV/Aβ דרך הפה יכול להמיר את רירית מערכת העיכול ולהפחית הצטברות עמילואידים במוח, בעוד שסטיל ואח' מצאו כי חיסון דרך הפה הראה חיסון הישרדותי ואנטי-גידולי עליונים לעומת הזרקה תוך-שרירית. אותו מחקר דיווח כי rAAV6 הפגין טרופיזם מעיים חזק יותר מ-rAAV5. מעבר ליישומים של חיסונים, פוטנציאל טיפולי הושג במודלים מחלותיים נוספים. Ma et al.7 ו-Hao et al.8 הוכיחו כי rAAV דרך הפה הוביל לדיכוי גידולים ולטיפול אנטי-פיברוטי בכבד ובקיבה, בהתאמה, לאחר העברה למערכת העיכול. הואנג ואח' זיהו את הסרוטיפ המהונדס Rec2 כטרנסדוקציה סלקטיבית של רקמת שומן חומה לאחר מתן דרך הפה, בניגוד לטרופיזם הכבד הדומיננטי שנצפה בלידה תוך-ורידית10. למרות ממצאים פורצי דרך אלו, המחקר על מתן rAAV דרך הפה נותר מוגבל, בין היתר בשל היעדר מערכות סקר חוץ גופית להערכה רחבת היקף.

מודל שקי המעי המוצא, שפותח על ידי וילסון וויסמן ב-1954-11, נותר פלטפורמה חשובה במבחנה לחקר מנגנוני ספיגת תרופות במעי. בניגוד למכשירי סימולטור ספיגה אחרים, מערכת זו מתייחסת באופן ייחודי לתהליכים פיזיולוגיים רבים מעבר לדיפוזיה פסיביתפשוטה 12. תכונה זו הופכת אותה ליתרון מיוחד לחקר רפואה מסורתית13. באמצעות מערכת זו, מתועד כי תרכובות הרפואה הסינית מראות לעיתים דפוסי ספיגה תלויי מקטעים במעיים לאורך מערכת העיכול. לדוגמה, מחקר אחד הראה כי מספר אלקלואידים מווווי צ'ינגג'ואו סאן נספגים סלקטיבית במקטעי מעיים שונים, כאשר הג'ג'ונום והאילאום מראים את הספיגה הפעילהביותר 14. בנוסף, מתן משותף של רכיבי ה-TCM יכול לווסת את הספיגה במעי. ליאו ואח' דיווחו כי מתן משותף עם תמצית Radix Angelicae dahuricae שיפר משמעותית את הספיגה המעיים של פואררין, והדגיש את השפעת האינטראקציות עם הרפואה הסינית הסינית על קליטת הסגמנטים. לכן, מודל שקית המעי המוצא משמש ככלי אידיאלי להבהרת התנהגויות הספיגה המורכבות והאינטראקציות הסינרגיסטיות הטבועות בנוסחאות הרפואה הסינית ובתרופות אחרות.

בחירת מודל מתאים למחקר ספיגת rAAV דורשת הבנה מעמיקה של הפשרות בין דיוק פיזיולוגי, מורכבות טכנית ותפוקה. הטבלה למטה מסכמת את המודלים הניסיוניים העיקריים המשמשים לחקר ספיגה במעי.

מחקר זה מספק הוכחה לכך שמודל שקית המעי המוצא יכול לשמש לחקר ספיגה במעי של וקטורי וירוס אדנו-קשורה (rAAV) רקומביננטיים. הוא מספק תובנות חשובות כיצד מתן משותף של ה-TCM משפיע על ספיגת וקטורי rAAV במעיים, ומדגיש את הצורך באפיון נוסף של האינטראקציות המכאניות שלהם בתנאים פיזיולוגיים רלוונטיים. אופטימיזציה של אסטרטגיות אספקה אוראלית משופרת ב-TCM באמצעות גישה זו עשויה להקל על פיתוח טיפולים לא פולשניים ל-rAAV, ובכך לשפר את הציות למטופלים ואת נגישות הטיפול.

החוקרים צריכים להעריך את מודל שק המעי המוצא על בסיס הקריטריונים הבאים כדי לוודא שהוא תואם למטרות הניסוי שלהם. יישומים מתאימים כוללים סקר מהיר של סרוטיפים, הערכת תוספים/משפרים, וקינטיקה אזורית, בעוד יישומים ומגבלות לא מתאימים כוללים מחקרי ביטוי ארוכי טווח (>48 שעות) ופרמקולוגיה מערכתית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הימית (אישור CHEC (A.E)-2025011).

1. הכנת תמיסת טיירוד ותמיסות ויראליות

  1. קדם-תנאי הפתרון של טיירוד:
    1. הכינו שני אליקוטים של 500 מ"ל של תמיסת טירוד (pH 7.4) (ראו טבלת חומרים).
    2. מקרר אחד ל-4 מעלות צלזיוס וחמם את השני ל-37 מעלות צלזיוס.
    3. בועות בכל אליקוט עם 95% O₂/5% CO₂.
  2. הכנת תמיסה ויראלית:
    1. הוסף AAV9-CMV-EGFP רקומביננטי לתמיסת טיירוד בטמפרטורה של 37°C להשגת ריכוז סופי של 1 x 1011 vg/mL (תנאי בקרה).
    2. לתנאי ניסוי, יש להשלים את תכשיר AAV9-CMV-EGFP בנוסחת TCM GZNG (טבלה 2) המומסת ברכב לריכוז סופי של 200 מ"ג/מ"ל.
    3. לבקרת GZNG בלבד, הוסף GZNG (200 mg/mL) לתמיסת Tyrode ללא AAV9 CMV-EGFP.
      הערה: יש להכין דילול ויראלי מיד לפני השימוש כדי לשמור על הזיהום. ה-pH של תמיסת ה-GZNG הוא בערך 5.0–6.0.

2. הכנת בעלי חיים ואיסוף רקמות מעיים

  1. צום: צום את חולדות ספרג–דולי בת 8 השבועות במשך 24 שעות לפני הניתוח. וודא גישה חופשית למים במהלך תקופה זו כדי לשמור על הידרציה.
    הערה: צום מסייע במזער תכולת המעיים ומבטיח מדידה מדויקת של הספיגה במעיים במהלך ניסויי ex vivo (ex vivo ).
  2. בדקו את בריאות בעלי החיים לפני הצום וודאו שהם במצב טוב. החריגו בעלי חיים עם סימני מצוקה או מחלה מהמחקר.
  3. נתן נתרן פנטוברביטל (200 מ"ג/ק"ג, תוך-פריטוני) כדי לגרום להרדמה עמוקה. לוודא שהחיה מורדמת לחלוטין על ידי בדיקת חוסר רפלקסים ונשימה יציבה.
    אזהרה: פנטוברביטל הוא חומר מבוקר מסוכן; יש לטפל בכפפות וציוד מגן באמצעות מכסה אדים כדי למנוע מגע או שאיפה בעור ולעקוב אחר הנחיות מוסדיות להשמדה בטוחה ולתגובה חירום.
  4. לבצע המתת חסד באמצעות ניתוק צוואר הרחם לאחר אישור ההרדמה העמוקה.
  5. יש לשטוף את אזורי הבטן והחזה עם 75% אתנול כדי לחטא את העור ולהפחית זיהום מיקרוביאלי במהלך הניתוח.
  6. בצע חתך בקו אמצעי לאורך אזור הבטן באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים לחשיפת חלל הפריטונאלי.
  7. הפרדו בעדינות וחשפו את הקיבה והמעיים. השתמשו בווילון סטרילי כדי להגן על הרקמות והאיברים הסובבים במהלך ההליך.
  8. חתכו בזהירות את הסוגר הפילורי כדי להפריד בין הקיבה לתריסריסריון הפרוקסימלי. ודאו שהתריסריסריון נשאר שלם לפרוצדורות הבאות.
  9. נתח את המעי הגס הדיסטלי במפגש הרקטו-אנאלי תוך הימנעות מנזק לרקמות הסובבות.
  10. שחרר בעדינות את החיבורים המזנטריים מהמעי הדק באמצעות מלקחיים דקים או מספריים. היזהר לא למתוח או לקרוע את המזנטריה.
  11. העבר מיד את המעי הדק השלם לתמיסה קרה של בופר קרבס-רינגר מחומצן (תמיסת טירוד, 4 מעלות צלזיוס).

3. הכנה לשקית המעי מחוץ למערכת החי

  1. בחרו מקטעי מעיים כדלקמן: קטע באורך 8 ס"מ הממוקם 10 ס"מ רחוק מהפילורוס סומן כסגמנט התריסרון.
  2. אספו קטע ג'יונלי באורך 8 ס"מ שמתחיל 16 ס"מ דיסטלי לסגמנט התריסר.
  3. יש לקבל מקטע איליאלי באורך 8 ס"מ שמתחיל עוד 16 ס"מ דיסטלי למקטע היערית.
  4. למעי הגס, אספו קטע של 8 ס"מ הממוקם 5 ס"מ קרוב לקצה העיוור של הצוף.
    הערה: ודאו שהרקמה אלסטית ושלמה, המתאימה להיפוך במהלך ההכנה.
  5. שטוף את לומן המעי באמצעות מזרק של 2 מ"ל מלא בתמיסת טירוד קר ומחומצן.
  6. השליך את השפכים בהתאם לפרוטוקולי פסולת ביולוגית מוסדית לשמירה על סטריליות ומניעת זיהום.
    זהירות: לטפל בפסולת ביולוגית באמצעות כפפות וציוד מגן מתאים כדי להימנע מחשיפה לחומר שעלול להיות מדבק. להשליך את כל הפסולת הביולוגית והשפכים בהתאם להנחיות בטיחות ביולוגיות מוסדיות למניעת זיהום סביבתי.
  7. הכנס את הקצה הפרוקסימלי של מקטע המעי למוט זכוכית מלוטש בקוטר 4 מ"מ. ודא שמשטח המוט חלק כדי למנוע קריעה רירית.
  8. קשרו את הקצה המרוחק של הקטע עם תפר משי 2-0 כדי לקבע את הרקמה על המוט. ודאו שהרקמה נשארת יציבה במהלך ההיפוך.
  9. העבירו בעדינות את מקטע המעי על ידי החלקת הרקמה לאורך המוט עד שהרירית נחשפה לחלוטין. הימנעו ממתיחה או סיבוב מופרזים כדי לשמור על שלמות הרקמה.
  10. הזרקו 2 מ"ל של תמיסת טירוד קר לתוך הלומן כדי לבדוק דליפה. הדליפה המקובלת צריכה להיות <5% תוך דקה. אם מתגלה דליפה, כוון את התפרים ואמת היפוך מלא של פני הריר.
    הערה: לבצע את ההפיכה בסביבה קרה כדי למזער את ההתפרקות האנזימטית ולשמור על חיוניות הרקמה.
  11. הכנס נימי זכוכית באורך 5 ס"מ באורך 3 מ"מ לקצה הפתוח של המקטע היוצא כדי לשמש כניסת פרפוזיה. קדם את הקנולה בעדינות כדי למנוע קרעים ברירית.
  12. אבטח את הקנולה באמצעות תפרי משי 2-0. ודא שהקנולה נשארת קבועה במקומה מבלי לקרוס או לחסום את זרימת הנוזלים.
  13. הפעילו מתח עדין על התפרים כדי לשמור על הצורה הנכונה של שק המעיים. מנעו עיקולים או עיוותים, שכן הם עלולים להפריע לפרפוזיה ולשנות את תוצאות הספיגה.
  14. הימנעו מהידוק מופרז, שכן הדבר עלול לפגוע ברקמה או לעוות את השק. שמרו על מתח אחיד לאורך כל הניסוי. בדקו באופן קבוע את שק המעי שהפך לדליפה או נזק מבני. אם הדליפה עולה על 5%, יש לתקן או להחליף את המקטע לפני ההמשך.

4. טרנסדוקציה ודגירה של AAV

  1. הניחו כל שק שיצא לתוך צינור חרוטי בנפח 7 מ"ל המכיל 4 מ"ל של תמיסת טירוד מחומצנת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  2. הוסף פתרון ויראלי כך: בקרה: AAV9-CMV-EGFP בלבד; ניסוי: AAV9-CMV-EGFP + GZNG.
  3. דגירה סטטית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, במהלכה תערובת גז של 95% O2/5%CO2 הוזרקה ברציפות לתמיסה.

5. דגימה, עיבוד וניתוח נקודות קצה

  1. דגימת מסלול זמן
    1. יש למשוך 50 מיקרוליטר נוזל סרוזלי מכל שק מעי ב-0, 30, 60, 90 ו-120 דקות באמצעות מיקרומזרינג' מכויל. להבטיח דגימה מדויקת מבלי להכניס בועות אוויר.
    2. החלף מיד את הנוזל שנמשך ב-50 מיקרוליטר של תמיסת טירוד מחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) לשמירה על איזון אוסמוטי ונפח פנימי. מזער את הזמן בין המשיכה להחלפה כדי לשמור על תנאי ניסוי עקביים.
      הערה: בעת שימוש במיקרו-מזרק (למשל מזרק המילטון), שמרו על סטריליות וטפלו בו בעדינות כדי למנוע נזק לממברנת שק המעיים.
    3. בצע דגימה במהירות בכל נקודת זמן כדי למזער הפרעה לסביבת הדגירה.
  2. קביעת טיטר וירוס
    1. חלץ DNA מלא מהנוזל הסרוזלי באמצעות ערכת חילוץ DNA גנומי של בעלי חיים הזמינה מסחרית לפי הוראות היצרן.
    2. בצע כימות מוחלט של מספר העתק הגנום של וקטור rAAV באמצעות qPCR. השתמש בערכת SYBR Green Kit עם פריימרים ITR. בצע את ההגברה של qPCR בלוח סטנדרטי של 96 בארות באמצעות מחזור תרמי עם תנאי מחזור הבאים: דנאטורציה ראשונית: 95°C למשך 10 דקות; דנאטורציה: 95°C למשך 15 שניות; אנילינג והרחבה: 60°C למשך דקה אחת; 40 מחזורים בסך הכל
    3. כדי לכמת את מספר עותק הגנום, יש ליצור עקומה סטנדרטית באמצעות דילול סדרתי של rAAV-CMVp-gfp בפלסמיד (1 ng, 0.1ng ו-0.01 ng). השתמש בדילול זה כדי לחשב את מספר עותק הגנום הוויראלי בהתבסס על ערכי סף המחזור (Ct) המתאימים להם.
    4. קבעו את מספר עותק הגנום הווקטורי בנוזל הסרוזלי שנאסף באמצעות העקומה הסטנדרטית. התוצאות דווחו כעותקי גנום לכל 100 ng של DNA שנלקח.
      הערה: ודאו שכל החומרים והציוד סטריליים כדי למנוע זיהום במהלך חילוץ DNA וניתוח qPCR. השתמשו בבקרות מתאימות לאימות דיוק qPCR, כולל בקרות ללא תבנית (NTC) ותקני פלסמיד.
    5. בצע qPCR בשלושה עותקים לכל דגימה כדי להבטיח שחזוריות ואמינות של התוצאות.
  3. עיבוד רקמות סופיות
    1. שאפו את כל הנוזל הלומינלי שנותר מכל שק מעי באמצעות פיפטה סטרילית. לטפל בעדינות כדי למנוע קרע ברקמה.
    2. שטפו כל שק שלוש פעמים במי מלח עם בופר פוספט (PBS) המכיל 1% פניצילין–סטרפטומיצין (P/S) להסרת שאריות, חיידקים וזיהום. ודאו שטיפה יסודית לשמירה על סטריליות לשימושים במורד הזרם.
    3. חתכו את רקמת המעי לחתיכות בגודל 2 מ"מ3 (2 מ"מ * 2 מ"מ * 0.5 מ"מ) באמצעות מספריים או להבים כירורגיים סטריליים. שמרו על גודל השברים באופן אחיד לדגירה עקבית.
    4. דגרו את שברי הרקמה ב-10 מ"ל DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% (v/v) P/S בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות באינקובטור לח עם 5% CO₂. יש לרענן את מדיום התרבית כל 12 שעות במהלך הדגירה.
      הערה: שלב זה שומר על חיוניות הרקמה ומאפשר התאוששות לאחר הניסוי. ודא שהרירית נשארת שלמה במהלך החיתוך והכביסה. בצע שלוש שטיפות PBS מלאות להסרת פסולת ומזהמים מיקרוביאליים. שמירה על טמפרטורה קבועה (37 מעלות צלזיוס) ולחות גבוהה לתמיכה בפעילות מטבולית ובריאות הרקמות.
      זהירות: לטפל בקטעי רקמה באמצעות כלים סטריליים ולהימנע מלחץ מכני לשמירה על שלמות האפיתל.
  4. ניתוחים לאחר הדגירה
    1. אליקווט A (ניתוח היסטולוגי):
      1. קיבעו את דגימות הרקמה ב-4% פאראפורמלדהיד (PFA) למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשמירת הארכיטקטורה התאית.
      2. לאחר קיבוע הרקמות, יש להטמיע את הרקמות בתרכובת OCT ולבצע צביעת המטוקסילין ואיוזין (H&E) להערכת שלמות הרקמה והמורפולוגיה.
        אזהרה: פאראפורמלדהיד הוא קיבע מסוכן; לטפל בו בתוך מכסה אדים באמצעות ציוד מגן אישי מתאים
    2. Aliquot B (ניתוח פלואורסצנציה וכימות גנום):
      1. הקפיאו את הרקמה שנותרה בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לעיבוד נוסף.
      2. השתמשו בדגימות הקפואות למיקרוסקופיה פלואורסצנצית כדי לזהות ביטוי EGFP, להערכת יעילות הטרנספקציה או קליטת הווירוס.
      3. לבצע חילוץ DNA ואחריו qPCR כדי לקבוע את מספר עותק הגנום הוויראלי או ביטוי גן טרנסגני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה שימש להערכת יעילות העברת הגנים המתווכת על ידי AAV9 במקטעים שונים במעי הדק, וכן את השפעת טיפול ה-GZNG על שיפור העברת הגנים והביטוי. נצפו מספר תוצאות מרכזיות, המדגימות הן את יישום הפרוטוקול בהצלחה והן את השונות שיכולה להיווצר בתנאים מסוימים.

הערכת ביטוי EGFP בתיווך AAV9 באמצעות ניתוח היסטולוגי (צביעת H&E) ופלואורסצנציה (EGFP) במעי הדק (תריסריון, ג'ג'ונום, איליאום ומעי גס) הראתה טרנסדוקציה מוצלחת בכל הרקמות שנבדקו (איור 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה הוקמה גישה חדשה במבחנה להערכת ספיגת rAAV במעי באמצעות התאמת מודל השק המעי הקלאסי. שיטה זו מאפשרת ניתוח ספציפי למקטע של יעילות ההעברה של AAV במעי הדק בתנאים מבוקרים והערכת ההשפעות הסינרגטיות בין הרפואה הסינית ל-rAAV. כאן נדונים השלבים הקריטיים, פתרון תקלות ושינויים, מגבלות, ויישומיהם הרחבים בטיפול גנטי ובמתן תרופות.

שלבים טכניים קריטיים
יישום מודל שק המעי המוצא למחקרי העברת rAAV דורש תשומת לב קפדנית למספר שלבים טכניים הקריט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

המחברים רוצים להודות לכל הקולגות והשותפים שסיפקו דיונים חשובים וסיוע טכני לאורך כל המחקר הזה. אנו גם מעריכים את התמיכה המוסדית שאפשרה עבודה זו. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענק #82474349 מקרן המדע הטבעי הלאומית של סין (ל-CL).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMבהכרח319-005-CLנוזלי, עם 4.5 גרם לליטר D-גלוקוז, עם L-גלוטמין, פנול אדום ונתרן פירובט
פריימרים של אזור CDS ל-qPCR של EGFPצ'ינגקהחלוץ: 5'-ACTTCTTCAAGTCCGCCATG-3'; R: 5'-TGTCGGCCATGATATAGACG-3'
סרום בקר עובריבהכרח086-550איכות מעולה, דרגת תרבית תאים ראשונית
פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)בהכרח450-201-ELתמיסה זו מכילה 10,000 יחידות למ"ל פניצילין ו-10,000 מיקרו; g/mL של סטרפטומיצין.
PrimeScript RT Master Mix (מושלם בזמן אמת)טאקארהRR036A
ערכת חילוץ RNA אוניברסלית TaKaRa MiniBESTטאקארה9767
TSINGKE TSE401 ArtiCanCEO SYBR qPCR Mixצ'ינגקהTSE401מוצר זה מתאים לניסויים כמותיים בפלואורסצנציה בשיטת צבע SYBR Green ותואם למכשירי PCR כמותיים פלואורסצנטיים בזמן אמת שונים.
צ'ינגקה TSP202-200 טרליף  ערכת DNA גנומית של בעלי חיים Hi-Pureצ'ינגקהTSP202-200
הפתרון של טירודיואן יהR20268-500mlהוא מורכב בעיקר מכלוריד נתרן, כלוריד אשלגן, כלוריד מגנזיום, פוספטים, כלוריד סידן, גלוקוז ו-HEPES.

מקורות

  1. Wang, J. H., et al. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 78(2024).
  2. Durbacz, M. Z., et al. Optimized genomic editing of a common Duchenne muscular dystrophy mutation in patient-derived muscle cells and a new humanized mouse model. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (2), 102569(2025).
  3. Hara, H., et al. An oral Aβ vaccine using a recombinant adeno-associated virus vector in aged monkeys: reduction in plaque amyloid and increase in Aβ oligomers. J Alzheimers Dis. 54 (3), 1047-1059 (2016).
  4. Xin, K. Q., et al. Oral administration of recombinant adeno-associated virus elicits human immunodeficiency virus-specific immune responses. Hum Gene Ther. 13 (13), 1571-1581 (2002).
  5. Hara, H., et al. Development of a safe oral Abeta vaccine using recombinant adeno-associated virus vector for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 6 (5), 483-488 (2004).
  6. Steel, J. C., et al. Oral vaccination with adeno-associated virus vectors expressing the neu oncogene inhibits the growth of murine breast cancer. Mol Ther. 21 (3), 680-687 (2013).
  7. Ma, H., et al. Oral adeno-associated virus-sTRAIL gene therapy suppresses human hepatocellular carcinoma growth in mice. Hepatology. 42 (6), 1355-1363 (2005).
  8. Hao, Z. M., et al. Oral administration of recombinant adeno-associated virus-mediated bone morphogenetic protein-7 suppresses CCl4-induced hepatic fibrosis in mice. Mol Ther. 20 (11), 2043-2051 (2012).
  9. Huang, W., et al. Genetic manipulation of brown fat via oral administration of an engineered recombinant adeno-associated viral serotype vector. Mol Ther. 24 (6), 1062-1069 (2016).
  10. Liu, X., et al. Adipose tissue insulin receptor knockdown via a new primate-derived hybrid recombinant AAV serotype. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 8(2014).
  11. Alam, M. A., Al-Jenoobi, F. I., Al-Mohizea, A. M. Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: limitations and applications. J Pharm Pharmacol. 64 (3), 326-336 (2012).
  12. Lassoued, M. A., Khemiss, F., Sfar, S. Comparative study of two in vitro methods for assessing drug absorption: Sartorius SM 16750 apparatus versus everted gut sac. J Pharm Pharm Sci. 14 (1), 117-127 (2011).
  13. Yang, Y. N., Zhan, J. G., Cao, Y., Wu, C. M. From ancient wisdom to modern science: Gut microbiota sheds light on property theory of traditional Chinese medicine. J. Integr. Med. 22 (4), 413-444 (2024).
  14. Liao, C. P., et al. Intestinal absorption components and absorption characteristics of Wuwei Qingzhuo San by everted intestinal sac models. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 49 (2), 509-517 (2024).
  15. Liao, Z. G., et al. Transport properties of puerarin and effect of extract of Radix Angelicae Dahuricae on puerarin intestinal absorption using in situ and in vitro models. Phytother Res. 28 (9), 1288-1294 (2014).
  16. During, M. J., Xu, R., Young, D., Kaplitt, M. G., Sherwin, R. S., et al. Peroral gene therapy of lactose intolerance using an adeno-associated virus vector. Nat. Med. 4 (10), 1131-1135 (1998).
  17. Hao, Z., Yang, X., Lv, Y., Li, S., Purbey, B. K., et al. Intracolonically administered adeno-associated virus-bone morphogenetic protein-7 ameliorates dextran sulphate sodium-induced acute colitis in rats. J. Gene Med. 14 (7), 482-490 (2012).
  18. Meng, J. S., et al. Melittin analog p5RHH enhances recombinant adeno-associated virus transduction efficiency. J. Integr. Med. 22 (1), 72-82 (2024).
  19. Sun, H., et al. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 4 (4), 395-411 (2008).
  20. Meneses, A. M. C., et al. Intestinal organoids—current and future applications. Vet Sci. 3 (4), 31(2016).
  21. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19 (1), 98(2019).
  22. Caldeira, T. G., et al. Determination of intestinal permeability using in situ perfusion model in rats: challenges and advantages to BCS classification applied to digoxin. Int J Pharm. 551 (1-2), 148-157 (2018).
  23. Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411(2019).
  24. Mateer, S. W., et al. Ex vivo intestinal sacs to assess mucosal permeability in models of gastrointestinal disease. J Vis Exp. (108), e53250(2016).
  25. Liu, W., et al. Developments in methods for measuring the intestinal absorption of nanoparticle-bound drugs. Int J Mol Sci. 17 (7), 1171(2016).
  26. Lengler, J., et al. Crucial aspects for maintaining rAAV stability. Sci Rep. 14, 27923(2024).
  27. Benskey, M. J., et al. Targeted gene delivery to the enteric nervous system using AAV: a comparison across serotypes and capsid mutants. Mol Ther. 23 (3), 488-500 (2015).
  28. Polyak, S., et al. Gene delivery to intestinal epithelial cells in vitro and in vivo with recombinant adeno-associated virus types 1, 2, and 5. Dig Dis Sci. 53 (5), 1261-1270 (2008).
  29. Dudhatra, G. B., et al. A comprehensive review on pharmacotherapeutics of herbal bioenhancers. Scientific World Journal. 2012, 637953(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

rAAV

מאמרים קשורים