מאמר שיטה

הערכת הפעילות המטבולית של חדרי דגי זברה המתחדשים מחוץ לחיים באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאית

538 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70459

⸱

17 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

במאמר זה

סיכום

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לכימות קצב צריכת החמצן וקצב החמצה החוץ-תאית של חדרי דגי זברה בוגרים מחוץ לחיים כדי לאפיין את היכולת המטבולית החמצונית והגליקוליטית שלהם.

תקציר

היכולת של דגי זברה לחדש את ליבם במהלך הבגרות מיוחסת בחלקה להתאמות מטבוליות. למרות שהועלתה השערה כי לב הדג תלוי באופן משמעותי בגליקוליזה, מחקרים עדכניים חשפו פרופיל מטבולי מורכב יותר שבו מטבוליזם חמצוני מתפתח כרכיב חיוני בהתחדשות הקרדיומיוציטים ובהתחדשות הלב המוצלחת בשלבים מאוחרים. בשנת 2025 אימצנו שיטה בעלת תפוקה גבוהה להערכת הפרופיל המטבולי של חדרי דג הזברה השלמים מחוץ לחיים, תוך שימוש בבדיקת Seahorse (בדיקת שטף חוץ-תאי). שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה בזמן אמת של קצב צריכת החמצן הבסיסי והמקסימלי (OCR) וקצב החמצה החוץ-תאית (ECAR) באמצעות מבחן XF Mito Stress על מנתח Seahorse XFe24. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לביצוע ניתוח שטף חוץ-תאי על כל חדרי דג הזברה. היכולת לכמת את ה-OCR וה-ECAR בלבבות חיים מלאים אקס ויבו תספק הזדמנות להבהיר את חילוף החומרים הלבבי בנקודות זמן קריטיות במהלך ההתפתחות, התקדמות המחלה וההתחדשות.

מבוא

בניגוד לבני אדם, דגי זברה (Danio rerio) שומרים על היכולת לחדש רקמת לב שאבדה לאורך כל חייו הבוגרים1. לאחר פגיעת לב, הקרדיומיוציטים באזור הגבול של הפצע מתפרקים ונכנסים מחדש למחזור התא 2,3 במטרה לשקם את מספרהקרדיומיוציטים 4 ולשקם את הפצע. לאחרונה, הוכרה חשיבותה של התחדשות קרדיומיוציטים בתהליך ההתחדשות5. שני התהליכים הללו מוסדרים בקפדנות על ידי שינויים מטבוליים בלב דג הזברה, כאשר גליקוליזה מניעה רבייה 6,7 וזרחון חמצוני (OXPHOS) מקדם התבוננותמחדש 8. למרות ששיטות פרמקולוגיות וגנטיות למניפולציה של חילוף חומרים נפוצות בתחום ההתחדשות 6,7, אימות ההשפעות המטבוליות של אותן הפרעות נותר מאתגר בשל גודלו הקטן של לב דג הזברה, שדורש התקנה מורכבת ומותאמת אישית לקנולציה 9,10,11 או לאיחוד לבבות מרובים לספקטרומטריית מסה12 או ספקטרוסקופיית NMR 8, 13.

כדי לעקוף מגבלות אלו, תיארנו לאחרונה את השימוש באנלייזר Seahorse XFe24 לפרופיל מטבולי בקצב גבוה של חדרי זברה שלמים ex vivo8. מבחן השטף החוץ-תאי מיועד למדוד את קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב החמצה החוץ-תאית (ECAR) של תאים, איי לבלב וספירואידים. זה מושג באמצעות חיישנים במצב מוצק שמזהים שינויים בריכוז החמצן והפרוטונים (pH) במדיה הנובעים מניצול שרשרת העברת אלקטרונים נשימתית של חמצן וייצור לקטט תלוי גליקוליזה, בהתאמה (איור 1A)14.

ניתוח השטף החוץ-תאי יכול להתבצע על פלטות עם 96 בארות (XFe96 ו-XF Pro), מיניפלטות עם 8 בארות, או גרסאות שונות של לוחות 24 בארות (XFe24). למרות שלוחות 96 הבארות מספקים תפוקה גבוהה יותר, מרחק העבודה בין החיישן לקרקעית הבאר אינו מתאים להכיל את כל חדר דג הזברה. בנוסף, בפורמט לוח 96 בארים, אין אפשרות לאבטח את החדר בתחתית הבאר כדי למנוע ממנו לצוף במדיה ולהפריע לחיישנים. מצד שני, מיקרופלטת לכידת האי XFe24 תוכננה במקור לאפיון מטבולי של איים ראשוניים בלבלב, ולכן מאפשרת הצטברות הרקמה בתחתית הבאר, אשר מאובטחת על ידי רשת (רשת). עקב גודלו הקטן של לב דג הזברה, הצלחנו להתאים את לוח הלכידת האי לשימוש על חדרי דגי הזברה, שנשארים מאובטחים מתחת לרשת לאורך כל תקופת הבדיקה.

להערכת קיבולת הנשימה המיטוכונדריאלית השתמשנו במבחן הלחץ של מיטו שבו השתמשו בארבעה מעכבים של שרשרת העברת האלקטרונים ובסינתאז אדנוזין טריפוספט (ATP) (איור 1A). ראשית, מדידות בסיסיות של ה-OCR נרכשות (איור 1B, מג'נטה). לאחר מכן מוזרק אוליגומיצין, מעכב V מורכב. אוליגומיצין מעכב את פעילות הסינתאז של ATP ולכן מוביל לירידה ב-OCR, הנובעת מייצור ATP (איור 1B, ירוק). צריכת החמצן שנותרה היא תוצאה של נשימה לא מחוברת וצריכת חמצן לא-מיטוכונדריאלית (איור 1B, כתום ואפור, בהתאמה)15. לאחר אוליגומיצין, מזריק FCCP, שמפזר את גרדיאנט הפרוטונים דרך ממברנת המיטוכונדריה (איור 1A). בניסיון לשחזר את גרדיאנט הפרוטונים, המיטוכונדריה מגבירה את צריכת החמצן שלה לקיבולת המקסימלית שלהן (איור 1B, כחול). לבסוף, נעשה שימוש בתערובת של רוטנון ואנטימיצין A שמעכבת קומפלקסים I ו-III, בהתאמה (איור 1A). שילוב תרופות זה מוביל לכיבוי מוחלט של פעילות שרשרת העברת האלקטרונים הנשימתית המיטוכונדריאלית עקב חוסר זרימת אלקטרונים מהקומפלקסים I ו-III למתחם IV15. דבר זה מאפשר מדידת צריכת חמצן לא-מיטוכונדריאלית (איור 1B, אפור).

בסך הכל, באמצעות מיקרופלטת לכידת האיים עם מבחן הלחץ של מיטו, הצלחנו להעריך במהירות ובאופן שחזורי את היכולת המטבולית החמצונית והגליקוליטית של כל חדרי דגי הזברה מחוץ לחיים. להלן אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט של הליך זה. לבסוף, אנו מראים את הישרדותם של חדרים מבודדים מסוג פראי, מחוץ לחיים מחוץ לחיים , באנלאזר השטף החוץ-תאי, ומאמתים את מבחן הלחץ של מיטו על 14 ימים לאחר פגיעת קריוגני (DPCI) של חדרי דג זברה טרנסגניים8.

פרוטוקול

כל ההליכים המתוארים להלן בנוגע לבעלי חיים בוצעו בהתאם לחוק בעלי החיים (נהלים מדעיים) המתוקן 1986 בבריטניה ולהוראת 2010/63/EU באירופה, ואושרו על ידי הוועדה המרכזית לטיפול בבעלי חיים וסקירה אתית של אוניברסיטת אוקספורד.

הערה: פרוטוקול זה בוצע באמצעות אנלייזר Seahorse XFe24 ומדיום Seahorse DMEM ללא פנול אדום וביקרבונט.

1. פציעת לב קריו-פלישה (אופציונלי)

  1. קבל את האישור האתי המתאים מהמוסד המקומי ומהרשויות הלאומיות לפני תחילת הניסוי.
  2. לבצע קריופראקט על לבבות דגי הזברה כפי שתואר קודם 16,17,18.

2. לחות את מחסנית החיישן

  1. פתח את ערכת בדיקת השטף החוץ-תאית וטען את פלטת השירות של 24 בארות (איור 2A) על ידי פיפטינג של 500 מיקרו-ליטר של תמיסת הכיול לכל באר.
  2. סגור את פלטת השירות באמצעות מחסנית החיישן ומגבר ההידרו (איור 2A).
  3. דגרו את המקלט ולוחית השירות באינקובטור לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה (18–72 שעות). שמור את המכסה על מחסנית החיישן לאורך כל תקופת הדגירה.

3. הכנת פתרונות התרופות והמדיה

  1. הכינו תמיסות סטנדרטיות של התרופות: המיס את האוליגומיצין בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) לריכוז של 10 מ"מ, את הציאניד הקרבוניל 4-(טריפלואורומתוקסי)פנילהידראזון (FCCP) ב-DMSO לריכוז של 5 מ"מ, את הרוטנון ב-DMSO לריכוז של 10 מ"מ ואנטימיצין A באתנול לריכוז של 10 מ"מ ולשמור בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס אם לא משתמשים בו מיד.
    הערה: מומלץ להכין תמיסות טריות של אוליגומיצין, רוטנון ואנטימיצין כל 2–3 חודשים, ותמיסת FCCP בכל פעם לפני ביצוע הבדיקה.
  2. הכנת ריכוז עבודה של התרופות (500 מיקרומום אוליגומיצין, 300 מיקרומום FCCP, 450 מיקרומום כל תערובת רוטנון/אנטימיצין A) על ידי דילול תמיסת המאגר במדיה DMEM. ודא שנפח הריכוזים הסופיים הוא 1.5 מ"ל לאוליגומיצין, 1.65 מ"ל ל-FCCP, ו-1.8 מ"ל לרוטנון/אנטימיצין A, מה שמאפשר טעינה של 30 פורטים (24 פורטים לכל מעכב במחסנית ועוד 6 פורטים נוספים לכל תרופה לתיקון שגיאות פיפטינג).
    הערה: יופיעו משקעים מסוימים ברוטנון/אנטימיצין A, אך לאחר ערבוב טוב, הם יוקטעו. שימו לב שהריכוזים המוזכרים ב-3.2 הם פי 10 מהריכוז הסופי של התרופות כאשר יוזרקו לבארות.
  3. הכינו את מדיום ה-DMEM (pH 7.4) להכיל 10 מ"מ גלוקוז, 1 מ"מ פירובט ו-2 מ"מ גלוטמין, ואחסנו ב-20- מעלות צלזיוס עד לשימוש.

4. הפעלת מנתח השטף החוץ-תאי

  1. הפעל את האנלייזר מהכפתור הצדדי במהלך הלילה לפני הבדיקה כדי לאפשר איזון טמפרטורה עם הסביבה.
  2. הפעל את המחשב ופתח את תוכנת Wave.
  3. בחר במבחן הלחץ של מיטו בתוכנה.
  4. כבה את התנור בפינה השמאלית התחתונה של התוכנה כך שהטמפרטורה באנלייזר תרד מתחת ל-37 מעלות צלזיוס ותגיע ל-28–29 מעלות צלזיוס, כדי להתקרב לטמפרטורה הסטנדרטית של גידול דגי זברה19.
  5. הגדר את אסטרטגיית ההזרקה בדף הגדרות הקבוצה (תחת לשונית אסטרטגיות ההזרקה ) על ידי הוספת התרכובות שיופקדו בכל פורט מתוך קטלוג התרכובות. למבחן Mito Stress, הוסף אוליגומיצין בפורט A, FCCP בפורט B, ורוטנון/אנטימיצין בפורט C. יש קיבולת להוספת תרופה נוספת בפורט D, שאינה בשימוש בפרוטוקול זה.
  6. מחק את כל האסטרטגיות המתוכננות מראש הקיימות תחת לשונית אסטרטגיות ההזרקה לאחר הגדרת האסטרטגיה הניסויית. ציין את קבוצות הניסוי (למשל, wild-type ומוטנט) בצד הקבוצות של הדף, וציין את אסטרטגיית ההזרקה שהם יקבלו (זו שהוגדרה בשלב 4.5). ודא שאסטרטגיות ההזרקה תואמות בין הקבוצות וגם תואמות את אסטרטגיית ההזרקה שתוכננה.
  7. בדף מפת הלוחות , ציין את מיקום כל דגימה על פלטת 24 הבארות על ידי לחיצה על כל קבוצה ואז לחיצה על הבארות שיכילו את הדגימות.
    1. יש לשים לב כי ארבע מהבארות אינן מתאימות להצבת דגימות (איור 2B) ומשמשות כחללים שישמשו לתיקון רקע. ודאו שהדגימות בכל קבוצה מפוזרות באופן שווה על פני הפלטה כדי לאזן את ההטיה המיקום האפשרית במדידות או בתנאי הסביבה.
  8. בדף הפרוטוקול , הסר את לשונית Control או Experiment אם לא נעשה שימוש במעכב נוסף מלבד אלו שהוזכרו לעיל, וודא שפורטי התוכנה תואמים למיקומי התרופות על המחסנית.
  9. התוכנה מגדירה אוטומטית 3 מחזורי ערבוב, המתנה ומדידה לכל תנאי. שנו את מספר המחזורים ל-10 מדידות בסיסיות (לא מטופלות), 3 אוליגומיצין, 7 FCCP ו-9 רוטנון/אנטימיצין A כדי לאפשר עקבות יציבים ולפעול המעכבים על הרקמה התלת-ממדית. ודאו שכל מחזור כולל 3 דקות ערבוב, 2 דקות המתנה ו-3 דקות מדידה.

5. כיול אנלייזר

  1. הסרת המחסנית ולוח השירות מהאינקובטור הלח (ראו שלבים 2.1–2.3).
  2. הסר את הבוסטר ההידרו והמכסה (איור 2A) מהמחסנית והניח את מחסנית החיישן על לוח השירות המכיל את הכיול.
  3. הפיפט בעדינות את המעכבים ליציאות הרלוונטיות שלהם תוך נגיעה בדופן הצדדית של הפתח עם קצה הפיפטה, כדי להבטיח זרימה חלקה של הנוזל: 50 מיקרוליטר אוליגומיצין בפורט A, 55 מיקרוליטר FCCP ביציאה B, ו-60 מיקרוליטר רוטנון/אנטימיצין A ביציאה C (איור 2C).
    1. שימו לב שהנוזל מוחזק במקום רק באמצעות מתיחות פנים בחור הפתח, לכן הימנעו מפיפטינג או הדבקה פתאומית של המחסנית מהשלב הזה ואילך. ודא שאין נוזל שנכנס ליציאת החיישן (איור 2C) כי זה עלול להזיק לאנלייזר.
  4. לחץ על start run בתוכנה, שם את הריצה, ושמור אותה במחשב. בשלב זה, מגש האנלייזר ייפתח כדי להניח את המחסנית ולוחית השירות.
  5. הנח את המחסנית הטעונה עם התרופות ואת פלטת השירות המכילה את הכיוב על מגש האנלייזר בהתאם למפת הלוחית (באר A1 בפינה השמאלית העליונה) וודא התאמה נכונה. הסר את מגבר הברז ואת המכסה (איור 2A) מהפלטה לפני שמכניסים אותו למגש. אי עמידה בזה תפגע באנלייזר.
  6. כשאתה מוכן, הורה לתוכנה להתחיל את הבדיקה על ידי לחיצה על הרצת מבחן. בשלב זה, המנתח יקבל את המגש הטעון ויתחיל את הכיול.
  7. התחל את בידוד הלב (ראו שלבים 6.1–6.12). הכיול יימשך כ-40 דקות, אך ניתן לשמור את הפלטה באנלייזר כל עוד יידרש לבודד את הלבבות ולמקם במיקרופלטת לכידת האיים (איור 2B,D).

6. בידוד לבבות הדגים והעמסתם על צלחת האי בעלת 24 הבארות

  1. פתח את לוח הלכידת האי והעמיס את לוח האי עם 24 בארות ב-500 מיקרוליטר DMEM (10 מילימטר גלוקוז, 1 מילימטר פירובאט, 2 מילימטר גלוטמין) בטמפרטורת החדר.
  2. הניחו את כל הרשתות בצלחת פטרי בגודל 35 מ"מ המכילה מדיה DMEM בטמפרטורת החדר, כדי להבטיח שהן טבולות לחלוטין וללא בועות גדולות.
  3. הכינו צלחת פטרי נוספת בקוטר 35 מ"מ המכילה DMEM (10 מ"מ גלוקוז, 1 מ"מ פירובאט, 2 מ"מ גלוטמין) בטמפרטורת החדר. זה ישמש לשטוף את הלבבות בעת האיסוף ולנתח את החדר מהעלייה ומהבולבוס ארטריוזוס.
  4. תכבוש דג אחד ב-MS-222 של 5 גרם לליטר ותבדוק אם אין רפלקסים.
  5. הניחו את הדג על ספוג המאובטח על צלחת פטרי בקוטר 92 מ"מ, פתחו את חלל הלב ונתחו את הלב כפי שתוארקודם 16,20.
  6. שטוף את הלבבות בצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה DMEM (10 מ"מ גלוקוז, 1 מ"מ פירובאט, 2 מ"מ גלוטמין) בטמפרטורת החדר.
  7. הסר את האטריום והבולבוס ארטריאוסוס באמצעות המלקחיים בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ.
  8. נער ולחץ בעדינות על החדר כדי שהדם ייצא מהלומן שלו. אין לפגוע בדופן החדר בעת שטיפת הלב.
  9. העבר את הלב לבאר המיועדת שלו במיקרופלטת לכידת האי ואפשר לו לשקוע למרכז הבאר המתאימה לפי מפת הלוחות. שמור על הצלחת בטמפרטורת החדר. כלול את כל החדרים בבדיקה, גם אם הם מפסיקים לפעום לעין.
  10. חזור על התהליך עבור כל הדגים הזמינים. אם משווים את הפעילות המטבולית של קבוצות ניסוי שונות, אנו ממליצים לבודד לב אחד בכל קבוצה במקום את כל הלבבות מקבוצה אחת לפני שתעבור לשלב הבא. למרות שהלבבות יכולים לשרוד לפחות 180 דקות באנלייזר (איור 3A), אנו מציעים שהבידוד מתרחש לב אחד לכל קבוצה בכל פעם כפרקטיקה מיטבית להבטחת חלוקה שווה של הזמן במדיה בין הקבוצות.
  11. לאחר שכל הלבבות בודדו (כ-60 דקות לפלטה של 20 לבבות), מניחים אותם בתחתית בארות המיקרופלט של האי (איור 2B), ומקמו אותם במרכז הבאר באמצעות מלקחיים דקים (איור 2D,E).
  12. השתמש במלקחיים כדי לכסות אותם עם הרשת (כ-20 דקות) (איור 2D). ודא שהרשת בכיוון הנכון (הרשת פונה כלפי מטה לכיוון הלב) ואינה מכילה בועות גדולות, שכן זה עלול להפריע למדידות (איור 2E).
    1. לאחר שהרשת במקומה, השתמש במלקחיים כדי לדחוף אותה מהקצוות עד שנשמע קליק קל. תוודא שלא תתנגש בלב עם המלקחיים דרך הרשת.

7. טעינת הדגימות על האנלייזר ורכישת מדידות

  1. לאחר שהלבבות סגורים במיקרופלטת לכידת האי, בדוק בתוכנה שכל הבארות כויללו בהצלחה, כפי שמצוין בסימני טיק ירוקים על מסך המחשב. עכשיו תוציא את פלטת השירות על ידי לחיצה על מגש פתוח.
    הערה: המחסנית לא תיפלט בשלב זה, ורק פלטת השירות המכילה את הכיול תופיע.
  2. החלף את פלטת השירות במיקרופלטת האי המכילה את הדגימות במגש האנלייזר. ודאו שהמיקרופלט של האי ממוקם נכון (A1 בפינה העליונה-שמאלית) ושהמכסה הוסר. אי הסרת המכסה תפגע באנלייזר.
  3. לאחר מיקום לוח האי, הורה לתוכנה להתחיל את הניסוי על ידי לחיצה על לוח תא העומס. במהלך כ-10 הדקות הראשונות, החיישנים יבצעו שלב איזון, ואז המדידות יתחילו.
  4. לאחר סיום הניסוי (כ-4 שעות), לחץ על פליטת מחסנית כדי שהמגש ייפתח ויוציא את המיקרופלטה והמחסנית של האי.
  5. הסר את המיקרופלטה והמקלטית של האי, ולחץ על זה כדי שהמגש ייסגר. בשלב זה, לחץ על הצג תוצאות כדי לראות את הנתונים שנאספו.
  6. שמור את המדידות, ייצא אותן מהמחשב של האנלייזר, והעלה אותן לממשק האנליטיקה להמשך ניתוח ועיבוד. זה יפעיל את כריתת צלחת האי והמחסנית מהאנלייזר.
  7. הסר את פלטת האי והמחסנית מהאנלייזר וסגר את המחסנית באמצעות המכסה.
  8. הקפיאו את צלחת האי על קרח יבש או הסירו את הלבבות מהבארות (ראו שלב 8.2) ואחסנו בטמפרטורה של -20°C אם בידוד החלבון לנרמול (שלב 8) לא בוצע מיד.
  9. לאחר שהנתונים נשמרים, כבו את התוכנה, את האנלייזר ואת המחשב.
  10. העלה את הנתונים לממשק האנליטיקה והמחיש אותם על ידי בחירת גרף ה-OCR מתוך אפשרות התצוגות הסטנדרטית . בממשק, הצג את הנתונים כ-OCR ורמת ECAR או קצב, תקן רקע לפי בארות ריקות, ובחר בארות להמחשה על ידי לחיצה על מפת הלוחות כדי להופיע או להיעלם.

8. בידוד וכימות חלבונים לצורך נרמול

  1. הכנת בופר רדיואימונופרציפיטציה (RIPA) המכיל מעכב פרוטאז על ידי המסה של טבליית מעכב פרוטאז אחת ב-10 מ"ל של בופר RIPA וערבוב היטב.
  2. אם לא עשו זאת כבר (שלב 7.8), באמצעות כלי הכניסה למסך לכידת האי (איור 2F), הסר את הרשתות מלוח האי כדי לשחרר את הלבבות. הסר את הלבבות בזהירות, כי הם עלולים להיתקע על הרשת. אם זה המצב, השתמשו במלקחיים כדי לשחרר אותם. אם לא ניתן להסיר את הרשת באמצעות כלי הכנסת המסך, העבר את הפלטה מתחת לסטריאוסקופ ובמספריים מיקרודיסקציה חתכו בזהירות את הרשת כדי לשחרר את הלב.
  3. הניחו כל חדר בצינור בנפח 1.5 מ"ל המכיל 200 מיקרו-ליטר של בופר RIPA מועשר במעכב פרוטאז על הקרח.
  4. הומוגניזציה של הלב באמצעות הומוגניזר עם עלים חד-פעמיים על קרח.
  5. הכינו את התקנים על ידי דילול אלבומין הסרום הפר (BSA) בבופר RIPA בריכוזים הבאים: 2000 מיקרוגרם/מ"ל, 1500 מיקרוגרם/מ"ל, 1000 מיקרוגרם/מ"ל, 750 מיקרוגרם/מ"ל, 500 מיקרוגרם/מ"ל, 250 מיקרוגרם/מ"ל, 125 מיקרוגרם/מ"ל, 25 מיקרוגרם/מ"ל, 0 מיקרוגרם/מ"ל.
  6. הכינו את תמיסת ה-BCA של פירס (50:1, מגיב A: מגיב B, לפי הוראות היצרן). חשב את נפח התגובה הפעיל הנדרש באמצעות הנוסחה הבאה:
    (מספר תקנים + מספר דגימות) × 2 × 200 מיקרוליטר
    הערה: נפח זה מאפשר שימוש ב-200 מיקרו ליטר של תמיסה עובדת לכל דגימה ותקן, ומאפשר רכישת מדידות כפולות לכל דגימה ותקן.
  7. בלוח עם 96 בארות, הוסף 25 מיקרוליטר מכל תקן וכל דגימה לכל באר בשכפולים.
  8. הוסף 200 מיקרוליטר מהתמיסה העובדת לכל באר.
  9. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  10. תן לצלחת להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ואטום אותה עם אטם לפלטות. ודא שאין בועות בבארות, כי זה עלול להפריע לקורא הלוחות. אם נוצרים מספר מוגבל של בועות, השתמש בקצה או במלקחיים דקים כדי להתפוצץ אותן.
  11. מדדו את הספיגה ב-562 ננומטר באמצעות קורא לוחות.
  12. יצירת עקומת תקן המבוססת על ספיגת התקנים וחישוב ריכוז החלבון בדגימות.
  13. תתעד את ריכוז החלבון בלשונית הנרמול (איור 2G) של ממשק האנליטיקה של כל באר.

9. ניתוח נתונים

  1. לאחר הנרמול מול תוכן החלבון, ייצא את הנתונים מממשק האנליטיקה כקבצי Excel או Prism לניתוח נוסף באמצעות כפתור הענן בפינה הימנית העליונה של הגרף.
  2. באמצעות הנתונים המנורמלים, חשב את ה-OCR וה-ECAR הבסיסיים כממוצע של מדידות הבסיס, ללא שלוש הרכישות הראשונות, שכן האות עלול להיות לא יציב במדידות הראשונות.
  3. באמצעות הנתונים המנורמלים, כדי לציין את ה-OCR וה-ECAR המקסימליים, חישבו את המדידות הממוצעות של שלושת הרכישות המובילות של טיפול FCCP.

תוצאות

פרוטוקול זה מאפשר לכימות את ה-OCR וה-ECAR של חדרי דג הזברה השלמים. אימתנו את שרידות החדרים במצב אקס ויבו על ידי דגירה של חדרי KCL פראיים לא פגועים באנלייזר בהיעדר טיפול תרופתי (איור 3A). הנתונים מראים כי החדרים בעלי OCR ו-ECAR יציבים, שהם גבוהים משמעותית מהמדידות הבסיסיות של הבארות הריקות למשך לפחות 180 דקות (איור 3A). הנתונים מצביעים על כך שהחדרים מראים תפקוד נשימתי תקין והישרדות בסביבה אקס-ויבו זו.

ביצענו מספר מדידות OCR באמצעות ריכוזים שונים של תרופות ונוסחאות מדיה כדי לזהות את המינון האופטימלי לחדרים (איור 3B). ראינו עלייה קלה בשינוי קפל OCR (FCCP/basal) בעת שימוש בשילובים [אוליגומיצין] 10 מיקרומון, [FCCP] 8 מיקרומטר, ו-25 מיקרומון/אנטימיצין, ועלייה מעט גדולה יותר ב-50 מיקרומטר של אוליגומיצין, 30 מיקרומטר ו-45 מיקרומיצ'ן רוטנון/אנטימיצין (איור 3B). כתוצאה מכך, המשכנו עם הריכוזים האחרונים בניסויים שלנו. מכיוון שהחדר הוא מבנה תלת-ממדי, ייתכן שהתרופות פועלות בעוצמה על התאים החיצוניים של הרקמה מבלי להגיע לתאים בצד הלומינלי של החדר עצמו. כדי להתמודד עם זה, ביצענו שלב פרמיאביליזציה שבו טיפלנו בלבבות בספונין 0.5% במשך 30 דקות לפני דגירה ב-DMEM (10 מ"מ גלקטוז, 1 מ"מ פירובאט, 4 מ"מ גלוטמין). דבר זה גרם לירידה מתמשכת ב-OCR ולהיעדר העלייה הצפויה ב-OCR לאחר הזרקת FCCP (איור 3C), מה שמרמז שהלבבות נכשלו מטבולית. כתוצאה מכך, לא חדרנו את החדרים לניסויים שלנו.

יתרה מזאת, אנו מציגים כאן את העקבות המנורמלות מהניסוי המקורישלנו 8. בניצול השונות הטבעית בפוטנציאל ההתחדשות של שבעה זני דגי זברה פראיים, זיהינו את mdh1ab, המלאט הציטוזולי דהידרוגנאז 1Ab, כבעל השפעה חיובית על ההתחדשות באמצעות התחדשות קרדיומיוציטים. כדי לאמת ממצא זה, יצרנו דג זברה טרנסגני שמבטא יתר על המידה mdh1ab באופן ספציפי לקרדיומיוציטים (mdh1ab cOE) ודג בקרה שמביע פרץ חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP cOE). פצענו את החדרים בקריו, אספנו אותם ב-14 dpci, וחקרנו את חילוף החומרים שלהם באמצעות מבחן הלחץ של מיטו (איור 3D). הטיפול באוליגומיצין לא שינה באופן משמעותי את ה-OCR, אם כי נצפתה עלייה קלה ב-ECAR. הזרקת FCCP למדיה הביאה לעלייה הצפויה ב-OCR וב-ECAR, כאשר דגימות mdh1ab cOE שמרו על קיבולת נשימתית מקסימלית (איור 3D). לבסוף, רוטנון/אנטימיצין הובילו להפסקה מוחלטת של חילוף החומרים בשתי הקבוצות. בסך הכול, שיטה זו אפשרה לנו לזהות הבדלים משמעותיים ביכולת המטבולית של החדרים המבטאים יותר מדי את mdh1ab ובין שבעה זני דגי זברה פראייםשונים 8.

figure-results-1
איור 1: מטבוליזם של הגלוקוז במהלך בדיקת לחץ של מיטו. (א) ייצוג סכמטי של מטבוליזם הגלוקוז. הגלוקוז נכנס לתא דרך נשאי ה-GLUT ומומר לפירובט דרך גליקוליזה. לקטט דה-הידרוגנאז (LDH) ממיר פירובט ללקטט, והפרוטונים שנוצרים מופרשים מהתא. פירובאט מומר לאצטיל-CoA ונכנס למחזור המיטוכונדריה ו-TCA כדי להזין את שרשרת העברת האלקטרונים הנשימתית בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה. המעכבים של הקומפלקסים I, III ו-V, כמו גם המפרק FCCP, מסומנים באדום. אלקטרונים המועברים דרך שרשרת העברת האלקטרונים הנשימתית מסומנים בחצים כחולים, שמובילים בסופו של דבר להמרת חמצן ופרוטונים למים. (ב) סכמת תוצאות בדיקת מאמץ של מיטו. הנשימה הבסיסית מזוהה במג'נטה. בהזרקת אוליגומיצין, ה-OCR יורד, מה שמאפשר חישוב הנשימה הקשורה ל-ATP (ירוק) וכן את דליפת הפרוטונים (כתום). FCCP מעלה את ה-OCR לקיבולת הנשימה המקסימלית של התאים (כחול). רוטנון והזרקת אנטימיצין A מובילות להפסקת הנשימה המיטוכונדריאלית ומאפשרת רק נשימה לא-מיטוכונדריאלית (אפורה). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: מחסנית חיישנים ותפיסת מיקרופלט לכידת האי. (א) תמונה של מחסנית חיישן המכסה-מחסנית הידרו-פלטת שירות (למעלה) ומחסנית החיישן ההפוכה (למטה). סקאלה-בר: 1 ס"מ. (B) תמונה של מיקרופלטת לכידת אי עמוסה בחדרי דגי זברה. העיגולים האדומים מציינים את הבארות הריקות שאינן מכילות חדרים, וישמשו כתיקון רקע במהלך הניתוח. סקאלה בר: 1 ס"מ. (C) ייצוג סכמטי של פריסת הפורט במחסנית החיישן XFe24. פורט A מכיל אוליגומיצין, B מכיל FCCP, ו-C מכיל את תערובת רוטנון/אנטימיצין. פורט D יכול להישאר ריק, או להוסיף תרופה נוספת. S מציין את פתח החיישן, שלא אמור להכיל נוזל כדי לא לפגוע באנלייזר. (ד) תמונה מייצגת של חדר דג זברה בתחתית הבאר, מוקף ברשת (משמאל) וללא רשת (מימין). סקאלה-בר: 5 מ"מ. (E) חתך סכמטי של מיקרופלטת לכידת האי הכולל חדר, רשת (צהובה) ומחסנית החיישן (ירוק). P מציין את היציאות ו-S את החיישן. הקו הגלי מייצג את המדיום. (ו) כלי לכידת מסך האי. סקאלה בר: 1 ס"מ. (G) אייקון לשונית הנרמול בממשק האנליטיקה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: מדידות OCR ו-ECAR מייצגות של חדרי דגי זברה. (א) עקבות מייצגים של OCR ו-ECAR של חדרי דגי זברה מסוג פראי לא פצועים (זן KCL) שלא טופלו במעכבים ששימשו בבדיקה (n = 2, קו אדום). העקבות הנובעות מבארות ריקות שאינן מכילות חומר ביולוגי מוצגות באפור (n = 4); OCR, מדידות חזרתיות דו-כיווניות ANOVA, מקדם זמן P = 0.0200, אינטראקציה בין זמן × באר P = 0.0196, פקטור באר P < 0.0001, גורם קבוצתי P < 0.0001; מדידות ECAR דו-כיווניות חוזרות ANOVA, מקדם זמן P = 0.1323, אינטראקציה בין זמן × באר P = 0.0216, פקטור באר P = 0.0009, גורם קבוצתי P<0.0001; הנתונים הוצגו כממוצע ± SEM. (B) שינוי קיפול OCR על ריכוזי תרופות שונים ומדיה בשימוש. ANOVA חד-כיווני (P = 0.0032) עם מבחן ההשוואות המרובות של טוקי. [O] 5 מיקרומטר, [F] 4 מיקרומון, [RA] 2 מיקרומטר, n = 6; [O] 10 מיקרומון, [F] 8 מיקרומון, [RA] 25 מיקרומטר, n = 8; [O] 25 מיקרומון, [F] 16 מיקרומון, [RA] 45 מיקרומון, n = 8; [O] 50 מיקרומטר, [F] 30 מיקרומון, [RA] 45 מיקרומון, n = 8; [O] 100 מיקרומטר, [F] 60 מיקרומטר, [RA] 90 מיקרומטר, n = 8. O, אוליגומיצין; F, FCCP; RA, רוטנון/אנטימיצין. (C) עקבות של חדרים חדירים-ספונין (אדום, n = 4) לעומת חדרים לא מטופלים (אפור, n = 4); מדידות דו-כיווניות חוזרות ANOVA, מקדם זמן P < 0.0001, אינטראקציה בין זמן × מדגם P < 0.0001, גורם טיפול P < 0.0001, גורם מדגם P = 0.824; הנתונים הוצגו כממוצע ± SEM.OCR מקסימלי של חדרים מטופלים בספונין בהשוואה לחדרים שלא טופלו; מבחן t של תלמיד לא מזווג (P = 0.0850). (D) עקבות OCR ו-ECAR מייצגים מ-mdh1ab cOE (אדום, n = 8) ו-gfp cOE (אפור, n = 8) 14dpci חדרים. OCR, מדידות דו-כיווניות חוזרות ANOVA, מקדם זמן P < 0.0001, זמן × אינטראקציה עם מדגימה P < 0.0001, גורם גנוטיפ P < 0.0001, גורם מדגם P = 0.1098; ECAR, מדדים דו-כיווניים חוזרים ANOVA גורם זמן P < 0.0001, זמן × אינטראקציה מדגימה P = 0.7507, פקטור מדגם P = 0.2154, גורם גנוטיפ P < 0.0001. הנתונים מותאמים מ-Lekkos ואחרים, 20258 והוצגו כממוצע ± SEM. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה רחבה יותר של הנתון.

דיון

כאן אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול לניתוח OCR ו-ECAR של חדרי דגי זברה מחוץ לחיים באמצעות מנתח Seahorse XFe24 ומבחן Mito Stress. חילוף החומרים של הקרדיומיוציטים ממלא תפקיד חיוני בהתחדשות הלב 21,22,23,24. עם זאת, אימות הפנוטיפ המטבולי של לב דג הזברה המתחדש היה מאתגר ולעיתים קרובות חסר בפרסומים 6,7. עקב גודלו הקטן של לב דג הזברה, טכניקות כמו ספקטרוסקופיית NMR או ספקטרומטריית מסה דורשות ריכוז של מספר חדרים כדי להשיג אות מספק 8,12,13. לעומת זאת, השיטה שאנו מתארים כאן מאפשרת רכישת מדידות OCR ו-ECAR ממספר חדרים בודדים, ובכך מגדילה את העוצמה הסטטיסטית.

שיטות פרופיילינג מטבוליות קלאסיות, כגון מטבולומיקה, מספקות תמונת מצב של הפרופיל המטבולי של הרקמה ברגע שנאספה. באמצעות מבחן הלחץ של מיטו הצלחנו לאסוף נתונים חיים בזמן אמת על האופן שבו החדרים מסתגלים לאתגרים מטבוליים שונים, כולל קיבולת הנשימה המרבית שלהם, דבר שאינו ניכר בשימוש בשיטות אחרות. כדי להשיג פנוטיפ חי של חדרי דג הזברה, ניסו לבצע פרפוזיה ללב דג הזברה 9,10,11. זה דורש ציוד מותאם אישית מורכב וטכנאים מיומנים מאוד כדי להשיג קנולציה, תוך שמירה על שיטה בעלת תפוקה נמוכה. האנלייזר מספק חלופה פשוטה יותר באמצעות ציוד מסחרי לפנוטיפינג בתפוקה גבוהה (20 חדרים בו-זמנית). למיטב ידיעתנו, לא הייתה השוואה ישירה בין השיטה המתוארת במאמר זה לבין טכניקות אחרות של אוקסימטריה חיה, כמו אלקטרודה מסוג קלארק.

חשוב לציין שהשיטה שאנו מתארים ניתנת להתאמה בהתאם לשאלת המחקר. הבדיקה שימשה בעבר לאפיון עוברים שלמים של דג זברה 25,26. בנוסף למבחן הלחץ של מיטו המתוארת כאן, מבחן Mito Fuel Flex מותאם להערכת ניצול הדלק המטבולי של חלקי לבאנושיים. יתרה מזאת, בדיקת הפנוטיפ של אנרגיית התאים הותאמה לאפיון היכולת הגליקוליטית של לבבות Astyanax mexicanus מתחדשים. אנו צופים שפרוטוקול זה ישמש למבנים תלת-ממדיים נוספים כגון אורגנואידים לבביים, ויהיה שימושי לאימות הפרעות גנטיות במסלולי מטבול בלבבות דגי זברה שלא נפגעו.

אנו מכירים בכך שלטכניקה זו יש מגבלות מסוימות. מבחינת אתגרים טכניים, לאחר הבידוד, הלבבות טופלו במדיום DMEM בטמפרטורת החדר ולא נשמר על 28 מעלות צלזיוס, שהיא הטמפרטורה האופטימלית לדגי זברה19. הורדת טמפרטורת המים ל-18 מעלות צלזיוס יכולה להשפיע משמעותית על תפקוד לב דג הזברה במקום. עם זאת, איננו מצפים שחשיפה קצרה לטמפרטורת החדר תשפיע משמעותית על הפיזיולוגיה של החדרים המבודדים, שכן החדרים חוזרים במהירות למנתח של 28 מעלות צלזיוס. בידינו, רוב החדרים הפסיקו לפעום באופן גלוי לאחר ניתוח האטריום, מה שמעיד על חוסר גירוי קוצב לב כגורם לחוסר ההתכווצות. יתרה מזאת, במהלך תקופת הבידוד, המדיום לא היה מחומצן, מה שעלול להוביל להיפוקסיה קלה, שמתאוששת לרמות חמצן רגילות לאחר ערבוב האנלייזר לפני המדידה הראשונה.

שיקול מעשי נוסף לגבי טמפרטורת הלבבות קשור גם לכיבוי המחמם באנלייזר, וכך להפחתת הטמפרטורה מ-37 מעלות צלזיוס ל-28–29 מעלות צלזיוס. האנלייזר אינו מאפשר הפחתת עוצמת המחמם לטמפרטורה הרצויה. עם זאת, כאשר האנלייזר פועל, הטמפרטורה בתוך המגש גבוהה ב-6–7 מעלות צלזיוס מטמפרטורת החדר. טווח טמפרטורות זה תואם לטמפרטורת גידול אופטימלית של דגי זברה19.

בדיקה זו מתבצעת על חדרי דגי זברה בתפזורת. כתוצאה מכך, אי אפשר להבחין בין תרומות סוגי התאים הבודדים לשינויים שנצפו ב-OCR וב-ECAR. ייתכן שזה יהיה חשוב מאוד כאשר בודקים את קצבי המטבוליזם של נקודות זמן רגנרציה מוקדמות, שבהן זרם גבוה של תאי חיסון31 עשוי להסתיר את השינויים ב-OCR בקרדיומיוציטים. בנוסף, דם שנותר בלומן החדר יכול להשפיע על הקריאות המטבוליות. מתן אפשרות ללבבות לדמם בנוכחות הפארין7 עשוי להפחית עוד יותר את השפעת קרישת תאי הדם בלב. יתרה מזאת, כדי להגביר את הפצת המעכבים לכיוון התאים הפנימיים של החדר הפנימי, ניסינו שלב חדירות באמצעות סאפונין. חדירת סאפונין הובילה לירידה מתמשכת ב-OCR לאורך כל הבדיקה, מה שהוביל את החדרים לכשל נשימתי. מגבלות אלו יכלו להימנע על ידי בידוד, תרבית וניתוח של קרדיומיוציטים מבודדים, אם כי גישה זו דורשת תרבית ממושכת של תאים32 , מה שעשוי לא להיות אופטימלי לסביבה רגנרטיבית.

הרקמה הפגועה עשויה להשפיע על שיטת הנרמול שבה משתמשים. במחקר זה, ננרמל את ה-OCR באמצעות מיקרוגרם חלבון למ"ל באמצעות בדיקת BCA. למרות שבדיקת BCA אינה מגיבה בחוזקה לחלבוני קולגן בשל הרכבם העשיר בהידרוקסיפרולין ובפרולין, אשר אינם מזוהים היטב באמצעות קופר, נוכחות רכיבים נוספים של פצעים חסרי תאים עשויה להשפיע על הנרמול שלה. מחקרים עתידיים עשויים לשקול שימוש ב-DNA33 הכולל כהשקפות מדויקת של תאים חיים בחדר.

יתרה מזאת, לא הצלחנו לשחזר את הירידה הצפויה ב-OCR שנגרמה על ידי עיכוב תלוי באוליגומיצין של קומפלקס V15. למרות שמחקרים מסוימים מראים ירידה ב-OCR על ידי טיפול באוליגומיצין בקרדיומיוציטיםמבודדים 32,34,35, הנתונים כאן דומים לחוסר התגובה שדווח במחקר עדכני על קרדיומיוציטים בוגרים מבודדים 36. מכיוון שריכוז האוליגומיצין שבו אנו משתמשים גבוה משמעותית מזה שדווח במחקרים שהוזכרו לעיל, לא ברור אם העלאת הריכוז הסופי ליותר מ-50 מיקרומום תשפיע על כך.

לבסוף, למרות שצריכת החמצן תלויה בעיקר בנשימה, החמצה החוץ-תאית אינה מונעת אך ורק על ידי הלקטט המיוצר בגליקוליזה, אלא גם דרך המרת פחמן דו-חמצני לחומצה פחמנית. דווח כי במיובלסטים המוזנים מגלוקוז, שליש מהחמצה החוץ-תאית נגרמת מפחמן דו-חמצני בתנאים בסיסיים37. בהתאם לכך, אנו ממליצים להיזהר בפרשנות מדידות ECAR הנובעות ממנתח Seahorse אם לא בוצע תיקון לשיעור החמצה המונעת על ידי נשימה38.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים לניק האו (Agilent Technologies) ולתומאס ניקול (אוניברסיטת אוקספורד) על תמיכתם ודיון ביקורתי במהלך פיתוח השיטה הזו. ברצוננו להודות לצוות במתקן החיות שלנו ברמה 1 (אוניברסיטת אוקספורד, יחידת שירותים ביו-רפואיים) ובמכון לרפואה התפתחותית ורגנרטיבית (אוניברסיטת אוקספורד) על תחזוקת והעברת דג הזברה. עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר הרפואי (MR/W006731/1 to KL), בית החולים והמרכז למחקר מלך פייסל (פוסט-דוקטורט ל-RA), קרן התמיכה האסטרטגית של מוסדות וולקום (204826/Z/16/Z ל-JSOM), קרן הלב הבריטית IBSRF (FS//17/58/33072 to LCH), המועצה האירופית למחקר (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (715895, CAVEHEART, ERC-2016-STG ל-MTMM), מענקי פרויקט של קרן הלב הבריטית (PG/15/111/31939 ו-PG/23/11189 ל-MTMM), MTMM מכיר בתמיכה ממרכז המחקר BHF אוקספורד, אוניברסיטת אוקספורד (RE/24/130024) וממרכז הרפואה הרגנרטיבית של BHF (RM/13/3/30159).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 מ"ל שפופרות אפנדורף סטארלאבS1615-5550
לוח 96 בארות & nbsp;תרמופישרAB-0800
אנטימיצין AChemCruz SC-202467A
מדיום DMEMאג'ילנט1035755-100
DMSOסיגמא-אלדריץ'  D2650-100mL
קרח יבש  
אתנולסופלקו1.00983.2500
ערכת בדיקת שטף חוץ-תאיתאג'ילנט103518-100החבילה כוללת פלטת שירות, Hydro Booster, מחסנית חיישן, מכסה (מגיע עם לוחות האי)
FCCPסיגמא-אלדריץ'  C2920
גלוקוזאג'ילנט103577-100
גלוטמיןאג'ילנט103579-100
חממה
מיקרופלטת לכידת אייםאג'ילנט101122-10025 רשתות כלולות בחבילה
כלי לכידת מסך האיאג'ילנט101135-100
מלקחיים מיקרודיסקציהאידיאלי-טק3131760גודל 5-S (יידרשו פי 2 לבידוד החדר מהבולבוס ארטריוזוס ומהאטריום)
מספריים מיקרודיסקציהFST15009-08
MS-222סיגמא-אלדריץ'  E10521
אוליגומיציןMP 151786
Pestle mottor homogeniser VWR431-0100
עליםVWR431-0094
צלחת פטרי 35 מ"מגריינר ביו-וואן627102
צלחת פטרי 92 מ"מסטארסטדט82.1473
ערכת הבדיקה של פירס BCAתרמו-סיינטיפיק23227
כדורי מיני פרוטאז ומעכבי פוספטאז של פירס, ללא EDTAתרמו-סיינטיפיקA32961
פירובטאג'ילנט103578-100
מאגר ניתוק RIPAסנטה-קרוסSC-364162
רוטנונהMP 02150154-CF
שלב אינטרפאזה של Seahorse Analytics Agilentאג'ילנטhttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
אנלייזר Seahorse XFe24אג'ילנטhttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
חותםתרמו-סיינטיפיקAB-0558
SPECTROstar ננוMG LABTECH GmbH601-0298
ספוגעשה חתך ארוך ועמוק מספיק כדי להתאים את הצד הגחוני של הדג כלפי מעלה
גל (גרסה 2.6.1.56)אג'ילנטhttps://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
XF calibrent אג'ילנט100840-000

מקורות

  1. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science (1979). 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  2. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  3. Kikuchi, K., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4+ cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
  4. Bertozzi, A., et al. Is zebrafish heart regeneration "complete"? Lineage-restricted cardiomyocytes proliferate to pre-injury numbers but some fail to differentiate in fibrotic hearts. Dev Biol. 471, 106-118 (2021).
  5. Nguyen, P. D., et al. Interplay between calcium and sarcomeres directs cardiomyocyte maturation during regeneration. Science (1979). 380 (6646), 758-764 (2023).
  6. Fukuda, R., et al. Stimulation of glycolysis promotes cardiomyocyte proliferation after injury in adult zebrafish. EMBO Rep. 21 (8), e49752(2020).
  7. Honkoop, H., et al. Single-cell analysis uncovers that metabolic reprogramming by ErbB2 signaling is essential for cardiomyocyte proliferation in the regenerating heart. Elife. 8, e50163(2019).
  8. Lekkos, K., et al. Oxidative phosphorylation is required for cardiomyocyte redifferentiation and long-term fish heart regeneration. Nat Cardiovasc Res. 4 (10), 1363-1380 (2025).
  9. Zhang, H., et al. A Langendorff-like system to quantify cardiac pump function in adult zebrafish. Dis Model Mech. 11 (9), dmm034819(2018).
  10. Zhang, P. C., Llach, A., Sheng, X. Y., Hove-Madsen, L., Tibbits, G. F. Calcium handling in zebrafish ventricular myocytes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 300, 56-66 (2011).
  11. Lin, E., et al. Construction and use of a zebrafish heart voltage and calcium optical mapping system, with integrated electrocardiogram and programmable electrical stimulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 308, R755-R768 (2015).
  12. Miklas, J. W., et al. Amino acid primed mTOR activity is essential for heart regeneration. iScience. 25 (1), 103574(2022).
  13. García-Poyatos, C., et al. Cox7a1 controls skeletal muscle physiology and heart regeneration through complex IV dimerization. Dev Cell. 59 (14), 1824-1841.e10 (2024).
  14. How Agilent Seahorse XF Analyzers Work. , Agilent. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/how-seahorse -xf-analyzers-work?srsltid=AfmBOopkIZodH4uZO 5puXTOp1U5gdkky661L6TKluz5XgBWGqujHEzww (2026).
  15. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  16. Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. J Vis Exp. (62), e3666(2012).
  17. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  18. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503(2011).
  19. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  20. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. J Vis Exp. (55), e3165(2011).
  21. Duan, X., Liu, X., Zhan, Z. Metabolic regulation of cardiac regeneration. Front Cardiovasc Med. 9, 933060(2022).
  22. Yu, F., Cong, S., Yap, E. P., Hausenloy, D. J., Ramachandra, C. J. Unravelling the interplay between cardiac metabolism and heart regeneration. Int J Mol Sci. 24 (12), 10300(2023).
  23. Cook, M., Lal, S., Hume, R. D. Transcriptional, proteomic and metabolic drivers of cardiac regeneration. Heart. 111 (18), 851-858 (2025).
  24. Chen, X., et al. Metabolic reprogramming: A byproduct or a driver of cardiomyocyte proliferation. Circulation. 149 (20), 1598-1610 (2024).
  25. Bond, S. T., McEwen, K. A., Yoganantharajah, P., Gibert, Y. Live metabolic profile analysis of zebrafish embryos using a seahorse XF 24 extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1797, 393-401 (2018).
  26. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300(2013).
  27. Trampel, K. A., et al. Seahorse metabolic analysis for human and mouse cardiac organotypic slices. bioRxiv. , (2025).
  28. Ruggiero, G., et al. A balanced circadian glycolytic rhythm drives cardiomyocyte cell cycle progression during fish heart regeneration. bioRxiv. , (2025).
  29. Lee, L., et al. Functional assessment of cardiac responses of adult zebrafish (Danio rerio) to acute and chronic temperature change using high-resolution echocardiography. PLoS One. 11 (1), e0145163(2016).
  30. Shaftoe, J. B., Geddes-McAlister, J., Gillis, T. E. Integrated cellular response of the zebrafish (Danio rerio) heart to temperature change. J Exp Biol. 227 (20), jeb247522(2024).
  31. Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration—looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochem Cell Biol. 154 (5), 533-548 (2020).
  32. Angelini, A., Pi, X., Xie, L. Evaluation of long-chain fatty acid respiration in neonatal mouse cardiomyocytes using SeaHorse instrument. STAR Protoc. 3 (2), 101392(2022).
  33. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Rodríguez Colman, M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protoc. 2 (1), 100386(2021).
  34. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. J Mol Cell Cardiol. 74 (100), 340-352 (2014).
  35. Cheng, Y. Y., et al. Metabolic changes associated with cardiomyocyte dedifferentiation enable adult mammalian cardiac regeneration. Circulation. 146 (25), 1950-1967 (2022).
  36. Li, X., et al. Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice. Nature. 622 (7983), 619-626 (2023).
  37. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim Biophys Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  38. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate. J Vis Exp. (106), e53464(2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Seahorse
הערכת הפעילות המטבולית של חדרי דגי זברה המתחדשים מחוץ לחיים באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.