מאמר שיטה

פרוטוקול אופטימלי לזיהום קנדידה אלביקנס בשמידטאה ים-תיכון לחקר פתוגנזה פטרייתית והגנה על המאכסן

DOI:

10.3791/70500

⸱

17 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Health Sciences Research Institute, University of California, Merced, 4Center for Cellular and Biomolecular Machines, University of California, Merced

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק מדריך אופטימלי ומפורט לשימוש בפלנרית Schmidtea mediterranea כמערכת מודל לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן במהלך זיהום פטרייתי. השיטה מתבססת על ההליך הקודם להדבקת פלאנרים בפתוגן הפטרייה האנושי Candida albicans, ומספקת הנחיות מפורטות לשיפור השחזוריות והעקביות הניסיונית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קנדידה אלביקנס היא פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי נפוץ המתיישב באופן אסימפטומטי ברוב בני האדם. למרות שבדרך כלל מדובר במצב שפיר, דיסביוזה הנגרמת משימוש באנטיביוטיקה, תפקוד לקוי חיסוני או פגיעה במחסום האפיתל עלולה לגרום לצמיחת יתר פטריות וזיהום, החל ממחלת רירית שטחית ועד לקנדידיאזיס מערכתית מסכנת חיים. נדרשים מודלים חדשים של זיהום קדם-קליני כדי לפרק את הפתוגנזה של C. albicans in vivo בשלבי זיהום שונים ועם תוצאות מדידות שונות של המארח. הפלנרית Schmidtea mediterranea הוכחה בעבר כמארח חסר חוליות לחקר אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן במהלך זיהום C. albicans . S. mediterranea נשענת לחלוטין על מנגנוני חיסון מולדים שמורים המסוגלים להתגבר על זיהום במיקרואורגניזמים פתוגניים, כולל חיידקים ופטריות. יכולת ההתחדשות המרשימה של הפלנריאנים ואוכלוסיות תאי הגזע הנגישות הופכות את האורגניזם הזה למודל נגיש לניתוח תגובות חיסוניות מוקדמות, תיקון רקמות ופינוי פתוגנים בחיים. מודל זה תומך בניתוח סימולטני של אלימות פטרייתית ותגובות שעתוק של המאכסן, ומספק תובנות חשובות על דינמיקת זיהומים. כאן הוצג פרוטוקול מעודכן עם שינויים מפורטים, נהלים סטנדרטיים ושלבים אופטימליים להדבקת S. mediterranea ב-C. albicans , שנועד לשפר את השכפול ולאפשר מחקרים שיטתיים של פתוגנזה פטרייתית והגנה על המארח.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קנדידה אלביקנס היא פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי נפוץ המתיישב באופן אסימפטומטי ב-50-70% מבני האדם 1,2,3. בדרך כלל, קומנסל בלתי מזיק, C. albicans עלול לגדול יתר על המידה בתנאים כמו חוסר איזון במיקרוביוטה, שימוש באנטיביוטיקה, דיכוי חיסונית, הפרעת מחסום אפיתל או נוכחות של מכשירים רפואיים, מה שמוביל למחלות הנעות מזיהומים שטחיים ברירית ועד קנדידיאזיס מערכתית מסכנת חיים 4,5. אצל אנשים עם מערכת חיסון מוחלשת – כולל אלו עם HIV/AIDS, מטופלים שעוברים כימותרפיה או טיפולים מדכאים חיסון, אנשים עם מחלות כרוניות או כאלה בטיפול נמרץ – שיעורי התמותה עלולים לעלות על 70%, מה שמדגיש את העומס הבריאותי הציבורי המשמעותי של קנדידיאזיס פולשני 6,7,8. ברחבי העולם, זיהומים פטרייתיים פולשים משפיעים על יותר מ-6.5 מיליון אנשים בשנה, כאשר עלויות הבריאות הישירות בארצות הברית בלבד עולות על 8 מיליארד דולר בשנה עבור זיהומים הקשורים לקנדידה, 9,10. למרות טיפולים אנטי-פטרייתיים זמינים, שיעורי תחלואה ותמותה הקשורים לזיהומים ב-C. albicans נותרו ברובם ללא שינוי במשך עשרות שנים, מה שמדגיש את הצורך הדחוף להבין טוב יותר את האינטראקציות בין המארח לפתוגן במחלות פטריות.

C. albicans עושה שימוש במגוון רחב של גורמי אלימות התומכים בהתיישבות, התמדה ופתוגנזה במגוון סביבות מארח. אלה כוללים הידבקות לרקמות המארח, התחמקות חיסונית, שינוי דפנות התא, הפרשת אנזימים הידרוליטיים, פלסטיות מורפולוגית ויצירת ביופילם 11,12,13,14,15,16. ביחד, תכונות אלו מאפשרות ל-C. albicans להסתגל לנישות מארח מגוונות, לווסת את תגובות החיסון ולהתנגד לטיפולים אנטי-פטרייתיים 16,17,18,19,20,21. הבהרת האופן שבו תהליכים אלו מעצבים את תוצאות ההדבקה – כולל תחלואה של מארח, תמותה ופינוי פתוגנים – היא חיונית לפיתוח אסטרטגיות מניעה וטיפול יעילות יותר.

כדי לחקור את הדינמיקה בין המארח לפתוגן, הקמנו מערכת מודל המשתמשת ב-Schmidtea mediterranea הפלנרי כמארח 22,23,24. מודל זה משמש כפלטפורמה רב-שימושית לחקר תגובת המארח הרב-מערכתית לזיהום פטרייתי, תוך שימוש בשיטת השרייה שמאפשרת חשיפה סינכרונית של בעלי חיים ל-C. albicans. הסעיף הבא מציג נהלים מעודכנים שלב אחר שלב שמחדדים פרוטוקול זה, משפרים את השחזוריות ומאפשרים יישום עקבי בין המעבדות.

פלנריאנים הם חסרי חוליות החיים חופשי בעלי יכולת התחדשות יוצאת דופן, המסוגלים להחליף במהירות רקמות שאבדו מפציעות או זיהומים25. הם חסרים מערכת חיסון אדפטיבית והם מסתמכים לחלוטין על הגנות מולדות שמורות – כולל קולטני זיהוי דפוסים, פפטידים אנטימיקרוביאליים, הפרשת ריר ותאי פגוציטיקה – כדי לנקות פתוגנים חיידקיים ופטרייתיים בתוך ימים26, 27, 28, 29. מכיוון שחיסון מולד מייצג את קו ההגנה הראשון בין אאוקריוטים ועדיין לא נחקר מחוץ למערכות יונקיות27, פלאנרים מציעים הזדמנות לבחון תהליכים אלה ב-vivo ברזולוציה תאית ומולקולרית. יכולת ההתחדשות שלהם מונעת על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים בוגרים, הידועים כנאובלסטים, המהווים כ-30% מהתאים הבוגרים ותורמים להחלמה לאחר ההדבקה. תכונות אלו הופכות את S. mediterranea למודל עוצמתי לניתוח אלימות פתוגנים והגנה על המארח בקנה מידה גנטי, תא, רקמתי ואורגניזם, ומאפשרים לנו להתמודד עם שאלות שלעיתים קרובות קשה לחקור באמצעות מערכות יונקות מסורתיות.

בנוסף, גודלם הקטן (בדרך כלל כמה מילימטרים באורך), העלות הנמוכה והקלות בתחזוקה תומכים בניסויים רחבי היקף תוך הימנעות מהמגבלות הפיננסיות, האתיות והרגולטוריות הטבועות במודלים של חולייתנים. בדומה ל-C. albicans, S. mediterranea הוא יעיל גנטית, עם גנום שרוצף ומסומן במלואו, והוא תומך בטכניקות מולקולריות ותאיות מתקדמות – כולל פרופילינג שעתוק, אימונוהיסטוכימיה והיסטולוגיה ברזולוציה גבוהה, והפרעות RNA עמידות (RNAi)32,33,34,35,36,37,38. כלים אלו מאפשרים ניתוח מקביל של תגובות המארח והפתוגנים במהלך ההדבקה.

מספר מודלים פרה-קליניים חלופיים שימשו לחקר זיהומים פטרייתיים. מארחים חסרי חוליות כמו Galleria mellonella (עש שעווה), Caenorhabditis elegans (תולעת עגולה) ו-Drosophila melanogaster (זבוב פירות), וכן החולייתן Danio rerio (דג זברה), כל אחד מהם מספק יתרונות ניסיוניים ייחודיים אך גם עם מגבלות בולטות. מערכות אלו לעיתים קרובות מסתמכות על הישרדות כנקודת הסיום העיקרית, שכן זיהומים גורמים במהירות למוות של המארח, ומונעים הערכה מפורטת של תחלואה, החלמה ותגובות רב-מערכתיות – תכונות שהמודל הפלאנרי תופס בקלות.

מודלים יונקים כמו Mus musculus (עכבר), Rattus norvegicus (עכברוש), Oryctolagus cuniculus (ארנב) ו-Cavia porcellus (חזיר ים) משקפים פיזיולוגיה אנושית בצורה מדוקדקת יותר, אך מוגבלים בשל עלויות גבוהות, גודל קבוצה קטן, דרישות אתיות ורגולטוריות, והאתגר להבחין בין תגובות חיסוניות מולדות לאדפטיביות. יתרה מזאת, עשרות שנים של מחקר פתוגנזה פטרייתית בעכברים התמקדו בעיקר בזיהום מערכתי בשלב מאוחר 39,40,41,42,43, לעיתים תוך התעלמות מאירועים מוקדמים כמו הפרעה במחסום אפיתל וצמיחת יתר רירית – המסלולים הנפוצים ביותר להתחלת מחלות פטריות בבני אדם 44,45,46.

לכן, חקר האינטראקציות בין מארח לפתוגן חיוני להבנת התהליכים הביולוגיים שמאחורי אלימות הפטרייתית, ההגנה על המארח והתקדמות המחלה. זיהומים פטרייתיים פולשים מהווים איום עולמי הולך וגובר, כאשר מינים רבים מראים עמידות לכל סוגי התרופות האנטי-פטרייתיות המרכזיות. מוערך כי יותר ממיליארד אנשים מושפעים מזיהומים פטרייתיים, וגורמים כמו שינויי אקלים, שימוש נרחב באנטימיקרוביאליים ומספר הולך וגדל של אנשים עם מערכת חיסון מוחלשת מאיצים את הופעת פתוגנים עמידים לאנטי-פטרייה 47,48,49,50. הבנת האופן שבו פטריות פתוגניות מתיישבות ומתקשרות עם המארחים שלהן היא קריטית לפיתוח אסטרטגיות מניעתיות וטיפוליות חדשות.

להלן מתאר פרוטוקול זיהום מערכתי מתוקן וסטנדרטי לאינטראקציות בין S. mediterranea-C. albicans, שנועד לקדם שכפול ולאפשר חקירה שיטתית של פתוגנזה פטרייתית ומנגנוני הגנה על המארח. הפרוטוקול המקורי נשמר בפרסומים קודמים 22,23,24. טבלה 1 מסכמת את העדכונים המרכזיים ששולבו בגרסה המתוקנת הזו, כולל שיפורים בהליכי חיסון פטריות, הפחתת נפח בארות, הגדרת קריטריונים להכללת בעלי חיים, קביעת מינונים זיהומיים וקטלניים, והמלצות מעודכנות לגידול בעלי חיים. תהליך זה מספק הנחיות מפורטות לגידול C. albicans, להדביק פלנרים באמצעות חשיפה להשרייה, ולהערכת אלימות פטרייתית ותגובות מארח באמצעות קריאות איכותניות וכמותיות בתנאים סימפטומטיים ומינון קטלני (איור 1). ההליכים האופטימליים המוצגים כאן משלבים משתנים שזוהו אמפירית כגורמים מרכזיים לדינמיקת הזיהום ולתוצאות המארח, ובכך משפרים את השחזוריות ומאפשרים הערכה שיטתית של אינטראקציות בין מארח לפתוגן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתבסס על השיטות הקודמות 22,23,24 ומבסס נהלים ברורים וסטנדרטיים לשיפור השחזוריות ולאפשר חקירה שיטתית של פתוגנזה פטרייתית ותגובות מארח ב-S. mediterranea. השיפורים המרכזיים בפרוטוקול כוללים קריטריונים מוגדרים מראש להכללה והדרה של בעלי חיים, הכנה סטנדרטית למיקרואורגניזמים, והערכה מקיפה של נקודות קצה של המארח.

כל ההליכים חייבים להתבצע באמצעות טכניקות בטיחות ביולוגית סטרילית ואספטית ברמה 2 מתאימות. ציוד מגן אישי (PPE) סטנדרטי למעבדה, כולל כפפות, חלוק מעבדה ונעליים סגורות, יש ללבוש בכל עת. ההליכים הקשורים ל-S. mediterranea הפלנרי בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות לשימוש אתי בחסרי חוליות.

כל שיפורי הפרוטוקול מסוכמים בטבלה 1. כל התגובות, הציוד הקריטי, והמדיה, הבופרים והמתכונים לצביעת חיסון מופיעים בטבלת החומרים ובטבלה 2.
הערה: כל ההליכים הנוגעים למודל של בעלי החיים חסרי החוליות S. mediterranea צריכים להתבצע כדי להבטיח את הסטנדרטים הגבוהים ביותר של רווחת בעלי החיים. S. mediterranea צריך להיות מאוחסן בתנאים אופטימליים המדמים בתי גידול טבעיים. יש לעצב ניסויים כדי למזער כאב או מצוקה פוטנציאליים כדי להבטיח טיפול אתי לאורך כל המחקר.

1. גידול פטריות

  1. מידע על זן C. albicans
    1. זן המעבדה הסטנדרטי של C. albicans SN25051 שימש כזן הבר לכל הניסויים, וזמין לציבור במרכז המלאי לגנטיקה פטרייתית (http://www.fgsc.net/). SN250 נגזר מהבידוד הקליני SC5314, שנאסף במקור מתרבות דם של מטופל עם קנדידיאזיס52 מפוזר.
    2. זני C. albicans נשמרים כמלאי גליצרול של 25% ב-−80°C.
  2. גידול זנים של C. albicans לזיהום
    1. פסים ממאגר קריוגני
      1. באמצעות אפליקטור סטרילי, מרחו את הזן הרצוי ממאגר של −80°C על צלחות אגר עם תמצית שמרים (YPD) (1% תמצית שמרים, 2% פפטון, 2% גלוקוז; pH 6.8).
      2. דגרו סטטית ב-30°C למשך 72 שעות.
  3. הכנת תרביות לילה
    1. החדינו מושבה אחת לנוזל 4 מ"ל YPD בצינורות תרבית זכוכית בורוסיליקט סטריליים (18 מ"מ × 150 מ"מ) באמצעות מקל אפליקטור סטרילי.
    2. כלול צינור בקרה שלילי המכיל YPD לא מחוסן בתנאים זהים.
    3. כיסו את הצינורות ברפיון כדי לאפשר אוורור ודגרו במהלך הלילה (16 שעות) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-220 סל"ד (מסלול) באינקובטור מתנדנד.
      הערה: אם מתרחשת גידול מיקרוביאלי במערכת הביקורת השלילית, לבטל את הניסוי ולהתחיל מחדש עם מדיה חדשה וטכניקת סטריליה.
  4. איסוף ושטיפת תאים
    1. באמצעות טכניקה אספטית, מעבירים תרביות לצינורות צנטריפוגה מסומנים בנפח 15 מ"ל.
    2. תרביות צנטריפוגה במשך 5 דקות ב-~3,000 × גרם כדי לשחק את התאים.
    3. הסר בזהירות את הסופרנטנט של YPD מבלי להפריע לכדור.
    4. החזירו את הכדור למים פלנריים (ראו טבלה 2 להרכב) בנפח השווה לזה של ה-YPD ששימש.
    5. ערבב היטב על ידי מערבולת מערבבת.
    6. חזור על שלבים 1.4.2-1.4.4 פעמיים נוספות כדי להסיר את מדיית הצמיחה לחלוטין.
    7. לאחר השטיפה הסופית, החזירו את כדור התא למים פלנריים טריים על ידי מערבולת.
  5. כימות ריכוז התאים של C. albicans
    1. דילול למדידת OD
      1. הכינו שלושה צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים בנפח 1.7 מ"ל עם דילול של 1:20 (תרבית 50 מיקרוליטר + 950 מיקרוליטר מים מישוריים) או גורם דילול חלופי נבחר. ערבב היטב.
      2. הכן צינור ריק המכיל 1000 מיקרוליטר מים מישוריים.
    2. ספקטרופוטומטריה
      1. הגדר את הספקטרופוטומטר למדוד צפיפות אופטית ב-600 ננומטר (OD600).
      2. תרוקן את הספקטרופוטומטר עם מים מישוריים.
      3. מדדו OD600 עבור כל דגימה מדוללת ורשמו ערך.
      4. ממוצע את שלוש המדידות והכפל בגורם הדילול כדי לקבוע את OD600 של תרבות המלאי. להמיר OD600 לריכוז תאים.
        הערה: יש לקבוע אמפירית את מקדם המרת הצפיפות האופטית עבור כל ספקטרופוטומטר. בהתבסס על המכשור הספציפי שבו השתמשו, OD600 של 1 מתאים לכ-2 ×107 תאי C. albicans /mL53.
  6. קביעת ריכוזי אינקולום ניסיוניים
    1. הכינו את ריכוז האינוקולום הרצוי לכל תנאי ניסוי.
      הערה: בצע לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים כדי לקבוע את המינון היעיל למושבה הפלנרית, במיוחד עבור נקודות קצה זיהומיות או קטלניות. חישוב מייצג להכנת ריכוזי חיסון זיהומיים וקטלניים מסופק בקובץ המשלים 1.

2. מינים פלנריים ותחזוקה

  1. מיני פלנרים ותחזוקה
    1. השתמשו בקו השיבוט הא-מיני CIW4 של S . mediterranea הפלנרי לכל הניסויים.
    2. לשמור מושבות פלנריות במיכלים שקופים מפלסטיק ברמת מזון המכילים 1,500–2,000 מ"ל של מים פלנריים 1×.
    3. שמור על מיכלים בחושך בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עם מכסים סגורים ברפיון כדי לאפשר חילופי גזים.
    4. אל תטפל בפלאנרים באנטיביוטיקה.
  2. תחזוקה והאכלה במושבה
    1. האכילו את המושבות במחית כבד בקר טרי ומסוננת פעם בשבוע.
    2. נקו מיכלים פעמיים בשבוע.
    3. לשמור על צפיפות פלנרית של 200–400 בעלי חיים לכל מיכל. עבודות קודמות מציגות נהלים מפורטים להכנת מושבה ותחזוקה ארוכת טווח31.
  3. התניה טרום-ניסוי
    1. לפני ההדבקה הניסיונית, הפלנריים מרעבים במשך 7–12 ימים כדי לתקן את תנאי המטבול והגודל.
    2. השתמש בקבוצות של 5–10 בעלי חיים בכל באר לכל תנאי ניסוי. להבטיח מספר שווה של בעלי חיים בכל התנאים, כולל בקרות חיוביות ושליליות.
  4. בחירת גודל בעלי חיים
    1. בחרו פלנרים באורך של כ-5 מ"מ, המתאימים ל~5 ×-105 תאים מארחים לכל בעל חיים54.
    2. הימנעו משימוש בפלנרים קטנים מ-5 מ"מ, שכן בעלי חיים בגודל זה עשויים לכלול פרטים עם בלסטמות או התפתחות לא שלמה שיכולה לגרום לתוצאות לא עקביות.
    3. הימנעו משימוש בפלנרים גדולים מ-5 מ"מ, שכן בעלי חיים גדולים פחות מתאימים לצביעת חיסון פלואורסצנטית.
    4. השתמש בפלנריאנים באורך של כ-5 מ"מ בעת קביעת מצבי מינון זיהומי (ID50) ומינון קטלני (LD50).
      הערה: כדי להקל על בחירת גודל עקבית, הדפיסו רשת ייחוס בגודל 5 מ"מ × 5 מ"מ והניחו אותה בתוך שרוול פלסטיק מתחת למיכל הפלאנרי השקוף. ודא שהפלאנרים מוארכים במלואם לפני מדידת האורך.
  5. בריאות וקריטריונים להכללה
    1. שלב קריטי: בדוק את כל הפלנרים תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ לפני השימוש.
    2. החריגו בעלי חיים עם נזק או פציעה נראים לעין, כולל התנאים הבאים:
      1. נוכחות של בלסטמות (רקמה חסרת פיגמנטציה) או התפתחות פיגמנטציה לא שלמה.
      2. פיגמנטציה חריגה, כמו אזורים כהים משמעותית.
      3. רקמה חסרה או פגועה.
      4. נגעים או צלקות.
      5. פצעים פתוחים.
      6. חריגות או עיוותים מורפולוגיים.
      7. כל מצב כרוני או לא מחלים.
    3. להוציא בעלי חיים עם חריגות התפתחותיות.
      1. אזורים מפוצלים או משוכפלים של ראש או זנב.
      2. מורפולוגיית גוף מעוותת או אסימטרית.
      3. מספר שגוי של קולטני האור (רק זוג דו-צדדי אחד מקובל).
      4. הלוע במיקום לא תקין.
      5. ריסניות פגומה הגורמת לפגיעה בתנועתיות או להתנהגות החלקה לא סדירה.
    4. כלול רק בעלי חיים באורך של כ-5 מ"מ, מפותחים במלואם, וללא פציעות או חריגות נראות לעין.
  6. הכנת צלחות
    1. העבר פלנרים בריאים העומדים בכל קריטריוני ההכללה ל-2 מ"ל מים פלנריים טריים לכל באר בלוח פוליסטירן בן 6 בארות שאינו מטופל בתרבות רקמות.
      הערה: העבירו את בעלי החיים יום אחד לפני ההדבקה כדי לאפשר הסתגלות לסביבה ולצפיפות האוכלוסייה החדשה.
    2. הקצאת בארות לתנאי הניסוי הבאים:
      1. ביקורת שלילית: בעלי חיים לא נגועים או מטופלים בדומה (מדומה).
      2. ביקורת חיובית: בעלי חיים נגועים בסוג בר C. albicans.
    3. הסר והחלף את כל המים ב-2 מ"ל מים פלנריים טריים כדי להבטיח אחידות בין הבארות.

3. הגדרת זיהום

  1. הכינו חיסון (ראו קובץ משלים 1 לחישוב מדגם)
    1. באמצעות טכניקת אספטית, הסר בעדינות את כל המים מלוח 6 בארות על ידי הטיית הפלטת לכיוון המשתמש.
    2. הוסף את הנפח המחושב של מים פלנריים לכל באר.
      הערה: יש להמשיך באר אחת בכל פעם כדי למנוע מבעלי החיים להתייבש.
    3. הוסף את הנפח המחושב של תרבית C. albicans לכל באר.
      הערה: הימנעו מחשיפת בעלי חיים לאוויר לפרקי זמן ממושכים, שכן ייבוש עלול לגרום ללחץ ולשנות את תוצאות ההדבקה.
  2. תנאי דגירה ניסיוניים בלוחות
    1. הניחו את הפלטת המחוסנת עם 6 בארות במקום חשוך וסטטי בטמפרטורת החדר.
    2. לשמור על לוחות ניסוי באזור נפרד ממושבות פלאנריות לא נגועות, כדי למנוע זיהום צולב.
    3. רשמו את תאריך ושעת החיסון (המסומנים כשעה 0 שעה).
      הערה: הימנעו מאזורים עם תנועה גבוהה או רגישים לרעידות (למשל, מגירות, משטחי מכשירים או משטחים עמוסים), שכן תנועה עלולה להעמיס על בעלי חיים ולבלבל תוצאות.
    4. דגרו פלנרים עם C. albicans עד 72 שעות, בהתאם לנקודת הקצה הרצויה.
  3. השעיה מחדש של תאי פטרייה
    1. בכל נקודת זמן, החזירו בעדינות את תאי C. albicans המיושבים מבלי להפריע לפלאנרים.
      הערה: הזמן (שעות [ש] או ימים [ד] לאחר ההדבקה) מתייחס לזמן שחלף מאז החשיפה הראשונית (זמן 0).
    2. ב-24 שעות לאחר ההדבקה (hpi)
      1. באמצעות פיפטת העברה סטרילית של 3 מ"ל, הט את הפלטה מעט לכיוון המשתמש.
      2. שאבו את המים הפלנריים ושפכו אותם בעדינות לאזור בבאר נקי מבעלי חיים כדי לערבב את שכבת הפטרייה שהתיישבה.
      3. חזור על שלב זה 5–10 פעמים בכל באר כדי לשבור את שכבת הפטרייה היציבה, תוך הימנעות ממגע ישיר עם פלנרים.
      4. צפה בהתיישבות פטרייתית על רקע כהה לראיה מיטבית לפני ואחרי שלבי ההשעיה.
      5. החזירו את בארות הבקרה הלא נגועים בתנאים זהים.
    3. ב-48 hpi
      1. חזור על הליך ההשעיה מחדש שתואר לעיל.
      2. בצע את כל שלבי ההשעיה מחדש בתוך ± שעה מהנקודה שנקבעה.
  4. סיום החשיפה (72 hpi)
    1. בעוצמה של 72 כ"ס, העבר בעדינות את הפלאנרים ללוח חדש עם 6 בארות המכיל 2 מ"ל מים פלנריים טריים לכל באר.
    2. למזער את העברת תרבית הפטרייה על ידי שימוש בנפח הנוזל הקטן ביותר האפשרי.
    3. לאחר העברת בעלי חיים, הסר את כל המים והחליפם במים פלנריים טריים.
      הערה: לטפל בבעלי חיים ובשברי רקמה בעדינות כדי להימנע מפגיעה מכנית או עומס נוסף.

4. הערכת נקודת קצה של מארח

  1. רישום תוצאות המארח
    1. התחל להעריך את תוצאות המארח ביום אחד לאחר ההדבקה (dpi) והמשך מדי יום עד לנקודת הסיום הניסיונית הרצויה.
    2. כמת את נזק המארח באמצעות מערכת ניקוד סטנדרטית 0–3 (איור 2).
      ציון 0: אין שינוי מביקורת לא נגועה (בריאה, ללא תסמינים).
      ציון 1: תסמינים קלים.
      ציון 2: תסמינים חמורים.
      תוצאה 3: מוות.
  2. קריטריונים להערכת תסמיני מארח
    1. ציון 0 (ללא תסמינים):
      1. זהה בעלי חיים שמפגינים מורפולוגיה, פיגמנטציה, התנהגות ותגובתיות תקינים ללא שינויים נראים לעין בביקורת לא נגועה.
    2. תוצאה 1 (קלה):
      הקצה ציון קל כאשר לפחות אחד מהתסמינים הבאים נצפה ביחס לבקרות אסימפטומטיות.
      1. מהירות תנועה מופחתת או התנהגות גלישה לא תקינה.
      2. אובדן חלקי או מלא של תגובת הפוטוטקטי.
      3. התכווצויות גוף ממושכות או חוזרות.
      4. פיגמנטציה לא תקינה או לא אחידה (אזורים בהירים או כהים יותר).
      5. נסיגה של רקמת ראש או זנב.
    3. תוצאה 2 (חמור):
      הקצה ציון חמור כאשר אחד או יותר מהתסמינים הבאים מופיעים בזמן שבעלי החיים חיים.
      1. שכבת עיניים או אובדן של עין אחת או שתיהן.
      2. אובדן מוחלט של הראש או נזק בולט לרקמות הקדמיות.
      3. אובדן רקמה משמעותי באזור הקדם-לועי.
      4. פיצול לאזורים מרובים בגוף (ראש, לוע או מקטעים אחוריים).
      5. פצעים פתוחים עם או בלי הפרשת ריר או דליפה פנימית.
      6. ניתוק חלקי של רקמות שמוביל לאובדן שלמות מבנית.
      7. יציבת גוף בצורת C, שיתוק או פגיעה חמורה בתנועתיות.
    4. תוצאה 3 (מוות):
      זהה את המוות על פי אחד או יותר מהקריטריונים הבאים.
      1. פירוק רקמה מלא או לליזה של בעלי חיים שלמים.
      2. אובדן מוחלט של תגובה לגירויים.
      3. אי התאוששות או התחדשות.
        הערה: איור 2 מספק תמונות מייצגות ותכונות מגדירות לכל ציון כדי להבטיח סיווג עקבי של פנוטיפ המארח.

5. קביעת הישרדות המאכסן לאחר חשיפה לפטרייתיות

  1. ב-3 dpi, העבירו בעדינות פלנרים ללוח חדש עם 6 בארות המכיל 2 מ"ל מים פלנריים טריים בכל באר, תוך הימנעות מהעברת תרבית פטרייתית שאריתית.
  2. צפו בבעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ אור (≥ 10x אובייקטיביות).
  3. רשמו את תוצאות המארח באמצעות גיליון הניקוד הסטנדרטי המסופק בקובץ המשלים 2.
  4. קביעת בעלי חיים חיים
    1. זהה בעלי חיים חיים על פי אחד או יותר מהקריטריונים הבאים.
      1. פוטוטקסיס שלילי.
      2. תגובה להפרעה עדינה של פיפטת העברה.
      3. מבנה גוף שלם.
      4. חיבור יציב לפלטה.
  5. קביעת בעלי חיים מתים
    1. זהה בעלי חיים מתים על פי אחד או יותר מהקריטריונים הבאים.
      1. פירוק מלא או פירוק (רק שאריות פסולת).
      2. גוף שקוף או מפורק.
      3. היעדר תנועה או תגובה לגירויים.
      4. אי התחדשות (היעדר היווצרות בלסטה).
  6. הסרת בעלי חיים מתים
    1. הסירו בעלי חיים מתים ופסולת רק לאחר אימות אי-עמידות תחת מיקרוסקופיה.
    2. שלב קריטי: הסרת בעלי חיים מתים מיד כדי למנוע זיהום צולב או מדידות הישרדות משתנות.
    3. אם נשארים פסולת או פטריות, העבר שוב את בעלי החיים ששרדו לצלחת טרייה המכילה מים פלנריים נקיים כדי למנוע זריעה מחדש או יצירת ביופילם של C. albicans .
      הערה: הנחו לוחות עם 6 בארות על רקע כהה במהלך בדיקה ויזואלית כדי לשפר את הניגודיות ולהקל על הערכת הפנוטיפ.

6. הערכת עומס פטרייתי

  1. כימות יחידת יצירת מושבות (CFU)
    1. בנקודות הזמן הרצויות להידבקות, לאסוף פלנרים (5–10 בעלי חיים לכל מצב ביום). כלול בקרות לא נגועות/מדומות תואמות ובקרות נגועות מסוג פראי.
    2. שטוף בעדינות את הבארות פעמיים עם 2 מ"ל מים פלנריים טריים כדי להסיר תאי C . albicans רקע.
    3. העבר פלנרים לצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים ומסומנים בגודל 1.7 מ"ל או 5.0 מ"ל והסר את כל שאריות המים.
    4. הוסף 300 מיקרוליטר מים פלנריים טריים לכל צינור.
    5. הומוגניזציה של בעלי חיים באמצעות עלי סטרילי עד שלא נותרו שברים גדולים (כ-30–45 שניות).
    6. בצע דילול סדרתי של ההומוגנט (למשל, 1:10, 1:100, 1:1000).
    7. לוח 100–200 מיקרוליטר של כל דילול על לוחות אגר של YPD בתוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל של אמפיצילין, ריפמפיצין, סטרפטומיצין וניאומיצין. פזרו באופן שווה באמצעות חרוזי זכוכית סטריליים או מפזר תאים סטריליים.
    8. אפשר לצלחות להישאר זקופות על הספסל במשך 5–10 דקות לאחר השריון כדי לאפשר ספיגת נוזל לאגר.
    9. הכינו שלוש פלטות לכל דילול ומצב.
    10. דגירה של לוחות בטמפרטורה של 30°C למשך 48 שעות.
    11. סופר את ה-CFU והכפל בגורם הדילול.
    12. נרמול ערכי CFU למספר הפלאנרים כדי לחשב ממוצע CFU לכל פלאנרי לכל תנאי. לדוגמה, אם נצפים 100 מושבות בדילול של 10× מהומוגנט של 5 בעלי חיים, הערך המחושב הוא 200 CFU לכל בעל חיים.

7. צביעת אנטי-קנדידה באימונופלואורסצנציה

  1. שיקולים כלליים לצביעה
    1. בצע את כל השלבים בנדנוד אורביטלי קל (100–140 סל"ד) בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. ראו קובץ משלים 1 לפרטים על נוגדנים ומקורות תגובה.
      אזהרה: פורמלדהיד, נתרן דודציל סולפט (SDS) ומי חמצן הם כימיקלים מסוכנים ויש לטפל בהם בהתאם לתקנות הבטיחות המוסדיות. פורמלדהיד הוא רעיל ומסווג כמסרטן; SDS הוא מגרה; ומי חמצן הוא מחמצן חזק שעלול לגרום לכוויות. לבש ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות ניטריל, נעליים סגורות ומשקפי מגן). לבצע הליכים הכוללים תגובות נדיפות במכסה אדים כימי מוסמך ולהיפטר מפסולת בהתאם להנחיות הבריאות והבטיחות הסביבתית המוסדית.
  2. איסוף דגימות
    1. אסוף בעלי חיים מכל תנאי ניסוי ונקודת זמן.
    2. העבר בעלי חיים לבקבוקי סינטילציה מתויגים בנפח 20 מ"ל המכילים 2 מ"ל מים פלנריים.
    3. הסר את כל הנוזלים, שטוף פעם אחת ב-2 מ"ל מים פלנריים טריים, ואז שוב את כל הנוזלים.
  3. קיבוע וחדירות
    1. הקריבו בעלי חיים ב-7.5% N-אצטילציסטאין (NAC) ב-1× PBS למשך 3 דקות.
    2. הסר את התמיסה ומקבע חיות ב-4% פורמלדהיד ב-0.3% PBSTx למשך 15 דקות.
    3. שטוף דגימות פעמיים עם 1× PBS.
    4. חדירת דגימות ב-1% SDS למשך 15 דקות.
    5. שטוף דגימות שלוש פעמים עם 1× PBS.
  4. הלבנה
    1. דגימות אקונומיקה ב-6% מי חמצן ב-1× PBS תחת אור LED בהיר למשך 4–12 שעות.
      הערה: אם ההלבנה לא מתבצעת מיד, יש לאחסן דגימות קבועות ב-1× PBS בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע או לייבוש דגימות ב-100% מתנול לאחסון ארוך טווח.
  5. חסימה ודגירה של נוגדנים
    1. העבר בעלי חיים ללוחות 24 בארות המכילים 1× PBS.
    2. חסום קשירה לא ספציפית ב-2.5% PBS-TB (PBS המכיל טריטון X-100 ואלבומין סרום בקר) למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או 8 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. דגמו דגימות עם נוגדן אנטי-קנדידה ראשוני (1:500 ב-PBS-TB) למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או 8 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. הסרת נוגדנים ראשוניים ושטיפה של דגימות שמונה פעמים כל 20 דקות עם 0.3% PBSTx (סה"כ ~2.5 שעות).
    5. דגמו דגימות עם נוגדן משני אנטי-ארנב מצומד Alexa-568 (1:800 ב-PBS-TB) למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או 8 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: להגן על דגימות מאור כדי למנוע הלבנת פוטו. ניתן להשתמש בתמיסות נוגדנים לשימוש חוזר.
    6. הסר נוגדנים משניים ושטוף דגימות שמונה פעמים כל 20 דקות עם 0.3% PBSTx.
  6. התקנת סלייד אופציונלית
    1. הנח את החיות על מגלש מיקרוסקופ כשכל בעלי החיים מכוונים לצד הקדמי כלפי מעלה.
    2. הסר מים עודפים באמצעות פיפטת העברה.
    3. ספג בזהירות את הנוזל שנותר מהקצוות באמצעות קצה מגבת נייר.
    4. הוסף 150–175 מיקרוליטר של מדיום הרכבה של גלוואטול (טבלה 2 להרכב) בזרם עד שבעלי החיים מכוסים במלואם.
    5. הנח בזהירות כיסוי מעל הדגימה, תוך הימנעות מבועות אוויר.
    6. תן לגלווטול להתגבש לפחות שעתיים לפני ההדמיה.
    7. אחסנו את המגלשות במקום קריר וחשוך לשימור ארוך טווח.
  7. הדמיה
    1. דגימות תמונה באמצעות עירור צהוב-ירוק (~578 ננומטר) ותצפית על פליטה כתומה-אדומה (~603 ננומטר).
    2. השתמש בעדשת אובייקטיב 2x כדי להמחיש דפוסי צביעה של בעלי חיים שלמים.

8. פתרון תקלות

  1. אם תוצאות ההדבקה אינן עקביות, יש לבצע עקומת מינון-טיטרציה באמצעות SN250 מסוג פראי או זן בסיסי אחר במרווחים של 5–10 ×10 7 תאים למ"ל.
  2. לבצע לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים המכילים 5–10 בעלי חיים בכל קבוצה.
  3. כללו קבוצות ביקורת שליליות וחיוביות כדי לזהות בעיות פוטנציאליות כגון זיהום צולב, כישלון בטכניקת אספטית, בעיות בחיוניות של זן, או בריאות בסיסית לקויה.
  4. לאחר השלמת ניסוי טיטרציית המינון, הבריכה משכפלת כדי לקבוע את ההישרדות החציונית לכל קבוצה.
  5. ניתוח הבדלים בהישרדות באמצעות ניתוח זוגות של מנטל–קוקס עם דירוג לוגריתם.
  6. השתמש בניתוח הישרדות קפלן–מאייר להערכת הבדלים בזמן עד המוות בין זנים או טיפולים.
  7. במצבי מינון תת-קטלניים או זיהומיים, נתחו תוצאות סימפטומטיות של מארח (למשל, פנוטיפים קלים או חמורים או קולוניזציה פטרייתית) במקום הישרדות.
  8. השווה תגובות מארח בין קבוצות מינון כדי לקבוע את טווח המינון המדבק או הקטלני המתאים לניסויים הבאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מעודכן להדבקת פלנרים ב-C. albicans (איור 1) וכימות שיטתי של תוצאות המארח (איור 2). זרימת עבודה משופרת זו תומכת בהערכה מעמיקה של פרמטרים מרובים של זיהומים, כולל תחלואה (חומרת מחלה סימפטומטית), הישרדות (קטלניות), עומס פטרייתי (CFUs), ודינמיקה מרחבית-זמנית של קולוניזציה של פתוגנים (פלואורסצנטיות אימונוסיינינג). בניגוד לרוב מודלי ההדבקה בחסרי חוליות, שמספקים בעיקר קריאות בינאריות של חיים ומתים, מודל פלאנרי זה תופס ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינוי המינון המדבק של C. albicans מסוג בר יוצר הבדלים תלויים במינון בתחלואה ב-S. mediterranea, מה שמדגיש את רגישות המודל להערכה כמותית של אלימות פטרייתית. פרוטוקול זה מפרט אסטרטגיות לקביעת מינונים בסיסיים של זיהום וקטלני במושבות פלאנריות המנוהלות במעבדה, ומציג קריטריונים לאישור הצלחה של זיהום מערכתית באמצעות השרייה, תוך שילוב ניקוד בריאות המארח עם מדידות עומס פטרייה באמצעות כימות CFU וצביעה חיסונית.

באמצעות אופטימיזציה שיטתית, זוהו מספר פרמטר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.J.N. הוא ממייסדי BioSynesis, Inc., חברה המפתחת אבחונים ותרפויים לזיהומים בביופילם. כל שאר המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לכל חברי מעבדות Nobile, Oviedo ו-Hernday על דיונים מעמיקים במודל הזיהום S. mediterranea-C. albicans ומודים לאדלוויס פיסטר על ניהול המעבדה ותחזוקת הפלאנרים. עבודה זו נתמכה על ידי פרסי המכון הלאומי לבריאות (NIH) והמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) R35GM156045 R35GM124594 ל-C.J.N., ו R35GM158501 ו-R01GM132753 ל-N.J.O. עבודה זו נתמכה גם על ידי משפחת קמנגר בצורת כיסא ממומן ל-C.J.N. N.M.S. נתמכה על ידי מלגות מרכז למכונות תאיות וביומולקולריות (CCBM) של הקרן הלאומית למדע (NSF) במרכז למצוינות מחקר במדע וטכנולוגיה (CREST) תחת פרסים NSF-HRD-1547848 ו-NSF-EES-2112675.

למממנים לא היה תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף וניתוח הנתונים, בפרשנות הנתונים, בכתיבת כתב היד או בהחלטה לפרסם את התוצאות. N.M.S. מכירה בשימוש ב-ChatGPT לסיוע בעריכת כתב היד (בדיקת איות, דקדוק, עיצוב ומבנה משפטים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.7 מ"לVWR/Genemate490004-436-BOXOF500נקי, קופסה של 500 חלקים
בקבוקי סינטיון בנפח 20 מ"לפישר סיינטיפיק12-100-006בקבוקי זכוכית שקופים לצביעת חיסון
לוחות פוליסטירן לא מטופלים עם 24 באריםפישר סיינטיפיק08-772-51צביעת חיסון
צינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 5.0 מ"לאפנדורף/סיגמא אולדריץ'EP0030119487-200EAנקי, קופסה של 200 חלקים
לוחות פוליסטירן לא מטופלים עם 6 בארותפישר סיינטיפיק08-772-49בדיקות זיהום
אגרVWR89405-066דרגה בקטריולוגית למדיום YPD
מקלות אפליקטורתרמופישר/פוריטני22-029-491C. albicans תרבות
BioRenderBioRender Inc.לא זמיןתוכנת עיצוב דמויות המשמשת ליצירת איורים סכמטיים
כלוריד סידן (CaCl2)סיגמא-אלדריץ'C5080-500Gמים פלנריים/1x Montjuï מלחים C
Candida albicans נוגדנים פוליקלונליים אנטי-ארנב, IgGתרמו פישרPA1-27158צביעת חיסון
צינורות צנטריפוגהVWR89039-664C. albicans קציר
צינורות תרבית זכוכית בורוסיליקט בגודל 18x150 מ"מVWR47729-583C. albicans תרבות
קובטותפישר סיינטיפיק14-955-127למדוד צפיפות אופטית של תרבויות
דקסטרוז (D-גלוקוז)פישר סיינטיפיקD16-3מדיום YPD
גליצרולפישר סיינטיפיקG33-4דרגת ביולוגיה מולקולרית לתוסף לאחסון קריוגני של C. albicans 
כלי גרפיה ויזואליזציה של נתוניםGraphPad/Prismתוכנה סטטיסטית וכלי לוויזואליזציה. Verison 10.6.1.
כלי גרפיםRתוכנה סטטיסטית. Verison 4.4.3.
רעידת חממהאפנדורףEPM1282-0004-1EAניו ברונסוויק אינובה 44/44R עבור C. albicans גידול
מגנזיום כלוריד (MgCl2)סיגמאM8266-100Gלמים פלנריים  (1x Montjuï c salts)
מגנזיום סולפט (MgSO4)סיגמא-אלדריץ'M7506-500Gלמים פלנריים  (1x Montjuï c salts)
שקופיות מיקרוסקופVWR16004-368
מיקרוסקופ מולטיזוםניקוןNikon AZ100 
N-אצטיל-L-ציסטאיןסיגמא אולדריץ'A7250-50Gתגובת רירית וקורבן   קיבוע
פרמלדהיד, תמיסה של 16%, דרגת ביולוגיה מולקולריתמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15710תגובת קיבוע
מנוע אלחוטי של Pellet Pestleפישר סיינטיפיק12-141-361הומוגניזציה פלנרית
פפטון, דרגה בקטריולוגיתHIMEDIA/VWR89129-480מדיום YPD
עליםפישר סיינטיפיק12-141-368כדור חד-פעמי ללא RNase להומוגניזציה פלנרית
צלחת פטרי, 100 על 15 מ"מVWR25384-342
פוליאוריתן (אלכוהול ויניל)סיגמא-אלדריץ'P-8136 עבור גלוואטול
כלוריד אשלגן (KCl)מדעי החיים של סיגמאP9541-500Gמדיום/מים פלנריים  (1x Montjuï c salts)
נוגדן משני נגד ארנב עזים, IgG, Alexa Fluor 568פישר סיינטיפיקA-11011צביעת חיסון
SN250מרכז מלאי גנטיקה פטרייתיתWildtype C. albicans זן (https://www.fgsc.net/)
אזיד נתרןפישר סיינטיפיקS227-100עבור גלוואטול
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)סיגמא-אלדריץ'S5761-1KGמדיום/מים פלנריים  (1x Montjuï c salts)
נתרן כלוריד (NaCl)מדעי החיים של סיגמאS3014-500Gמדיום/מים פלנריים  (1x Montjuï c salts)
ספקטרופוטומטראג'ילנט26354BioTek Epoch 2 Microplate למדידת צפיפות אופטית
חממה סטטיתפישר סיינטיפיק15-015-2634C. albicans culturing
פיפטות העברהפישר סיינטיפיק13-711-9CMפיפטות חד-פעמיות סטריליות ומדורגות לפלנרים מעבירים
בסיס טריססיגמא-אלדריץ'252859עבור גלוואטול
תמצית שמריםתרמו פישר212750מדיום YPD

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Delavy, M., et al. Unveiling Candida albicans intestinal carriage in healthy volunteers: the role of micro- and mycobiota, diet, host genetics and immune response. Gut Microbes. 15 (2), 2287618(2023).
  2. Bays, D. J., Savage, H. P. Candida albicans gastrointestinal colonization resistance: a host-microbiome balancing act. Infect Immun. 93 (9), e0061024(2025).
  3. Nash, A. K., et al. The gut mycobiome of the Human Microbiome Project healthy cohort. Microbiome. 5 (1), 153(2017).
  4. Fróis-Martins, R., Lagler, J., LeibundGut-Landmann, S. Candida albicans virulence traits in commensalism and disease. Curr Clin Microbiol Rep. 11 (4), 231-240 (2024).
  5. Kumamoto, C. A., Gresnigt, M. S., Hube, B. The gut, the bad and the harmless: Candida albicans as a commensal and opportunistic pathogen in the intestine. Curr Opin Microbiol. 56, 7-15 (2020).
  6. Fisher, M. C., et al. Tackling the emerging threat of antifungal resistance to human health. Nat Rev Microbiol. 20 (9), 557-571 (2022).
  7. Gow, N. A. R., et al. The importance of antimicrobial resistance in medical mycology. Nat Commun. 13 (1), 5352(2022).
  8. Lockhart, S. R., Chowdhary, A., Gold, J. A. W. The rapid emergence of antifungal-resistant human-pathogenic fungi. Nat Rev Microbiol. 21 (12), 818-832 (2023).
  9. Denning, D. W. Global incidence and mortality of severe fungal disease. Lancet Infect Dis. 24 (7), e428-e438 (2024).
  10. Benedict, K., Jackson, B. R., Chiller, T., Beer, K. D. Estimation of direct healthcare costs of fungal diseases in the United States. Clin Infect Dis. 68 (11), 1791-1797 (2019).
  11. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
  12. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 71-92 (2015).
  13. Höfs, S., Mogavero, S., Hube, B. Interaction of Candida albicans with host cells: virulence factors, host defense, escape strategies, and the microbiota. J Microbiol. 54 (3), 149-169 (2016).
  14. Talapko, J., et al. Candida albicans—the virulence factors and clinical manifestations of infection. J Fungi. 7 (2), 79(2021).
  15. Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
  16. Gaffar, N. R., Valand, N., Venkatraman Girija, U. Candidiasis: insights into virulence factors, complement evasion and antifungal drug resistance. Microorganisms. 13 (2), 272(2025).
  17. Xie, J., et al. White-opaque switching in natural MTLa/α isolates of Candida albicans: evolutionary implications for roles in host adaptation, pathogenesis, and sex. PLoS Biol. 11 (3), e1001525(2013).
  18. Costa-de-Oliveira, S., Rodrigues, A. G. Candida albicans antifungal resistance and tolerance in bloodstream infections: the triad yeast-host-antifungal. Microorganisms. 8 (2), 154(2020).
  19. Whaley, S. G., et al. Azole antifungal resistance in Candida albicans and emerging non-albicans Candida species. Front Microbiol. 7, 2173(2017).
  20. Marichal, P., et al. Contribution of mutations in the cytochrome P450 14α-demethylase to azole resistance in Candida albicans. Microbiology. 145 (10), 2701-2713 (1999).
  21. Lee, Y., Robbins, N., Cowen, L. E. Molecular mechanisms governing antifungal drug resistance. npj Antimicrob Resist. 1 (1), 5(2023).
  22. Maciel, E. I., Jiang, C., Barghouth, P. G., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. The planarian Schmidtea mediterranea is a new model to study host-pathogen interactions during fungal infections. Dev Comp Immunol. 93, 18-27 (2019).
  23. Maciel, E. I., Valle Arevalo, A., Ziman, B., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. Epithelial infection with Candida albicans elicits a multi-system response in planarians. Front Microbiol. 11, 629526(2021).
  24. Maciel, E. I., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. A planarian model system to study host-pathogen interactions. Methods Mol Biol. 2680, 231-244 (2023).
  25. Sánchez Alvarado, A. Planarian regeneration: its end is its beginning. Cell. 124 (2), 241-245 (2006).
  26. Sluys, R., Riutort, M. Planarian diversity and phylogeny. Methods Mol Biol. 1774, 1-56 (2018).
  27. Riera Romo, M., Pérez-Martínez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
  28. Peiris, T. H., Hoyer, K. K., Oviedo, N. J. Innate immune system and tissue regeneration in planarians: an area ripe for exploration. Semin Immunol. 26 (4), 295-302 (2014).
  29. Kangale, L. J., Raoult, D., Fournier, P. E., Abnave, P., Ghigo, E. Planarians as an emerging model organism for investigating innate immune mechanisms. Front Cell Infect Microbiol. 11, 619081(2021).
  30. Karami, A., Tebyanian, H., Goodarzi, V., Shiri, S. Planarians: an in vivo model for regenerative medicine. Int J Stem Cells. 8 (2), 128-133 (2015).
  31. Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. Establishing and maintaining a colony of planarians. Cold Spring Harb Protoc. 2008 (10), (2008).
  32. Ivanković, M., et al. A comparative analysis of planarian genomes reveals regulatory conservation in the face of rapid structural divergence. Nat Commun. 15, 8215(2024).
  33. Fincher, C. T., Wurtzel, O., De Hoog, T., Kravarik, K. M., Reddien, P. W. Cell type transcriptome atlas for the planarian Schmidtea mediterranea. Science. 360 (6391), eaaq1736(2018).
  34. Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods Mol Biol. 1774, 455-466 (2018).
  35. Rouhana, L., et al. RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics. Dev Dyn. 242 (6), 718-730 (2013).
  36. Winsor, L., Sluys, R. Basic histological techniques for planarians. Methods Mol Biol. 1774, 285-351 (2018).
  37. Lu, J., et al. 3D reconstruction of neuronal allometry and neuromuscular projections in asexual planarians using expansion tiling light sheet microscopy. eLife. 13, e101103(2025).
  38. Rink, J. C., Vu, H. T. K., Alvarado, A. S. The maintenance and regeneration of the planarian excretory system are regulated by EGFR signaling. Development. 138 (17), 3769-3780 (2011).
  39. Fajardo, P., Cuenda, A., Sanz-Ezquerro, J. J. A mouse model of candidiasis. Methods Mol Biol. 2321, 63-74 (2021).
  40. Singh, S., Singh, S., Kumar, A. Systemic Candida albicans infection in mice causes endogenous endophthalmitis via breaching the outer blood-retinal barrier. Microbiol Spectr. 10 (4), e01658-e01722 (2022).
  41. Spellberg, B., Ibrahim, A. S., Edwards, J. E., Filler, S. G. Mice with disseminated candidiasis die of progressive sepsis. J Infect Dis. 192 (2), 336-343 (2005).
  42. Andes, D. Use of an animal model of disseminated candidiasis in the evaluation of antifungal therapy. Methods Mol Biol. 118, 111-128 (2005).
  43. Spellberg, B., et al. Parenchymal organ, and not splenic, immunity correlates with host survival during disseminated candidiasis. Infect Immun. 71 (10), 5756-5764 (2003).
  44. Clinical overview of invasive candidiasis. , Centers for Disease Control and Prevention. Available at: https://www.cdc.gov/candidiasis/hcp/clinical-overview/index.html (2024).
  45. Kobayashi, G. S. Medical microbiology. , NCBI Bookshelf. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8103/ (1996).
  46. Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 18026(2018).
  47. Van Rhijn, N., Rhodes, J. Evolution of antifungal resistance in the environment. Nat Microbiol. 10 (8), 1804-1815 (2025).
  48. Brown, G. D., et al. The pathobiology of human fungal infections. Nat Rev Microbiol. 22 (11), 687-704 (2024).
  49. Osset-Trénor, P., Pascual-Ahuir, A., Proft, M. Fungal drug response and antimicrobial resistance. J Fungi. 9 (5), 565(2023).
  50. Yan, Z. Z., et al. Environmental microbiome, human fungal pathogens, and antimicrobial resistance. Trends Microbiol. 33 (1), 112-129 (2025).
  51. Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network. PLoS Genet. 5 (12), e1000783(2009).
  52. Noble, S. M., French, S., Kohn, L. A., Chen, V., Johnson, A. D. Systematic screens of a Candida albicans homozygous deletion library decouple morphogenetic switching and pathogenicity. Nat Genet. 42 (7), 590-598 (2010).
  53. Gulati, M., et al. In Vitro Culturing and Screening of Candida albicans Biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60(2018).
  54. Takeda, H., Nishimura, K., Agata, K. Planarians Maintain a Constant Ratio of Different Cell Types During Changes in Body Size by Using the Stem Cell System. Zoological Science. 26 (12), 805-813 (2009).
  55. Roberts-Galbraith, R. H. RNAi screening to assess tissue regeneration in planarians. Methods Mol Biol. 2450, 509-527 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים