מאמר שיטה

שימוש ב-NMR בתמיסה לאפיון קונדנסטים ביומולקולריים בתנאים דו-פאזיים

DOI:

10.3791/70530

⸱

17 באפריל 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Institute of Biochemistry, ETH Zurich

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לשיטות NMR, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) ו-CONdensate DEtectioN באמצעות העברת מגנטיזציה SEmi-מוצק (CONDENSE-MT) המאפשרים אפיון כמותי ללא תוויות של קונדנזטים ביומולקולריים בתנאים דו-פאזיים, החושפים חלוקה מולקולרית, דינמיקת חילופיים, הידרציה של קונדנסאט ומבנה טיפות ללא שקיעה או תיוג.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיבויים ביומולקולריים הנוצרים באמצעות הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) מארגנים את הסביבה התוך-תאית ומווסתים תהליכים ביוכימיים מגוונים. למרות חשיבותם, חקירת הרכב העיבוי, דינמיקת החלפות וארגון פנימי נותרת מאתגרת, במיוחד ללא תגיות חיצוניות. ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) יכולה לספק חלון ייחודי ללא תוויות אל ההרכבות המזוסקאליות הללו, ולוכד הן את התנועה המולקולרית והן את ההטרוגניות הסביבתית. שתי שיטות NMR משלימות מאפשרות אפיון מקיף של עיבויים ישירות בתוך מצבם הביפאזי. עבור עיבויים שהם דינמיים מספיק כדי להיבחין בהם באמצעות NMR, גישת חילופי הדיפוזיה, REstricted DIffusion of INvisible speciEs בקיצור REDIFINE, משתמשת בניגוד הדיפוזיה להחלפה כימית כדי לכמת את חלק המולקולות המחולקות בין פאזות מעובות לדוללות, לקבוע את גודל הטיפה וחדירות הממשק, ולחלץ קצבי החלפה מולקולריים מעבר לגבול הפאזה. עבור עיבויים קשיחים יותר שאינם נראים על ידי NMR, שיטת העברת מגנטיזציה חצי-מוצקה המזוהה במים, CONdensate DEtectioN באמצעות העברת מגנטיזציה SEmi-solid, או בקיצור CONDENSE-MT, מנצלת את ניגוד הרלקסציה והחלפת פרוטונים בין ביומולקולות מעובות לממס פאזה מדולל כדי לנטר עיבויים על פרוטוני המים בתפזורת המים, ומספקת גישה לחלוקה יחסית, קצב גלגול מולקולרי, דינמיקת הידרציה ותכולת מים קשורים. ביחד, גישות אלו מספקות מבט רב-ממדי וכמותי על מבנה ודינמיקת העיבוי בתנאים דו-פאזיים כמעט טבעיים ללא תגיות פלואורסצנטיות או גילוי. האינטגרציה שלהם מרחיבה את ארגז הכלים של NMR לחקר הפרדת פאזה ביומולקולרית ומבססת בסיס לחיבור תכונות פיזיקוכימיות של קונדנסאט לבין תפקודם הביולוגי ולוויסות הלקוי הפתולוגי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים משיגים את הארגון המרחב והזמני יוצא הדופן שלהם על ידי הפרדת תגובות ביוכימיות 1,2,3. בנוסף לאברונים הקשורים לממברנה, תהליכים תאיים קריטיים רבים מתרחשים בתוך תאים חסרי ממברנה הנוצרים על ידי הפרדת שלב נוזל-נוזל (LLPS) של חלבונים וחומצות גרעין4. הרכבים דינמיים אלו, המכונים לעיתים קונדנסאטים ביומולקולריים, כוללים את הגרעין, גרגרי מאמץ, נקודות גרעיניות וגופי עיבוד, הממלאים תפקידים חיוניים, למשל, במטבוליזם של RNA, ויסות שעתוק או העברת אותות 5,6. היכולת שלהם ליצור, להמיס ולהחליף רכיבים בתגובה לרמזים סביבתיים מעניקה לתאים מנגנון גמיש לארגון פעילויות ביוכימיות מבלי להסתמך על ממברנות ליפידיות.

תת-קבוצה גדולה של עיבוי ביומולקולר נובעת מחלבוני קישור RNA (RBPs) המכילים אזורים לא מסודרים (IDRs) ותחומי קישור RNA (RBDs)7,8. חלבונים אלו יכולים להיפרד באופן פאזי לבד או במורכבות עם RNA, וליצור עיבויים בעלי תכונות חומריות ופונקציות ביולוגיות מגוונות. לדוגמה, חלבון הנוקלאוקפסיד SARS-CoV-2 (N) יוצר עיבוי ביומולקולרתי תלויי RNA9 המעורבים באריזת והרכבה של הגנום הוויראלי, בעוד שחלבון הפוליפירימידין 1 (PTBP1) יוצר עיבוי גרעיני התורם להשתקת גנים10. בנוסף, חלבונים כמו FUS ו-DDX4 עוברים LLPS המונעים על ידי האזורים הלא מסודרים שלהם, המשפיעים על מטבוליזם ה-RNA והיווצרות גרנולות לחץ11,12. דיסרגולציה של תהליכים אלו קשורה למחלות ניווניות כמו טרשת צדדית אמיוטרופית (ALS) ודמנציה פרונטוטמפורלית, שבהן מעברי פאזה חריגים עלולים להוביל להצטברות ואובדן תפקוד13.

עיבוי אינו מוגבל לחלבונים ולקומפלקסים של חלבון–RNA. RNA לבדו יכול לעבור LLPS, במיוחד בהקשר של רצפי התרחבות חוזרים הקשורים למספר הפרעות נוירודגנרטיביות14,15. התרחבויות חוזרות של טרינוקלאוטידים והקסנוקלאוטידים, כמו CAG במחלת הנטינגטון או CUG בדיסטרופיה מיוטונית, עלולות ליצור עיבוי דמויי טיפות הן במבחנה והן בתאים14. הבנת הבסיס הפיזיקלי של עיבוי RNA, וכן כיצד הוא שונה מעיבויים מונעי חלבון וחלבון-RNA, היא חיונית להבהרת המנגנונים המולקולריים שמאחורי מחלות התרחבות חוזרות.

למרות חשיבותם הביולוגית, אפיון כמותי וללא תוויות של עיבויים ביומולקולריים נותר אתגר משמעותי16. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית וטכניקות ספקטרוסקופיה מסתמכות על תוויות חיצוניות, שיכולות להפריע למבנה המולקולות הביולוגיות, לדינמיקה או להתנהגות פאזה17,18. יתרה מזאת, חלק מהעיבויים אינם נראים ל-NMR בשל תנועה מולקולרית מוגבלת וצורות קווים רחבות, מה שמגביל את המידע הנגיש בגישות המסורתיות של NMR. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף באסטרטגיות ניסיוניות שיכולות לחקור עיבויים ישירות במצבם הביפאזי, הדומה לילידים, ללא תיוג. בהינתן התפקיד החשוב של גבול פאזה של הטיפה בתהליכי חילוף ובבשלת קונדנסט, חשוב לא פחות לייצב טיפות ביומולקולריות בתוך נפח דגימה נתון, ובכך למנוע שקיעה של השלב הצפוף. ניתן להשיג זאת בקלות באמצעות הידרוג'לים האגרוזיים המחקים שלד ציטו.

פיתוחים אחרונים במתודולוגיות מבוססות NMR מספקים פתרון כזה. הגישה REDIFINE (REstricted DIffusion of INvisible speciEs)19 משלבת NMR דיפוזיה עם ניתוח חילוף כימי כדי לכמת חלוקה מולקולרית, קינטיקת חילוף וגודל טיפות בחלבון ובעיבוי חלבון–RNA. בנוסף, טכניקת CONDENSE-MT (CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer)20 מזהה עיבויים בלתי נראים ב-NMR באמצעות העברת מגנטיזציה של מים, ומאפשרת לכימות את כמות החומר המעובה בתנאים נתונים ולחשוף עוד יותר את דינמיקת ההידרציה וקצב הגלגול המולקולרי בתוך הקונדנסאט. יחד, שיטות אלו מאפשרות מחקרים ללא תוויות ולא פולשניות של סוגי קונדנסט מגוונים, חלבון בלבד, RNA חלבון ועיבוי RNA בלבד בתנאי שיווי משקל דו-פאזיים. על ידי הרחבת ארגז הכלים של NMR, הם פותחים דלת לחקירה שיטתית וכמותית של מבנה העיבוי, הדינמיקה והקשרים שלהם לתפקוד ביולוגי ולמחלה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת דגימה

  1. בחירת בופר: השתמש בבופרים שנבדקו בהם הביומולקולות הן היציבות ביותר.
    הערה: אותות NMR בדרך כלל חזקים יותר ב-pH נמוך. כדרישה טכנית, להוסיף 5% D2O כנעילת שדה לכל דגימות ה-NMR (v/v סופי).
  2. ייצוב את הדגימה הדו-פאזית, באמצעות הידרוג'ל אגרוז המדמה שלד ציטוקלטון כמדיום. שקול אבקת אגרוז להכנת ציר אגרוז של 1.5% (בלי/כיוון) באותו בופר. השתמש באגרוז רגיל כחלופה זולה יותר לקונדנסטים ביומולקולריים שנוצרים על ידי חלבונים לא מסודרים (IDPs) ו-RNA שיכולים לעמוד בטמפרטורות גבוהות יותר. השתמש באגרוז עם התכה נמוכה בעת הכנת עיבויים עדינים הכוללים חלבונים המכיליםדומיינים מקופלים.
  3. הכנת ציר האגרוז: חממו את המתקן לטמפרטורה של כ-80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וממיסים את האגרוז במלואו על ידי ערבוב או מערבולת.
    אזהרה: אגרוז מותך חם ויכול לשרוף; עם כפפות עמידות לחום.
    הערה: שמרו על האגרוז המותך חם (למשל, 55 מעלות צלזיוס לאגרוז רגיל ו-37 מעלות צלזיוס לאגרוז עם התכה נמוכה) באמבט מים כדי להישאר נוזלי לפני ערבוב עם הדגימה הביולוגית.
    ניתן לשמור על אגרוז מותך חם במשך כמה עשרות דקות19,21.
  4. הכינו דגימה דו-פאזית סופית:
    1. להכנת דגימה דו-פאזית שמיוצבת על ידי הידרוג'ל אגרוז, מערבבים מלאי חלבון (ו/או RNA) עם בופר אגרוז חם בהתאמה בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
      הערה: ריכוז החלבון/RNA הסופי הוא בדרך כלל 50-500 מיקרומולר כדי להתאים לזיהוי NMR.
    2. העבר מיד את התערובת לצינור NMR בקוטר 3 מ"מ באמצעות פיפטת זכוכית ארוכה. אפשר לאגרוז להתגבש זמן קצר לאחר ההעברה.
      הערה: ללא אגרוז, הדגימה הדו-פאזית מתכווצת עם הזמן, מה שמסבך את איסוף וניתוח נתוני NMR משום שהדגימה משתנה פיזית בקנה המידה של הניסוי.
  5. ביצוע בדיקה ויזואלית: בדוק את הדגימה בצורה ויזואלית. אם מתרחשת הפרדה בפאזה, הדגימה נראית מיד עכורה ונשארת כך. דבר זה מצביע על כך שהדגימה הביפאזית יוצבה בהצלחה באגרוז.
  6. כאשר מתכוונים להריץ CONDENSE-MT, הכינו דגימת ייחוס אגרוז נוספת על ידי ביצוע אותם שלבים, רק תוך השמטת הוספת הביומולקולה. הוסיפו את הבופר במקום זאת כדי לקבל את אותו נפח דגימה. הכינו דגימה זו רק לאחר הכנת דגימת העיבוי ומדידת כל הנתונים עליה, כדי להבטיח שדגימת הייחוס של האגרוז לא תדגר זמן רב יותר.

2. תיעוד ניסויי REDIFINE

  1. נעול, שים, התאמה, וכוון את ערוץ 1Hכרגיל. כייל את אורך הדופק של 90 ° על 1שעה לפי ההליך הכללי שלך.
  2. הקלט ספקטרום חד-ממדי עם דיכוי מים. רצוי שאות ביומולקולרי חזק נצפה (איור משלים 1A).
    1. אם לא נצפה אות או מעט מאוד, נניח שהחלבון/RNA המעובה אינו ניתן לצפייה ב-NMR ושהחלוקה לפאזה המעובה גבוהה. במקרה זה, אל תמשיך ב-REDIFINE, שכן שיטה זו מתבססת על אות ביומולקולרי נצפייה.
    2. במצב כזה, בעיקרון ניסויי CONDENSE-MT אמורים לעבוד היטב, אז קפצו מיד לשלב 4 (הקלטת ניסויי CONDENSE-MT).
  3. טענו את ניסוי ספקטרוסקופיית דיפוזיה מסודרת (DOSY) הקונבנציונלי המבוסס על פרוצדורה דו-ממדית עם הדהוד מגורה קונבנציונלי באמצעות גרדיאנטים דו-קוטביים (רצף פולס ברוקר: stebpgp1s19). עיינו במדריכי המשתמש של Bruker DOSY ו-Diffusion לפרטים נוספים.
  4. כוון את P0, P1 ו-P27 לאורך הפולס המכויל של 90°. הגדר ככלל אצבע, NS ל-32 סריקות, DS ל-16, TD1 ל-16, וכיוון את TD2 ו-SW2 כדי לקבל זמן רכישה AQ של 80-100 מילישניות. הגדר d1 ל-1.5 שניות.
    הערה: הגרדיאנטים צריכים להיות מכוילים כראוי.
  5. אופטימיזציה של עיכוב ווטרגייט d19 כרגיל בהתאם לשדה המגנטי שלך, כדי לספק עירור מקסימלי באורומטים (כ-7 ppm) או באליפטיות (כ-1 ppm). הגדר d20 ל-75 מילישניות. הבחירה ב-p30 תלויה בגודל החלבון/RNA. לחלבונים >20 kDa, השתמשו ב-5 ms; לחלבונים קטנים יותר, השתמשו ב-3.5 ms ככלל אצבע.
  6. הקליטו ניסוי DOSY באמצעות הפקודה: 'xau dosy 2 95 16 l y y' שמסדר את עוצמת גרדיאנט הדיפוזיה מ-2 עד 95% ב-16 שלבים, בצורה ליניארית.
    1. באופן אידיאלי, יש לצפות בדעיכה הראשונית של האות הנובעת מהפאזה המדוללת, בעוד שדעיכת אות הפאזה המרוכז צריכה להגיע לתייצון (איור 1A ואיור משלים 1B).
  7. כדי להמשיך לאסוף נתונים עבור כל סט REDIFINE, צור 9 stebpgp1s19 חדשים על ידי העתקת הפרמטרים מהפרמטרים הראשוני שהרצת. בכל ניסוי עוקב, שנו רק את עיכוב הדיפוזיה d20 בשלבים משתנים כך שיכסה את הטווח בין 100–1000 מילישניות (כלומר, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 1,000 מילישניות).
  8. הריץ כל אחד מהניסויים הללו לפי הפקודה 'xau dosy 2 95 16 l y n'. ה-"n" האחרון מבטיח שהרווח של המקלט נשמר לאורך עשרת הניסויים.

3. עיבוד מערכי נתונים של REDIFINE והדמיית התוצאות

  1. עבדו כל ניסוי (10 בסך הכל) בדרך הבאה:
    1. הגדר qsine של SSB 2 כפונקציית חלון, חילוץ פרוסהחמישית באמצעות qsin; fp, הפאזה של ממד אחד ושמור את פרמטרי השלב למערך הנתונים הדו-ממדי.
    2. לאחר מכן מעבדים 2D עם xf2, מבצעים תיקון בסיסי abs2, וחלצו את 16 הפרוסות האלה עם split2D (קלטים נוספים בחלון הפופ-אפ: r – 16 – 11). זה יחלץ 16 ספקטרות שנרכשו באמצעות עוצמות גרדיאנטים שונות וישמור אותם כניסויים מעובדים חד-ממדיים בין 11 ל-26 בתוך אותו מאגר נתונים.
    3. חזור על אותו הדבר עבור תשעת הניסויים הנותרים. לפעמים חשוב לבדוק לפחות את 4-5 הפרוסות הראשונות כדי לוודא שהפאזה ותיקון הבסיס נכונים. אם צריך, יש לתקן ידנית – פאזה טובה וקו בסיס הם תנאי מוקדם לכימות נכון (איור 1B).
  2. השתמש בקוד Matlab LLPS_REDIFINE_fit לניתוח (איור משלים 2A). בקוד, התאם לפי הניסויים שלך את הדברים הבאים: 'Delta' (דיפוזיה כפול d20), 'P.d' (משך גרדיאנט כולל 2*p30), exp(1,:) ל-exp(10,:) בהתבסס על # הניסויים שהרצת. אחר כך הגדר P.g לפי עוצמות הגרדיאנט של הגרוב שלך (נגיש בתיקיית הניסויים של TopSpin תחת קובץ "difflist").
  3. התאימו את ה'תיקייה' וה'נתיב' לפי מיקום הנתונים שלכם. הרץ את הקוד עד השורה 40. זה ייתן לך את הפרוסה החד-ממדית – מכאן, בחר את אזורי האינטגרציה; אלה צריכים לכלול ארומטיים או אליפטיים, ולבחור את האזור הצר ככל האפשר, מבלי להתחשב בקבוצות מולקולריות שונות כמו אמידים.
  4. הזן את גבולות האינטגרציה בנקודות במשתנים 'שמאל' ו'ימין' בהתאם (איור משלים 2A). המטרה היא לשלב את הנתונים לניתוח הכמותי (איור 1C). בחר את שם המטריצה לפי הדגימה שלך, תאריך הריצה, וכמה פרטים ניסיוניים.
  5. הרץ את כל הקוד. ב-'fit0', ניתן לבחור את הפרמטרים ההתחלתיים שבהם פונקציית האופטימיזציה תשתמש כדי להתחיל את המינימיזציה. התחל עם הערכים ברירת המחדל, ואם לא הושגה התכנסות, שנה את ערך fit0 השני (אוכלוסייה בשלב הדחוס) בשלבים של 0.1 מ-0.1 ל-1.
    הערה: לפעמים למערך הנתונים יש מספר מינימום מקומי, ויש לשנות את הפרמטרים ההתחלתיים באופן נרחב כדי להתחיל להתכנס למינימום הגלובלי יותר.
  6. כאשר הושג התאמה מספקת, ערכי ההתאמה יירשמו בתוך האיור (איור 1D ואיור משלים 2B) וניתן לגשת אליהם במשתנה 'התאמה'. השרטט את הפרמטרים הללו כגרף סטטיסטי לשיפור ההמחשה.

4. תיעוד ניסויי CONDENSE-MT

הערה: מטרת הניסוי היא לזהות בעקיפין את הקונדנסטים על ידי תצפיתם על אות המים בממס דרך חילוף פרוטונים20. בניסוי CONDENSE-MT, נרכש ומנותח פרופיל MT של טביעת אצבע (איור 2A)20.

  1. הקלט את הספקטרום החד-ממדי האהוב עליך עם מדכא מים. אם נצפה מעט מאוד אות, סביר מאוד שניסוי CONDENSE-MT יעבוד היטב.
  2. ניתוח CONDENSE-MT כמותי דורש קביעה מוקדמת של קצב המים R1. קבעו את קצב R1 באמצעות התאוששות ההיפוך T1 . העתק את רצף הפולסים שסופק, קבוצת פרמטרי ברוקר ורשימת ה-vd לתיקיות המתאימות. טען את מערך הפרמטרים "T1_inversion_recovery" והתאם את ההספק והתדרים לספקטרומטר ה-NMR שלך (לפי "edprosol").
    1. כיייל את הפולס של 1H ב-90° (p1), כוון את NS ל-2, DS ל-0, d1 ל-20 שניות, SW ל-10 ppm, TD2 ל-16k, ו-TD1 ל-24 (מאורך רשימת ה-VD המתואמת שלך). אפשר שיפוע חלש לאורך Z (GPZ0 = 0.1%) כדי למנוע השפעות דיכוי קרינה.
  3. לניסוי CONDENSE-MT,
    1. העתק את סט הפרמטרים של Bruker, הרצף ורשימת התדרים לתיקיות הספציפיות ל-Bruker, טען את ערכת הפרמטרים "CONDENSE-MT", והתאם את התדרים וההספק בהתאם לספקטרומטר שלך.
    2. כוון את P1 לאורך הפולס המכויל של 90° ואת P4 ל-1 מיקרושניות לפולס העירוי כדי למנוע דיכוי קרינה. הגדר NS ל-2, DS ל-16, d1 ל-4 שניות, SW2 ל-20 ppm, TD2 ל-8k, TD1 לאורך רשימת התדרים (בדרך כלל 46). הגדר SPNAM10 ל-Squa100.1000 ומשך הזמן שלו p10 עד 5 שניות.
    3. מצא את ההספק של SP10 כדי להפיק הקרנה של 100 הרץ (הפקודה 'pulse 100 Hz' תחשב את ההספק שלך גם בוואט וגם ב-dB). כוון את עוצמת פולס ההקרנה SP10 בהתאם והריץ את הניסוי הפסאודו-ממדי הזה באמצעות פקודת 'zg'.
      הערה: הניסוי ישתמש ברשימת התדרים שסופקה החוצה את הסטות הקרינה מההפעלה עם המים ועד תהודה רחוקה מאוד (100000 הרץ) כדי לזהות את אות המים בהסטות קרינה שונות (איור 2B). גרף של אינטגרלים של מים (להבטיח שלב נכון של הספקטרומים; איור 2C) ביחס להיסט הקרינה נותן את פרופיל CONDENSE-MT המוצג באיור 2A.
  4. צור 7 ניסויים חדשים ובכל אחד עוקב, הגדל רק את עוצמת הקרינה כדי לכסות את הטווח בין 170 הרץ ל-1000 הרץ (כלומר, 170, 250, 330, 500, 650, 780, 1,000 הרץ). בכל ניסוי, השתמש בפקודה מהנקודה הקודמת. על כל עוצמת רוויה, רשימת ההיסט כולה תתרכש (איור 2D).
    הערה: התאמת CONDENSE-MT דורשת את נתוני הייחוס שנאספו בדגימת אגרוז בלבד (מדיום ללא עיבוי ביומולקולרי). להבטיח את אותו מרווח זמן בין הכנת הדגימה לאיסוף נתונים, ולרכוש את אותו מערך נתונים של 8 ניסויים על דגימת ייחוס של אגרוז. המטרה היא להבטיח שגם הפנייה לאגרוז וגם הדגימה הביפאזית היו מודגרים לאותו פרק זמן.

5. עיבוד מערכי נתונים של CONDENSE-MT והדמיית התוצאות

  1. עבדו כל ניסוי CONDENSE-MT (8 בסך הכל, איור משלים 3A) בדרך הבאה.
    1. הגדר qsine של SSB 2 כפונקציית החלון, חילץאת הפרוסה ה-46 באמצעות qsin; fp, מאזן את שיא המים ב-1D, ושמור את פרמטרי השלב למערך הנתונים הדו-ממדי, ואז מעבד דו-ממדי עם xf2, וחלץ את 46 הפרוסות הללו עם split2D (קלטים נוספים בחלון הפופ-אפ: r – 46 – 11).
      הערה: זה יחלץ 46 ספקטרום חד-ממדי שנרכשו באמצעות הזזות קרינה שונות וישמור אותם כניסויים מעובדים חד-ממדיים מ-11 עד 56 בתוך אותו מערך נתונים (איור משלים 3A, מוצג לניסוי CONDENSE-MT ב-1000 הרץ).
    2. חזור על אותו הדבר בשבעת הניסויים הנותרים. בדוק מספר פרוסות מכל ניסוי כדי לוודא שהפאזה והבסיס נכונים (איור 2C). אם צריך, תקן ידנית – פאזינג טוב וקו בסיס הם תנאי קדם לכימות נכון!
  2. חזרו על אותם שלבים בנתונים שנאספו באמצעות דגימת ייחוס אגרוז ולניסויי שחזור ההיפוך, תוך חילוץ הפרוסה ה-24 לפאזה ושימוש בפיצול 2D (r – 24 – 11).
  3. התאמת הנתונים שנרכשו באמצעות קוד Matlab שסופק. עקוב אחרי ההוראות הספציפיות בתסריט.
  4. בצע את ניתוח ההתאמה תחילה עבור דגימת הייחוס של האגרוז כדי לקבל את פרמטרי הרקע בהיעדר עיבויים. קוד read_CONDENSE_MT_data קורא תחילה את נתוני ה-NMR המעובדים ומשלב את אות תהודה המים בפרוסות חד-ממדיות שנוצרות על ידי פקודת split2D (איור משלים 3B).
  5. קבע גבולות אינטגרציה בנפרד; ספקטרום חד-ממדי ייתן ב-Matlab כדי להעריך את גבולות האינטגרציה (איור משלים 3C). הקוד ינרמל עוד יותר את הנתונים ויתאים לאינטגרלים המנורמלים של מים כפונקציה של הסטת הקרינה והספק למודל CONDENSE-MT20. read_CONDENSE_MT_data יאחסן את האינטגרלים המנורמלים במשתנה integral_water_real_all, אשר ישמש לאחר מכן להתאמה הבאה.
  6. קבעו את קצב ההרפיה R1 של המים בנוכחות אגרוז או קונדנסטים לפני התאמת נתוני CONDENSE-MT.
    הערה: התאמת ניסוי שחזור ההיפוך של המים יכולה להתבצע בתוך החלק הראשון של כתב CONDENSE-MT_full Matlab (או בסקריפט CONDENSE_MT_referenceMTpool במקרה של נתוני ההתייחסות של האגרוז). שם הקובץ והנתיב של הניסוי, כמו גם מזהה הניסוי של הניסוי, ניתנים להזנה כדי להריץ את סקריפט Inversion_Recovery Matlab (איור משלים 4A, סעיף 1). במידת הצורך, ניתן להתאים את מספר הפרוסות החד-ממדיות ואת גבולות האינטגרציה בסקריפט זה; האחרון תלוי בפרמטרי העיבוד בהם משתמשים ב-TopSpin. סעיף זה יקבע את קצב המים R1 ויאחסן אותו במשתנה P.R1w , הנדרש להתאמה הבאה של נתוני CONDENSE-MT.
  7. לנתוני אגרוזה, יש להשתמש באינטגרלים המנורמלים ישירות להתאמה, תוך שימוש בסקריפט CONDENSE_MT_referenceMTpool (שקורא לפונקציית function_1MT .
  8. לצורך כימות עיבוי, השתמשו בפרמטרים המותאמים של אגרוז כקלט להתאמה גלובלית של הנתונים שנאספו על הדגימה המעובה (איור משלים 4A). זה יקבע את התכונות הפיזיקליות של רשת האגרוז כערכים קבועים להתאמה, ויאפשר כימות של ההשפעה הנוספת של עיבוי המוטמע ברשת האגרוז (איור 2E).
  9. בצע את כימות העיבוי באמצעות סקריפט CONDENSE-MT_full , שקורא לפונקציית function_2MT Matlab. הפרמטרים ההתחלתיים לאופטימיזציה חישובית ניתנים באמצעות fit0 (איור משלים 4B). אי-הוודאות של הפרמטרים של ההתאמה תחושב באמצעות מטריצת יעקוביאן שממנה תופק מטריצת השנות-משתנות (איור משלים 4B).
  10. הערך את איכות ההתאמה לפי סטיית ההתאמה, בדומה לסטייה השארית של חיזוי המודל מנתוני ניסוי. לבקרת איכות נוספת, השרטט את ההתאמה יחד עם נתוני ניסוי (איור משלים 4C).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול LLPS REDIFINE המתואר כאן יושם על דומיין N-טרמינל של FUS (NTD). FUS NTD מתפצל בקלות בתנאים סביבתיים בריכוזים מיקרומולריים19,21. דגימה זו הוכנה בריכוז של 200 מיקרומום בבופר HEPES של 30 מ"מ, המכילה 200 מ"מ KCl ב-pH 7.5, עם 0.5% אגרוז סדיר. לאחר הפרדת פאזה, אותות FUS NTD נשארים ניתנים לצפייה בפאזה המעובה (איור 1A,B). זה הופך אותו למועמד מושלם ללימודי LLPS REDIFINE. כלומר, רוב החלבונים הנוטים ל-LLPS מכילים אזורים ארוכים עם חוסר סדר פנימי שבדרך כלל נשארים נראים בשלב המעובה; עם זאת, בחלבונים מובנים יותר, זה לא המצב.

התאמת REDIFINE (איור 1D ואיור 3A,B) חשפה מספר פרמטרים ייחודיים לדגימת FUS NTD זו. באופן ספציפי, הוא קבע את מקדמי הדיפוזיה בפאזה המדוללת והמעובה (Ddil ו-D cond), אוכלוסיית החלבון בפאזה המעובה (νcond), גודל הטיפה הממוצע R, וחדירות אינטרפאזה p. גודל הטיפה והחדירות מגדירים את שער החליפין בין הפאזות מהפאזה המעובה לפאזה מדוללתk cd=3p/R, ומאפשרים לנו לקבל מידע על דינמיקת ההחלפה19.

תוצאות אלו ניתנות להמחשה בדרכים שונות (איור 3B). באמצעות תרשים עכביש, ניתן להשוות תוצאות בין תנאים או דגימות שונות. מצד שני, ניתן לייצג את פרמטרי REDIFINE במודל בצורה ציורית כדי להמחיש אותם בצורה היעילה ביותר. שימו לב ש-REDIFINE מספק את כל התוצאות הללו ללא תוויות תוך כמה שעות בלבד, באמצעות דגימה אחת בלבד.

מכיוון שאות ה-NMR של FUS NTD נשאר ניתן לזיהוי בשלב המעובה (איור 3C), סביר להניח שאות ה-CONDENSE-MT לא יהיה רלוונטי בשל היעדר ניגוד הרפיה. תיעדנו את מערך הנתונים CONDENSE-MT על FUS NTD, ואכן, לא נצפה הבדל בפרופיל ה-MT בין הפנייה של האגרוז לדגימה הדו-פאזית של FUS NTD (איור 3C). דבר זה הופך את מתודולוגיית CONDENSE-MT לבלתי ישמה לדגימת FUS NTD הספציפית הזו.

עם זאת, ה-CONDENSE-MT מספק אפיון דינמי של עיבוי RNA בהרחבה חוזרת (איור 3C,D)20. יש לשים לב ש-CONDENSE-MT יכול לספק מספר פרמטרים המאפיינים באופן ייחודי את ה-RNA בפאזה המעובה (איור 3D), למרות שהאות שלו אינו ניתן לצפייה ב-NMR קונבנציונלי (איור 3C). הפרמטרים שהתקבלו הם הקינטיקה של חילוף פרוטונים בין העיבוי למים בתפזורת (kעיבוי, H2O ו-kH2O, עיבוי), קצב ההרפיה T2 עבור העיבוי (T2, עיבוי), המשקף את היקף העצירה הדינמית של הביומולקולות בעת העיבוי, וקצב R2 הנראה של מים בתפזורת (R2, מים). פרמטר זה הוא שילוב ליניארי של קצב הגלגול של נפח מים, מים מדוללים, ומים מעובים ואיטיים. ערכיR 2 גבוהים יותר מצביעים על אוכלוסייה גבוהה יותר של מים בעיבוי, מה שמעלה את קצב המים הכולל הנראה R2 ל-20 (איור 2E ואיור 3D).

זמינות נתונים וקוד

נתוני LLPS REDIFINE הגולמיים וקודי עיבוד זמינים במאגר Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787 . נתוני גולם וקודי עיבוד של CONDENSE-MT הופקדו במאגר Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697. MATLAB נדרש לעיבוד. הם מופיעים גם במאמר זה (קבצי קידוד משלימים).

figure-results-1
איור 1: תהליך עבודה של REDIFINE. (א) מדידות דיפוזיה מניבות עקומות דעיכה דו-פאזיות מורכבות בדגימות מעובים. הדעיכה המתקבלת מכילה פרמטרים דה-קונבולביים המתארים את מקדמי הדיפוזיה של המינים בשלב המעובה והמדולל, את אוכלוסיותיהם, גודל הטיפות ושיעור החליפין בין-פאזי. (ב) כדי לפענח פרמטרים מבודדים אלו, יש להקליט מערך נתונים פסאודו-תלת-ממדי על ידי שינוי לא רק עוצמת הגרדיאנט אלא גם של עיכובי הדיפוזיה. חשוב מאוד לכימות שכל פרוסה ממדידות אלו תתוקן בפאזה ובסיס נכון. (ג) לאחר בדיקת איכות הנתונים הנמדדים והמעובדים, פרוסות חד-ממדיות אלו מוזנות לקוד MATLAB לניתוח ולגרף סופי. (D) הנתונים מותאמים לאחר מכן על ידי פותר תכנות לא ליניארי. ההתאמה והפרמטרים המתקבלים מוצגים עבור דגימת NTD הדו-פאזית FUS. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: זרימת עבודה של CONDENSE-MT (A) פרופיל ייחודי של CONDENSE-MT שנצפה על תהודה המים הממחיש את ההרחבה הנובעת מנוכחות ביומולקולות מעובות ומים. (B) מים נצפים עבור כל הזזת קרינה. (ג) לצורך כימות חיוני שכל הספקטרום יועברו בפאזה נכונה. (D) לאחר רכישת תהודה של המים בהזזות קרינה שונות, הניסוי חוזר על עצמו בעוצמות קרינה שונות. זה יניב מערך נתונים של אות המים היחסי כפונקציה הן של הזזת הקרינה והן של עוצמת הקרינה (E). הנתונים מותאמים לאחר מכן על ידי פותר תכנות לא ליניארי. ההתאמה והפרמטרים המתקבלים מוצגים עבור דגימת RNA דו-פאזית 31xCAG. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: הצגת תוצאות REDIFINE ו-CONDENSE MT. (א) ייצוג גרף ספיידר של פרמטרי REDIFINE לניתוח השוואתי בין דגימות או תנאים. (B) מודל סכמטי המדגים פרמטרים שמקורם ב-REDIFINE, כולל מקדמי דיפוזיה, רדיוס הטיפות, חלוקה ושער החלפה בין פאזות. (ג) השוואת פרופילי CONDENSE-MT שנאספו עבור ייחוס אגרוז ו-FUS דו-פאזי NTD באגרוז בהקרנה של 500 הרץ.
(D) ניתוח CONDENSE-MT של עיבוי RNA עם התרחבות חוזרת 31xCAG המראה חילוץ פרמטרים והדמיה של השפעות העברת מגנטיזציה הקשורה לעיבוי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: הגדרת REDIFINE. (א) תחום ה-N-טרמינל של FUS נשאר ניתן לצפייה בעת הכנת הדגימה הדו-פאזית המעובה. נצפתים אות חזק של אמיד/אמינו ואות פרוטונים ארומטיים. (B) דעיכת האות שנצפתה בניסוי DOSY הדיפוזיה מדגימה דעיכה מהירה יותר של אוכלוסיית חלבוני שלב הדילול ודעיכה איטית יותר של החלבון בשלב המעובה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: עיבוד REDIFINE. (A) קוד Matlab המשמש להתאמת REDIFINE, עם פרמטרים מודגשים במקום שבו נדרש הקלט הספציפי. ההשקעה ממחישה כיצד בוחרים את אזור האינטגרציה. (ב) מזעור פונקציית ההתאמה והתוצאות הנובעות מכך. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3: הגדרת CONDENSE-MT. (א) סקירה של ניסויי ה-NMR הנדרשים לניתוח CONDENSE-MT, כולל ניסוי ההיפוך והחזרת מים (expno. 5) וניסויי CONDENSE-MT בעוצמות קרינה שונות (expno 11-18). (B), (C) סקירה של סקריפט Matlab לקריאה ואינטגרציה של ספקטרום המים חד-ממדי עבור מערכי נתונים CONDENSE-MT. ניסויי CONDENSE-MT ניתנים כראשי – main8. גבולות האינטגרציה מוזנים כ-water_left ו-water_right. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 4: עיבוד CONDENSE-MT. (A) החלק הראשון של סקריפט התאמת CONDENSE-MT, הכולל התאמת התאוששות הפיכת מים (סעיף 1) וקלט של פרמטרי הרקע שנקבעו מראש באגרוז. (ב) התאמה וקביעת אי-ודאות פרמטרים של מאגרי נתונים של CONDENSE-MT. פרמטרי ההתחלה של ההתאמה יכולים להיות מוגדרים בתוך fit0. (ג) קטע השרטוט של תוצאת התאמת CONDENSE-MT. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קבצי קידוד משלימים: סקריפטים של MATLAB לניתוח REDIFINE ו-CONDENSE-MT. קודדי Bruker Topspin להקמת ניסוי CONDENSE-MT וסקריפטי MATLAB המשמשים לעיבוד והתאמת מערכי נתוני דיפוזיה של REDIFINE ומערכי נתונים להעברת מגנטיזציה CONDENSE-MT, כולל אינטגרציית נתונים, ניתוח הרפיה ושגרות התאמת מודלים גלובליות. MATLAB נדרש להריץ את הסקריפטים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן הצגנו פרוטוקולים מפורטים לאפיון NMR ללא תוויות של עיבויים ביומולקולריים דו-פאזיים. אלה כוללים את שתי המתודולוגיות המתפתחות, LLPS REDIFINE, וניסוי משלים אך אורתוגונלי בשם CONDENSE-MT. למרות שבדרך כלל ישים, LLPS REDIFINE מסתמך על גילוי ביומולקולרי ודורש אות נצפה בעת הפרדת פאזה לניתוח נכון. למרות שזה עלול להגביל את היישום של REDIFINE, רוב הקונדנסטים מכילים חלבונים עם אזורים בלתי מסודרים באופן מהותי שבדרך כלל נראים על ידי NMR. בפרט, עבור עיבוי של חלבון:RNA ו-RNA בלבד, אות המולקולות הביולוגיות בשלב המעובה מתרחב מעבר למגבלות הגילוי בהפרדת פאזה. אם מקדם החלוקה לפאזה המעובה גבוה, כמעט ואין אות שנצפה ב-NMR קונבנציונלי. CONDENSE-MT עוקפת את מגבלת הגילוי הזו בכך שהיא טכניקה שנצפתה במים, המתבססת על הבדל משמעותי ברפיה בין מינים מולקולריים בשלבים מדוללים ומעובים.

הכנת דגימה נכונה היא המפתח ליישום מוצלח של REDIFINE ו-CONDENSE-MT. לכן חשוב לוודא שהאגרוז מותך לחלוטין לפני העברתו לתערובת, כדי למנוע היווצרות נרחבת של בועות אוויר במהלך ההעברה ולספק חומר מספק למילוי אמין של צינור NMR בתערובות דו-פאזיות שנוטות להידבק תחילה לדופן הזכוכית. עבור CONDENSE-MT, חשוב להעביר נפח אגרוז נתון באופן שכפולי, שכן רקע האגרוז ימומד בנפרד. אם חלוקת הביומולקולות בין פאזות מעובות לדוללות מוטה מאוד, או אם ההחלפה בין פאזות איטית או מהירה מאוד, ייתכן שהשפעות REDIFINE או CONDENSE-MT יהיו חסרות או חלשות מדי לכימות אמין. זה יכול להיראות כמו מגבלה מרכזית של טכניקות אלו. במקרה כזה, עם זאת, העלאה או הורדה של הטמפרטורה יכולה לעזור, שכן הטמפרטורה היא מודולטור חזק של חלוקה מולקולרית ושערי חליפין כימיים. לאחר רכישת מערכי נתונים, תוצאות התאמה אופטימליות מתקבלות לעיתים באופן איטרטיבי על ידי חזרה על האופטימיזציה החישובית באמצעות פרמטרי ההתאמה הטובה ביותר מההתאמה הראשונית או הקודמת כערכי קלט.

במערכות שמפיקות אפקטים חזקים של REDIFINE ו-CONDENSE-MT, ניסויים אלו יכולים לספק תובנות ללא תוויות על חלוקה מולקולרית, שערי חליפין ודינמיקה מולקולרית שקשה להשיג בשיטות אחרות ללא תווית. יתרה מזאת, שיטות מבוססות NMR הן בדרך כלל לא פולשניות, ומאפשרות ניתוח דגימות מספר פעמים או אחסון לפרקי זמן ממושכים, מה שמאפשרות ניטור תכונות העיבוי לאורך זמן. זה מעניין במיוחד בהקשר של הבשלה פתולוגית של עיבוי בפיבריליזציה, שהיא מאתגרת לחקור בשיטות משלימות לאורך תקופות זמן ארוכות מאוד.

בהינתן שאברונים תאיים ללא ממברנה הם בדרך כלל הרכבות רב-רכיביות עם ארכיטקטורה מורכבת, יישומים עתידיים של טכניקה זו יכללו זיהוי ואפיון של מערכות מודל קונדנסט רב-רכיביות מתקדמות יותר ויותר, וכן ניתוחי עיבוי בהקשר תאי באמצעות NMR בתוך התא. עם זאת, הדבר דורש התאמת REDIFINE או CONDENSE-MT למערכות מורכבות כאלה, ומאמצים להשגת זאת מתבצעים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי קרן המדע הלאומית השווייצרית (SNSF) 310030-215555 (F.H.-T.A.), 4078P0_198253 (F.H.-T.A.), CRSII5_205922 (F.H.-T.A.), 205321_204920 (F.H.-T.A.), ומענק RNA ומחלות של NCCR 51NF40-182880 (F.H.-T.A.).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ספקטרומטר 700 מגה-הרץ Avance NEO NMRברוקר ביוספיןhttps://www.bruker.com/en.htmlהנתונים נאספים באמצעות ספקטרומטר NMR בתדר 700 MHz. 
טופספיןביוספין ברוקרhttps://www.bruker.com/en.htmlהנתונים מעובדים באמצעות תוכנה זו.
חלבון FUS NTDלא זמיןחלבון זה מתבטא ומטוהר במעבדה שלנו
RNA 31xCAGלא זמיןRNA מיוצר ומטוהר במעבדה שלנו
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlהנתונים מעובדים ומוצגים באמצעות תוכנה זו.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).
  2. Alberti, S. Phase separation in biology. Curr. Biol. 27, R1097-R1102 (2017).
  3. Mehta, S., Zhang, J. Liquid–liquid phase separation drives cellular function and dysfunction in cancer. Nat. Rev. Cancer. 22 (4), 239-252 (2022).
  4. Boeynaems, S., et al. Protein phase separation: a new phase in cell biology. Trends Cell Biol. 28 (6), 420-435 (2018).
  5. Mitrea, D. M., Kriwacki, R. W. Phase separation in biology; functional organization of a higher order. Cell Commun. Signal. 14 (1), 1(2016).
  6. Brangwynne, C. P., Mitchison, T. J., Hyman, A. A. Active liquid-like behavior of nucleoli determines their size and shape in Xenopus laevis oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (11), 4334-4339 (2011).
  7. Borcherds, W., Bremer, A., Borgia, M. B., Mittag, T. How do intrinsically disordered protein regions encode a driving force for liquid–liquid phase separation. Curr. Opin. Struct. Biol. 67, 41-50 (2021).
  8. Langdon, E. M., Gladfelter, A. S. A new lens for RNA localization: liquid-liquid phase separation. Annu. Rev. Microbiol. 72 (1), 255-271 (2018).
  9. Perdikari, T. M., et al. SARS-CoV-2 nucleocapsid protein phase-separates with RNA and with human hnRNPs. EMBO J. 39 (24), e106478(2020).
  10. Sola, I., et al. The polypyrimidine tract-binding protein affects coronavirus RNA accumulation levels and relocalizes viral RNAs to novel cytoplasmic domains different from replication-transcription sites. J. Virol. 85 (10), 5136-5149 (2011).
  11. Murthy, A. C., et al. Molecular interactions underlying liquid–liquid phase separation of the FUS low-complexity domain. Nat. Struct. Mol. Biol. 26 (7), 637-648 (2019).
  12. Yuwen, T., Brady, J. P., Kay, L. E. Probing conformational exchange in weakly interacting, slowly exchanging protein systems via off-resonance R1ρ experiments: application to studies of protein phase separation. J. Am. Chem. Soc. 140 (6), 2115-2126 (2018).
  13. Patel, A., et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 162 (5), 1066-1077 (2015).
  14. Jain, A., Vale, R. D. RNA phase transitions in repeat expansion disorders. Nature. 546 (7657), 243-247 (2017).
  15. Wadsworth, G. M., et al. RNAs undergo phase transitions with lower critical solution temperatures. Nat. Chem. 15 (12), 1693-1704 (2023).
  16. Alberti, S., Gladfelter, A., Mittag, T. Considerations and challenges in studying liquid–liquid phase separation and biomolecular condensates. Cell. 176 (3), 419-434 (2019).
  17. Dörner, K., et al. Fluorescent protein and peptide tags alter condensate formation and dynamics in vivo and in vitro. EMBO Rep. 27, 89-121 (2026).
  18. Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649(2014).
  19. Novakovic, M., et al. LLPS REDIFINE allows the biophysical characterization of multicomponent condensates without tags or labels. Nat. Commun. 16 (1), 4628(2025).
  20. Schmoll, J., Novakovic, M., Allain, F. H. T. Water-detected NMR allows dynamic observations of repeat-expansion RNA condensates. Nat. Chem. 17 (11), 1785-1794 (2025).
  21. Emmanouilidis, L., et al. NMR and EPR reveal a compaction of the RNA-binding protein FUS upon droplet formation. Nat. Chem. Biol. 17 (5), 608-614 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

REDIFINECONDENSE MT

מאמרים קשורים