חילוץ DNA בעמודה בקצב בינוני באמצעות מדפי 24 בארות

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה חסכונית להאצת חילוץ DNA מפלסמיד. באמצעות מדפי תלת-ממד מותאמים אישית התואמים לרוטורים סטנדרטיים עם פלטות דלי מתנדנדות, חוקרים יכולים לעבד עד 48 עמודי סיבוב עם פקקים או עד 116 עמודות סיבוב ללא פקקים בו-זמנית, מה שמקצר משמעותית את זמן הטיפול בהשוואה לשיטות מיקרוצנטריפוגה ידניות.

תקציר

חילוץ עמוד ספין באמצעות ממברנת סיליקה הוא התקן לטיהור DNA איכותי, אך הוא דורש עבודה רבה וקשה להרחיב ידנית מעבר למנות קטנות. רובוטים אוטומטיים קיימים לטיפול בנוזלים עדיין לעיתים קרובות יקרים מדי למעבדות קטנות ובינוניות. מאמר זה מציג גישה פשוטה וחצי-אוטומטית באמצעות מדפים מותאמים אישית ומודפסים בתלת-ממד, המתאימים לרוטורים סטנדרטיים של פלטות צנטריפוגה.

המערכת המוצעת מאפשרת עיבוד מקביל של עד 116 עמודות סיבוב מסחריות סטנדרטיות. עיצוב המדף מאפשר תצורה "מקוננת", המאפשרת הבהרה סימולטנית של ליזאט (באמצעות עמודי סינון) וקשירת DNA (באמצעות עמודי סיליקה) בשלב צנטריפוגציה יחיד. יתרה מזאת, העיצוב כולל מאגר פסולת משותף, מה שמבטל את הצורך להשליך זרימה מצינורות בודדים במהלך שלבי השטיפה.

שיטה זו משיגה תפוקת DNA וטוהר השווים לפרוטוקולים ידניים סטנדרטיים, אך מפחיתה את זמן העיבוד הכולל בכ-50–70% עבור דגימות גדולות מ-24 (60–90 דקות במקום 120–180 דקות). הזמן הכולל הנדרש לשלבים הכוללים סינון ליזאט, שטיפות והשלכת פסולת מתקצר ב-5–10 דקות ללא קשר למספר הדגימות המעובדות. גישה חומרה בקוד פתוח זו מגשרת בין מיני-הכנות ידניות לאוטומציה יקרה.

מבוא

בידוד חומצות גרעין באמצעות מטריצות סיליקה הובהר לראשונה בשנת 1979 על ידי ווגלשטיין וגילספי, שקבעו את העיקרון היסודי של ספיגת שברי DNA לאבקת זכוכית בנוכחות ריכוזים גבוהים של מלחים כאוטרופיים, ובפרט יודיד נתרן¹. פריצת דרך זו הציעה אלטרנטיבה בטוחה ויעילה יותר למיצוי פנול-כלורופורם רעילים ולשיטות האולטרה-צנטריפוגציה המייגעות של גרדיאנט כלוריד צזיום ששלטו בתקופה. בהמשך, בום ושותפיו שיפרו משמעותית את המתודולוגיה הזו על ידי הכנסת גואנידיניום תיוציאנאט (GuSCN) כסוכן הכאוטרופי העיקרי². חידוש זה היה מכריע, שכן GuSCN פועל בו-זמנית כדנאטורנט חלבון עוצמתי לתאי ליז וכמעכב חזק של RNאזות ו-DNאזות, ובכך שומר על שלמות חומצות הגרעין בשלבי החילוץ הראשוניים.

מאז תחילתה, טכנולוגיית החילוץ בפאזה מוצקה זו — המכונה "שיטת הבום" — עברה שיפורים נרחבים. הוא הותאם לבידוד חומצות גרעין ממטריצות ביולוגיות מורכבות יותר ויותר, החל מפלסמיד^{חיידקי 3} ו-DNA^{גנומי 4} ועד ל-DNA גנומי אאוקריוטי⁵ ו-DNA גנומי בעל משקל מולקולי גבוה. יתרה מזאת, הטכנולוגיה הורחבה ליישומים קליניים ופורנזיים, כולל בידוד DNA מחזור חופשי מתאים מפלזמה⁶, הפקת DNA ו-RNA צמחים עקשנים עשירים בפוליפנולים⁷, וטיהור חומצות גרעין ויראליות⁸. קיימות גם ערכות מסחריות רבות המשתמשות בעמודי ספין.

המנגנון הפיזיקוכימי שמאחורי התהליך הזה נשען על שיבוש מבנה המים על ידי יונים כאוטרופיים. בנוכחות חוזק יוני גבוה ו-pH נמוך, קליפות ההידרציה שמקיפות את עמוד השדרה של פוספט חומצת הגרעין ואת פני הסיליקה מוסרות (התייבשות). דבר זה מאפשר יצירת גשרים קטיוניים—בדרך כלל מתווכים על ידי Na⁺ או קטיוני כאוטרופיים—בין קבוצות הסילנול הטעונות שלילית על פני הסיליקה לבין קבוצות הפוספט של חומצת הגרעין. סלקטיביות לגבי סוג חומצת הגרעין (DNA מול RNA) ואורך השבר מושגת באמצעות מודולציה מדויקת של כימיית הבופר. לדוגמה, ריכוזי מלח ספציפיים ורמות pH יכולים להעדיף קישור של גדילי גנום ארוכים על פני אוליגונוקלאוטידים קצרים, או להבדיל בין RNA ל-DNA. בנוסף, גרסאות מודרניות של טכנולוגיה זו משתמשות לעיתים קרובות במשטחי סיליקה מותאמים כדי לשפר את איזותורמות הספיגה הדיפרנציאלית של מיני חומצות גרעין ספציפיות.

תהליך העבודה הקנוני לטיהור חומצות גרעין מבוסס סיליקה עובר ארבעה שלבים מובחנים: (1) ליזיס, שבו החומר הביולוגי ההתחלתי עובר הומוגנית ומבנים תאיים מתפרקים, לעיתים באמצעות תנאים בסיסיים או חומרי ניקוי (SDS/Triton); (2) הבהרה, שבה מסירים פסולת תאית, חלבונים שוקעים ופוליסכרידים כדי למנוע סתימת עמודות; (3) קשירה, שבה הסופרנטנט מכוון עם מלחים כאוטרופיים ואתנול כדי לקדם ספיחה לממברנת הסיליקה; ו-(4) שטיפה, שבה חומצות הגרעין הקשורות לממברנה נשטפות באמצעות בופרים מבוססי אלכוהול להסרת מלחים ומעכבים שנותרו לפני שחרור בבופר בעל חוזק יוני נמוך.

למרות שהכימיה של תהליך זה חזקה, הטיפול המכני בעמודי סיבוב בודדים נותר צוואר בקבוק משמעותי בתהליכי עבודה בקצב בינוני (24–100 דגימות), ויוצר פער בין עיבוד ידני למערכות טיפול נוזליות אוטומטיות יקרות. גישות קיימות לפישוט חילוץ ידני מבוסס עמודות כוללות סעפות ואקום ותחנות עבודה רובוטיות לטיהור אוטומטי 9,10,11,12.

סעפות ואקום זמינות בדרך כלל בתצורת גישה אקראית המצוידת ב-20–24 מתאמי לואר לעמודים צנטריפוגליים, או בעיצוב המיועד לשימוש עם לוחות 96 בארות. מניפולדי ואקום המותאמים ל-20–24 דגימות מאיצים את שלב שטיפת העמודה במהלך טיהור ה-DNA בהשוואה לצנטריפוגציה, שכן הם מבטלים את הצורך להסיר עמודים מהרוטור. למרות ששיטה זו נוחה, עלולה להתרחש זיהום צולב מכיוון שקצה הניקוז בעמוד נוגע בפתח לואר של מניפולד הוואקום. אם DNA מעמודה נכנס לפתח לואר, ניתן להעבירו לעמוד דגימה אחר במהלך שימוש נוסף במניפולד. כדי למנוע זיהום, יצרנים ממליצים על אביזרים נוספים^10,13; עם זאת, אלה מסבכים את הרכבת מערכת החילוץ ולעיתים קרובות מושמטים.

מניפות ואקום שתוכננו לפורמט של 96 בארות כוללות מבנה שונה ומיועדות לא לעמודי מיקרוצנטריפוגות אלא ללוחות חילוץ DNA תואמים עם 96 בארות, שבהן בארות מכילים ממברנת סיליקה. במקרה זה, חילוץ ה-DNA מתבצע באמצעות ערכות בידוד DNA בפורמט 96 בארות¹⁴. ערכות אלו מציעות תפוקה גבוהה אך יש להן יישום מוגבל, שכן עיבוד של פחות מ-96 דגימות הוא לעיתים קרובות בלתי מעשי.

תחנות עבודה רובוטיות אוטומטיות להפקת חומצות גרעין הן ללא ספק השיטה הנוחה ביותר לטיהור DNA, שכן הן דורשות מעורבות מינימלית של המפעיל, ובכך חוסכת זמן לחוקר וממזערת גורמים סטוכסטיים כמו זיהום. למרבה הצער, רוב תחנות החילוץ חסרות אוניברסליות ופועלות אך ורק עם ערכות ייעודיות. תחנות עבודה אלו משמשות בעיקר במעבדות אבחון, אך אינן משתלמות ברוב המעבדות האקדמיות הקטנות והבינוניות.

לכן, קיים פער בפרקטיקה מעבדתית לשיטות חילוץ DNA במהירות בינונית המסוגלות לעבד בין 12 ל-96 דגימות בפחות משעה. אנו מציגים מתקן עם 24 בארות שמאפשר בידוד ידני של עד 48 דגימות באמצעות עמודות ספין עם כיסוי ועד 116 דגימות באמצעות עמודות ספין לא מכוסות. צנטריפוגה עם רוטור דלי מתנדנד ומיקרוצנטריפוגה בזווית קבועה משמשים כציוד נוסף. ההליך לטיהור DNA בפלסמיד מוצג כדוגמה לשימוש במדפי 24 בארות, שכן בידוד DNA בפלסמיד כולל שלב הבהרה להסרת פסולת תאים מפורקים, מה שמקשה על אוטומציה של התהליך. עם זאת, ניתן להשתמש במדפים אלו כמעט בכל שיטת חילוץ חומצות גרעין מבוססת עמודות.

פרוטוקול

1. הכנת ציוד מודפס בתלת-ממד

1. הדפיסו את המדף באמצעות מדפסת תלת-ממד עם פילמנט מותך עם פיה בקוטר 0.4 מ"מ. השתמש בפילמנט PLA, PETG או ABS גנרי עם מילוי של 100%. הגדר את גובה השכבה ל-0.1 מ"מ ואפשר החלקת משטח. כוון את הגדרות ההדפסה כדי להבטיח עמידות למים ויציבות מכנית.
   הערה: קבצי STL לרכיבי rack מסופקים בקובץ המשלים 1. עקבו אחר פרמטרי ההדפסה שנקבעו עבור מאגר הבסיס. בדקו את המאגר לפני השימוש על ידי מילוי ב-70% אתנול וצנטריפוגה לאורך זמן הולך וגדל (1, 2, 5, 10 ו-30 דקות) כדי לוודא שאין דליפה או נזק מבני.
2. הדביקו את רכיבי מאגר הבסיס יחד ליצירת יחידה אטומה.

2. תרבית חיידקים וניתוק

1. חיסון טרנספורמנטים של E. coli לתוך 3–5 מ"ל מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. דגרו במהלך הלילה (12–16 שעות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור.
2. קצרו תאים בצנטריפוגציה ב-2,000 × גרם למשך 10 דקות. זרוק את הסופרנטנט.
   הערה: כדורי תאים עשויים להיאחסן בטמפרטורה של −20°C לפני העיבוד.
3. הוסף 250 מיקרוליטר של בופר תלייה מחדש (Buffer P1 עם RNase A) לכדור. תשעה מחדש לחלוטין באמצעות וורטקס או פיפטינג.
4. הוסף 250 מיקרוליטר של בופר ליזיס (Buffer P2). מערבבים על ידי הפיכת הצינור בעדינות 4–6 פעמים.
   הערה: הימנעו מערבוב אינטנסיבי כדי למנוע חיתוך DNA גנומי.
5. הוסף 350 מיקרוליטר של בופר ניטרול (Buffer N3). מערבבים מיד היטב על ידי היפוך.
   הערה: אמור להיווצר משקע לבן, מה שמעיד על ניטרול מוצלח.

3. הרכבת יחידת הסינון

1. הניחו עמודות קישור DNA בשכבת מחזיק העמודה של המתקן.
2. מקם את מכסי העמודה בחריצים ייעודיים כדי לאבטח אותם במהלך הצנטריפוגה.
3. הנח עמודות הבהרה/סינון בשכבת עמודות הסינון ישירות מעל עמודות הקישור.
   הערה: אם עמודות המסנן אינן זמינות, יש לצנטריפוגה את הליזאט במיקרוצינורות ולהעביר את הסופרנטנט לעמודות הקישור.

4. ניקוי ליזאט וקשירת DNA

1. העבר את הליזאט המנוטרל משלב 2.5 לעמודות הסינון.
2. הנח את המתקן המורכב בתוך רוטור דלי מתנדנד.
   זהירות: ודא איזון נכון באמצעות מתקן משקל נגד בעל מסה שווה ותצורה זהה.
3. צנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך דקה בטמפרטורת החדר.
4. הסר את המתקן מהצנטריפוגה.
5. הסר והשליך את שכבת עמודת המסנן.

5. כביסה

1. להשליך את הזרימה מהמאגר למיכל פסולת. הרכיבו מחדש את המדף עם עמודי כריכה.
2. הוסף 500–700 מיקרוליטר של בופר שטיפה לכל עמוד קישור באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
3. צנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך דקה אחת.
4. השליכו את הזרימה מהמאגר.
5. חזור על השטיפה על ידי הוספת בופר שטיפה לכל עמודה וצנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך דקה.
   הערה: ניתן לאחסן עמודים בטמפרטורת החדר או בטמפרטורה של 4°C לאחר הכביסה.

6. ייבוש והסרה

1. הסר את עמודי הקישור מהמדף והעבר אותם לצינורות איסוף של 2 מ"ל.
2. צנטריפוגה ב->10,000 × גרם למשך דקה אחת לייבוש הממברנה.
3. להעביר עמודים לצינורות נקיים של 1.5 מ"ל.
4. הוסף 50 מיקרו-ליטר של בופר שחרור או מים ישירות לממברנה. דגרו דקה בטמפרטורת החדר.
5. צנטריפוגה ב->10,000 × גרם למשך דקה אחת כדי להוציא DNA.

7. אופציונלי: משקעים משותפים עם דו-תחמוצת טיטניום

1. מערבבים בופר ליזיס עם אבקת טיטניום דו-חמצני ביחס נפח למסת 2:1.
2. הוסיפו 250 מיקרוליטר מתליית דו-תחמוצת הטיטניום לליזאט. ערבב לפי היפוך.
3. הוסיפו 350 מיקרוליטר של בופר ניטרול וערבבו היטב.
4. צנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך דקה אחת.
5. אספו את הסופרנטנט מבלי להפריע למשקעים.
6. העבר את הסופרנטנט לעמוד הקישור.

תוצאות

וריאציות של מדף
פיתחנו ארבע גרסאות של מדפים המתאימות למגוון רחב של דגמי צנטריפוגות, המאפשרות שימוש במשאבים הזמינים במעבדות שונות והתאמה להעדפות המשתמשים. כל המדפים כוללים פורמט של 24 בארות, אך בהתאם לגרסה, כוללים עמדות ישיבה נוספות לעמודים. ממדים מפורטים ותאימות מסופקים בקובץ המשלים 2. תמונה ברזולוציה גבוהה של המדף המורכב מסופקת באיור המשלים S1.

גרסת ה-rack הבסיסית (איור 1) היא הקונפיגורציה היעילה ביותר. הוא מורכב מארבעה חלקים ויש לו מידות של 88 × 130 × 77 מ"מ. הוא מאפשר שימוש בו-זמני עד 48 עמודות כאשר משתמשים בעמודות עם אותיות גדולות, או עד 116 עמודות כאשר משתמשים בעמודות ללא אותיות גדולות. רכיבי המדף מעוצבים לנוחות השימוש ולמזעור השפעות לא רצויות במהלך הצנטריפוגה. עמודי סיבוב ממוקמים בשכבת העמודה, שיש לה חריצים להכנסת כובעים; אותם חריצים יכולים גם להכיל עמודים ללא כובעים. שכבת העמודים יושבת על המאגר. פתח הניקוז של העמודים ממוקם מעל פתח המאגר, מה שעוזר להפחית התזות בין עמודים סמוכים. הנוזל מתנקז דרך פתח בתחתית החיתוך אל המאגר. קיבולת המאגר היא כ-100 מ"ל, וכוללת שני צעדי שטיפה עם עומס עמוד גבוה. שכבת עמודת המסנן יכולה להיות ממוקמת מעל שכבת העמודה בעת הצורך, כאשר עמודות המסנן ממוקמות מעליה ובמגע עם עמודות הקישור. המכסה אוטם את השכבה המכילה את עמודי המסנן או הקושר, ומגביל את זרימת האוויר במהלך סיבוב הצנטריפוגות. גרסת המדף הבסיסית תואמת לרוטורי דלי A-2-DWP (למשל, Eppendorf 5804), רוטור 1770 (למשל, HETTICH Rotina 380), או מערכות מקבילות.

גרסת המיני-ארק (איור 2) מתאימה למגוון רחב של רוטורי דלי צנטריפוגות. הוא מורכב משלושה חלקים ויש לו מידות מינימליות של 82.5 × 128 × 58 מ"מ (עם שכבת עמוד המסנן). הוא מאפשר שימוש עד 48 עמודות עם כובעים, או עד 90 עמודות ללא כובעים. הגיאומטריה של גרסה זו דומה לזו של המדף הבסיסי, אך שורות העמודים החיצוניות מוסרות ומוחלפות בחריצים לכיסויי עמודים. קיבולת המאגר משתנה בהתאם לגרסה המודפסת. המאגר הקטן ביותר (20 מ"ל) מכיל שלב שטיפה אחד לכ-30 עמודים; מאגרים גדולים יותר מאפשרים תפוקה גבוהה יותר. שכבת עמוד הסינון כוללת קצוות מעוגלים כדי לאפשר תנועת דלי רוטור בצנטריפוגות קטנות יותר. גרסת המיני-ארק תואמת לדיסקים של UC-124 (למשל, Accumax iFuge UC02) או מערכות מקבילות. כאשר משתמשים בו ללא שכבת עמודת המסנן, המדף תואם לרוטורי דלי A-2-MTP (למשל, Eppendorf 5430) או למקביליהם.

הגרסה ללא מיכל (ללא כיסוי) (איור 3) מתאימה למשתמשים עם ניסיון מוגבל בהדפסת תלת-ממד, שכן המיכל מוחלף במיכל חיצוני כמו תיבת קצה פיפטה. גרסה זו מורכבת משלושה חלקים ומידותיה 79 × 115 × 61.5 מ"מ. הוא מאפשר שימוש עד 48 עמודות עם כובעים, או עד 78 עמודות ללא כובעים. הגיאומטריה דומה לגרסאות הקודמות אך חסרה מאגר משולב. במקום זאת, משתמשים במיכל מתאים לאיסוף פסולת. שכבות העמודים והפילטר כוללות פחות מקומות ישיבה, ושכבת המסנן כוללת מושבים חרוטיים כדי למנוע הפרעות לתנועת הרוטור. הבסיס מתוכנן להתאים למיכלים סטנדרטיים וניתן לייצבו באמצעות מרווחי צד. התאימות תלויה במיכל הנבחר אך כוללת רוטורי דלי A-2-DWP (למשל, Eppendorf 5804), רוטור 1770 (למשל, HETTICH Rotina 380), ורוטור דלי UC-124 (למשל, Accumax iFuge UC02).

גרסת ה-cap rack (איור 4) היא התצורה הפשוטה ביותר ומשמשת יחד עם לוחות באר עמוקים של 5 מ"ל או 10 מ"ל עם 24 בארים. הוא מורכב מרכיב יחיד במידות 73 × 109 × 4 מ"מ ומאפשר שימוש עד 48 עמודים. גרסה זו תואמת לכל רוטור צנטריפוגה התומך בפורמט הלוחית המתאים.

תפוקה וטוהר
חילוץ DNA בוצע על תרביות E. coli באמצעות פרוטוקול מיקרוצנטריפוגה ידני סטנדרטי ושיטה מבוססת מדף. ניתוח ספקטרופוטומטרי הראה כי איכות ה-DNA שהופקה באמצעות המדפים הייתה דומה לזו שהתקבלה בשיטה הסטנדרטית. היחסים הטיפוסיים של A260/A280 נעו בין 1.8 ל-1.9 בשתי הגישות. תפוקת הפלסמיד הכוללת (μg) לא הראתה הבדל משמעותי בין השיטה הקונבנציונלית לבין החילוץ באמצעות תצורות המדפים (איור 5); הנתונים הגולמיים מסופקים בקובץ המשלים 2. קונפורמציית הפלסמיד נשמרה גם היא, עם התפלגויות דומות של צורות רפויות, ליניאריות וסופר-סליליות (איור 6).

ניתוח זיהום צולב
כדי להעריך זיהום צולב פוטנציאלי, בוצע ניסוי לוח שחמט. העמודות הוטענו לסירוגין בתמיסת אתידיום ברומיד בריכוז גבוה (המדמה DNA בעל טיטר גבוה) ובמים. לאחר צנטריפוגה ב-2,000 × גרם, התפלגות הצבע הוגבלה לאזור הפסולת שמתחת לעמודים הטעונים, ולא זוהה אות נראה לעין בבארות סמוכות או בקצות עמודים סמוכים (איור 7). תצפיות אלו מצביעות על כך שעיצוב המדפים מפחית את הסיכוי להתזות והעברת עמודות רוחביות בתנאים שנבדקו.

להערכת זיהום נוספת, בוצע PCR בזמן אמת באמצעות אמפליקון כסוכן מזהם (ראו קובץ משלים 2). הגברה זוהתה רק בפלטות מהעמודות אליהן נוסף האמפליקון (איור 8). בתנאים שנבדקו, לא זוהה זיהום צולב; עם זאת, הביצועים עשויים להשתנות בהתאם לזרימת העבודה ולסוג הדגימה.

איור 1: גרסה בסיסית של סכמת הרכבת המדפים. תצוגת CAD מתפוצצת המציגה את (A) Cap, (B) שכבת עמוד המסנן, (C) שכבת מחזיק עמודה, ו-(D) מאגר בסיס. המתקן מורכב מארבעה חלקים במידות 88 × 130 × 77 מ"מ, ומאפשר שימוש בו-זמני של עד 48 עמודות עם כובעים, או עד 116 עמודות ללא כובעים. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: גרסה מינית של סכמת הרכבת המדפים. תצוגת CAD מתפוצצת המציגה את (A) שכבת עמודת המסנן, (B) שכבת מחזיק העמודה, ו-(C) מאגר בסיס. גרסה זו דומה גיאומטרית לגרסה הבסיסית, אך שתי שורות הצד של מושבי העמוד מוסרות והוחלפו בחריצים לכיסויי עמודים. הוא מורכב משלושה חלקים, ממדים מינימליים של 82.5 × 128 × 58 מ"מ (עם שכבת עמודת הסינון), ומאפשר שימוש עד 48 עמודות עם כובעי או עד 90 עמודות ללא קבלים. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: גרסה ללא מאגר (לא מכוסה) של סכמת הרכבת מדפים. תצוגת CAD מתפוצצת המציגה את (A) שכבת עמודת המסנן, (B) שכבת מחזיק עמודה, (C) בסיס, ו-(D) קופסת קצה פיפטה. גרסה זו מחליפה את המאגר המשולב במיכל חיצוני כמו קופסת קצה פיפטה. הוא מורכב משלושה חלקים, בעל מידות של 79 × 115 × 61.5 מ"מ, ומאפשר שימוש בעד 48 עמודים עם כובעי או עד 78 עמודות ללא קפסים. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: גרסת הכובע של מדפי 24 בארים. תצוגה למעלה (משמאל) ותצוגה תחתונה (מימין). זוהי הגרסה הפשוטה ביותר, המשמשת יחד עם לוחות באר עמוקים של 5 מ"ל או 10 מ"ל עם 24 בארים. הוא מורכב מחלק יחיד במידות 73 × 109 × 4 מ"מ ומאפשר שימוש בעד 48 עמודות עם או בלי קבלים. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 5: השוואת תפוקת DNA וטוהרה. ניתוח ספקטרופוטומטרי של תפוקת הפלסמיד (μg/mL). לא נצפה הבדל מובהק סטטיסטית בתפוקת הפלסמיד הכוללת בין השיטה הקונבנציונלית לבין החילוץ באמצעות תצורות המדפים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6: השוואת איכות DNA. צורות DNA הוצגו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. הצורות הרפיות, הליניאריות והסופר-סליליות של DNA דומות בין חילוץ ידני סטנדרטי לבין חילוץ מבוסס מדף. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 7: הערכת זיהום צולב. תצוגה של מאגר הפסולת לאחר הצנטריפוגה, המציגה בריכות פסולת נפרדות ללא חפיפה. העמודות הוטענו בתמיסת אתידיום ברומיד בריכוז גבוה (המדמה DNA בעל טיטר גבוה) ובמים. לא נצפה צבע בבארות "מים" סמוכות או בקצות עמודים סמוכים לאחר הצנטריפוגה, מה שמעיד על ירידה בהתזת מים והעברת עמודות רוחביות בתנאים שנבדקו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 8: ניתוח זיהום צולב באמצעות PCR כמותי. עקומות הגברה עבור דגימות המכילות את הסוכן המזהם מוצגות באדום, בעוד דגימות המכילות רק מים מוצגות בירוק. הגברה זוהתה רק בדגימות המכילות את הסוכן המזהם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

קובץ משלים 1: קבצי דגמים תלת-ממדיים לעיצובים של מדפים. ערכת הקבצים הזו כוללת קבצי STL לכל תצורות המדפים, כולל גרסת ה-rack הבסיסית, גרסת mini rack (עם מספר גרסאות גובה מאגר), גרסת ללא מאגר, וגרסת מדף הכיסוי. רכיבים בודדים (למשל, מאגר בסיס, שכבת מחזיק עמודה, שכבת עמודת מסנן וכובע) מסופקים להדפסה תלת-ממדית. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 2: נתונים ושיטות תומכות. סט קבצים זה מכיל את טבלת התאימות לצנטריפוגות, הליך בדיקת זיהום צולב מפורט, מערכי נתוני תפוקת DNA גולמיים וקבצי פלט של מכשירי PCR הקשורים לניתוח הזיהום. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים S1: גרסת מדף בסיסית (מורכבת במלואה). תמונה ברזולוציה גבוהה של תצורת המדף הבסיסית המורכבת במלואה, הממחישה את המבנה הכללי וסידור הרכיבים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

פרוטוקול זה מתמודד עם "פער התפוקה" במעבדות רבות לביולוגיה מולקולרית. בעוד שלוחות סינון עם 96 בארות מהירות יותר, הן עשויות להציג יכולות קישור נמוכות יותר או ריכוזים סופיים מופחדים בהשוואה לעמודות סיבוב בודדות¹⁴. על ידי התאמת עמודות סיבוב סטנדרטיות לפורמט של לוחות-רוטור, שיטה זו משלבת את התפוקה הגבוהה של עמודים עם מהירות של זרימות עבודה מבוססות פלטות.

המדפים הם היתרון ביותר כאשר מעבדים יותר מ-12 דגימות. החידוש המרכזי של הפרוטוקול הוא השימוש במדפי 24 בארות, שמפשטים ומאיצים את חילוץ חומצות גרעין מבוססות עמודות על ידי שימוש במאגר משותף לטיפול בתמיסות העל-טבעיות ושטיפה. בעת שימוש במדפים, הזמן הנדרש לביצוע שלבים אלו עבור 14–116 דגימות דומה לזה הנדרש ל-2–12 דגימות. יתרה מזאת, מאמץ המפעיל מצטמצם, כאשר שלבים חוזרים כמו הסרת צינורות בודדים, העברת עמודים, השלכת תמיסות שטיפה ופתיחת פקקים. מכיוון שרכיבי הקיט המקוריים (תמיסות ועמודות ספין) נשארים ללא שינוי, צפוי איכות DNA דומה ונתמכת על ידי התוצאות המוצגות.

הדפסת תלת-ממד של מדפי 24 בארים אפשרית עם ציוד סטנדרטי אך עשויה לדרוש ניסיון בגרסאות הבסיסיות והמיניאטוריות. הגרסאות ללא מיכל ו-cap-rack פשוטות יותר וניתן לייצרן עם ניסיון הדפסה מינימלי. שיקול מרכזי במידול השקיעה מותכת הוא יצירת פערים מיקרו-בין שכבות, העלולים לפגוע באטימות מים בצנטריפוגה. בדיקות הראו כי מילוי של 100%, עובי דופן המאגר של 7 מ"מ, וגובה שכבה של 0.1 מ"מ מספקים אטימות מספקת למים. חימום משטח ההדפסה והחלקת משטח שיפרו עוד יותר את ביצועי האיטום. לעומת זאת, שיטות איטום לאחר ההדפסה באמצעות שרפי אפוקסי או ממסים אורגניים לא היו יעילות, שכן עיוותים במהלך הצנטריפוגה הוביל לסדקים ודליפה. עובי דפנות לא מספק עלול גם לגרום לכשל מבני ואובדן אטימות למים, מה שעלול להוביל לחוסר איזון בצנטריפוגות. לכן, מומלץ לבצע בדיקות טרום-שימוש של רכיבים מודפסים.

גרסאות ארבעת המדפים מתאימות למגוון רחב של צנטריפוגות עם רוטורי דלי, ומאפשרות למשתמשים לבחור את התצורה המתאימה ביותר לציוד ולדרישות התפוקה שלהם. הגרסה הבסיסית עם מדף מספקת את התפוקה הגבוהה ביותר אך דורשת צנטריפוגות גדולות יותר ואיכות הדפסה גבוהה יותר. הגרסה הקטנה מפחיתה את דרישות גודל הצנטריפוגה אך גם מפחיתה את קצב התפוקה. הגרסה ללא מאגר מפשטת את הייצור ותואמת למכולות נפוצות כמו קופסאות טיפ פיפטות, אם כי התאימות תלויה בגאומטריית המיכל. גרסת cap-rack היא התצורה הפשוטה ביותר אך לא ניתן להשתמש בה עם עמודות סינון.

עמודות מסנן שאינן קושרות חומצות גרעין עשויות להיות פחות זמינות מאשר עמודות קישור סטנדרטיות⁹. בהיעדרם, ייתכן שיידרשו צעדי הבהרה נוספים, מה שיאריך את זמן העיבוד הכולל. לחלופין, ניתן להשתמש בקצוות פיפטות פילטר (1000 מיקרוליטר) או בפרוטוקול טיטניום דו-חמצני.

מדפי החילוץ פועלים כתוספת מכנית לתהליכי חילוץ DNA סטנדרטיים⁹ ואינם משנים את הרכב הבופר או את כימיית העמודה (למעט בגרסת הטיטניום דו-חמצני). בהתאם לכך, לא צפויה השפעה משמעותית על איכות ה-DNA, דבר התואם לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ומניבים השוואות המראות צורות וכמויות דומות של פלסמיד ביחס לשיטה הסטנדרטית.

למרות שהשימוש במאגר פסולת משותף יוצר סיכון פוטנציאלי לזיהום צולב, הדבר לא נצפה בתנאים שנבדקו. מאפיין עיצוב מרכזי הוא גאומטריית "הארובה" של יציאות העמודים, השומרת על הפרדה בין קצות העמודים למשטח נוזל הפסולת. כדי לשמור על הפרדה זו, אין למלא את המאגר יתר על המידה, ומומלץ לרוקן אותו לאחר כל זרימה מלאה.

מגבלה אחת של השיטה היא מהירות מקסימלית של רוטורי דלי נדנדים (בדרך כלל 2,000 × גרם). למרות שהמהירות הזו מספיקה לשלב הקישור והשטיפה, אינה מספקת לייבוש מלא בממברנה. לכן, נדרש שלב צנטריפוגה סופי במהירות גבוהה במיקרוצנטריפוגה בזווית קבועה. למרות הצעד הנוסף הזה, החיסכון הכולל בזמן נותר משמעותי עבור אצוות העולות על 24 דגימות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
3D Printer Filament	NIT, Russia	-	PETG או PLA מומלץ
Buffer N3	Qiagen, Netherlands	19064
Buffer P1	Qiagen, Netherlands	19051
Buffer P2	Qiagen, Netherlands	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality, China
Elution Buffer	Qiagen, Netherlands	19086
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf, Germany	22626001	רוטור זווית קבועה
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf, Germany	22625080	רוטור צלחת מתנדנדת
Ethidium Bromide	Biolabmix, Russia	EtBr-10
Frit of 1000 μL Filter Pipette Tip	GenFollower, China	E-FTB1000	חלק מעמודות פילטר
Miniprep Without Filter Barrier Spin Column	JVLAB, China	-	חלק מעמודות פילטר
Phenol Red	Lenreactiv, Russia	200125
PrusaSlicer	Prusa Research, Czech Republic
QIAprep 2.0 Spin Miniprep Columns	Qiagen, Netherlands	27115
RNase A	Qiagen, Netherlands	19101
Wash Buffer	Qiagen, Netherlands	19065