פלטפורמת אלקטרופורציה מיקרופלואידית דיגיטלית לעריכת גנום CRISPR בקלט נמוך וטרנספקציה של mRNA בתאי T תלוי-תלת-ממדיים ובמודלים של תאי תלת-ממד

סיכום

פרוטוקול זה מתאר עריכת גנום CRISPR–Cas9 מוקטנת של קולטן TCRα/β בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות 'DMF-ection', פלטפורמת אלקטרופורציה דיגיטלית מיקרופלואידית (DMF). השיטה מאפשרת עריכת גנים מקבילה עם קלט נמוך עם יכולת היתכנות גבוהה, והיא גמישה עוד יותר להעברת mRNA לספירואידים תלת-ממדיים רב-תאיים.

תקציר

אלקטרופורציה מיקרופלואידית דיגיטלית (DMF) מאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת ובנפח נמוך של תאי יונקים, תוך מזעור קלט תאים עד פי 100 ושמירה על חיוניות. מחקר זה מציג תהליך העברה מבוסס DMF בתפוקה גבוהה עבור ניקוי CRISPR של לוקוס TRAC בתאי T תלויים ראשוניים בבני אדם ועבור העברת mRNA של ספרואידים תלת-ממדיים HEK293T. באמצעות RNA מדריך CRISPR שהופקד במרחב והרכבת ריבונוקלאופרוטאין (RNP) על הקראטידג', הושגה הפרעה יעילה של לוקוס TRAC הן באוכלוסיות תאי T של CD4⁺ והן ב-CD8⁺ תוך שימוש ב-10,000 תאים בלבד בכל מצב, כאשר היעילות לאחר העריכה עוברת את 85%. אפיון ביופיזיקלי באמצעות ניתוחי זרימה וניתוחי פיזור טיילור הראו כי תוספים פולימריים מייצבים קומפלקסים של Cas9–sgRNA בתנאי בופר אלקטרופורציה, ותומכים בעריכה שחזורית בנפחים תת-מיקרוליטריים. זרימת העבודה הותאמה עוד יותר ליישומים תלת-ממדיים על ידי העברת mRNA של EGFP לספירואידים HEK293T שלמים, מה שהוביל לפלואורסצנציה עמידה ואחידה במרחב מבלי לפגוע בצמיחת הספרואידים או במורפולוגיה. יחד, תוצאות אלו מראות כי אלקטרופורציה של DMF מאפשרת עריכה יעילה של הגנום והעברת mRNA הן לתאי חיסון מועלים והן לספירואידים רב-תאיים. פלטפורמה זו מספקת פתרון בקנה מידה ובעל קלט נמוך ליישומים בטיפול בתאי CAR-T, גנומיקה פונקציונלית ומודלים תלת-ממדיים מתקדמים לתאית.

מבוא

עריכת גנים בתאי אדם ראשוניים היא מרכזית יותר ויותר הן בפיתוח טיפולי והן במחקר בסיסי, כולל יישומים בהנדסה חיסונית, מידול מחלות נדירות וגנומיקה פונקציונלית¹. למרות שאלקטרופורציה מאפשרת עריכת גנום יעילה מאוד, מערכות מבוססות קובטה קונבנציונליות דורשות בדרך כלל עד מיליוני תאים בכל מצב, מה שמגביל את השימוש בהן בדגימות שמקורן במטופלים ובאוכלוסיות חיסוניות נדירות². בנוסף, מערכות אלו אינן מתאימות במיוחד לסינון בקנה מידה גדול בשל מגבלות בתפוקה, אוטומציה וצריכת תגובות³.

אלקטרופורציה מיקרופלואידית התגלתה כגישה מבטיחה לעריכת גנום בקלט נמוך⁴. עם זאת, רוב הפלטפורמות הקיימות מסתמכות על ארכיטקטורות זרימה רציפה הכוללות טיפול מורכב בנוזלים, גמישות מוגבלת בערבוב מגבים, ודרישות תא גבוהות יחסית לכל תנאי. לעומת זאת, מיקרופלואידיקה דיגיטלית (DMF) מאפשרת מניפולציה פעילה של טיפות בקנה מידה ננו-ליטר בדידות על מערך אלקטרודות מישורי, ומאפשרת שליטה מדויקת על הרכב התגובה, תזמון ומיקום מרחבי. הפורמט המבוסס על טיפות מסוג plug-and-play מתאים במיוחד לתהליכי עבודה בנפח נמוך ובקצב תפוקה גבוה, שבהם שימור תאים ראשוניים ומגבים הוא חיוני⁵.

עבודות עדכניות הדגימו את ההיתכנות של משלוח תוך-תאי מבוסס DMF באמצעות ארכיטקטורות אלקטרופורציה תלת-טיפות, המייצרות שדות חשמליים מקומיים בזרם נמוך להעברת RNP ו-mRNA יעילה, תוך מזעור הלחץ התרמי והאלקטרוכימי ^6,7,8. בהתבסס על יסוד זה, פותחה פלטפורמת אלקטרופורציה מהדור הבא של DMF, בשם 'DMF-ection', הכוללת 48 אתרי תגובה ניתנים לכתובת עצמאית, תאימות מלאה לאוטומציה וייצור מחסניות בקנה מידה⁽איור 1). מחסנית ה-DMF מורכבת מפלטת PCB תחתונה ולוח עליון מפלסטיק המופרד על ידי אטם, המורכבים באמצעות סנאפים ליישור בכיוון נכון אחד (איור 1A). פריסת 48-plex מאורגנת לשמונה משפחות זהות (איור 1A–H), שכל אחת כוללת שישה אתרי אלקטרופורציה ניתנים לכתובת עצמאית, התומכת בעד 48 תנאי עריכה מקבילים לכל מחסנית (איור 1B). ספריות RNA מנחים מונחות על פני השטח של המצע באמצעות מפזר אקוסטי לפני הרכבת המחסנית. דיוק המיקום של ההפקדה אושר בכל 48 האתרים, כאשר מיקומי הטלה התקבצו בתוך סטייה תת-מילימטרית מנקודת האמצע של האלקטרודה (איור 1C), מה שתומך בהרכבת RNP אמינה על המחסנית. לאחר הטעינה, תאים וטיפות אלקטרודות נוזליות מופעלות על המחסנית ליצירת גאומטריית האלקטרופורציה התלת-טיפלית (איור 1D). לאחר האלקטרופורציה, התאים מופרקים ללוחות תרבית לצורך התאוששות וניתוח במורד הזרם, כולל ציטומטריית זרימה, ריצוף ומיקרוסקופיה (איור 1E). מערכת זו מאפשרת עריכת גנום ביעילות גבוהה תוך שימוש בעד פי 100 פחות תאים מאשר שיטות סטנדרטיות מבוססות קובטה, ומרחיבה משמעותית את הגישה להנדסת גנום ביישומים בעלי קלט נמוך ותפוקה גבוהה.

מחקר זה מעריך את ביצועי הפלטפורמה על ידי אספקת מטענים ביומולקולריים מרובים, כולל קומפלקסים של mRNA ו-CRISPR–Cas9 ריבונוקליאופרוטאין (RNP), ומשיג טרנספקציה יעילה והפרעה גנטית. בנוסף לתאי T ראשוניים, DMF-ection מספק מסגרת כללית להעברת חומצות גרעין למבנים רב-תאיים מורכבים. ספרואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) ומודלים אורגנואידיים מטילים חסמים משמעותיים לחדירת תגובות בשל הארכיטקטורה והשבריריות שלהם, ושיטות אלקטרופורציה קונבנציונליות לעיתים משבשות את המורפולוגיה או יוצרות הפצה הטרוגנית. כדי להעריך האם אותם עקרונות אלקטרופורציה מוקטנים ששימשו לעריכת תאי T חלים גם על רקמות מובנות, תהליך העבודה של DMF יושם על ספרואידים HEK293T תלת-ממדיים. ניסויים אלו הראו כי אלקטרווטציה מבוססת DMF יכולה למקם בעדינות ספרואידים שלמים בתוך גאומטריות של שלוש טיפות ולתמוך בהעברת mRNA אחידה תוך שמירה על מבנה וצמיחה. למרות שתוצאות אלו אינן פרוטוקול תאי ה-T הראשוני המתואר כאן, הן ממחישות את היישום הרחב יותר של אלקטרופורציה DMF מתוכנתת למערכות תאיות תלת-ממדיות מתפתחות הרלוונטיות לגילוי תרופות ולמידול מחלות.

פרוטוקול

תאי T אנושיים ראשוניים ששימשו בפרוטוקול זה הושגו מספקים מסחריים בהסכמת תורם מדעת ובהתאם להנחיות המוסדיות, האתיות והרגולטוריות החלות. כל הטיפול בחומרים ביולוגיים שמקורם באדם בוצע בהתאם לפרוטוקולי בטיחות ביולוגית מוסדיים. חוקרים המיישמים פרוטוקול זה אחראים לוודא שהשימוש שלהם בתאים אנושיים ראשוניים עומד בדרישות ועדת ביקורת מוסדית מקומית (IRB) או ועדת אתיקה, תקנות בטיחות ביולוגית רלוונטיות, וכל חקיקה לאומית או אזורית רלוונטית המסדירה את השימוש בחומר ביולוגי אנושי. לא היה מידע מזוהה על ידי מטופל לחומר התא ששימש במחקר זה.

1. הכנה והפעלה של תאי T ראשוניים בבני אדם

1. הפשרה מהירה של תאי CD3⁺ T ראשוניים של בני אדם באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. העבר את התאים למדיום תאי T בסיסי מחומם מראש ולצנטריפוגה ב-180 × גרם למשך 10 דקות. השליך את הסופרנטנט ותלה את הכדור במצב מדיום טרי.
2. קבעו את ריכוז התאים ועמידותם באמצעות מונה תאים אוטומטי.
3. השעתי תאים ב-1 ×^{10 6} תאים/מ"ל בתווך תרבית תאי T, בתוספת נוגדן טטרמרי מסיס CD3/CD28, גירוי מפעיל תאי T (לפי הוראות הספק) ו-200 IU/mL IL-2. דגרו תאים במשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
   הערה: שמרו על צפיפות תאים בין 0.5–2 × 10⁶ תאים למ"ל במהלך ההפעלה. בצע הפעלה בלוחות U-bottom 96 בארות כדי למקסם את המגע בין התא למפעיל ויעילות ההפעלה.

2. הכנת כתמי RNA מונחים על מצע ה-DMF (כתמים אקוסטיים במפזר)

1. שחזור sgRNA ליופילי במים נטולי נוקלאז לריכוז מלאי של 100 מיקרומון. בצינור נפרד, יש להכין מלאי של 100 מ"ג/מ"ל של חומצה פולי-L-גלוטמית (PGA, מלח נתרן, MW 15,000–50,000 Da) במים נטולי נוקלאז. משלבים את מאגר sgRNA ו-PGA ביחס נפח של 5:4 (sgRNA: PGA) שמניב ריכוז סופי של sgRNA של 55.6 pmol/μL וריכוז סופי של 44.4 mg/mL במים נטולי נוקליאז. מערבולת לזמן קצר וצנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 30 שניות, ומפרקים לנפחים חד-פעמיים ומאחסנים אליקווטים לא בשימוש בטמפרטורה של −80°C עד 6 חודשים.
   הערה: הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.
2. הוסיפו את תערובת המדריך-PGA לפלטת מקור אקוסטית בנפח מת נמוך בבארות התואמות לפריסת אתר התגובה הרצויה.
3. העבר 40 ננו-ליטר (שווה ערך ל-2.2 pmol sgRNA) מתערובת ה-guide-PGA לכל אזור סימון יעד במצע ה-DMF באמצעות מפזר אקוסטי מכויל.
   הערה: ב-55.6 pmol/μL, 40 nL מספק 2.2 pmol sgRNA לאתר (55.6 × 0.040 = 2.22 pmol). מדרכים מיובשים מורכבים מחדש במהלך מיזוג טיפות על המחסנית; השעיה מלאה מאושרת על ידי יעילות עריכה עקבית בין האתרים.
4. בארון בטיחות ביולוגית, אפשר לטיפות המנוקדות להתייבש באוויר לחלוטין בטמפרטורת החדר עד שלא יישאר נוזל נראה לעין (כ-5 דקות).
   הערה: אין להשתמש בזרימת אוויר מאולצת או חום, שכן זה עלול להזיז או לפגוע ב-RNA המנחה.
5. הרכיבו את מחסנית ה-DMF.
   1. בארון בטיחות ביולוגי, יישר את הלוח העליון מעל המצע המנוקד על ידי התאמת תכונות הפיצוץ הפלסטיות הא-סימטריות מהפלטה העליונה עם החריצים בלוח התחתון. הפעילו לחץ אחיד וסימולטני לאורך הקצוות הקצרים עד שמרגישים נקישה מכנית ברורה, המאשרת את החיבור המלא של תכונות הנעילה.
      הערה: המחסנית מעוצבת עם כיוון נכון אחד; הרכבה לא נכונה לא תגרום ל-snap. החזק את המצע בקצוות כל הזמן כדי למנוע זיהום או נזק למשטחים פונקציונליים ולהימנע מההחלקה של המצעיים זה על זה, שכן זה עלול לשרוט את ציפויי המשטח.
   2. נקודת ביקורת: אשר את ההרכבה הנכונה על ידי ה-snap המכני.
      הערה: אין אינדיקטור חשמלי מוקדם לשלמות הציפוי; כל כשל פונקציונלי הנובע מהרכבה לא נכונה מזוהה אוטומטית ומדווח בדוח בקרת איכות לאחר ההרצה.
      נקודת עצירה: אחסן מחסניות מורכבות שלא נעשה בשימוש באריזה אטומה עם חומר ייבוש (שקיות סיליקה ג'ל) בטמפרטורת החדר למשך עד 48 שעות.

3. הכנת תאים

1. הכינו 1 מ"ל של בופר טרנספקציה מלא טרי לפני כל שימוש על ידי שילוב בופר אלקטרופורציה תואם DMF עם סורפקטנט ביוקומוניטיבי לא-יוני ביחס 20:1 (v/v) (בופר אלקטרופורציה: סורפקטננט), מה שמניב ריכוז סופי של 0.05% (v/v). ערבבו בעדינות ותשאירו על הקרח.
   הערה: בופר הטרנספקציה התואם ל-DMF המשמש כאן הוא בופר איזוטוני בעל מוליכות נמוכה (מוליכות: 3.5 mS/cm, אוסמולליות: 305 mOsm/L). חוקרים המשתמשים במאגרים חלופיים צריכים לאמת תאימות להפעלת DMF ולחיוניות התאים. הסורפקטנט הביוקומוניטיבי הלא-יוני משמש להפחתת הצמדת הטיפות; אם לא נעשה שימוש בחומר השטח המסופק, יש תחליף מתאים.
2. שטוף תאי T מופעלים פעם אחת עם בופר טרנספקציה (שאינו מכיל חומר פעיל). צנטריפוגה בעוצמה של 180 × גרם למשך 5 דקות, שאיפת הסופרנאנט, והשיה מחדש את כדור התא בבופר טרנספקציה מלא (המכיל חומר פעיל) ב-1.0 × 10⁷ תאים/מ"ל בנפח כולל של 100 מיקרוליטר לכל מחסנית. תשמור על הקרח.
3. מיד לפני הטעינה על המחסנית, הוסף נוקלאז Cas9 ישירות ל-100 מיקרולטר של מתלה T ומערבב על ידי פיפטינג עדין; תשמור על הקרח.
   הערה: עבור תאי T ראשוניים, Cas9 נטען ב-42 pmol לכל נפח מחסנית של 100 מיקרוליטר (0.42 pmol/μL). כל אתר אלקטרופורציה מעבד כ-1 מיקרוליטר של תליית תא, ומספק 0.42 pmol Cas9 לכל עריכה. אופטימיזציה של מינון זה בעת הסתגלות לסוגי תאי חיסון אחרים (ראו טבלה 1).

רכיב	ריכוז סופי לפי עריכה
Cas9	0.42 pmol בטיפת ~1 מיקרוליטר
sgRNA	2.1 pmol (ממקום 40 ננו-ליטר)
PGA	מלאי 44.4 מ"ג/מ"ל בתערובת ספוטינג
סרפקטנט	0.05% (v/v)
קלט תא	~10,000 תאים

טבלה 1: טבלת סיכום הריכוזים הסופיים בכל טיפה טרנספקציה.

4. טרנספקציה על פלטפורמת DMF-ection

1. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, מזרים 10 מיקרוליטר מתערובת T-cell/Cas9 לכל אחד מ-8 פתחי הטעינה של התאים, ו-10 מיקרוליטר של בופר טרנספקציה מלא ל-16 פתחי טעינת האלקטרודות הנוזליות (כפי שמוצג באיור 1).
2. הגדר את המתח ל-500 וולט, משך הפולס ל-3 מילישניות, ומספר הפולסים ל-2. התחל את רצף האלקטרופורציה לפי הוראות הפלטפורמה.
   1. נקודת צ'קפוינט: עברו על דוח ה-QC לאחר הריצה מיד לאחר הריצה. כשלים ספורדיים (<10% מהאתרים) אינם דורשים התערבות. אם התקלות שיטתיות, החלף את הקלטת בלוח האיכות, הרץ את בדיקת בריאות המערכת (~2 דקות), ופנה לתמיכה הטכנית אם הבעיות נמשכות.

5. פריקה ושחזור של תאי T ערוכים

1. באמצעות מטפל נוזלי, העבירו תאים אלקטרופורטיביים מכל אתר תגובה ללוח U תחתית עם 96 בארים המכיל 150 מיקרוליטר של מדיום תאי T בסיסי מחומם מראש בתוספת 200 IU/mL IL-2.
2. דגרו תאים למשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO₂ כדי לאפשר מחזור חלבונים ושינויים בביטוי הקולטנים על פני השטח.

6. ניתוח ציטומטריית זרימה של TRAC knockout

1. העבר תאים לפלטת תחתית חרוטית סטרילית עם 96 בארים כדי להפחית אובדן תאים בין שטיפות. שטפו תאים פעמיים עם בופר זרימה ציטומטרי (1× PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) על ידי צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות והסרת הסופרנטנט על ידי הפיכת הפלטה התחתונה הקונית. התאים יישארו גלויים בצלחת.
2. הכינו תערובת מאסטר לצביעת שטח הכוללת נוגדנים אנטי-CD4, אנטי-CD8 ואנטי-TCRα/β ב-Flow Cytometric Buffer בריכוזים מומלצים על ידי היצרן. הוסף 25 מיקרולטר מהתערובת הראשית לכל באר ודגור במשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגן מאור. שטוף פעמיים עם 1× PBS (בלי FBS) על ידי צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות. החזירו תאים ב-100 מיקרוליטר של 1× PBS המכילים צבע חיוני ב-1:1,000 (v/v) ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור.
   הערה: לוחות תחתית חרוטיים יעילים ביצירת תאים; בדוק שהתאים תלויים היטב בכל שלבים.
3. שוטפים תאים פעמיים עם בופר זרימה-ציטומטריה והשלים מחדש 150–200 מיקרוליטר לכל דגימה לצורך רכישה.
4. הגדר את הציטומטר עם קווי לייזר ומערכות סינון מתאימים לפלואורוכרומים (למשל, עירור 488 ננומטר לצבע חיוניות; 405 ננומטר או 488 ננומטר לסימני משטח לפי הצורך). קבע מתחים באמצעות בקרות פיצוי צביעה בודדת ודגימה לא מוכתמת. אסוף מינימום 5,000 אירועי סינגל חיים לכל דגימה. השער ברצף מופעל: סינגלטים פיזוריים → תאים חיים (שלילי לצביעה חיונית) → CD4⁺ או CD8⁺ → ביטוי TCRα/β.
   הערה: בתנאים סטנדרטיים, סך כל האירועים החיים שנרכשו יכול לנוע בין 5,000 ליותר מ-10,000 לכל דגימה לאחר אובדן במהלך שטיפה וצביעה, בהתחשב בכך שהתאים הספיקו להתרבות.
5. קבעו את ההפרעה בגנים של TRAC על ידי מדידת תדירות התאים השליליים TCRα/β באוכלוסיות CD4⁺ ו-CD8⁺. דווח על יעילות הנוקאאוט כאחוז התאים השליליים TCRα/β ביחס לשער הסינגלט החי עבור כל תת-קבוצה.

תוצאות

תוצאות צפויות
אלקטרופורציה של 10,000 תאי T מופעלים בכל מצב בדרך כלל מביאה ליעילות של >85% TRAC עם חיוניות >95% 72 שעות לאחר הטרנספקציה. ציטומטריית זרימה מגלה אובדן ברור של צביעת TCRα/β במצב המיקוד ב-TRAC ביחס לבקרות sgRNA (NTC) שאינן נחשפות לשדות חשמליים. אלא אם צוין אחרת, n מייצג ריצות DMF-ection עצמאיות שבוצעו בימים נפרדים. שכפולים טכניים מאותו ריצת מחסנית נמדדו בממוצע לפני ניתוח סטטיסטי ואינם תורמים באופן עצמאי ל-n. כל הניסויים בתאי T שדווחו כאן נערכו באמצעות תאי קריופרזור שמקורם בתורם בריא יחיד. שונות בין תורם לתורם בשימוש באותה פלטפורמה מאופיינת עוד⁹.

שיפור ביציבות ריבונוקלאופרוטאין Cas9–sgRNA בתנאי אלקטרופורציה הודות לתוספי פולימר אניוניים
דרישה מרכזית לעיצוב מיקרופלואידיקה דיגיטלית היא משטח הידרופובי מאוד, המאפשר לטיפות להחליק בחופשיות במהלך הרטבה חשמלית. בעוד תכונה זו חיונית לתנועת טיפות והפעלה מדויקת, היא יוצרת אתגרים בטעינת תגובה. ליישומי סינון מערכים, קריטי שספריות מטען מוגדרות על ידי המשתמש יוכלו להפקיד ישירות על פני שטח המחסנית. דבר זה מאפשר לפריסות המגיב לשקף את עיצוב הספרייה של המשתמש ומבטיח שזרימת העבודה הדיגיטלית של מיקרופלואידיק תוכל לבצע ניסויים מאורגנים בצורה חלקה ללא העברה נוספת או התערבות ידנית. שימוש בננו במפזר אקוסטי מתאים היטב למשימה זו, שכן הוא מסוגל להעביר נפחי ננוליטר בדיוק מיקום גבוה על פני מערכים גדולים על פני משטחים שונים. עם זאת, כאשר הטיפות פוגעות במשטח מחסנית הידרופובית, הן לעיתים קופצות, מתפשטות או אינן מתפשטות באופן אחיד, מה שמוביל לשקיעה והתאוששות לא עקביות. שונות זו בולטת במיוחד בנפחי טיפות ביניים הנעים בין 40 ננוליטר ל-120 ננוליטר (איור 2A, n = 3 לכל תנאי, *** ערך p < 0.01), שם משערים שהאנרגיה הקינטית של הטיפה גבוהה מספיק כדי לגרום לריבאונד, אך הידבקות פני השטח אינה מספיקה לעיגון הנוזל. כתוצאה מכך, הפקדה ישירה על המחסנית במינוני מטען גבוהים עלולה להיות לא אמינה ללא שינויים נוספים. כדי לצמצם אפקט זה, הוספו לחומרים פולימרי פולימר ביו-בטוח פולי-L-גלוטמיק (PGA). PGA הוא פוליפפטיד מתכל במטען שלילי, המשמש רבות כמייצב בפורמולציות תרופות, עם תאימות מצוינת לתהליכים של תאים חיים. השערה היא שעמוד השדרה הטעון מוריד את זווית המגע של הטיפות ומקדם התפשטות אחידה יותר, מפחית את ההחזרה ומשפר את ההידבקות פני השטח. עם נוכחות PGA, נפחי פלואורסצאין שהופקדו גדלו בקו ישר עם ספיגה, והשונות הופחתה משמעותית בין המחסניות. ניתוח סטטיסטי אישר כי PGA שיפר משמעותית את השחזוריות בנפחי כתמים של 40, 90 ו-120 ננוליטר (***p < 0.001, ****p < 0.0001), בעוד שטיפות קטנות מאוד (10–20 ננוליטר) הראו הבדל מועט, שכן ההתאוששות פחות בולטת באנרגיות קינטיות נמוכות.

לאחר מכן, הוערכה הוספת תוספים פולימריים ששימשו בתהליך העבודה של DMF להשפעתם על התנהגות ריבונוקלאופרוטאין Cas9–sgRNA (RNP) בתנאי בופר בנפח נמוך המשמשים לאלקטרופורציה. לשם כך, נעשה שימוש בטכנולוגיית ניתוח פיזור מושרה זרימה (FIDA). FIDA נבחרה משום שהיא מספקת מדידה מדויקת של רדיוס הידרודינמי וזיקת קשירה, ומאפשרת לכמת אינטראקציות בין חלבון לחומצה גרעין באותם תנאי בופר כפי שנעשה בהם שימוש בניסוי. FIDA הראתה כי sgRNA חופשי מציג רדיוס הידרודינמי (Rh) של 3.45 ± 0.26 ננומטר, תואם למין RNA קטן חד-גדילי. טיטרציה עם Cas9 יצרה קומפלקס RNP יציב עם Rh של 15.32 ± 0.46 ננומטר וזיקה תת-ננומולרית (KD = 0.70 ± 0.14 ננומטר) (איור 2).

כדי להעריך את השפעת ייצוב הפולימר, נוספה חומצה פולי-L-גלוטמית (PGA) ל-RNA המנחה לפני יצירת RNP. נוכחות PGA הפחיתה את הזיקה הנראית בין Cas9 ל-sgRNA (K_D = 67.7 ± 9.5 ננומטר) והפחיתה את גודל הקומפלקס לכ-10 ננומטר (איור 2A לוח ימין). למרות שהזיקה המופחתת מרמזת על קומפלקסים פחות צמודים,_{ה-R h} הקטן והאחיד יותר מצביע על כך ש-PGA מונע היווצרות הרכבות RNP גדולות מדי (איור 2B).

לאחר מכן, יציבות RNP הוערכה בתנאי אלקטרופורציה באמצעות ניתוח פיזור טיילור (איור 2C). ללא פולימר, תערובות Cas9–sgRNA הפיקו טיילוגרמות רחבות ולא מותאמות היטב המעידות על אגרגציה (איור 2B). לעומת זאת, הוספת 0.0025 mg/mL PGA הניבה פרופילי פיזור מונודיספיזציה מוגדרים היטב (R² = 0.999) עם R_h ~ 9.6 ננומטר. תוצאות אלו מראות ש-PGA מונע אגרגציה ומשפר את אחידות ה-RNP, ובכך תומך באלקטרופורציה בקנה מידה ננו-ליטר שניתן לשחזר. ייצוב זה מספק הצדקה מכנית ליעילות העריכה הגבוהה שנצפתה בניסויים בתאי T במורד הזרם.

יעילות עריכה תלויה במינון בתאי T ראשוניים

למרות שניסויי FIDA הראו כי PGA מפחית את יעילות הרכבת ה-RNP, תוצאות העריכה הפונקציונליות הונחו כפחות מושפעות, שכן אלקטרופורציה מתבצעת בדרך כלל עם RNA מונחה עודף ביחס ל-Cas9. לכן, נפח הקלט של PGA–RNP הוערך להשפעה על יעילות הנוקאאוט בתאי T ראשוניים בבני אדם בלוקוס TRAC (איור 2D). בארבע מחסניות, יעילות העריכה הייתה גבוהה באופן עקבי (>75–80%) בכניסות RNP של 40 ננוליטר (2.1 פיקו-מול), 20 ננוליטר (1.05 פיקו-מול) ו-10 ננוליטר (0.53 פיקו-מול), עם שונות מינימלית בין תת-קבוצות CD4⁺ ל-CD8⁺ . אפילו ב-5 ננוליטר (0.26 pmol), העריכה נותרה יציבה, אם כי נצפתה ירידה מתונה בהשוואה למינונים גבוהים יותר. במינון הנמוך ביותר שנבדק (2.5 ננוליטר, 0.13 pmol), יעילות העריכה ירדה משמעותית, והגיעה לתיקיעת כמעט ~60% TRAC KO. הבקרות אישרו את הספציפיות של העריכה: בארות ללא אלקטרופורציה (0V) ובקרות מחוץ למחסנית (OCC) הציגו רק כיבוי רקע. התדירות המוגברת ל-TCR שלילית שנצפתה באוכלוסיית CD8⁺ של בקרת מחוץ למחסנית (OCC) ככל הנראה משקפת ירידה ב-TCR בסיסית ספציפית לתורם לאחר ההפעלה, ללא תלות באלקטרופורציה או בעריכת גנים, שכן תאים אלו לא נחשפו למחסנית. יחד, תוצאות אלו מראות כי DMF-ection מאפשר עריכה יעילה בתיווך CRISPR בקלטי RNP בקנה מידה ננוליטרי. חשוב לציין שהעריכה הייתה דומה בין תאי T של CD4⁺ ו-CD8⁺ , מה שהדגיש את היישום של הפלטפורמה על פני תאי T והציע שניתן להפחית את השימוש ב-RNP ביותר מסדר גודל מבלי לפגוע ביעילות הנוקאאוט.

הפרעה יעילה לגנים בתאי T ראשוניים מסוג CD4⁺ ו-CD8⁺ באמצעות DMF-ection מוקטן
כדי לאמת לעומק את ביצועי תהליך ה-DMF-ection, נבדקה הדחיפה בתיווך CRISPR–Cas9 של לוקוס TRAC בתאי CD4⁺ ו-CD8⁺ T אנושיים ראשוניים, תוך שימוש ב-10,000 תאים מופעלים בלבד בכל מצב. שלוש קבוצות ניסוי נכללו: תנאי המדריך למיקוד TRAC (TRAC KO), בקרה לא-ממוקדת (NTC) כדי להתחשב בהשפעות לא ספציפיות של מתן RNP, ובקרת מחוץ למחסנית (OCC) לקביעת ביטוי בסיסי של TCRα/β בתאים לא מטופלים ולא מעובדים. אסטרטגיית שער סטנדרטית יושמה לזיהוי סינגלטים חיים, ואחריה תת-קבוצות CD4⁺ ו-CD8⁺ וביטוי TCRα/β (איור 3A). הפרעה גנטית ביעילות גבוהה של לוקוס TRAC הושגה בשני תת-הקבוצות של תאי T ב-40 ריצות אלקטרופורציה עצמאיות. בתאי T מסוג CD4⁺, יעילות הדחיפה של TRAC הגיעה ל-88.4 ± 4.9%, לעומת 3.2 ± 4.7% ב-NTC ו-9.8 ±-5.1% במצבים של OCC. תוצאה דומה נצפתה בתאי T ב-CD8⁺, כאשר TRAC KO הגיע ל-89.8 ± 4.2%, לעומת 4.2 ± 7.4% (NTC) ו-20.2 ± 4.9% (OCC) (איור 3B, שמאל). חשוב לציין כי אלקטרופורציה לא יצרה ציטוטוקסיות משמעותית בתנאים שונים. הכדאיות עלתה על 96% בכל הקבוצות, ללא הבדל מובהק בין TRAC KO (97.1 ± 1%), NTC (96.8 ± 1%) ו-OCC (97 ± 1%) (איור 3B, מימין). יחד, הנתונים הללו מראים כי אלקטרופורציה של DMF מאפשרת הפרעה חזקה ויעילה של TRAC, תוך שמירה על חיוניות תאית במספר ריצות עצמאיות. תאי T אנושיים ראשוניים הושגו ממקורות מסחריים בהסכמת תורם מדעת ובהתאם להנחיות אתיות מוסדיות וספקיות.

טיפול בספירואידים HEK293T באמצעות מיקרופלואידיקה דיגיטלית
לאחר מכן, תהליך העבודה הדיגיטלי של אלקטרופורציה מיקרופלואידית הוערך ליישומים עם מבנים תלת-ממדיים רב-תאיים. ספרואידים חלולים HEK293T נוצרו על ידי זריעה של כ-100 תאים בכל באר בלוחות מיקרו-חיבור נמוכים וגידול במשך 24 שעות כדי לאפשר היווצרות ספרואידים (איור 4A). ספרואידים שנוצרו נאספו, הושמו מחדש והועמסו על מחסנית מיקרופלואידיק דיגיטלית לאלקטרופורציה. לאחר הטיפול, הספרואידים פורקו ללוח של 96 בארות להדמיה וניתוח צמיחה במורד הזרם.

כדי להשיג התאוששות ממוצעת של ספרואיד אחד בכל זמן לאחר האלקטרופורציה, הוטענו בכוונה מספר עודף של ספרואידים על המחסנית כדי לפצות על אובדן חומר במהלך הטיפול וההעברה. כ-192 ספרואידים הושעו מחדש בתוך 100 מיקרוליטר של בופר אלקטרופורציה ונטענו על המחסנית. כל משפחת תגובות קיבלה ~9.3 מיקרוליטר של ההשעיה, המתאימים ל~18 ספרואידים, כאשר טיפות בודדות הכילו ~1 מיקרו-ליטר (1–2 ספרואידים לכל טיפה). מכיוון שכמחצית מהספרואידים נשארו בפתח הטעינה במהלך הפעלת המחסנית, אסטרטגיית טעינה זו הובילה לממוצע ~1 ספרואיד לכל אתר אלקטרופורציה של שלוש טיפות.

ניתוח התאוששות הספרואידים הראה ש-0–1 ספרואידים שוחררו בדרך כלל בכל באר לאחר האלקטרופורציה, בהתאם לכ-4–6 ספרואידים שהוחזרו לכל משפחת תגובה (איור 4B לוח שמאל). ההתאוששות הזו נמוכה מהמקסימום התיאורטי ומשקפת אובדנים המתרחשים במהלך הכביסה, שאיבת סופרנטנט והחזקת ספרואידים בנמל הטעינה. אובדנים אלו מיוחסים לקוטר הספרואיד הקטן (~100 מיקרון) ולקושי הטמון בשמירה על התפלגות אחידה של מבנים שאינם חד-תאיים בתוך ההשעיה. כתוצאה מכך, חלק מהספרואידים נשארים מפוזרים באופן לא שווה או לא נכנסים לאזור הטרי טיפות. טעינת מספר עודף של ספרואידים הבטיחה שלפחות ספרואיד אחד יהיה נוכח ברוב אתרי האלקטרופורציה, מה שאפשר ניתוח עקבי במורד הזרם כפי שמודגם בהדמיה מיקרוסקופית של ספרואיד מוצבע ב-DAPI במחסנית המיקרופלואידיקה (איור 4B, לוח ימין). אופטימיזציה נוספת של תהליכים עשויה להפחית את מספר הספרואידים הנדרשים להשגת התאוששות שווה. למרות אובדן הטיפול הזה, זרימת העבודה אפשרה מיקום עדין של ספרואידים שלמים בתוך גאומטריית האלקטרופורציה התלת-טיפלית.

העברת mRNA ב-EGFP ויכולת היתכנות בספרואידים HEK293T
נצפתה אספקה יעילה של mRNA של EGFP לספרואידים HEK293T לאחר אלקטרופורציה (50 ng mRNA GFP לכל ספרואיד). מיקרוסקופ פלואורסצנציה שבוצע 24 שעות לאחר האלקטרופורציה גילה ביטוי GFP חזק ואחיד במרחב לאורך ספרואידים אלקטרופוריים, בעוד שלא נצפה פלואורסצנציה ניתנת לזיהוי בתנאי בקרה של 0 וולט או מחוץ למחסנית (איור 4C, לוח שמאל). ניתוח כמותי של עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת המנורמלת (MFI) לכל שטח ספרואידי אישר הצלחה של טרנספקציה תחת שתי מערכות הפרמטרים האלקטרופורציה שנבדקו (איור 4C, לוח אמצעי). בפרט, ספרואידים שאלקטרופורציה ב-500 וולט, 2 מילישניות, 2 פולסים הראו MFI של 6.96 × ^10-5 ± 3.50 × ^10-5, בעוד אלו האלקטרופוריים ב-375 וולט, 6 מילישניות, פולס אחד הראו MFI של 5.05 × ^10-5 ± 3.29 × ^10-5. לא זוהתה פלואורסצנציה מדידה בתנאי ביקורת (0 ± 0). שני תנאי האלקטרופורציה הניבו פלואורסצנציה גבוהה משמעותית בהשוואה לביקורת (p < 0.05), ללא הבדל מובהק סטטיסטית בין פרמטרי הפולס. כדי להעריך האם האלקטרופורציה פגעה בגדילה הספירואידית או בשלמות המבנית, נמדדו קוטרי הכדורים מדי יום במשך 5 ימים לאחר הטיפול. ספרואידים אלקטרופוריים הראו קינטיקת גדילה דומה לביקורת לא מטופלת, מה שמעיד כי טרנספקציה של mRNA לא פגעה בחיוניות או בקיבולת ההתרבות הספירואידי (איור 4C, לוח ימין). יחד, תוצאות אלו מראות כי אלקטרופורציה מיקרופלואידית דיגיטלית מאפשרת העברת mRNA יעילה לספירואידים רב-תאיים שלמים, תוך שמירה על שלמות וצמיחה מבנית, ותומכת בהיתכנות להרחיב פלטפורמה זו למודלים תלת-ממדיים של תאים.

הנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ±. מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות אנוביה חד-כיוונית עם תיקון פוסט-הוק של טוקי להשוואות מרובות, עם סף מובהקות של p < 0.05. N ערכים מייצגים שכפולים ביולוגיים עצמאיים (תורמים נפרדים או ריצות מחסניות עצמאיות) כפי שמצוין באיור.

איור 1. ארכיטקטורת פלטפורמת DMF אלקטרופורציה ותהליך עבודה. (א) צילום של תחמושת ה-DMF. (B) סכמטי עם הערות של פריסת מחסנית 48-פלקס (תמונה מרכזית), המציג את הארגון (A–H) של שמונה משפחות זהות, שכל אחת מכילה שישה אתרי אלקטרופורציה ניתנים לכתובת עצמאית, עם יציאות טעינה לאלקטרודות נוזליות, יציאות טעינה של תאים, אנודה, קתודה ואזורים ננו-נקודות מסומנים (תמונה פנימית שמאלית). תכונות מרכזיות, כולל יציאות טעינה, פורטי פריקה וספרי הרכבה, מסומנים. המחסנית מורכבת על ידי חיבור שני הלוחות בכיוון נכון יחיד עד שמרגישים התנגשות מכנית ברורה. תמונה מימין: מפה של מפזר מטפל נוזלי שמציגה מיקומים צבעוניים לפורטי טעינה (אדום), פורטי פריקה (ורוד) וזיהוי אזורי יעד (כחול). (C) משמאל: תמונה המראה את דיוק המיקום של חלוקת האקוסטיקה בכל 48 האתרים (n = 48), עם מיקום נפילה ביחס לנקודת האמצע של האלקטרודה (mm). הקיבוץ ההדוק מאשר דיוק הפקדה תת-מילימטרית. מימין: תמונות מייצגות שמראות נקודה ממוקדת נכון לפני ההידרציה מחדש על ידי טיפת התא (למעלה) ובמהלך ההידרציה, שבה הטיפה מועברת הלוך ושוב במקום שבו המדריך נמצא כדי להחזיר את המקום (למטה, חץ אדום). (ד) תמונה מלמעלה של אזורי אלקטרופורציה בדידים, המציגה את תנועת הטיפות מדורגות מ-(i) הידרציה מחדש של המטען על ידי הזזת הטיפה הלוך ושוב מעל ה-RNA המנחה שהופקד, (ii) תנועה לאתר האלקטרופורציה, בין האנודה לקתודה, שם הטיפה מתחברת עם שתי טיפות האלקטרודה הנוזליות הצדדיות ומקבלת פולס, ו-(iii) הטרי-דרופ המלא נע לנמל הפריקה לפני השליפה על ידי מטפל הנוזלים. (ה) סכמת זרימת עבודה מקצה לקצה. RNA מדריך מופקד על תת-המצע של המקלטת באמצעות מתקן אקוסטי. התאים והמטען מוכנים ונטענים על המקלט באמצעות מטפל נוזלים אוטומטי. האלקטרופורציה מתבצעת על פלטפורמת DMF. התאים מופרקים ללוח של 96 בארות ומועברים לאינקובטור לשחזור. ניתוח במורד הזרם מתבצע באמצעות ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופיה, ריצוף מהדור הבא או קריאות מתאימות אחרות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2. השפעת תוספת פולימרים על השקיעה והרכבת RNP. (A) תוספת פולימרים משפרת את נאמנות ההפקדה האקוסטית. ספיגת פלואורסצאין לאחר שקיעה ובנייה מחדש בארבעה מחסניות עצמאיות, עם או בלי חומצה פולי-L-גלוטמית. השונות הופחתה בנפחים ביניים (40–120 ננוליטר) בנוכחות PGA. 
(B) השפעת ה-PGA על הרכבת Cas9–sgRNA. עקומות קישור זיקה של FIDA מודדות רדיוס הידרודינמי (Rh) בהיעדר (פאנל שמאל) או נוכחות (פאנל ימין) של PGA. sgRNA חופשי הציג Rh של 3.45 ± 0.26 ננומטר, בעוד שטיטרציה של Cas9 הניבה גודל קומפלקס RNP של 15.32 ± 0.46 ננומטר (Kd = 0.70 ± 0.14 ננומטר). הוספת PGA הפחיתה את גודל המורכבות והחלישה את הזיקה להיקשרים באופן התלוי בריכוז. עם הוספת 0.005 mg/mL PGA, sgRNA חופשי הציג Rh של 4.31 ±-0.07 ננומטר, בעוד טיטרציה של Cas9 הניבה גודל קומפלקס RNP של 10.21 ± 0.38 ננומטר (K_d = 67.7 ± 9.5 ננומטר). הניסויים בוצעו בבופר אלקטרופורציה בעל מוליכות נמוכה עם 0.05% פלורוני F-68. זוהתה פלואורסצנציה ב-480 ננומטר באמצעות מודול LED משולב. נימי מצופה קבוע (Ø 75 מיקרון, L = 100 ס"מ) שימש בכל הניסויים. כדי לבדוק את השפעת הפולימרים הפוליאניוניים על הרכבת RNP, נוספה PGA לתערובות הבדיקה בריכוזים של 0.0025 מ"ג/מ"ל ו-0.005 מ"ג/מ"ל. תנאים אלו נבחרו כדי למודל את טווח השימוש במיקרופלואידיקה דיגיטלית באלקטרווטינג ובופרי אלקטרופורציה. לניתוח קישור ישיר, 10 ננומטר sgRNA מסומן ב-FAM שמכוון ללוקוס TRAC שימש כאינדיקטור פלואורסצנטי. ריכוזים הולכים וגדלים של נוקלאז Cas9 (עד 500 ננומטר) הותאמו מול האינדיקטור במבחן CapMix כדי ליצור פרופילי פיזור להיווצרות מורכבת. כל הניסויים בוצעו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, כאשר כל נקודת נתונים צרכה 40 ננו-ליטר של אינדיקטור ו~12 מיקרוליטר של אנליט (Cas9). הניסויים בוצעו עם הרצף הבא: (1) שטיפה עם חומצה זרחנית של 0.1% בעוצמה 3,500 מ"בר למשך 30 שניות; (2) שטיפה עם בופר בדיקה ב-3,500 מ"בר למשך 30 שניות; (3) מילוי הקפילריה באנליט ב-3,500 מ"בר למשך 20 שניות; (4) הזרקת המדד ב-50 מ"בר למשך 10 שניות; (5) מוביליזציה ומדידה עם אנליט ב-400 מ"בר למשך 180 שניות. רדיוסים הידרודינמיים חושבו באמצעות רוחב השיא שהופק בחצי מגובה השיא המקסימלי, וקבועי פירוק (K_D) נקבעו על ידי התאמת רגרסיה לא ליניארית למודל קישור 1:1. (C) השפעת PGA על יציבות RNP. פרופילי פיזור טיילור של קומפלקסים של Cas9–sgRNA עם ובלי PGA, שבוצעו עם נוקלאז Cas9 של 500 ננומטר ו-50 ננומטר sgRNA מתויג ב-FAM. בהיעדר PGA, לא נצפה קומפלקס יציב, כפי שמעיד היווצרות גוברת של אגרגטים גדולים יחד עם ירידה באות מהקומפלקס לאורך זמן (משמאל). הוספת 0.0025 מ"ג/מ"ל PGA הניבה טיילורגרם מונודיפיזור מוגדר היטב עם אגרגציה מינימלית המדידה של R_h ~ 9.6 ננומטר (R² = 0.999, ימין). היציבות המורכבת הוערכה בתנאי אלקטרופורציה סטנדרטיים (500 ננומטר Cas9 + 50 ננומטר sgRNA) עם או בלי 0.0025 מ"ג/מ"ל PGA. הדגימות היו מעורבבות מראש ונשמרו על טמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במגש הניסוי, בעוד שהזרקות בוצעו במרווחים של 10 דקות במשך מספר שעות. הניסויים בוצעו עם הרצף הבא: (1) שטיפה עם חומצה זרחנית של 0.1% בעוצמה 3,500 מ"בר למשך 30 שניות; (2) שטיפה עם בופר בדיקה ב-3,500 מ"בר למשך 30 שניות; (3) מילוי הנמים באנליט (בופר מבחן) ב-3,500 mbar למשך 20 שניות; (4) הזרקת המדד ב-50 מ"בר למשך 10 שניות; (5) מוביליזציה ומדידה עם אנליט ב-400 מ"בר למשך 180 שניות. היווצרות קומפלקסים לא יציבים הוכחה דרך היווצרות אגרגטים גדולים (קוצים בטיילורגרם) וירידה באות. קומפלקסים יציבים זוהו באמצעות טיילוגרמות מונודיספיזריות מותאמות היטב (R² > 0.99), ו-R_h הערכים הופקו מפרופילים מותאמים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3. יעילות וחיוניות של TCR אלפא/בטא בתאי T ראשוניים בבני אדם. (א) אסטרטגיית שער ציטומטריית זרימה מייצגת לסינגלטים חיים, תת-קבוצות תאי T של CD4⁺ ו-CD8⁺, וביטוי TCRα/β במצבים בקרה (sgRNA לא ממוקד) וניסויים (TRAC sgRNA). התאים סומנו ברצף על אוכלוסיות FSC/SSC, סינגלטים, חיוניות ו-CD4⁺ או CD8⁺ לפני הערכת ביטוי פני השטח של TCRα/β. (B) שמאל: יעילות הדחיפה של TCRα/β בתתי-קבוצות תאי T של CD4⁺ ו-CD8⁺ בשלושה מצבים: TRAC KO, שליטה לא מטרה (NTC), ושליטה מחוץ למחסנית (OCC). CD4⁺: TRAC KO = 88.4 ± 4.9% (n = 40), NTC = 3.2 ± 4.7% (n = 24), OCC = 9.8 ± 5.1% (n = 18). CD8⁺: TRAC KO = 89.8 ± 4.2% (n = 40), NTC = 4.2 ± 7.4% (n = 24), OCC = 20.2 ± 4.9% (n = 18). מימין: הקיימות לאחר האלקטרופורציה בכל התנאים, עם שער על סינגלטים. כדאיות: TRAC KO = 97.1 ± 1% (n = 40), NTC = 96.8 ± 1% (n = 24), OCC = 97 ± 1% (n = 18). נקודות נתונים בודדות מוצגות עם ממוצע ו-SD. n מייצג רצים עצמאיים של אלקטרופורציה על פני מספר מחסניות וימים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4. העברת mRNA יעילה לספרואידים HEK293T באמצעות DMF-ection. (א) דיאגרמת זרימת עבודה המתארת את תהליך יצירת הספרואידים וביצוע טרנספקציה ספרואידית. מאה HEK293T תאים נטענים בכל באר במיקרופלטה ספרואידי מיוחדת ומגודלים במשך 24 שעות ליצירת ספרואידים בקוטר 100 מיקרון. ספרואידים (192) משוחררים ומושלים מחדש לתוך 100 מיקרו-ליטר של בופר טרנספקציה. מתלה זה, עם מטען מתאים, נטען על מחסנית DMF-ection מנוקדת בהספק של 9.3 מיקרוליטר לכל משפחה. לאחר שמתבצעת אלקטרופורציה, הדגימות מופרקות ללוח באר 96 לניתוח במורד הזרם. (B) שמאל: מספר הספרואידים שפורקו לכל משפחה על מחסנית DMF-ection לעומת בקרות מחוץ למחסנית עם פיפט ידני. באמצע: תמונה פלואורסצנטית של הטרי-דרופ, שבה ריבוע אדום גדול יותר מסמן את הטרי-דרופ, והאובלי האדום מקיף את הספרואיד. מימין: תמונה פלואורסצנטית שמראה פורט טעינה עם ספרואידים טעונים (עיגולים כחולים). (ג) פאנל שמאל: תמונות ברייטפילד של ספרואידים HEK293T שלמים לפני אלקטרופורציה ותמונות פלואורסצנציה של ספרואידים 24 שעות לאחר אלקטרופורציית mRNA של EGFP , לעומת בקרות 0V ומחוץ למחסנית. (D) פאנל עליון: כימות של עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת המנורמלת לאזור ספרואידי לשני תנאי אלקטרופורציה (500 וולט, 2 מילישניות, 2 פולסים; 375 וולט, 6 מילישניות, פולס אחד). אין הבדל משמעותי בין תנאי אלקטרופורציה, אך כל תנאי האלקטרופורציה שונים משמעותית מבקרי 0 וולט וללא מחסנית (500 וולט 2 מילישניות 2 פולס: 6.955 × ^10-5 ± 3.502 × ^10-5, 375 וולט 6 מילישניות 1 פולס: 5.045 × ^10-5 ± 3.294 × ^10-5, 0 וולט: 0 ± 0, שליטה מחוץ למחסנית: 0 ± 0 (*p < 0.05). תמונות עובדו באמצעות חבילת עיבוד תמונות FIJI¹⁰. (500 וולט, 2 מילישניות, 2 פולסים: n = 6; 375 וולט, 6 מילישניות, פולס אחד: n = 4; שליטה מחוץ למחסנית: n = 3; בקרת 0 וולט: n = 3). (ד) לוח תחתון: קוטר ספרואידי לאחר האלקטרופורציה במשך 5 ימים בתנאים שונים. הקוטר נמדד באמצעות FIJI מתמונות חיזוק פאזה שצולמו בהגדלה של פי 20 עם מיקרוסקופ הפוך. (500 וולט, 2 מילישניות, 2 פולסים: n = 6; 375 וולט, 6 מילישניות, פולס אחד: n = 4; בקרת מחסנית כבויה: n = 3; בקרת 0 וולט: n = 3). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

פרוטוקול זה מתאר תהליך אלקטרופורציה מיקרופלואידי דיגיטלי מוקטן שמאפשר העברה תוך-תאית יעילה לתאי T ראשוניים של בני אדם באמצעות טיפות בקנה מידה ננו-ליטר. יתרון מרכזי של שיטה זו הוא היכולת לבצע עריכת גנום ב-CRISPR–Cas9 באמצעות 10,000 תאים בלבד בכל תגובה, מה שמפחית משמעותית את דרישות החומר בהשוואה לאלקטרופורציה קונבנציונלית. הארכיטקטורה המבוססת על טיפות תומכת באוטומציה, ומבטיחה טיפול משוחזר במגבים והרכבת תגובה באתרים מקבילים מרובים.

במחקרים קודמים, השוואה ישירה של פלטפורמת DMF-ection מול מערכת נפוצה הראתה כי נוקלופקציה קונבנציונלית מייצרת פחות מ-2% תאי T חיוביים ל-GFP ב-10,000 תאים בעריכה, בעוד שפלטפורמת DMF-ection השיגה >90% יעילות טרנספקציה באותם תנאי קלט נמוך. למסך מאורגן של 192 מצבים, פלטפורמת ה-DMF דרשה פי 25 תאים פחות וכ-50 פעמים פחות Cas9 לכל תנאי לעומת שיטות^{רגילות 9}. השוואות אלו מדגישות את היתרונות החומריים של אלקטרופורציה DMF מוקטנת ליישומים עם קלט נמוך וסינון

שלבים קריטיים ופתרון תקלות
מספר שלבים הם קריטיים להצלחה. כיול מדויק של מטפל הנוזל האקוסטי מבטיח הפקדה מדויקת של RNA מנחה על תת-המחסנית, דבר חיוני להרכבה עקבית של RNP. אם הכתמים אינם עקביים או שהטיפות אינן נדבקות למצע, ודאו ש-PGA כלול בתערובת המדריך-RNA בריכוז הנכון (5 מ"ג/מ"ל סופי) ושהמפזר האקוסטי מכויל לגאומטריית הפלטת המקור הספציפית. כתמים לא עקביים בנפחים ביניים (40–120 ננו-ליטר) נגרמות לרוב על ידי חזרת טיפות על פני השטח ההידרופוביים; העלאה קלה של ריכוז ה-PGA או הקטנת גובה הזריקה יכולה לפתור את הבעיה.

שמירה על ריכוז התאים הנכון לפני הטעינה חשובה, שכן סטיות בצפיפות עלולות לפגוע ביצירת טיפות ולהפחית את יעילות העריכה. אם יעילות העריכה יורדת מתחת ל-75%, ראשית, יש לוודא שהפעלת תאי T הייתה מספקת (לאשר את העלאת ויסות CD25 ו-CD69 באמצעות ציטומטריית זרימה לפני האלקטרופורציה), ולאשר ש-Cas9 ו-sgRNA שולבו מיד לפני הטעינה ולא מראש.

תוספים פולימריים ממלאים תפקיד חשוב בייצוב קומפלקסי Cas9–sgRNA בתנאי בופר אלקטרופורציה¹¹. למרות ש-PGA מפחית את הזיקה הנומינלית של הקשר, האפקט המייצב שלו משפר את השחזוריות ומונע הצטברות בנפחי ננוליטרים. זהו פרמטר שניתן לכוונן עבור חוקרים שמתאימים את תהליך העבודה למתחמי חלבון–RNA אחרים.

פתרון תקלות
גישור טיפות כושל
בדוק את דוח QC האינסטרומנטלי לאחר כל ניסוי. היעדר זרם מזוהה מצביע על כישלון בגישור, בין אם עקב טיפות לא מספקות או כישלון בהתכנסות, והוא מסומן אוטומטית על ידי המערכת. אתרים שנפגעו אינם ניתנים לשחזור באותו ריצה. אם הכשלים הם לסירוגין (<10%), אין צורך בפעולה; מפזר את השכפולים בין מספר מחסניות כדי למזער את ההשפעה. אם התקלות שיטתיות, הרץ את לוח הבקרת איכות ואת בדיקת בריאות המערכת ופנה לתמיכה הטכנית אם הבעיות נמשכות.

דימוי sgRNA לא עקבי
לאחר הפירוק, אשר חזותית שכל הטיפות הצפויות נמצאות, ממורכזות בתוך גבולות האלקטרודות, וחופשיות מטיפות לוויין. כלול PGA בתערובת ה-RNA המנחה כדי למנוע פולידיספיזרס. לגבי טיפות חסרות, בדוק את דוח הריצה במתקן והחליף במידת הצורך. במצב של היווצרות מניסקוס לקויה, שמרו על מינימום של 5 מיקרוליטר לבאר, סובבו את הפלטה לזמן קצר, וטפו בעדינות על משטח שטוח. עבוד על קרח ואטום לוחות כשאתה לא בשימוש כדי למנוע אידוי.

ירידה ביעילות העריכה
אם נצפתה ירידה ביעילות העריכה, יש לפתור תקלות בסדר הבא: (1) לאמת תנאי אספקה באמצעות mRNA של EGFP לפני המשך RNP; (2) מאשר שהזרם של בקרת האיכות הנמדד תואם את הערכים הצפויים; (3) להאזין צפיפות תאים, RNA מנחה וריכוז Cas9; (4) לאשר עמידות תא גבוהה מיד לפני הטעינה; (5) לוודא שלמות התגובה ותנאי האחסון; (6) לאשר ששיטת הקריאה מתאימה לצפיפות התא וליעד הרלוונטי.

התאמת הפלטפורמה לסוגי תאים ומודלים חלופיים
עבור סוגי תאי חיסון ראשוניים אחרים, כגון תאי NK או תאי T רגולטוריים, פרמטרי האלקטרופורציה ידרשו אופטימיזציה. גודל התא הוא גורם חשוב לקביעת סף השדה החשמלי הנדרש לחדירות ממברנה: תאים קטנים יותר דורשים עוצמת שדה גבוהה יותר, בעוד תאים גדולים יותר חודרים במתחים נמוכים — קשר מתועד היטב בביופיזיקה של אלקטרופורציה. כנקודת התחלה לסוגי תאים קטנים יותר מתאי CD3⁺ T מופעלים, לשמור או להעלות מעט מתח (500–550 וולט) תוך שמירה על משך פולס קצר (2–3 מילישניות) כדי להימנע מלחץ תרמי מופרז. לתאים גדולים יותר, יש להוריד מתח ל-350–400 וולט, ולווסת את משך הפולס מבלי לעבור את 10 מילישניות. בנוסף, מיקרואופטימיזציה ברמת התורם היא פרקטיקה נפוצה באלקטרופורציה, ופרמטרים שאומתים בתאי תורם בריאים עשויים שלא לתורגם ישירות לחומר חולה או שמקורו במטופל. תאים מתורמים עם ממאירות המטולוגית, זיהום כרוני או חסר חיסוני מציגים לעיתים קרובות תכונות ביופיזיקליות משתנות, ויש להעריך מחדש את יעילות העריכה והכדאיות עבור כל תורם חדש, במיוחד בעבודה עם דגימות לא בריאות או קליניות. יש להעריך את חיוניות התאים לאחר 24 ו-72 שעות לאחר האלקטרופורציה ולהתאים את הפרמטרים באופן איטרטיבי. ייתכן שיהיה צורך גם להעלות את מינון Cas9 ב-1.5–2× ביחס לפרוטוקול תאי T אם יעילות העברת ה-RNP מופחתת.

בדגמים תלת-ממדיים גדולים או צפופים יותר, כגון אורגנואידים בקוטר העולה על 200 מיקרון, ייתכן שאטם המקלט ידרש שינוי כדי להתאים לגודל מבנה מוגבר ולמחסומי דיפוזיה. משתמשים המנסים יישומים כאלה צריכים לשקול פרם דיסוציאציה של שכבות התא החיצוניות לשיפור חדירת המגיב או יישום תנאי פולס מרובים ברצף. יש לפנות למחבר המתאים לקבלת הנחיות בנוגע להתאמת גאומטריית טיפות ופרמטרי פולס למבנים שמעבר לקוטר הספרואיד של 100 מיקרון, כפי שאומת כאן.

רלוונטיות תרגומית
הפוטנציאל התרגומי של תהליך העבודה הזה חורג מעבר לניקוי פשוט. הפלטפורמה יושמה על תיקון מונחה הומולוגיה של קונסטרוקט GFP של 4 קילובייט ו-CAR נגד HER2 פונקציונלי בלוקוס TRAC בתאי T ראשוניים, וכן על מסך CRISPR מערך עם 45 מטרות המזהה רגולטורים חדשים של תציאת תאי CD4⁺ T⁹. יישומים אלו ממחישים מסלול מאופטימיזציה ברמת הפרוטוקול לגילוי פונקציונלי במודלים של תאים ראשוניים רלוונטיים קלינית. עם זאת, מגבלות חשובות נותרות: תוצאות פונקציונליות כמו שיעורי הפרעה אלליים על ידי ריצוף, הפרשת ציטוקינים והשתלה ב-in vivo לא הוערכו בפרוטוקול הנוכחי ומייצגות את הצעדים הבאים הנדרשים לתרגום הטיפולי. בנוסף, למרות שהפלטפורמה תומכת ב-48 תגובות מקביליות לכל מחסנית, יידרש מקביליות מרובת מחסניות למסכים גדולים יותר.

מגבלות
כמו בכל פלטפורמה מוקטנת, יש להכיר במגבלות מעשיות מסוימות. פנוטיפינג במורד הזרם חייב להיות מותאם לקנה מידה של תגובה קטנה; רכישת ציטומטריית זרימה עשויה לדרוש שלבי ריכוז נוספים או איחוד בארות משוכפלים להשגת ספירות אירועים מספקות. הגדרות האלקטרופורציה של הפלטפורמה עשויות לדרוש גם אופטימיזציה לסוגי תאים עם רגישות גבוהה לשדות חשמליים, והמשתמשים צריכים להתייחס לפרמטרים שפורסמו כנקודות התחלה ולא כערכים קבועים אוניברסליים. לבסוף, צביעת היתכנות פורמלית בנקודות זמן ממושכות לאחר האלקטרופורציה לא בוצעה עבור זרימת העבודה הספרואידי המוצגת כאן; מעקב גדילה מבוסס קוטר שימש כמדד חלופי לשלמות מבנית ומייצג כיוון חשוב לאפיון עתידי.

בסך הכול, DMF-ection, שיטת טרנספקציה לא-ויראלית, מספקת גישה עוצמתית וגמישה לעריכת גנום ולהעברת mRNA בסביבות עם קלט נמוך ותפוקה גבוהה. התאימות שלה לתאי T ראשוניים, מודלים תלת-ממדיים מובנים וטיפול נוזלי אוטומטי מרחיבה הזדמנויות בהנדסת טיפול תאים, סקר CRISPR רב-מצבי וגנומיקה פונקציונלית מוקטנת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentation
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Spheroid protocol
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Spheroid protocol
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentation
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Spheroid culture
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfection
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentation
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentation
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Spheroid culture
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentation
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Spheroid protocol
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T cell media supplement
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Peripheral Blood, Cryopreserved, pan CD3+ Helper T Cells, Negatively Selected
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T Cell Activation media
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T Cell Activation media
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentation
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentation
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Spheroid culture
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Use a at 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Spheroid protocol
Surfactant F	DropGenie		Transfection- use at 1:20 in DMF compatible buffer to make compete Transfection buffer
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Spheroid protocol