מאמר שיטה

זיהוי הזדקנות באמצעות אור מוחזר בחלק הווסקולרי סטרומלי שומני

171 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70588

⸱

5 ביוני 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג מיקרוסקופיה קונפוקלית מוחזרת באור לזיהוי אובייקטיבי של פעילות בטא-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורה להזדקנות בחלק הווסקולרי סטרומלי שבודד מרקמת שומן אנושית. השיטה תואמת לאימונוציטוכימיה, משלבת בקרות pH להערכה כמותית, ומספקת גם חלופה רגישה ופחות סובייקטיבית לצביעת SA-β-gal המסורתית.

תקציר

הזדקנות תאית היא מצב שנגרם מלחץ המאופיין בעצרת מחזור תא קבועה ובפיתוח פרופיל הפרשה ייחודי המשפיע על תפקוד הרקמה ותורם להזדקנות ולמחלות מטבוליות. פעילות β-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורה להזדקנות משמשת באופן נרחב כסמן לתאים מזדקנים; עם זאת, בדיקות SA-β-gal קונבנציונליות לעיתים קרובות מתבססות על הערכה חזותית סובייקטיבית ומספקות מידע כמותי מוגבל. מגבלות אלו בולטות במיוחד באוכלוסיות תאים ראשוניות בבני אדם, כגון חלק כלי הדם סטרומלי (SVF) שמקורו ברקמת שומן, המכילה תערובת הטרוגנית של פרה-אדיפוציטים, תאי חיסון ותאי אנדותל. כאן אנו מציגים גישה אופטימלית למיקרוסקופיה קונפוקלית של אור מוחזר לזיהוי כמותי ברזולוציה גבוהה של פעילות SA-β-gal בתאי SVF אנושיים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח אובייקטיבי של פעילות SA-β-gal בתא יחיד, מאפשר אימונוסיטוכימיה סימולטנית לזיהוי מולטי-פלקסי של סימני הזדקנות או שושלת נוספים, ומשלב בקרות תואמות pH. על ידי שילוב תכונות אלו, שיטה זו מספקת גישה רגישה, שחזורית וכמותית לחקר הזדקנות תאית באוכלוסיות תאים ראשוניות הטרוגניות של בני אדם. הוא מציע חלופה משופרת לצביעת SA-β-gal המסורתית.

מבוא

הזדקנות תאית היא תגובה רב-ממדית שיכולה להיגרם מסוגים רבים של לחץ, כולל נזק ל-DNA, שחיקה של טלומרים והפעלת אונקוגנים. הוא מוביל לעצירת יציבה של מחזור התא יחד עם הגברת ההתנגדות לאפופטוזיס, בין היתר על ידי השראה של חלבונים אנטי-אפופטוטיים 1,2. הזדקנות נקשרה לשיפור הישרדות התאים בהקשרים שבהם שימור שלמות הרקמה הוא חיוני, כגון תיקון ותחזוקה 3,4. מעבר לתפקידה בהומאוסטזיס הרקמות, הזדקנות תורמת גם להתפתחות תקינה על ידי עיצוב דפוסי עובר 5,6 וכמחסום להיווצרות גידול על ידי קידום ניקוי תאים פגועים או פוטנציאליים ממאירים 7,8,9. למרות שהזדקנות יכולה לשרת תפקידים מועילים, מחקרים רבים הדגישו היבט מנוגד שבו תאים זקנים מקבלים פרופיל הפרשה פרו-דלקתי שיכול להפריע למטבוליזם המקומי, לפגוע ברקמות הסובבות ואפילו לתמוך בהתקדמות הגידול 10,11,12,13.

הזדקנות זוהתה בסוגי תאים מגוונים ברקמות מרובות ולעיתים קרובות קשורה להזדקנות, מחלות, תפקוד לקוי ברקמות או סרטן. בכבד, הזדקנות של תאי כוכב כבדיים הוכחה כמעודדת התקדמות הגידול על ידי שינוי הומאוסטזיס מטבולי באמצעות גורמים מופרשים14,15. מחקרים שבחנו את הפטוציטציות16 או ביופסיות כבד שלם17 מצביעים על כך שהזדקנות בתאים אלו יכולה לתרום לתחלואות משולבות מטבוליות כגון מחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד לקוי ודלקת כבד תפקודית לקויה. יתרה מזאת, הקשר בין סוכרת סוג 2 להזדקנות זכה לתשומת לב רבה בעשור האחרון, עם ראיות המקשרות הזדקנות לסיבוכים הקשורים לסוכרת בתאי β בלבלב, בכבד16 ובשומרים 18,19,20,21. ממצאים אלו מדגישים את חשיבות זיהוי מדויק של תאים מזדקנים ברקמות מטבוליות, שם הצטברותם והטרוגניות תורמות להתקדמות המחלה ולמיקוד הטיפולי22.

השינויים באיתות ובביטוי חלבונים הקשורים להזדקנות הם לעיתים קרובות ספציפיים לתא ולרקמה; עם זאת, מספר תכונות מאפיינות באופן כללי תאים זקנים. אחד הסמנים הנפוצים ביותר הוא הפעילות האנזימטית המוגברת של β-גלקטוזידאז ב-pH 6.0, המכונה β-גלקטוזידאז מקושר להזדקנות (SA-β-gal)23. β-גלקטוזידאז הוא הידרולאז ליזוזומי הנמצא בכל התאים ופועל בדרך כלל ב-pH חומצי (~4.5–5.0), שם הוא תורם לפירוק הסובסטרטים הגליקוזיליים. התכונה המגדירה של SA-β-gal היא שמירת פעילות β-גלקטוזידאז בתנאי pH תת-אופטימליים. במבחן הקלאסי, התאים מודגרים עם הסובסטרט הסינתטי 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלאקטופירנוסיד (X-gal) ב-pH 6.0, כאשר הפעילות האנזימטית יורדת ברוב התאים אך נשארת ניתנת לזיהוי בתאים מזדקנים. זה מוביל להיווצרות משקע כחול בלתי מסיס שניתן לדמיין במיקרוסקופית24.

בעוד שבדיקה זו אומצה באופן נרחב, גילוי משקעי X-gal התבסס מסורתית על מיקרוסקופיית שדה בהיר. זיהוי שדות בהיר מתבסס על זיהוי חזותי של משקעים כחולים ולכן רגישותו מוגבלת לאותות ברמה נמוכה ולמצבי הזדקנות מוקדמים. לעומת זאת, הדמיית אור מוחזר לוכדת את הצפיפות האופטית של משקע X-gal, ומאפשרת זיהוי כמותי בטווח דינמי רחב יותר. לאחרונה פותחו סובסטרטים פלואורוגניים לשיפור הרגישות25. עם זאת, גישות אלו בדרך כלל מודדות פעילות β-גלקטוזידאז בתנאים שאינם שומרים על ההגדרה הקלאסית התלויה ב-pH של SA-β-gal. כתוצאה מכך, הם עשויים להעלות את עוצמת האות אך להפחית את הספציפיות להזדקנות. לעומת זאת, האטימות הטבועה במשקע X-gal מאפשרת את גילויו באמצעות הדמיית אור מוחזר קונפוקלית, ומספקת קריאה רגישה וכמותית יותר תוך שמירה על ההגדרה האנזימטית המקורית של SA-β-gal26.

במהלך השנים זוהו סימני היכר נוספים של הזדקנות, כולל ביטוי מוגבר של מעכבי הקינאז התלויים בציקלין P16 ו-P21, וכן גורם השעתוק P53, המווסת את עצירות מחזור התאים ותוכניות הזדקנות נוספות 27,28,29,30,31,32,33. התקדמויות אלו הובילו להגדרה מוצקה יותר של הזדקנות, שבה תאים מסווגים בדרך כלל על בסיס נוכחות משולבת של מספר סמנים. בפועל, עם זאת, סמנים אלו נמדדים לעיתים קרובות באמצעות שיטות שונות: סמנים גרעיניים, כמו P16 ו-P21, מזוהים בדרך כלל באמצעות טכניקות מבוססות פלואורסצנציה, בעוד שפעילות SA-β-gal נמדדה באופן מסורתי באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר. הפרדה זו הגבילה את היכולת להעריך מספר תכונות הזדקנות בתוך אותו תא. הדמיית אור מוחזר מתגברת על מגבלה זו בכך שהיא מאפשרת שילוב ישיר של זיהוי SA-β-gal עם סמנים מבוססי פלואורסצנציה בתוך תהליך דימות יחיד, ומקל על הערכה חזקה וביולוגית משמעותית יותר של הזדקנות באוכלוסיות תאים הטרוגניות.

בעוד שדדיק ועמיתיו מתמודדים עם מספר מגבלות של הדמיה מסורתית ב-SA-β-gal, כולל רגישות משופרת, שימוש בבקרות תואמות pH לסף אובייקטיבי, ותאימות לאימונוציטוכימיה, שיטת הקונפוקול שלהם באור מוחזר הותאמה במיוחד לשומנים בוגריםמבודדים 26. עם זאת, הזדקנות ברקמת השומן אינה מוגבלת לשומנים34,35, וניתן לקבל תובנות נוספות על ידי בדיקת חלק כלי הדם הסטרומלי (SVF). ה-SVF כולל פרה-אדיפוציטים, אוכלוסיות אנדותליות ופיברובלסטים, ותאי חיסון מגוונים, שכולם עשויים לעבור הזדקנות ולתרום לעיצוב מחדש של שומן, דלקת ושינוי באיתות מטבוליים. לכן, אפיון הזדקנות בתוך מחלקת ההטרוגניות זו חשוב לקישור תהליכים ספציפיים לסוג התא לתוצאות ברמת הרקמה ולמערכת המערכתית.

כאן, אנו מרחיבים את זיהוי SA-β-gal של אור מוחזר לתאי SVF, ומאפשרים את יישומו במספר סוגי תאי רקמת שומן. על ידי שילוב גישה זו עם אימונוציטוכימיה, השיטה מאפשרת ניתוח תא יחיד משולב של פעילות SA-β-gal לצד סימני שושלת ופונקציונליים בדגימות אנושיות ראשוניות.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם לתקנון הצהרת הלסינקי. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה האזורית בסטוקהולם, DNR 2012/50-31.

1. הכנת תאים

  1. השתמש בתאי שבר וסקולרי סטרומלי (SVF) המבודדים מרקמת שומן אנושית באמצעות עיכול קולגנאז.
    הערה: תפוקת התאים משתנה בהתאם לגודל הביופסיה ולהרכב הרקמה; עם זאת, כ-1.0 ×-10 6 תאי SVF מתקבלים בדרך כלל לכל 10 גרם רקמת שומן.

2. צביעת X-gal והכנות לשקופיות

  1. מקבע תאים ב-1 מ"ל של 2% פאראפורמלדהיד (PFA) בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על נדנדה (רוקר).
  2. צנטריפוגה ב-600 × גרם למשך 10 דקות והסרת הסופרנטנט.
  3. הכינו את תמיסת הצביעה X-gal באמצעות ערכת צביעת ההזדקנות β-גלקטוזידאז לפי הוראות היצרן.
  4. חלק את תמיסת הצביעה ל-3 צינורות (1 מ"ל כל אחד) וכיוון את ה-pH ל-5, 6 ו-8 עם 1 M HCl ו-1 M NaOH. מדדו pH באמצעות מד pH מכויל.
  5. הוסף תמיסת X-gal ל-0.5 × 106 תאים למצב ודגר במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללאCO2.
  6. צנטריפוגה ב-600 × גרם למשך 10 דקות והסרת הסופרנטנט.
  7. שטוף תאים עם PBS (pH 7), צנטריפוגה ב-600 × גרם למשך 10 דקות, והסר את הסופרנאנט.
  8. הכינו תמיסת נוגדנים ראשונית (CD31 [1:200] או בקרת IgG [1:333]) בסרום חמור תקין של 5% (NDS). דגר תאים ללילה בטמפרטורה של 4°C.
  9. שטוף תאים 3 פעמים ב-PBST (0.1%) במשך 10 דקות ב-RT על נדנדה.
  10. הכינו תמיסת נוגדנים משנית (אנטי-עכבר אלקסה פלור 555 [1:500]) ואגלוטינין נבט חיטה (WGA [1:200]) ב-5% NDS. תדגר שעה אחת ב-RT על רוקר.
  11. צנטריפוגה ב-600 × גרם למשך 10 דקות והסרת תמיסת צביעת נוגדנים משנית.
  12. שטוף את התאים 3 פעמים ב-PBST (0.1%) למשך 10 דקות על נדנדה ב-RT.
  13. צנטריפוגה ב-600 × גרם למשך 10 דקות והסרת הסופרנטנט.
  14. החזירו תאים במתקן האנטיפייד.
  15. הפיפט את תליית התא על שקופיות מיקרוסקופ.
  16. תן למדיום ההרכבה להתייבש במהלך הלילה ב-RT כדי לייצב את התאים.
  17. הוסיפו 100 מיקרוליטר של 100% גליצרול, הניחו כיסוי מעל, ואטמו עם לק לציפורניים.

3. מיקרוסקופיה

הערה: תאי תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המוגדר לזיהוי אור מוחזר. אות אור מוחזר צריך להיאסף לאורך הגל של העירור או קרוב אליו באמצעות מפצל קרן או מראה דיכרואית שסופקה על ידי היצרן. השתמש במטרת 30× עם שמן סיליקון (צמצם מספרי 1.05) לכל הניסויים.

  1. בחר את הגדרת מפצל הקרן T90/R10 בתוך תוכנת המיקרוסקופ.
  2. השתמשו בגירוי של 633 ננומטר ואספו אור מוחזר בין 635–645 ננומטר.
  3. רכוש את אות Hoechst באמצעות עירור של 405 ננומטר.
  4. רכישת אות WGA באמצעות עירור 488 ננומטר.
  5. רכוש אות CD31 באמצעות עירור של 555 ננומטר.
  6. הגדר את גודל שלב ה-Z לאופטימום המערכת (0.74 מיקרון) והגדר מחסנית Z המבוססת על אות הממברנה כדי ללכוד את נפח התא המלא.
  7. רכוש תמונות באמצעות אותן הגדרות רכישה לכל הדגימות. שמירת קבצים בפורמט המיקרוסקופ המקורי (למשל, .oir) ללא דחיסה.

4. ניתוח תמונה

הערה: נתח תמונות באמצעות ImageJ ו-CellProfiler.

  1. פיצול ערוצים ב-ImageJ ליצירת ערימות Z לכל ערוץ (405, 488, 555, 633).
  2. יצירת הקרנות עוצמה מסוכמות באמצעות פונקציית Z Project וייצא כקבצי TIFF 16 ביט.
  3. ייבאו תמונות ל-CellProfiler (גרסה 4.2.8) לצורך סגמנטציה אוטומטית של תאים וכימות עוצמת האור המוחזר לכל תא (איור משלים 1 ואיור משלים 2).
  4. ייצוא מדידות עוצמה לגיליון אלקטרוני לניתוח במורד הזרם.

5. ניקוד ב-SA-β-gal

  1. הגדר את סף החיוביות של SA-β-gal כעוצמת האור המוחזרת הממוצעת של תנאי pH 8 בתוספת שלוש סטיות תקן.
  2. סווג תאים במצב pH 6 עם ערכי עוצמה מעל סף זה כSA-β-gal חיוביים.

תוצאות

צביעת SA-β-gal באור מוחזר של תאי SVF אנושיים יצרה דפוסים ברורים וניתנים לשחזור בשלושת התנאים המבוקרים על ידי pH. צביעת CD31 נכללה לזיהוי תאי אנדותל בתוך ה-SVF, מה שאפשר להבחין בין תאים אלו לבין אוכלוסיות אחרות. למרות שרק מספר קטן של תאים חיוביים ל-CD31 היו נוכחים, הסמן אישר את נוכחות תאי האנדותל והראה את תאימות השיטה לדגימות ראשוניות הטרוגניות.

תנאי pH 5 יצר אות חזק ברוב התאים, בהתאם לפעילות בטא גלקטוזידאז אנדוגנית גבוהה ב-pH חומצי (איור 1Aa–Ac). ב-pH 6, המצב המשמש להערכת פעילות SA-β-gal, עוצמת הצביעה ירדה לעומת pH 5, ורק תת-קבוצה של תאים הציגה אות מעל הרקע (איור 1Ba–Bc). שינוי זה הן בעוצמת האות והן בתדר תואם את התלות הצפויה ב-pH של הבדיקה ומאפשר זיהוי תאים עם פעילות SA-β-גלקטוזידאז שנשארה בתנאים תת-אופטימליים. תנאי pH 8 יצר אות אור מוחזר מינימלי, כאשר רוב התאים קרובים או ברמות הרקע (איור 1Ca–Cc). תנאי זה שימש להגדרת הסף לחיוביות SA-β-gal, כפי שמסומן על ידי הקו האדום המקווק באיור 1A c,Bc,Cc.

לניתוח כמותי, הסף לפעילות SA-β-gal הוגדר כממוצע עוצמת האור המוחזר של תנאי pH 8 בתוספת שלוש סטיות תקן. תאים במצב pH 6 עם ערכי עוצמה העולים על סף זה סווגו כחיוביים ל-SA-β-gal. גישה זו מספקת חיתוך אובייקטיבי, מבוסס נתונים, המתחשב באות רקע וממזער סיווג חיובי שגוי.

כדי להעריך רגישות גילוי ותאימות לאימונוציטוכימיה, הושוו הדמיית אור מוחזר ושדה בהיר בכל תנאי ה-pH. ב-pH 5 (איור 2Aa–Ad), האור המוחזר חשף משקעים חזקים מסוג X-gal, בעוד ששדה בהיר זיהה רק את המשקעים הבולטים ביותר. ב-pH 6 (איור 2Ba–Bd), אור מוחזר זיהה תאים חיוביים SA-β-gal שלא היו ניתנים לזיהוי אמין על ידי שדה בהיר, כאשר האות נראה חלש או מפוזר. ב-pH 8 (איור 2Ca–Cd), אור מוחזר זיהה אות מינימלי, בהתאם לפעילות אנזימטית נמוכה, בעוד ששדה בהיר לא חשף משקעים ניתנים לזיהוי. תצפיות אלו מצביעות על כך שהדמיית אור מוחזר מספקת שיפור בזיהוי משקעי X-gal, במיוחד ברמות פעילות בינוניות ונמוכות.

בדיקת האור המוחזר SA-β-גלון בוצעה גם היא בלוח של 96 בארות (איור משלים 3). הגדרה זו גרמה לעלייה באות הרקע עקב השתקפות מהמשטח הפלסטי, מה שהפחית את הניגודיות בין תאים חיוביים לשליליים. פגמים במשטח, כמו שריטות, הגבירו עוד יותר את ההחזרה ברקע (איור משלים 3, חצים שחורים). כתוצאה מכך, ניתוח כמותי היה פחות אמין בהשוואה להדמיה על כיסויי זכוכית. אם נדרש פורמט לוחית, מומלץ לוחות עם תחתית זכוכית לזיהוי אותות מיטבי.

יחד, תוצאות אלו מראות הפרדה ברורה בין תנאי pH 5 החיובי בחוזקה, האות הביניים ב-pH 6, והרקע המינימלי ב-pH 8. תבנית זו תואמת את ההתנהגות הצפויה של הבדיקה ותומך בשימוש בהדמיית אור מוחזר לזיהוי פעילות SA-β-gal באוכלוסיות תאים ראשוניות הטרוגניות.

figure-results-1
איור 1: זיהוי אור מוחזר תלוי pH ב-SA-β-gal בתאי SVF.
WGA (Aa, Ba, Ca) ודימות אור מוחזר (Ab, Bb, Cb) מזהים משקעים מסוג X-gal בתנאי pH 5, 6 ו-8. האות חזק ביותר ב-pH 5, מופחת ב-pH 6, ומינימלי ב-pH 8. כימות עוצמת האור המוחזר (Ac, Bc, Cc) מראה את התפלגות פעילות ה-β-גלקטוזידאז תחת כל תנאי. כל נקודה מייצגת תא יחיד, והקו האדום המקוקו מציין את הסף המשמש לסיווג תאי SA-β-gal-חיוביים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: השוואה בין זיהוי אור מוחזר לשדה בהיר SA-β-gal בתאי SVF. תמונות מוגדלת של תאי SVF עם צביעת X-gal ב-pH 5, 6 ו-8 מראות צביעת WGA (Aa, Ba, Ca), צביעת CD31 (Ab, Bb, Cb) לזיהוי תאי אנדותל, הדמיית אור מוחזר (Ac, Bc, Cc) לזיהוי משקעים של X-gal, ותמונות שדה בהיר תואמות (Ad, Bd, Cd). התמונה של אור מוחזר מזהה משקעים מסוג X-gal בתנאים, בעוד ש-brightfield בעיקר חושף משקעים בעוצמה גבוהה ומספק זיהוי מוגבל ברמות אות נמוכות. צביעת CD31 נצפית הן בתנאי pH 5 והן ב-pH 6, מה שמאפשר זיהוי תאי אנדותל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: סקירה של צינור CellProfiler. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: זרימת עבודה לסגמנטציה של גרעינים ותאים. תמונות מייצגות של (א) גרעינים מוצבעים-הוכסט ו-(B) סגמנטציה תואמת של גרעינים. (ג) סגמנטציה של תאים בהתבסס על צביעת הממברנה. (ד) שכבת גרעינים וגבולות תאים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3: הדמיית אור מוחזר SA-β-גלון בפלטת פלסטיק תחתית עם 96 בארות. (א) צביעת WGA ו-(ב) הדמיית אור מוחזר של תאי SVF צבועים ב-X-gal בלוח סטנדרטי עם תחתית פלסטיק עם 96 בארות. אות רקע מוגבר נצמד בהשוואה להדמיה על זכוכית, בהתאם להחזרת אור מהמשטח הפלסטי, מה שמפחית את הניגודיות לזיהוי SA-β-gal. שריטות על פני השטח (חצים שחורים) מגבירות עוד יותר את אות הרקע (B). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

β-גלקטוזידאז הקשור להזדקנות הוא אחד הסמנים הנפוצים ביותר לזיהוי תאי זקנה; עם זאת, שיטות גילוי שדות בהירות מסורתיות מוגבלות בשל רגישות נמוכה ורמת סובייקטיביות גבוהה. הדמיית אור מוחזר של תאי SVF צבועים ב-X-gal מספקת גישה רגישה וניתנת לשחזור יותר למדידת פעילות SA-β-gal ברמת התא היחיד, תוך שמירה על התאמה לצביעת נוגדנים פלואורסצנטיים. על ידי אופטימיזציה של שיטה זו ל-SVF, ניתן לזהות פעילות SA-β-gal לצד סמנים ספציפיים לתאים כמו CD31, מה שמאפשר ניתוח אוכלוסיות תאים ראשוניות הטרוגניות ללא צורך במיון תאים.

מספר פרמטרים טכניים הם קריטיים ליישום אמין. כיול מדויק של pH של תמיסת צביעת X-gal הוא חיוני, שכן סטיות קטנות יכולות לשנות פעילות אנזימטית ולהשפיע על זיהוי אותות. מד ה-pH צריך להיות מכויל מיד לפני השימוש עם מדחפים סטנדרטיים (למשל, pH 4.0 ו-pH 7.0), ויש לאמת את ה-pH של תמיסת הצביעה לאחר ההכנה. בנוסף, רכישת ערימת Z חייבת ללכוד את נפח התא המלא, שכן כיסוי לא מלא מוביל להערכת חסר של עוצמת האור המוחזר. פרמטרי הדמיה, כולל עוצמת הלייזר ורווח הגלאי, צריכים להיות מותאמים כדי למקסם את האות ללא רוויה ולשמור על עקביות בין הדגימות.

בהשוואה לבדיקות הזדקנות חלופיות, הדמיית אור מוחזר מציעה מספר יתרונות. זיהוי SA-β-gal של Brightfield מתבסס על זיהוי חזותי של משקעים ולכן רגישותו מוגבלת ואינו תואם בקלות לניתוח מרוב-פלט. לעומת זאת, הדמיית אור מוחזר מזהה את הצפיפות האופטית של משקע X-gal תוך שמירה על ההגדרה האנזימטית התלויה ב-pH של SA-β-gal. דבר זה מאפשר זיהוי סימולטני של פעילות SA-β-gal לצד סמנים מבוססי פלואורסצנציה, ומאפשר להעריך הזדקנות באמצעות מספר תכונות בתוך תאים בודדים.

למרות היתרונות הללו, לשיטה יש מגבלות. התמונה של אור מוחזר מזהה את הצפיפות האופטית של משקע X-gal אך אינה יכולה להבחין באופן חד-משמעי בין אות זה למבנים תוך-תאיים צפופים אחרים, מה שהופך תנאים מבוקרי pH לחיוניים. תנאי pH 8 מספק קו בסיס לאור מוחזר ברקע ותומך בהבחנה בין אותות ספציפיים לא-ספציפיים. הגישה דורשת גם מיקרוסקופ קונפוקלי עם יכולות זיהוי אור מוחזר מתאימות, שאינן זמינות בכל המערכות. בנוסף, תכונות משטח ההדמיה יכולות להשפיע על איכות האות: לוחות תחתית מפלסטיק מגדילים את הרקע עקב ההחזרה ומפחיתים ניגודיות, בעוד שמשטחי זכוכית מספקים זיהוי אמין יותר.

שיטה זו מתבססת על עבודתם של דדיק ואחרים, שהקימו דימות אור מוחזר לזיהוי SA-β-gal בשומנים בוגרים, ומרחיבה את הגישה לטווח רחב יותר של סוגי תאים26. יישום על SVF מבודד זה עתה מראה כי זיהוי אור מוחזר של משקע X-gal תואם לאוכלוסיות תאים ראשוניות אנושיות מגוונות. היכולת לשלב גילוי SA-β-gal עם סימני שושלת כמו CD31 מאפשרת ניתוח של תת-אוכלוסיות מוגדרות בתוך רקמות הטרוגניות.

למרות שצפויה שונות בין תורמים בדגימות אנושיות ראשוניות, מטרת המחקר היא לקבוע את היישום הטכני של השיטה ולא לאפיין שונות ביולוגית. יישומים עתידיים במספר דגימות ביולוגיות או תנאים ניסיוניים צריכים לכלול ניתוחים סטטיסטיים מתאימים. בנוסף, אימות במודלים מבוססים של השראה להזדקנות ואינטגרציה עם סמני הזדקנות אורתוגונליים ישפרו עוד יותר את פרשנות פעילות SA-β-gal באוכלוסיות תאים מורכבות.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים לליב איידסמו וקירה מליקן על הגישה לביופסיות רקמות אנושיות, וללנה אפלסבד על הסיוע בעיבוד הדגימות. מחקר זה נתמך על ידי מענקים ל-KLS מהמועצה השוודית למחקר (2022-01236), תוכנית המחקר האסטרטגית לסוכרת במכון קרולינסקה (C5471162), קרן נובו נורדיסק (C5475033), פרס המלגה של קרן ואלה (C5471234), מענק Aspire של קרן מארק (C5477023), האגודה השוודית לסרטן (22,2420), תוכנית המחקר האסטרטגית לתאי גזע והתחדשות במכון קרולינסקה (C5472022) וקרן קנוט ואליס וולנברג (2020.0118; 2023.0536).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 mL tubesBioSphere72.706.200Biosphere safeseal tube 1.5 mL, 250 PC
5 mL tubesEppendorf30119401Eppendorf tubes 5.0 mL microtube
96-well plateCorning4680Corning 96-well high content ccreening microplates with film bottom
CD31 primary antibodyAbcamAb9498Anti-CD31 antibody clone JC/70A
Confocal microscope with reflected light capabilitiesEvidentFV-4000
CoverslipsEprediaBB02400500A113MNZOCoverslips 24 mm x 50 mm, #1.5 thickness (0.13-0.16 mm) 
DPBSGibco14190-136DPBS, no calcium, no magnesium
Fixation bufferSigma Aldrich1.00496.5000Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 
HClSigma-Aldrich320331-500mLHydrochloric acid (37%)
IncubatorStuartS130HHybridization oven/shaker
Microscopy slidesAvantor VWR631-1560Single-frosted slides, coloured ends
Mounting mediaInvitrogenP36984ProLong glass antifade mountant excitation/emission max 361/497 nm
Mouse IgG1 isotype controlR&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500GSodium hydroxide ≥ 98%
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pH meterMeterLabR21M002 PHM210 standard pH meter 
Pipette tips (1000 µL)Biosphere70.1186.2101250µL filtered pipette tips
Pipette tips (200 µL)Corning4823200µL filtered pipette tips
SABG KitCell signaling9860SSenescence beta-galactosidase staining kit
Secondary antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA31570Donkey anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed excitation/emission max
553/568 nm
Tween-20Fisher Scientific10419000Pure, Fisher chemical
Water bathRowe ScientificSWB20DStandard water bath
WGAInvitrogenW11261Wheat Germ Agglutinin (WGA) Alexa Fluor 488 conjugate: Excitation/emission max 495/519 nm

מקורות

  1. Wang, E. Senescent human fibroblasts resist programmed cell death, and failure to suppress bcl2 is involved. Cancer Res. 55 (10), 2284-2292 (1995).
  2. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nat Commun. 7 (1), 11190(2016).
  3. Jun, J. -I., Lau, L. F. The matricellular protein CCN1 induces fibroblast senescence and restricts fibrosis in cutaneous wound healing. Nat Cell Biol. 12 (7), 676-685 (2010).
  4. Krizhanovsky, V., et al. Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis. Cell. 134 (4), 657-667 (2008).
  5. Storer, M., et al. Senescence is a developmental mechanism that contributes to embryonic growth and patterning. Cell. 155 (5), 1119-1130 (2013).
  6. Muñoz-Espín, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
  7. Eggert, T., et al. Distinct functions of senescence-associated immune responses in liver tumor surveillance and tumor progression. Cancer Cell. 30 (4), 533-547 (2016).
  8. Feldser, D. M., Greider, C. W. Short telomeres limit tumor progression in vivo by inducing senescence. Cancer Cell. 11 (5), 461-469 (2007).
  9. Xue, W., et al. Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas. Nature. 445 (7128), 656-660 (2007).
  10. Acosta, J. C., et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nat Cell Biol. 15 (8), 978-990 (2013).
  11. Coppé, J. -P., Desprez, P. -Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol Mech Dis. 5 (1), 99-118 (2010).
  12. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. eLife. 4 (1), e12997(2015).
  13. Xu, M., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med. 24 (8), 1246-1256 (2018).
  14. Li, F., et al. FBP1 loss disrupts liver metabolism and promotes tumorigenesis through a hepatic stellate cell senescence secretome. Nat Cell Biol. 22 (6), 728-739 (2020).
  15. Yoshimoto, S., et al. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome. Nature. 499 (7456), 97-101 (2013).
  16. Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. J Hepatol. 58 (3), 549-556 (2013).
  17. Baboota, R. K., et al. BMP4 and Gremlin 1 regulate hepatic cell senescence during clinical progression of NAFLD/NASH. Nat Metab. 4 (8), 1007-1021 (2022).
  18. Chen, Y. -W., Harris, R. A., Hatahet, Z., Chou, K. Ablation of XP-V gene causes adipose tissue senescence and metabolic abnormalities. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), E4556-E4564 (2015).
  19. Gustafson, B., Nerstedt, A., Spinelli, R., Beguinot, F., Smith, U. Type 2 diabetes, independent of obesity and age, is characterized by senescent and dysfunctional mature human adipose cells. Diabetes. 71 (11), 2372-2383 (2022).
  20. Li, Q., et al. Obesity and hyperinsulinemia drive adipocytes to activate a cell cycle program and senesce. Nat Med. 27 (11), 1941-1953 (2021).
  21. Minamino, T., et al. A crucial role for adipose tissue p53 in the regulation of insulin resistance. Nat Med. 15 (9), 1082-1087 (2009).
  22. Shi, D., et al. Photoactivatable senolysis with single-cell resolution delays aging. Nat Aging. 3 (3), 297-312 (2023).
  23. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  24. Horwitz, J. P., et al. Substrates for cytochemical demonstration of enzyme activity:I. some substituted 3-indolyl-β-D-glycopyranosides1a. J Med Chem. 7 (5), 574-575 (1964).
  25. Lv, X., et al. Molecular engineering development of β-galactosidase-activatable fluorogenic probes for precise senescence tracking in cells, tissues and a mouse model of psoriasis. Sens Actuators B Chem. 444 (1), 138406(2025).
  26. Dedic, B., et al. Senescence detection using reflected light. Aging Cell. 23 (1), e14295(2024).
  27. Alcorta, D. A., et al. Involvement of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 (INK4a) in replicative senescence of normal human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13742-13747 (1996).
  28. Hara, E., et al. Regulation of p16CDKN2 expression and its implications for cell immortalization and senescence. Mol Cell Biol. 16 (3), 859-867 (1996).
  29. Lin, A. W., et al. Premature senescence involving p53 and p16 is activated in response to constitutive MEK/MAPK mitogenic signaling. Genes Dev. 12 (19), 3008-3019 (1998).
  30. Okamoto, A., et al. Mutations and altered expression of p16INK4 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (23), 11045-11049 (1994).
  31. Serrano, M., Hannon, G. J., Beach, D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature. 366 (6456), 704-707 (1993).
  32. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  33. Wong, H., Riabowol, K. Differential CDK-inhibitor gene expression in aging human diploid fibroblasts. Exp Gerontol. 31 (3), 311-325 (1996).
  34. Gustafson, B., Nerstedt, A., Smith, U. Reduced subcutaneous adipogenesis in human hypertrophic obesity is linked to senescent precursor cells. Nat Commun. 10 (1), 2757(2019).
  35. Barinda, A. J., et al. Endothelial progeria induces adipose tissue senescence and impairs insulin sensitivity through senescence associated secretory phenotype. Nat Commun. 11 (1), 481(2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הזדקנות תאיתרקמת שומןפעילות SA-Beta-Galמיקרוסקופיה באור מוחזרמיקרוסקופיה קונפוקליתאנליזה של תא בודדאימונוציטוכימיהסמני שושלת
זיהוי הזדקנות באמצעות אור מוחזר בחלק הווסקולרי סטרומלי שומני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.