הרכבה ושימוש במערכת גנוטוביוטית של צמחים למחקרי אינטראקציה בין צמחים למיקרואורגניזמים בדגנים

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והשימוש במערכת גידול גנוטוביוטית חדשה לצמחים, שנועדה להכיל דגנים ומאומתת בחיטה ותירס. מערכת גנוטוביוטית זו מאפשרת ניסויים מבוקרים בין צמחים למיקרואורגניזמים על ידי מתן תנאי גדילה סטריליים, ניהול השקיה ותאימות למצעי קרקע מגוונים.

תקציר

פיתוח תיקונים חקלאיים מבוססי מיקרוביאלים הפועלים בעקביות בשטח דורש הבנה של המנגנונים המולקולריים של אינטראקציות בין צמחים למיקרובים. חקר מנגנוני האינטראקציה הבסיסיים הללו דורש יכולת לגדל צמחים בתנאים מבוקרים סביבתית וגנוטוביוטיים (כלומר, כל המיקרואורגניזמים האינטראקטיביים עם הצמח ידועים, בין אם מדובר בקהילות מיקרוביאליות מוגדרות ללא חיידקים, או קהילות טבעיות). מערכות הגנוטוביוטיות הקיימות כיום אינן מתאימות לחקר צמחים גדולים בעלי חשיבות חקלאית, כגון דגנים. יתרה מזאת, רוב המערכות הללו אינן מסוגלות לנהל השקיה. כאן אנו מציגים את GNOVA, מערכת גנוטוביוטית חדשה שנועדה לאפשר צמחי דגנים עם יכולת לנהל השקיה. המערכת החדשה הזו היא פלטפורמה נגישה המורכבת מבסיס מודפס תלת-ממדי וחומרים זמינים מסחרית. פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב להרכבת המערכת והקמת הניסוי. בנוסף, אנו מציגים השוואת ביצועים בין GNOVA למערכת שקיות גנוטוביוטית. GNOVA האריכה את צמיחת הצמחים משבועיים במערכת השקיות ל-17 שבועות לחיטה ו-4 שבועות לתירס. קצב הנביטה של שני הגידולים עלה גם הוא בתוך GNOVA מ-66% ל-100% לחיטה ומ-75% ל-100% לתירס. חיטה שגודלה בתוך GNOVA פיתחה טילרים, שלא היו קיימים בצמחים בגיל דומה במערכת השקיות. משקל התירס הטרי שגודל ב-GNOVA היה גבוה ב-594% מאשר במערכת השקיות. בנוסף, גובה הנצרים ואורך השורשים של התירס היו גבוהים ב-89% ו-57% במערכת GNOVA מאשר בשקיות, בהתאמה. מערכת GNOVA מרחיבה את ארגז הכלים הזמין למדענים לחקר אינטראקציות בין צמחים למיקרוביוטה מעבר לשלב הנביעים בדגנים, על ידי מתן שטח גדילה מוגבר וניהול השקיה.

מבוא

טיפולים חקלאיים מבוססי מיקרובים זכו לעניין רב בעשורים האחרונים בשל הפוטנציאל שלהם לשפר את פריון הגידולים על ידי שיפור צמיחת הצמחים ועמידותם ללחצים סביבתיים. במקביל, מנגנוני הפעולה המולקולריים של הביוסטימולנטים הללו עדיין אינם מובנים היטב, מה שעשוי לתרום לתוצאותיהם הלא עקביות בקרקעות, במיקומים ובתנאים סביבתיים ^1,2. קידום שיפור היעילות של טיפולים קיימים מבוססי מיקרובים ופיתוח טכנולוגיות חדשות דורש הבנה מעמיקה יותר של המנגנונים המולקולריים של אינטראקציה בין צמחים למיקרואורגניזמים ^3,4. עם זאת, ניתוח מנגנונים אלו נותר מאתגר בשל המורכבות של קהילות מיקרוביאליות טבעיות ^5,6. כדי לזהות את האפקטורים והאינטראקציות המיקרוביאליות שמניעים את תועלות הצמח, ניתן להפחית את המורכבות של מערכות טבעיות על ידי שימוש בקהילות מיקרוביאליות סינתטיות (SynComs) בתוך מערכות גידול שמאפשרות שליטה בתנאי הסביבה ובקהילה המיקרוביאלית. גנוטוביולוגיה, מחקר על מארחים הקשורים לקהילות מיקרוביאליות מוגדרות⁷, מאפשר לחוקרים להשוות מארחים נטולי חיידקים לאלו שהתיישבו בקהילות מיקרוביאליות ידועות, במטרה לקשר את תפקוד המיקרוביאלי לפנוטיפ^{הצמח 8}.

מערכות גנוטוביוטיות מוקדמות נבנו באמצעות מבחנות זכוכית 9,10,11,12 וצנצנות¹³. מאז, ראינו התרחבות מהירה של מערכות חדשות שפותחו לחקר צמחים בגנוטוביוטית. המערכות הנפוצות ביותר כיום כוללות את השימוש בצלחות פטרי¹⁴, מבחנות^15,16, צנצנות זכוכית¹⁷, קופסאות מג'נטה¹⁸, שקיות אטומות¹⁹, הידרופוניקה²⁰, FlowPot ו-GnotoPot²¹, מערכות מיקרופלואידיקה²², ו-EcoFABs²³. למרות ההתקדמות הזו, רוב המערכות מותאמות או להדמיה²² או לאיסוף הפרשים ^17,20 או מיועדות למינים קטנים^{של דגם 14,18,21}. רבות מהן הן מערכות סגורות שמגבילות את בקרת ההשקיה ואת משך הניסוי. מגבלות אלו מציבות אתגרים לחקר גידולים חקלאיים גדולים יותר, כגון דגנים, שדורשים שטח נוסף, זרימת אוויר וניהול מים נוספים.

בהבנה של הצורך במערכת שיכולה להכיל צמחים גדולים יותר ולמחקרים ארוכים יותר, פותח לאחרונה EcoFAB 3.0 להרחבת גידול גנוטוביוטי לצמחים גדולים^יותר. ה-EcoFAB 3.0 מציע נפח שורש ומרחב ראש גדול יותר, התומך בצמיחת הסורגום הביקולור עד 4 שבועות, ומאפשר איסוף הפרשות והדמיית שורש²⁴ שבועות. למרות שמערכת חדשה זו היא דוגמה מבטיחה להרחבת מערכות גנוטוביוטיות לגידולים חקלאיים, עדיין יש צורך בפלטפורמה נגישה ורב-שימושית שניתן לאמץ בקלות במעבדות ותואמת למגוון רחב של תהליכי עבודה ניסיוניים. מסיבה זו, פיתחנו את GNOVA (מערכת GNotobiotic ליישומים צמחיים ורסטיליים), מערכת שנועדה להכיל גידולי דגנים בתנאים גנוטוביוטיים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט להרכבה והפעלה של GNOVA ומדגימים את ביצועיו ביחס למערכת שקיות גנוטוביוטית המשמשת באופן שגרתי במעבדתנו. עם פיתוח המערכת החדשה הזו, שיפרנו את היכולת לגדל חיטה ותירס בתנאים סטריליים על ידי מתן שטח גידול גדול יותר והשקיה מובנית בהשוואה למערכות סגורות קודמות. הביצועים של GNOVA דומים לאלו של EcoFAB 3.0, ובכך מרחיב את מגוון הכלים לניתוח אינטראקציות בין צמחים למיקרוביום בגידולי דגנים שאינם מודלים. יתרה מזאת, הרב-גוניות וההסתגלות של גנוטוביוטיקה צמחית משתפרת בזכות העיצוב הפשוט של GNOVA, השימוש בחומרים מסחריים זמינים וקבצי אובייקטים תלת-ממדיים זמינים, המאפשרים לחוקרים לשנות חומרים ועיצוב בהתאם לצרכי המחקר והתקציב שלהם.

פרוטוקול

הערה: קבצי הדפסה תלת-ממדיים לבסיס נמצאים בחומרים המשלימים וזמינים לציבור ב-Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc). לצורך מהירות ויעילות כלכלית, אנו ממליצים להדפיס בכמויות גדולות אצל ספקי שירותי הדפסת תלת-ממד מסחריים מקומיים.

1. הרכבת מערכת הגנוטוביוטית

1. התחל בהרכבת הפוט (בצע פעם אחת לפני שימוש ניסיוני חוזר).
   1. סגור את תחתית הפוט על ידי הנחת עיגול רשת הנירוסטה מעל קצה אחד של צינור הפוליקרבונט וקיבוע המעגל באמצעות מהדק הצינור (איור 1A).
   2. קדחו פתחי השקיה על ידי יצירת פתח השקיה בגודל 1/4 אינץ' (6.35 מ"מ) במרחק של 1.5 ס"מ מהקצה העליון של קצה צינור הפוליקרבונט. קדחו שני חריצים בקוטר 1/8 אינץ' (3.18 מ"מ) במרחק 3 ס"מ מהפתח הראשון, כאשר חריץ אחד במרחק 1 ס"מ מהקצה והשני 2 ס"מ מהחריץ העליון.
      הערה: במידת הצורך, ניתן להוסיף קווי צינורות נוספים סביב הקצה העליון של העציץ בהתאם לאותם שלבים.
   3. התקן את צינור ההשקיה על ידי הכנסת קטע קצר של צינור סיליקון דרך הפתח של 1/4 אינץ'.
   4. אבטח את הצינור על ידי הברגה בין שני החריצים בגודל 1/8 אינץ' (איור 1B). הכנס את הלואר הזכרי של התאמת 1 לתוך צינור הסיליקון היוצא מחוץ לעציץ (איור 1C).
      הערה: סיכת הצינור בחיבור 1 צריכה להיות חשופה.
   5. הכינו חביות מזרק על ידי מילוי חבית מזרק ריקה בצמר זכוכית וסגירת הקצה בחתיכת נייר אלומיניום קטנה (איור 1C).
   6. חבר חתיכת צינור סיליקון קצרה לקצה נעילת הלואר בקנה המזרק (איור 1C).
   7. הכן שני חביות מזרקים זהות. חבר אחד מקני המזרקים המוכנים לסיבוב הצינור החשוף של חיבור 1 על הצינור היוצא מהפוט (איור 1D).
   8. הפסקה: ניתן לאחסן סירים מורכבים לשימוש ניסיוני מאוחר יותר.

איור 1: הרכבת הסיר. א) תחתית הפוט נסגרה עם רשת תיל וקליפס צינור. (ב) פתח השקיה בקצה העליון של העציץ. (ג) חוט ההשקיה מסתיים בקוזה צינור חשופה מחיבור 1 עם קנה מזרק מוכן. (ד) עציץ מורכב עם קו השקיה סגור אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של האיור.

2. הכנת עציץ לניסוי (לבצע לפני כל ניסוי חדש)
   1. רפד את תחתית הסיר בשני עיגולים חתוכים מראש עם עטיפת צינורות פיברגלס (איור 2A).
   2. הכינו את מצע הקרקע על ידי ערבוב שני חלקים של חימר עם חלק אחד של חול. הוסיפו 840 מ"ל של מצע לעציץ.
   3. כסו את הסירים בכיסוי פלסטיק ואבטחו עם סרט דבק (איור 2B).
   4. אוטוקלאב ממלא סירים במחזור יבש בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אפשר להתקרר ללילה עם פקקי פלסטיק על העציצים. אוטוקלאב מחדש במחזור יבש בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. תן לעצמי להתקרר לגמרי. שמור על הסירים מכוסים במכסה פלסטיק.
      הערה: ניתן להשתמש במצעי קרקע אחרים, אך יש למקסם מראש את הכמות הנדרשת לכל עציץ. GNOVA נבדקה גם עם 800 מ"ל של 100% חימר ו-1 ליטר של 100% חול. מצעי קרקע אחרים עשויים לדרוש יותר מחזורי אוטוקלאב או סביבות שונות לעיקור מלא.
      זהירות: יש להיזהר בעת הסרת סירים מהאוטוקלאב, שכן החומר יהיה חם וקליפסי הצינור עלולים להתרופף. ודא שהקליפסים של הצינור צמודים עד האצבעות לאחר הקירור לפני שאתה אוסף את הפוטים.
   5. הכנס פוטים מקוררים לבסיס המודפס בתלת-ממד. הנח את העציץ המלא באדמה בתוך הבסיס המודפס בתלת-ממד. החזק את הסיר בבסיס, לא בעמודים הפותחים, כי הם החלק השברירי ביותר.
   6. העבר את צינור ההשקיה דרך אחד הפתחים התחתונים של בסיס המודפס בתלת-ממד (איור 2C).
      הערה: אל תבצע אוטוקלב לבסיס התמיכה המודפס בתלת-ממד, כי זה עלול להמיס את החלק. ניסויים הדורשים טמפרטורות מעל 60 מעלות צלזיוס עשויים להזדקק לפילמנט עמיד לחום חלופי (ראו טבלת חומרים).
   7. שמרו את הסירים בטמפרטורת החדר לאחר האוטוקלב, ואל תסירו את המכסה הפלסטי או את המזרק המוכן עד לסידור הניסוי הסופי.

איור 2: איור של סיר מוכן. (א) תחתית הסיר מרופדת בניילון פיברגלס. (ב) החלק העליון של הסיר סגור עם מכסה פלסטיק. (ג) כלי ריק מותקן בתוך עיצוב הבסיס המודפס התלת-ממדי הסופי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. הכנת גליל זכוכית (מבוצעת לפני כל ניסוי חדש)
   1. כסו קצה אחד של גליל הזכוכית במסנן DW4 חתוך מראש ואבטחו אותו באמצעות סרט ויניל (איור 3A).
   2. סובב את גליל הזכוכית כך שיפנה לקצה הפתוח השני וחבר טבעת כותנה בתוך הצינור במרחק 14 ס"מ מהקצה. אבטח את טבעת הכותנה באמצעות סרט נייר כירורגי (איור 3B).
   3. סגור את הקצה התחתון של הצילינדר עם עטיפת סטריליזציה באמצעות שני גומיות (איור 3B).
   4. אוטוקלב את גלילי הזכוכית המוכנים במחזור יבש בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני השימוש. לאחר האוטוקלב, אחסן את גלילי הזכוכית הסטריליים בטמפרטורת החדר עד הצורך מבלי להסיר את העטיפה.

איור 3: מכלול גליל זכוכית. (A) קצה העליון של גליל זכוכית סגור עם מדיית פילטר DW4 וסרט ויניל. (ב) קצה תחתון של גליל זכוכית מצויד בטבעת כותנה וסגור בניילון חיטוי וגומיות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. הכנת מסנני השקיה (מבוצעת לפני כל אירוע השקיה, למעט שלבים 1.4.4–1.4.6, שיש לבצע רק פעם אחת)
   1. הרכיבו את מחזיק המסנן על ידי מיקום ממברנת המסנן של PES (איור 4A.4) בין מחזיק המסנן (איור 4A.5) לדיסק המסנן (איור 4A.3).
   2. כוון את הצד החלק של ממברנת המסנן לכיוון הזרימה, תוך הבטחה שהוא פונה לחלק העליון של מחזיק המסנן (איור 4A.1).
   3. הנח את טבעת ה-O (איור 4A.2) בחלק העליון של מחזיק המסנן (איור 4A.1). חבר את החלק העליון של הפילטר למחזיק המסנן. רק להדק ביד.
   4. חבר מחברים. הכנס את הסליפ הזכר של חיבור 2 ליציאה העליונה של מחזיק המסנן.
   5. חבר חתיכת צינור סיליקון קצרה לקצה הקוץ של הצינור במסנן (איור 4B). הכנס את הלואר הזכרי של 1 בקצה קנה המזרק השני משלב 1.1.6 (איור 4B).
   6. חבר את המסנן לחיבור הצינור של קנה המזרק המוכן.
   7. אוטוקלב את המסננים המורכבים במחזור יבש בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הדק את המסננים לאחר שהם מתקררים ולפני השימוש.
      הערה: מומלץ להכין את כל המסננים הנדרשים ולבצע אוטוקלב בקופסת פוליפרופילן סגורה. לאחר האוטוקלב, ניתן לשמור על מסנני ההשקיה סטריליים בטמפרטורת החדר עד לשימוש, כל עוד המזרק המוכן לא מוסר ממנו.

איור 4: מכלול מחזיק המסנן. (A) חלק ממחזיק המסנן הפירוק: 1. חלק העליון של מחזיק המסנן, 2. טבעת O, 3. דיסק פילטר, 4. ממברנת פילטר, ו-5. מחזיק פילטר. (B) מחזיק מסנן מורכב עם קנה מזרק מוכן תואם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

2. הקמת ניסוי

1. יש להכין ולחטא תמיסות וחומרים לפחות יום אחד לפני הקמת הניסוי.
   1. הכינו 0.5X מדיום גידול צמחי Murashige ו-Skoog בהתאם להוראות היצרן. אוטוקלב מדיום על מחזור נוזלי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   2. אוטוקלב של מתקן הבקבוק המפורק במחזור יבש בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אוטוקלב של 1 ליטר מים דה-יוננים במחזור נוזלי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   3. צלחת פטרי מזכוכית עם אוטוקלאב, כוסות 500 מ"ל, מסננות תה ופינצטה במחזור יבש בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ביום מראש.
      הערה: אלא אם צוין אחרת, יש לבצע את השלבים הבאים במכסה זרימה למינרי בטכניקת אספטי.
2. לחטא זרעים על פני השטח.
   הערה: פרוטוקול עיקור זרעים על פני השטח תלוי במין הצמח שישמש. המערכת הגנוטוביוטית נבדקה הן עם חיטה והן תירס באמצעות פרוטוקולי עיקור הזרעים הבאים.
   זהירות: לבשו חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן בעת טיפול באקונומיקה ונתרן היפוכלוריט, שכן כימיקלים אלו עלולים להיות מגרים או מאכלים לעור ולעיניים. אתנול דליק; אל תשתמש בלהב קרוב ללהבה פתוחה.
   1. עיקור זרעי חיטה²⁵
      1. מלאו שתי כוסות ב-150 מ"ל של 95% v/v אתנול, בקבוק אחד ב-150 מ"ל של אקונומיקה ביתית לא מדוללת, ושתי כוסות ב-150 מ"ל מים.
      2. שים זרעי חיטה במסננת התה. ערבבו בעדינות את מסננת התה עם זרעים באחד הבקבוקים עם 95% v/v אתנול למשך דקה.
      3. העבר זרעים למסננת תה חדשה. ערבבו בעדינות מסננות תה עם זרעים באקונומיקה למשך 10 דקות.
      4. העבר זרעים למסננת תה חדשה. ערבבו בעדינות את מסננות התה עם זרעים בכוס השנייה עם 95% v/v אתנול.
      5. ערבב בעדינות מסננות תה עם זרעים במים סטריליים ללא יוניים למשך 30 שניות. ערבבו בעדינות את מסננות התה עם זרעים בכוס השנייה עם מים סטריליים ללא יוניים למשך 2 דקות. שים זרעים סטריליים בצלחת פטרי ריקה.
   2. עיקור זרעי תירס²⁶
      1. הנח זרעי תירס בצינור חרוטי של 50 מ"ל. מלאו את הצינור הקוני ב-70% V/V אתנול. הפוך בעדינות את הצינור הקוני למשך 3 דקות.
      2. פנק 70% אתנול וממלא את הצינור הקוני בזרעים ב-2% v/v נתרן היפוכלוריט. הפוך בעדינות את הצינור הקוני למשך 3 דקות.
      3. נקז 2% נתרן היפוכלוריט ושוטף זרעים במים סטריליים ללא יוניים. פנק מים ושוטף את הזרעים במים ארבע פעמים. שים זרעי תירס בצלחת פטרי סטרילית.
3. הוסיפו את החיסון המיקרוביאלי למדיום כשזה רלוונטי.
   הערה: לא הוחל אינוקולום מיקרוביאלי במהלך אופטימיזציה ובדיקות סטריליות של מערכת הגנוטוביוטית.
4. הרכיבו את מתקני הבקבוקים וחברו אותם לבקבוקי המדיה.
   הערה: מכיוון שמדובר במערכת פתוחה, אנו ממליצים שיהיה לך מיכל לאיסוף מדיה הזרימה. מצאנו שהשימוש במגש אפייה עובד טוב ומאפשר תנועה קלה, אך דורש ריקה תכופה.
5. הסר את מכסה הפלסטיק מהסיר ושפך 378 מ"ל מדיום לסיר.
   הערה: זה מתייחס לכ-70% משטחי נקבוביות מלאים במים (WFPS), שיש לכוונן בעת שימוש במצעי קרקע אחרים. השתמש ב-360 מ"ל לחימר ו-358 מ"ל לחול.
   1. זרעו את הזרע המעוקר לעומק המתאים באמצעות פינצטה סטרילית.
   2. זרעו חיטה בעומק של חצי אינץ' ותירס בעומק של אינץ' אחד. חלופה נוספת היא לזרוע שתילים סטריליים שנבטו מראש לתוך GNOVA. השתמשו בזרעים שנבטו מראש לבדיקות גידול תירס.
   3. החלף את המכסה הפלסטי מעל הסיר.

3. הרכבה סופית ותפעול ניסיוני

1. העבר את הסיר וצילינדר הזכוכית לתא גידול. החזק את גליל הזכוכית כשהתחתית פונה כלפי מטה, קרוב לסיר.
2. הסירו במהירות את הפקק הפלסטי מהסיר ואת עטיפת החיטוי מהצילינדר. הורידו את גליל הזכוכית למעלה, והניחו אותו על מדף הבסיס המודפס בתלת-ממד.
   הערה: להבה (למשל, מבער בונזן נייד) יכולה גם להיות מונחת ליד הסיר במהלך ההרכבה הסופית של מערכת הצמיחה כדי להפחית עוד יותר את הסיכון לזיהום.
   זהירות: ודא שכאשר עובדים עם להבה פתוחה, אין חומרים דליקים אחרים בסביבה. שים לב למיקום הלהבה ביחס לגוף שלך כדי למנוע פציעות כוויות.
3. גידול צמחים בין 4 ל-17 שבועות, בהתאם למין הצמח, בהתאם לתנאי גדילה ספציפיים למין.
4. גידול חיטה בטמפרטורות יום/לילה של 22°C/16°C ותירס ב-27°C/23°C. מחזור האור של שני הצמחים הוא 12 שעות רק תחת תאורה פלואורסצנטית.

4. השקיה

1. חבר צינור סיליקון ארוך למתקן מכסה הבקבוק.
2. שמרו על סטריליות במהלך ההשקיה באמצעות להבה ניידת. אם להבה ניידת אינה אופציה, בצע השקיה באמצעות אקונומיקה לשמירה על סטריליות.
3. השקיה באמצעות להבה ניידת.
   זהירות: עבדו בזהירות סביב להבה פתוחה כדי למנוע פגיעות גופניות ונזק למתקן.
   1. הניחו להבה ליד קו ההשקיה. הסר את קנה המזרק מקו ההשקיה וממחזיק הפילטר. שמור על כל קצות הצינור בתוך אזור הלהבה.
   2. חבר את מחזיק המסנן לקו ההשקיה. חבר את שני חביות המזרקים זה לזה. חבר את החלק הארוך השני של צינור הסיליקון במתקן העליון של הבקבוק ליציאה התחתונה של מחזיק המסנן.
   3. זרקו 150 מ"ל של מדיום 0.5X Murashige ו-Skoog. הפריד בין שני קני המזרקים.
   4. נתק את צינור הסיליקון ממחזיק המסנן והחלף אותו בקנה מזרק אחד.
4. השקיה באמצעות 10% אקונומיקה
   הערה: אנו ממליצים להשתמש באסטרטגיית השקיה זו בניסויים גדולים (n > 50) כדי להגדיל את קצב התפוקה במהלך ההשקיה.
   זהירות: לבשו חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן בעת טיפול באקונומיקה.
   1. שפכו תמיסת אקונומיקה של 10% V/V לשני כוסות פלסטיק קטנות והניחו אותן ליד קו ההשקיה. הסר את קנה המזרק מקו ההשקיה וממחזיק הפילטר.
   2. טבלו את כל קצות הצינור בתמיסת 10% אקונומיקה עד שצריך. נער את תמיסת האקונומיקה העודפת. חבר את מחזיק המסנן לקו ההשקיה של העציץ.
   3. חבר את החלק הארוך השני של צינור הסיליקון של מתקן הבקבוק העליון ליציאה התחתונה של מחזיק המסנן.
   4. זרקו 150 מ"ל של מדיום 0.5X Murashige ו-Skoog. נתק את צינור הסיליקון ממחזיק המסנן.
      הערה: נפח ההשקיה הוא 120 מ"ל לחול ו-360 מ"ל לחימר.
   5. החלף את המסנן בקו ההשקיה בחבית מזרק אחרי שניקרת עודף אקונומיקה.
      הערה: אם נפח ההשקיה משתנה, יש לקחת בחשבון כ-20 מ"ל מדיה כדי להכין את קו ההשקיה.
5. השקה עציצים פעם בשבוע. כוון את נפח ההשקיה ותדירות השקיה בהתאם למטרת הניסוי ולתת-הקרקע שבה השתמשו. אם משתמשים ב-100% חול, הגדילו את תדירות ההשקיה לפעמיים בשבוע.

5. קציר

הערה: פרוטוקול הקציר הזה נשמר במהלך הבדיקות והאופטימיזציה של מערכת הגנוטוביוטית. יש לשנות את פרוטוקול הקציר כדי להתאים למטרות מחקר ספציפיות ולנפח הדגימות המעובדות.

1. הכינו וסטריליזם את כל התמיסות והחומרים לפחות יום אחד לפני הקציר.
   1. אוטוקלב 4 ליטר מים דה-יוננים ו-500 מ"ל של 0.145 מ' NaCl, במחזור נוזלי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ביום מראש.
   2. מספריים ופינצטה עם אוטוקלאב במחזור יבש בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ביום מראש.
      הערה: אלא אם צוין אחרת, יש לבצע את השלבים הבאים במכסה זרימה למינרי בטכניקת אספטי. אם אין צורך בסטריליות לאיסוף דגימות, כל השלבים הללו יכולים להתבצע מחוץ למכסה זרימה למינרי.
2. העבר את מערכות הגנוטוביוטיקה מתא הגידול למעבדה ומקם אותן קרוב למכסה הזרימה הלמינרי.
3. הסר את גליל הזכוכית מהפוט והניח אותו במהירות במכסה הזרימה הלמינרי. תוציא את העציץ מהבסיס המודפס בתלת-ממד.
4. החזק את הצמח בבסיס ושפך את מצע הקרקע למיכל. נער בעדינות גושים גדולים של מצע אדמה מהשורשים.
   הערה: ניתן לאסוף ולעבד דגימות מצע הקרקע בהתאם למטרת המחקר הספציפית בשלב זה של הקציר. הפרוטוקול המתואר כאן בקצרה שימש לבדיקת עקר הקרקעות.
5. איסוף קרקע לחיידקים בקרקע^{- ספירת 27} באמצעות דילול סדרתי של פלטה אחת²⁸.
   1. מלאו את הבארות של לוח 96 בארות ב-270 מיקרוליטר של 0.145 M NaCl. השאירו את השורה הראשונה ריקה. הוסיפו 1 גרם מצע קרקע לצינור קוני של 15 מ"ל עם 9 מ"ל של 0.145 מ' NaCl.
   2. מערבולת במהירות מקסימלית למשך 5 דקות. העבר 30 מיקרוליטר מהדגימה לבאר ריקה של לוח 96 בארות.
   3. הכינו שבעה דילול סדרתי של כל דגימה על ידי פיפטינג של 30 מיקרוליטר מכל דגימה לבאר שמתחת, המכילה 270 מיקרוליטר תמיסת NaCl.
   4. ערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה בין כל העברה.
   5. הכינו זיהוי דילול סדרתי של צלחת יחידה לכל דגימה על ידי ציפוי של 10 מיקרוליטר מכל דילול סדרתי על פלטת R2A אחת.
   6. הטה את הצלחות כדי לפזר את הטיפות. דגמו צלחות בטמפרטורת החדר.
   7. ספירת יחידות יוצרות מושבות (CFU) ומחשבה CFU/g של הקרקע.
6. הפריד בין ניצנים לשורשים באמצעות מספריים סטריליים. שרטט משקל ירי טרי.
7. נקה את השורשים על ידי ניעורם בעדינות בכוס עם מים דה-יוניים. ייבוש את השורשים ורשום משקל חדש.
   הערה: ניתן לאסוף חומר מעל ומתחת לקרקע בשלב זה ולעבד אותו בהתאם למתודולוגיה המתאימה ביותר לניתוח במורד הזרם הרלוונטי.

תוצאות

פיתחנו GNOVA, מערכת גנוטוביוטית חדשה לצמחים, המאפשרת סביבה סטרילית ומבוקרת הנדרשת לבחינת אינטראקציות בין צמחים למיקרובים. המערכת החדשה מציעה 24.4 אינץ' (62 ס"מ) של שטח ניצנים אנכי ועציץ בנפח 1.3 ליטר התואם למספר מצעי קרקע. המערכת המורכבת במלואה היא בגובה של כ-3 רגל (92.4 ס"מ) וברוחב של 4.57 אינץ' (11.6 ס"מ) (איור 5A–C). בהשוואה למערכות אחרות, יש לו את הקיבולת האנכית הגבוהה ביותר לצמיחת ענף ואת תא השורש השני בגודלו (טבלה משלימה 1). GNOVA דורש רק 0.0135^מ"ר שטח פנים בתא הצמיחה, ולכן המערכת קומפקטית וניתנת לתמרון. מערכת זו יכולה לשמש בתאי גידול עם מרווח אנכי של 1.22 מטר. כל רכיבי המערכת הזו, למעט הבסיס המודפס בתלת-ממד, ניתנים לאוטוקלאב ותואמים לאוטוקלאבים במידות של 24 אינץ' × 24 אינץ' × 36 אינץ' (רוחב × אורך × גובה; 61 ס"מ × 61 ס"מ × 91 ס"מ). זה מייעל את ההתקנה הניסיונית על ידי עקיפת עיקור ידני של חלקים בודדים. בנוסף, רוב רכיבי המערכת ניתנים לשימוש חוזר, מה ששומר על עלות השימוש לכל ניסוי בכ-6 דולר לאחר עלות ההקמה הראשונית של 54 דולר ליחידה (טבלה משלימה 2). התנאים הסביבתיים בתוך GNOVA נקבעו על ידי מעקב אחר הטמפרטורה והלחות היחסית של המערכת עם צמח תירס בן שבוע למשך שלושה ימים. הטמפרטורה בתוך GNOVA הייתה, בממוצע, +1.3 מעלות צלזיוס גבוהה יותר מחדר הגידול (איור משלים 1). ההבדלים בטמפרטורות בתוך המערכת ובתוך החדר היו גדולים יותר במהלך מחזור האור (ממוצע +2.5 מעלות צלזיוס) מאשר במחזור החושך (ממוצע +0.4 מעלות צלזיוס). הלחות היחסית ב-GNOVA הייתה בממוצע 63%, לעומת 34% בחדר הצמיחה.

איור 5: הדמיות של מערכת GNOVA. (A) מודל תלת-ממדי של העיצוב הסופי של בסיס התמיכה (B) חתך רוחב של מודל תלת-ממדי של בסיס תמיכה (C) חתך של מודל תלת-ממדי של GNOVA מורכב במלואו אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי להבטיח סטריליות במערכת, ערכנו ניסוי של ארבעה שבועות של מערכות לא מושקות ומושקות ללא צמחים. הזיהום על גליל הזכוכית נקבע על ידי דגימה מעל ומתחת לטבעת הכותנה באמצעות ציפוי ישיר. לא נצפתה גידול מיקרוביאלי מעל שלוש מושבות (כלומר, מושבה אחת לשליש משטח הפנים שנדגם) מעל טבעת הכותנה עבור דגימות לא מושקות (n=4) ודגימות מושקות (n=6) (איור משלים 2A). מתחת לטבעת הכותנה, נצפה צמיחה בשכפול אחד שאינו מושקה, בעוד שלא זוהה גדילה במערכות מושקות (איור משלים 2B). דבר זה מרמז על פוטנציאל זיהום נמוך מגליל הזכוכית, שכן צמיחה מיקרוביאלית הייתה נוכחת רק בעותקים מוגבלים מתחת לטבעת הכותנה, שאינה במגע עם הצמח. זיהום הקרקע הוערך על ידי זיהוי דילול סדרתי על לוחות R2A (איור משלים 2C). לא זוהתה גידול מיקרוביאלי משמעותי באף אחד מהמצבים, למעט שכפול מושקה יחיד עם ספירת יחידות יוצרת מושבות שאינה ניתנת לעיבוד מדילול סדרתי (כלומר, < 30 מושבות). בנוסף לבדיקות הסטריליות, ביצענו השוואת ביצועים של חיטה ותירס שגודלו ב-GNOVA לפרוטוקול הגידול הגנוטוביוטי הסטנדרטי שלנו של שבועיים^במערכת שקית. כדי להבין את השפעת הגודל הקטן והיעדר ההשקיה על ביצועי הצמח, הארכנו את תקופות הגדילה בשקית כדי להתאים לאלו שב-GNOVA. למרות שתכולת מי הקרקע הראשונית ששימשה במהלך הקמת שתי המערכות הותאמה, GNOVA קיבלה דישון שבועי, בעוד שהשקיות לא. לכל ההשוואות, אנחנו משתמשים במערכת השקיות כהפניה, שכן זו הייתה ההגדרה הגנוטוביוטית הראשונית של המעבדה שלנו. גם החיטה וגם התירס הגיעו לנביטה של 100% בתוך GNOVA, בעוד שבמערכת השקית, החיטה השיגה רק 67% (n = 3) והתירס 75% (n = 8) (איור 6).

איור 6: נביטה של חיטה (n = 3) ותירס (n = 8) בתוך מערכת GNOVA (סגול) ומערכת שקיות (ירוק). תוצאת הנביטה של כל שכפול מיוצגת על ידי נקודות על ציר ה-y כ-No נביטה או כ-Germinated עבור כל מערכת גנוטוביוטית. פסים מייצגים את קצב הנביטה (%) של כל מין צמח בתוך מערכות שונות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

בוצעה גם בדיקת צמיחה לחיטה ותירס כדי לקבוע את תקופת הצמיחה המקסימלית והביצועי הצמח בתוך GNOVA. למרות שפרוטוקול השקיות הסטנדרטי שלנו דורש רק שבועיים של גדילה בשקיות, הארכנו את תקופת הגדילה בתוך השקיות מעבר לשבועיים כדי להשוות טוב יותר בין שתי המערכות. לאחר שבועיים, החיטה שגודלה בתוך GNOVA (n=3) כבר הגיעה לשלב הצמיחה של זדוק (GS) 13 (איור 7A), בעוד שבשקית נשארה ב-GS11. בשבוע החמישי, המפעלים הגיעו ל-GS21 בתוך מערכות GNOVA כפי שמעיד הופעת הטילרים (איור 7B). לעומת זאת, הטילריות נעדרו ממערכות השקית, והמפעלים נשארו ב-GS13. עיכוב הצמיחה והיעדר שינויים פנולוגיים במערכת השקיות הובילו להפסקת הצמחים במערכת זו בשבוע השישי. צמחי החיטה המשיכו לגדול עוד חמישה שבועות בתוך GNOVA, שם נצפתה עלייה במספר העלים ובביומסה (איור 7C). למרות שביומסה של החיטה עלתה חזותית לאחר 12 שבועות של צמיחה בתוך GNOVA, הצמחים גם החלו להראות עלים כלורוטיים יותר, ונפח גליל הזכוכית התמלא בביומסה של הצמחים (איור 7D). חיטה גודלה עוד שבועיים לאחר מכן (איור 7E,F). עם זאת, לא נרשמה עלייה חזותית בביומסה, ולכן מבחן הגדילה הופסק לאחר 17 שבועות של גדילה. גידול התירס הוערך גם בתוך GNOVA במשך ארבעה שבועות והושווה לתירס שגודל בשקיות (איור 8A,B). בניסוי זה, זרעי התירס עוברו עיקור ונבטה מראש לפני הזריעה בתוך מערכת GNOVA או מערכת השקיות. משקל הניצן הטרי ומשקל השורש של התירס היה שונה באופן משמעותי בין שתי המערכות (מבחן t דו-מדגמי, ערך p < 0.05, טבלה משלימה 3). תירס שגדל ב-GNOVA כלל ניצנים ושורשים טריים במשקל ממוצע של 11.2 גרם ו-5.7 גרם, בהתאמה (איור 8C,D). לעומת זאת, הניצנים והשורשים של התירס שגדלו בתוך השקית היו בעלי משקל טרי של 1.29 גרם ו-1.15 גרם, בהתאמה. בסך הכל, הביומסה הטרייה של תירס שגודלה ב-GNOVA עלתה ב-593% בהשוואה לתירס שגדל במערכת השקיות. יתרה מזאת, אורך הענף והשורש היה גדול משמעותית בתוך GNOVA מאשר בשקיות ב-89% ו-57%, בהתאמה (איור 8E,F).

איור 7: גידול חיטה בתוך אב-טיפוס GNOVA. (א) חיטה בשבועיים בשלב הצמיחה של זדוק (GS) 13. (ב) השוואה בין חיטה לאחר חמישה שבועות של צמיחה בשקית ו-GNOVA. הקופאים נמצאים בתוך GNOVA (GS21) ואינם נמצאים בשקית (GS13). (ג) עלייה בביומסה של החיטה לאחר 10 שבועות של גדילה. (ד) עלייה בביומסה של החיטה ב-13 שבועות של גדילה עם הופעת עלים כלורוטיים. (ה) הגדלה נוספת של ביומסה של חיטה ב-15 שבועות של גדילה. ו) ביומסה של חיטה תופסת את רוב נפח הגידול הזמין ב-17 שבועות של צמיחה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 8: גידול התירס בתוך אב-טיפוס GNOVA (סגול) בהשוואה למערכת השקיות (ירוק). פסים מציינים ערכים ממוצעים ± שגיאת תקן (n=4) (A) תירס שגודל במשך ארבעה שבועות במערכת GNOVA ובמערכת השקיות. (ב) השוואת גודל של צמחים שנקטפו שגודלו במערכת GNOVA ובשקיות. (ג) משקל ירי טרי (ממוצע±SE). (ד) משקל שורש טרי (ממוצע±מזרח). (ה) אורך ירי (ממוצע±מזרח). ו) אורך שורש (ממוצע±דרום-מזרח). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: דינמיקת זמן של לחות יחסית וטמפרטורה הנמדדת בתוך GNOVA (סגול) וחדר הצמיחה (כתום). הנתונים נרשמו במרווחי זמן של חמש דקות במשך שלושה ימים. הנתונים בתוך GNOVA נרשמו עם צמח תירס בן שבעה שבועות. אזורים מוצלים בכחול בהיר מתאימים לתקופות לילה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: גידול מיקרוביאלי הנובע מבדיקות סטריליות של ה-GNOVA ללא השקיה (בקרה) וללא השקיה ( בהשקיה). (א) דגימות גליל זכוכית מעל טבעת הכותנה. (ב) דגימות גליל זכוכית מתחת לטבעת הכותנה. (ג) ציפוי מדולל סדרתי של דגימות קרקע באמצעות לוח יחיד. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 1: השוואת תכונות של GNOVA לגנוטוביוטיקה צמחית קיימת אחרת (EcoFAB, קופסאות מג'נטה, שקיות, FlowPot, GnotoPot, ו-EcoFAB 3.0). מערכות מושוות לפי פרמטרים מרכזיים הרלוונטיים לתכנון ניסוי, כגון קיבולת גובה הצמח, נפח השורשים ובקרת השקיה. המידע נאסף מספרות שפורסמה ותיאורי מערכת זמינים; כאשר הנתונים לא דווחו במפורש, מצוינים הערכות. † הקירוב הטוב ביותר כאשר אינו מוגדר בספרות; ‡ אין צורך לפרק או להעביר את המערכת למכסה זרימה למינרי כדי לבצע את המשימה; * אפשרי עם שינויים במערכת; קטגוריות עלות מוגדרות כך: נמוך (< USD 30 ליחידה), בינוני (USD 30-100 ליחידה), גבוה (> USD 100 ליחידה). אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 2: רשימת החומרים (BOM) והעלויות המשוערות להרכבה והפעלה של יחידת GNOVA אחת. החומרים מסווגים כרכיבים רב-פעמיים או חד-פעמיים, עם עלות יחידה מתאימה, כמויות נדרשות למערכת, ועלות כוללת למערכת. רכיבים רב-פעמיים תורמים לעלות ההתקנה הראשונית, וחומרים חד-פעמיים מייצגים עלות צריכה לכל ניסוי. * מחושב ממחירים כמויות גדולות שסוכמו במשא ומתן עבור מחירים חסכוניים; ** הכמות הנדרשת משתנה בהתאם לאורך הניסוי, מצע הקרקע שבו השתמשו ומטרת המחקר. ערך לניסוי בן ארבעה שבועות עם לוח זמנים שבועי להשקיה באמצעות תערובת החימר והחול; † עלות משוערת של כמות החומר הנדרשת למערכת; ‡ אינו כולל את מחיר תמיסת החומרים התזונתיים או את מצע הקרקע, שכן זה משתנה בהתאם למטרה הניסויית. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 3: ערכי p שהתקבלו של מבחן t דו-דגמי לגידול תירס מדדו משתנים שגדלו בתוך GNOVA ומערכת השקיות. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

מערכת הגנוטוביוטיקה של הצמחים המוצגת כאן, GNOVA, מספקת כלי נגיש ורב-שימושי לחקר אינטראקציות בין צמחים למיקרואורגניזמים בגידולי דגנים. המאפיינים המרכזיים שלו כוללים קיבולת גדילה מוגברת והשקיה מובנית, שמרחיבה את צמיחת הדגנים מעבר לשלב הנביעים בתנאים סטריליים. הביצועים של מערכת זו דומים לאלו של EcoFAB 3.0 ומספקים מערכת גנוטוביוטית צמחית אלטרנטיבית נגישה. המערכת בנויה מרכיבים זמינים מסחרית שנבחרו לפי עלות, פשטות ותאימות לאוטוקלאבים בגודל בינוני, מה שמקל על אימוץ במעבדות. הרכבה ותפעול פשוטים ואינם דורשים ציוד מיוחד, וכך מפחיתים חסמים ליישום. ניתן להתאים את GNOVA למטרות מחקר שונות בזכות תאימותה למגוון רחב של מצעי קרקע, פרוטוקולי עיקור זרעים, חיקויים מיקרוביאליים (ללא חיידקים, SynCom או קהילה טבעית), וניתוחים מגוונים במורד הזרם.

זיהום מינימלי חיוני בניסויים גנוטוביוטיים צמחיים כדי להבטיח שההשפעות שנצפו יוחסו למיקרובים בעלי עניין ולא למזהמים. ההפעלה הפשוטה של GNOVA מפחיתה את הסיכון לזיהום. הקפדה קפדנית על טכניקת האספטיקה וההמלצות המרכזיות הבאות יבטיחו שמירה על הסטריליות. במהלך הקמת הניסוי, אנו ממליצים על חיטוי מכסה הזרימה הלמינרי בין החיסונים המיקרוביאליים כדי למזער זיהום צולב של הטיפולים. סדר יישום הטיפולים יכול גם להפחית זיהום צולב. יישום טיפולים ללא חיידקים לפני כל טיפול מיקרוביאלי חי הוא אידיאלי. מיקרובים זרים עשויים גם להיכנס דרך זרעים. לכן, יש לאופטם את פרוטוקולי עיקור הזרעים השטחיים לכל מין צמח או מקור זרע, כדי לאזן את העקרות לנביטה²⁶. פרוטוקולי עיקור לדגנים שאינם דגמים, כגון סורגום²⁴, שעורה²⁹, סוויץ'גראס ושיבולת שועל²³ , ניתנים ליישום בקלות ב-GNOVA. אם העיקור משפיע לרעה על הנביטה, ניתן להשתמש בזרעים שנבטו מראש במקום זאת. השקיה מהווה מקור עיקרי לזיהום במערכות גנוטוביוטיות. הנקודה הקריטית ביותר בתהליך זה היא חיבור המסננים לקווי ההשקיה. קצות הצינורות של קווי ההשקיה והמסננים חייבים להישאר סטריליים במהלך תהליך זה. עיקור בלהבה דורש מיומנות ויכול להיות דורש עבודה רבה, במיוחד בניסויים גדולים (n >50). לכן, שיטה חלופית מבוססת אקונומיקה מומלצת לניסויים גדולים או כאשר חיטוי להבה אינו מעשי. מומלץ גם לשמור על מסננים סטריליים נוספים ולספק אקונומיקה או אתנול במהלך ההשקיה במקרה של זיהום במהלך טיפול בחומרי המערכת. בנוסף, מומלץ בחום הכללת יחידות בקרה לזיהום (כלומר, ללא צמח, ללא טיפול במיקרובים וקבלת השקיה) כדי לנטר את הסטריליות ולזהות מזהמים.

כדי להתגבר על הסיכון לזיהום השקיה, מערכות הגנוטוביוטיות הצמחיות הראשונות נסגרו לחלוטין וחסרו יכולת השקיה, מה שהגביל את משך הניסויים. תירס גודל בגנוטוביוטית בשקיות^{19, 30}, צינורות זכוכית וצלחות פטרי¹⁵ בין שבועיים לארבעה שבועות. כדי למלא מים וחומרים מזינים במהלך צמיחת הצמח, מערכות חלופיות כמו EcoFAB²³, FlowPot ו-GnotoPot²¹ אפשרו השקיה על ידי פירוק חלקי בתוך מכסי זרימה למינריים. דבר זה הגביל את גודלם ואת ההתאמה שלהם לצמחים גדולים יותר. מכיוון שקווי ההשקיה נגישים בקלות מחוץ ל-GNOVA, אין צורך בפירוק, והמערכת אינה מוגבלת לגודל מכבדי הזרימה הלמינריים. זה לא רק מאפשר אספקה רציפה של חומרים מזינים ומים, אלא גם מגדיל את מרחב הגידול הזמין. הפחתת שטח הנצרים עלולה להפחית את קיבולת הפוטוסינתזה ולתרום לקינוח^, והגבלת נפח השורש עלולה להוביל להיקשרות שורשים ולהפחית את קליטת המים והחומרים המזינים³¹. השילוב של שטח גידול קטן והיעדר השקיה במערכת השקיות יכול להסביר את הירידה בביומסה ואת היעדר התקדמות פנולוגית של תירס וחיטה בהשוואה למערכת GNOVA. מערכת חדשה זו אפשרה צמיחה גנוטוביוטית של תירס למשך תקופה דומה לזו של הסורגום ב-EcoFAB 3.0²⁴. יתרה מזאת, הוא עולה על הצמיחה הגנוטוביוטית של החיטה במשך ארבעה שבועות במערכת הידרופונית (20) במערכת קרקע מייצגת יותר. בנוסף למגבלות הפיזיות, מערכות גנוטוביוטיות לעיתים קרובות מסתמכות על זרימת אוויר מוגבלת לשמירה על סטריליות. זרימת אוויר מוגבלת עלולה להוביל לעלייה בטמפרטורה ולחות, וכן לירידה בשיעורי החלפת גז, מה שעלול להשפיע על פיזיולוגיית הצמח³². דווח על שיפור במערכות עם זרימת אוויר משופרת, כגון קופסאות מג'נטה המצוידות במסנני HEPA³³ הפועלים בדומה למסנן DW4 המשמש ב-GNOVA. באופן דומה, EcoFAB 3.0 הציג עלייה בטמפרטורה ובלחות יחסית אך עדיין נחשב לפלטפורמה חזקה לצמיחת גנוטוביוטיקה של סורגום²⁴. דבר זה מרמז שלמרות שמגבלות פיזיות וסביבתיות קיימות במערכות הגנוטוביוטיות, ההתקדמות בעיצוב המערכות המוצגת כאן עדיין מספקת תנאים משופרים התומכים ביעילות רבה יותר בצמיחה הגנוטוביוטית של דגנים.

קלות השינוי היא תכונה מרכזית נוספת של GNOVA. המודולריות של העיצוב מאפשרת למשתמשים לבצע שינויים בחלקים בודדים כדי להתאים טוב יותר לצרכי המחקר והתקציב שלהם. מערכת זו תואמת לכל מצע קרקע, כולל קרקעות טבעיות. שינויים בנפח ההקמה, ריכוז תמיסת החומרים המזינים ונפח ותדירות ההשקיה צריכים להתבסס על התכונות הפיזיקליות-כימיות של הקרקע, שכן הם משפיעים ישירות על זמינות והפצת חומרים מזינים ומים³⁴. בצורת יכולה להיגרם על ידי ניטור משקל כל מערכת GNOVA וקביעת תכולת מי הקרקע בכבידה³⁵. הפרשות שורש יכולות להיאסף באופן הרסני על ידי דגירה של צמחים שנקטפו במים אולטרה-טהורים³⁶ או באמצעות שטיפת המערכת לקבלת נוזלים לא סטריליים³⁷. אם נדרשת הפרשות סטריליות, ניתן להתאים את הפוט של GNOVA ואת בסיס התמיכה המודפס בתלת-ממד כדי לשלב תכונת איסוף הפרשה מובנית בדומה לזו שבעיצוב EcoFAB 3.0²⁴. מדענים המעוניינים להבין את השפעות העדיפות³⁸ על הרכבת קהילות מיקרוביאליות יכולים להתקין קווי השקיה נוספים סביב העציץ. דבר זה מאפשר יישום נוסף של חינונים מיקרוביאליים תוך שמירה על סטריליות קו ההשקיה הראשי. ניתן היה לנטר את תנאי הסביבה על ידי הצבת חיישני טמפרטורה ולחות יחסית מחוטאים אלחוטיים בתוך GNOVA. חלופה נוספת היא החלפת גליל הזכוכית בתא פוליקרבונט וקידוח פתחי דגימה²⁴ יאפשרו מדידת סביבה ודגימת גזים. דבר זה עשוי לאפשר כימות גזים ותרכובות נדיפות, כגון CO₂, O₂ ואתילן, עם פוטנציאל להשפיע על ביצועי המפעל³³. ניתן גם להגדיל את זרימת האוויר למערכת על ידי הסרת טבעת הכותנה בצילינדר הזכוכית. עם זאת, כל אחד מהשינויים הללו עלול להגדיל את הסיכון לזיהום ועדיין לא אומת או אופטימיזציה במסגרת GNOVA.

למרות היתרונות והגמישות של GNOVA, יש לקחת בחשבון כמה מגבלות. יש לציין שמערכת זו מתאימה במיוחד לשימוש בתאי גדילה מבוקרים, שכן תנאים לא מבוקרים בחממה או בשדה עלולים להשפיע על ביצועיה. למרות שהחיטה הצליחה לגדול בתוך המערכת במשך 17 שבועות, נצפו סימני לחץ בסביבות 12 שבועות מהצמיחה. לכן, אין לגדל חיטה מעבר ל-12 שבועות. יתרה מזאת, שמירה על הסטריליות אושרה רק באמצעות ארבעה אירועי השקיה שבועיים במהלך תקופת צמיחה של ארבעה שבועות; ניסויים ארוכים יותר נושאים סיכון מוגבר לזיהום. למרות של-GNOVA יש קיבולת נפח שורשים מוגברת, הגבלת שורשים עדיין אפשרית, והערכה זמנית של מורפולוגיית השורשים עשויה לסייע בקביעת משך גדילה מיטבי שממזער את קשירת השורשים. בנוסף, שינויים מסוימים במערכת, כמו החלפת גליל הזכוכית בצילינדר פוליקרבונט, יכולים להעלות את עלות ההתקנה ליותר מ-100 דולר ליחידה. נכון להיום, GNOVA מאפשר רק דגימה הרסנית בנקודת קצה, מה שמגביר את דרישות העבודה והשכפול למחקרים זמניים של דינמיקה מיקרוביאלית, דפוסי הפרשה או ניטור סטריליות. לבסוף, שמירה על סטריליות במהלך ההקמה, ההשקיה והקציר גוזלת זמן, ואפילו מערכות פשוטות כמו GNOVA דורשות מאמץ ייעודי, מה שמעלה את עלויות התפעול הכוללות. יחד, יש לקחת בחשבון מגבלות אלו בעת אימוץ מערכת זו. יתרה מזאת, יש לקחת בחשבון מגבלות סביבתיות הנגרמות מגידול גנוטוביוטי בעת תכנון ניסויים ופרשנות התוצאות, שכן הן עשויות להשפיע על פיזיולוגיית הצמח ובתורן על המיקרוביום הנלווה לו.

GNOVA מספקת פלטפורמה גנוטוביוטית ורסטילית התואמת לגידולי דגנים. המערכת מאפשרת שחזור של מערכות שורש כמעט שלמות, המתאימות לכלי ניתוח ארכיטקטורת שורשים כגון RhizoVision Explorer³⁹ ו-ARIA⁴⁰, ומאפשרת אפיון של מורפולוגיית שורשים בתגובה למגוון חיסונים מיקרוביאליים ותנאי סביבה. בשילוב עם SynComs וניתוחי מולטי-אומיקס, GNOVA מסייעת בזיהוי קשרים מכניים בין אפקטורים מיקרוביאליים לתגובות הצמחים. SynComs גדולים יותר (>100 חברים) יחד עם ניתוח מטגנומי ^41,42,43 יכולים לשמש לבחינת דפוסי הופעה משותפת ולזיהוי מיקרובים בעלי חשיבות אקולוגית בתנאים שונים ^5,44. לעומת זאת, SynComs קטנים יותר (<50 זנים) בשילוב עם מטטרנסקריפטומי^45,46, מטפרוטאומי 19,47,48, ומטבולומיקס 49,50,51 מאפשרים אפיון מפורט של תגובה פונקציונלית הן בצמחים והן במיקרובים ⁴⁴. ביחד, יכולות אלו מציבות את GNOVA ככלי חשוב לזיהוי תכונות מיקרוביאליות מרכזיות שיכולות להאיץ את פיתוח ביו-אינוקולנטים חדשים שמגבירים את הקיימות של מערכות חקלאיות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Powerconnect cordless drill & 100-Piece Kit	Black+Decker	BDC120VA100	1/4" and 1/8" drill bits needed.
Vinyl tape, yellow, 1" wide x 36 yards	3M	471	Consumable material
Sterling Rubber bands size #32  (2 rubber bands per system)	Amazon	B001I1QO00	Consumable material.
Wheat seed			Cultivar used in this experiment: Catawba
Fiberglass pipe wrap insulation, 3 " widex 1/2 " thick  (2 pre-cut circles per system)	Lowe's	28930	Cut into 2 7/8 " (7.3 cm) diam circles. Consumable material. For high throughput production of circles roll out the wrap insulation and use the open edge of the pot to cut the circle by placing the pot on top of the insulation wrap and applying pressure and twisting.
DW4 Filter media, Pre-cut to 15" x 75 yards  (1 cut circle per system)	Class Biological Clean, Ltd	NA	Cut into 6.3 " (16.02 cm) diam circles. CBC has other pre-cut or standard roll sizes that can be purchased instead if desired.  Consumable material. cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area of the DW4 media and cut with scissors.
Silicon tubing, Versilon SPX-50 High-strength, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" wall thickness	Saint-Gobain	ABX00007	Cut into two long pieces ( 16" // 40.64 cm) and three short pieces (2.5" // 6.35 cm)
Sodium hypoclorite 5% available chlorine in aqueous solution	VWR	JT9416-1	Dilute to 2% v/v and use for maize sterilization protocol
Murashige & Skoog medium, micro and macro elements. 25 L	Research Products International	M10200-25.0	Diluted to 0.5x strength
Ethanol, 100%, Deacon Labs	Fisher scientific	04-355-451	Diluted to 95% v/v
Syringe 3 mL, luer lock unsterile  (2 per system)	Fisher scientific	14-817-117	Discard plunger and only keep the barrel, fill with glass wool and cap with foil.
Glass beakers, 250 mL	VWR	470191-150	Five are needed for wheat seed sterilization
Maize seed			Genotype used in this experiment: Mexico 21–22 B73XMo17
Aluminum baking tray 18" x 26"	Amazon	B01FIK54LQ	Make sure it fits the dimensions of your flow hood
Sodium Chloride	Fisher scientific	BP358-1	Prepare 0.145 M solution.
3D printed base, polylactic acid (PLA) filament used (1 per system)	Protolabs	NA	Printing and editable files can be found in supplemental materials. Files available at Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. DO NOT AUTOCLAVE if PLA was used as filament to produce the base. PLA will melt above 150 °C and can get deformed above 60 °C. It is recommended that the integrity of the PLA 3D printed base is tested if it is to be used at temperatures above 40 °C. For higher heat resistance materials such as PETG (Polyethylene Terephthalate Glycol) or PC (polycarbonate) can be used instead; this will increase the cost of the part and might still not be autoclaveable. 3D printing of the base prototypes were accomplished in a personal printer with build volumes of of 256 × 256 × 256 mm (length × width × height). For speed and cost efficiency we recommend printing in bulk at local commercial 3D-printing service providers.
Male luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polypropelene  (2 per system)	Cole-Parmer	EW-50114-69	Refered as fitting 1 in the protocol
Male slip luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polyproylene  (1 per system)	Cole-Parmer	EW-50114-63	Refered as fitting 2 in the protocol
201 Stainless steel worm gear hose clamps, 1 1/2" -3 1/2" clamping diameter (1 per system)	Grainger	5CZF2	Refered as hose clamps in protocol
Airstream Gen 3 Laminar flow cabinet with simple switch, dimensions 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 "	ESCO Lifesciences	2120707	Refered as laminar flow hood in protocol. Any laminar flow hood with similar dimensions works. Modifications might be needed in smaller flow hoods.
Play sand, Quikrete Premium. 50 lb	The Home Depot	1001709466	Refered as sand in protocol
304 Stainless steel woven wire, 120 mesh (1 per system)	Amazon	B09KRS5F7T	Refered as stainless steel wire mesh in article. Cut into 4.7" (11.9 cm) diameter circles. For high troughput or circle production, cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area woven mesh of the woven mesh and cut with scissors.
Clay (Montmorillonite), OIL-DRI Loose Sorbent, 50 lb Wt, not scented	Grainger	44Z111	Refered in protocol as clay. Consumable material.
Clear hurricane candle shade chimney tube without a bottom 4" OD x 30" length (1 per system)	WCG International	HST0430	Refered in protocol as glass cylinder
Clear plastic cap, 3" (7.6 cm) diam  (1 per system)	ClearTec Packaging	PCC3.000	Refered in protocol as plastic cap
Clear Polycarbonate tubing, 3" OD x 2 7/8" ID x 1/16' wall thickness x 12" length  (1 per system)	ePlastics	PCTUB3.000X2.875	Refered in protocol as pot. Can request company to cut to other desired lengths.
Cleanroom sterlization wrap, 6" x 6" (1 per system)	Fisher scientific	17-101-102	Refered in protocol as sterilization wrap. Consumable material.
Dissecting forceps, Medium serrated tip 4 1/2" length	VWR	82027-398	Refered in protocol as tweezers.
Tea strainers	Amazon	B0FRMRZWZY	Three are needed for wheat seed sterilization
Clorox bleach with 5.7% available chlorine	The Home Depot	10051