מאמר שיטה

מבחן בידוד סיב יחיד להערכת התנהגות סיבי מיו חמצונית

534 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70637

⸱

31 במרץ 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Health Promotion Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Juntendo University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את בידוד סיבי שריר יחיד שלמים מהסולאוס החמצוני ואת הקמת תרביות מיובלסט מטוהרות מאוד שמקורן בסיבים אלו. ההליך האופטימלי מניב באופן אמין כ-300–500 סיבי מיו שלמים לכל עכבר, ומאפשר ניתוחים מולקולריים ותאים במורד הזרם.

תקציר

שריר השלד מורכב מסיבי שריר רב-גרעיניים ששלמותם ותפקודם חיוניים לתנועה ולבריאות כללית. בהפרעות נוירומוסקולריות, קבוצות שרירים עלולות להיות מושפעות באופן שונה בין סוגי מחלות ושלבים שונים, ולכן חשוב לבודד סיבים בודדים ברי קיימא משרירים מייצגים לצורך מחקרים מכניים. מטרת הפרוטוקול היא לספק שיטה אמינה לבידוד תפוקה גבוהה של מיוסיבים בודדים שלמים משריר הסוליאוס של העכברים (SOL), שקשה להתנתק בשל אורך הסיבים ושבריריותו. על ידי אופטימיזציה של ריכוז הקולגנאז וזמן העיכול, הפרוטוקול מפחית אובדן סיבים ושומר על הקיימות במהלך דיסוציאציה. תהליך העבודה האופטימלי מפחית משמעותית את ההיצמדות השארית של רקמות לסיבים מבודדים, ובכך מגביל את העברת תאים שאינם סיבים ומפחית זיהום בין תאים. טכניקה זו מתאימה לניתוח סיב יחיד וכן לבידוד תאי לוויין ולהרחבה בתנאים עם זיהום מינימלי. באמצעות זרימת עבודה אופטימלית זו, אנו מקבלים באופן שגרתי ~300–500 סיבים בודדים שמקורם ב-SOL, שניתן לסמן אותם ביעילות גבוהה ולספק אוכלוסיית תאי לוויין איכותיים עם זיהום מינימלי של פיברובלסטים. באמצעות ניתוחים השוואתיים עם שריר Extensor Digitorum Longus (EDL) אנו מדגישים את הערך של גישה מותאמת וספציפית לשריר להערכת טיפולים במחלות נוירומוסקולריות, המאפשרת לבדוק התערבויות תרופתיות מועמדות בתוך חלונות ניסוי קטנים וניתנים לכיוונון.

מבוא

שריר השלד הוא הרקמה השכיחה ביותר בגוף האדם, ומהווה כ-40–50% ממסת הגוף הכוללת1. שריר השלד משמש כמאגר אנרגיה בצורת גליקוגן. במהלך חשיפה לקור, הוא מספק חום דרך תרמוגנזה, וחשוב מכך גם מספק תנועה. שריר השלד מורכב מסיבי מיו רב-גרעיניים פוסט-מיטוטיים. כדי לשמר את הבשלה ותיקון השריר, נוצרים מיונוקליאים חדשים על ידי תא הגזע הקבוע של שריר השלד שלנו, תא הלוויין (SC). SCs נמצאים בשולי סיבי השריר השלדיים לאחר הלידה 2,3,4. SCs מזוהים על ידי גורם השעתוק Pax7, המובע הן במצב שקט והן במצב מופעל 3,5. בעת פציעה או גירוי היפרטרופי, SCs מפעילים ומווסתים את ה-MyoD, נכנסים לתוכנית המיוגנית, מתרבים, ולבסוף מתאחדים עם סיבי שריר קיימים או חדשים כדי לשקם את תפקוד השריר 6,7,8. SCs הם הטרוגניים ביכולת הגבעול שלהם, במקור העוברי (סומיטי לעומת לא סומיטי), בשלב הגדילה לאחר הלידה (צעיר מול זקן), ובהרכב השריר (סיבים מהירים מול איטיים)9,10,11.

בהתאם לאזור בגוף, שריר השלד מותאם לדרישות האנרגטיות והתפקודיות של אותו אזור. ההטרוגניות הזו בסיבי השריר אפשרית בשל ההתכווצות והיכולת החמצונית שלהם. למעשה, סיבי שריר מורכבים מסיבי חמצון איטיים (המכונים סוג I ו-IIa) וסיבים גליקוליטיים מתכווצים במהירות (נקראים IIx, במכרסמים IIb)12,13. פסיפס יפה ופונקציונלי זה של סוגי סיבים מאפשר לנו לנוע בחופשיות בחיי היומיום שלנו. לדוגמה, שרירי יציבה כמו הסוליאוס (SOL) ועמוד השדרה הזקוף נמצאים במצב של הפעלה כרונית ברמה נמוכה, ולכן מכילים אחוז גבוה של סיבי שריר מסוג I ו-IIa איטיים. לעומת זאת, שרירים קצרים אך מהירים, כמו השרירים המאריך של השרירים הארוכים (EDL), מורכבים בעיקר מסיבי גליקוליטיקה מסוג IIx ו-IIb. עם זאת, הרכב הסיבים אינו קבוע; במקום זאת, סיבי שריר הם מבנים דינמיים המסוגלים לעבור ממהיר לאיטי ולהפך, בהתאם לדרישות הפונקציונליות המוטלות עליהם. ההבדל בכיווץ סוג הסיבים אפשרי בשל תכולת חלבון המיוזין. זהו החלבון העיקרי בשריר השלד, המורכב מאיזופורמים של שרשראות מיוזין קלות וכבדות12,14.

בתוך סרקומר (היחידה התפקודית הקטנה ביותר בשריר שמייצרת כוח), ראשי המיוזין והאקטין מתקשרים ליצירת מבנה הידוע כגשר צולל. באמצעות הידרוליזה של ATP, משתחררת אנרגיה על ידי מחזור האינטראקציות בין המיוזין לאקטין15,16. שרשרת המיאוסין הכבדה (MyHC) היא הסמן המתאים ביותר לזיהוי סוגי סיבים 12,13. בהתאם לאיזופורם של MyHC המובטא, קצב ההתכווצות של השריר ישתנה. כפי שצוין, סיבי סוג I הם סיבים חמצניים איטיים, בניגוד לסיבים מסוג II. קבוצות שרירים דומיננטיות מסוג I מכילות שפע גבוה יותר של אנזימים חמצוניים, עשירות יותר במיטוכונדריה, ויש להן רשת נימים צפופה שמחליפה את השריר17,18 (תחשבו על רץ מרתון). סיבים מסוג I מקודדים על ידי הגן MYH7 13,19. סיבים מסוג II מהירים לעייפות, מכילים אחוז גבוה של אנזימים גליקוליטיים, ויש להם מהירות קיצור מרבית גבוהה יותר, מה שהופך אותם לאידיאליים לפרצי כוח או תנועה קצרים (כמו פאוור לייטר). סיבים מסוג II עבור סוגי IIa, IIx ו-IIb (במכרסמים) מקודדים על ידי הגנים MYH2, MYH1 ו-MYH4, בהתאמה20,21. כמובן, כל פגיעה פתופיזיולוגית שמשפיעה על שלמות השריר תשנה את הרכב הסיבים ותוביל להשפעות מזיקות על תפקוד השריר, מה שעלול להוריד את איכות החיים. למעשה, דיסטרופיות שריריות רבות מתחילות בתא הלוויין (אופתיות תאי לוויין) או בסיבי השריר (נוירונים מוטוריים או רקמת שריר), ועלולות לגרום לשינוי בהרכב סוג הסיבים 22,23,24,25. לדוגמה, פגיעות חוט שדרה, מחקרים במנוחה במיטה וטיסות חלל (מיקרו-כבידה) מראים כי חוסר פעילות ממושכת יכול לגרום לשרירי היציבה לעבור מפנוטיפ איטי למהיר של סיבים 26,27,28,29,30. לעומת זאת, בדיסטרופיה שרירית של דושן, הן במודלים אנושיים והן בעכבר (mdx), סיבים גליקוליטיים מהירים מושפעים במידה רבה יותר ובחומרה רבה יותר מאשר סיבים איטייםיותר 31,32,33,34. באופן דומה, בדיסטרופיה שרירית פאסיוסקפלו-הומרלית (FSHD), נצפה מעבר מהיר לאיטי של עווית עם שיעור גבוה יותר של סיבי סוג I יחד עם ייצור כוח נמוך יותר בסיבי סוג II 24,35,36.

עדיין לא ברור מדוע סוגים מסוימים של סיבי שריר מושפעים סלקטיבית או נחסכים במחלות שונות. העובדה שדפוסים אלו אינם אקראיים מדגישה את החשיבות של ניתוח המנגנונים הבסיסיים, עבורם בידוד סיב יחיד הפך לטכניקה חזקה ונפוצה. למעשה, מאז שהוצג לראשונה באמצע שנות ה-80 על ידי בישוף37, הכלי החיוני הזה עבר שיפור והתאמה מתמשכת, מה שמאפשר חקירה מדויקת יותר של ביולוגיית השרירים 38,39,40. חשוב לציין כי בידוד סיב יחיד שומר על ה-SC קרוב ככל האפשר לנישה הפיזיולוגית שלהם, ומאפשר בדיקה מספקת של פעילותם המולקולרית. למרות שניתן להוציא קבוצות שרירים כמו אלו של כופף הדיגיטורום ברביס (FDB) ו-EDL בקלות יחסית 41,42,43, שריר ה-SOL נשאר אחד השרירים הקשים ביותר להשגת אוכלוסייה עשירה של סיבים שלמים. הסיבה לכך היא הקשיחות שלו, אורך הסיבים הארוך והרגישות לנזק. כדי להתמודד עם זה, טכניקה אופטימלית במחקר הנוכחי שמניבה באופן יציב אוכלוסיית סיבים איכותית וברת קיימא משריר SOL הידוע לשמצה שקשה לבודד. בשילוב עם בידוד סיבי EDL, גישה זו מאפשרת תרבית של סיבים ותאים נגזרים (תאי לוויין, מיובלסטים ומיוטיובים) מקבוצות שריר שונות. חשוב לציין, פלטפורמה זו מאפשרת חקירה שיטתית של הגורמים המולקולריים שעשויים לתרום באופן שונה לפתולוגיות שרירים מגוונות ומספקת אמצעי עוצמתי לבדיקת התערבויות תרופתיות באופן שיכול לחשוף תגובות ספציפיות לסוג השריר ולבסוף לתמוך בפיתוח טיפולים יעילים למחלות שריר שלד.

פרוטוקול

כל בעלי החיים שוחזקו במתקן הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת טוקיו מטרופוליטן (מספרי היתרים: A4-4, A5-9, A6-7, A7-018). כל בעלי החיים נשמרו בתנאים מסוימים ללא פתוגנים (SPF). טיפול בבעלי חיים ונהלים ניסיוניים שנקטו במחקר זה עמדו בקפדנות בהנחיות ועדת הבטיחות והאתיקה של אוניברסיטת טוקיו מטרופוליטן.

1. הכנת ריאגנטים

  1. תלבש כפפות לאורך כל הדרך. בצינור צנטריפוגה בנפח 25 מ"ל, יש להכין 0.5% מתמיסת קולגנאז סוג I ב-Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMAX של Dulbecco עם 1% תליית פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B (AB). לאחר שהקולגנאז מומס היטב (נגיעה קלה על הצינור במידת הצורך), עקר את התמיסה על ידי סינון דרך פילטר קושר חלבון נמוך של 0.22 מיקרון.
    הערה: 2.5 מ"ל תמיסת קולגנאז מספיקה לשני סוליאוס (עכבר אחד).
  2. הכינו 10 מ"ל של 5% אלבומין סרום בקר (BSA) במי מלח מפוזר פוספט (PBS). השבית את התמיסה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז סינן את התמיסה דרך פילטר קושר חלבון נמוך של 0.22 מיקרון.
    הערה: ה-5% BSA בתמיסת PBS ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 10 ימים.

2. ניתוח שרירי הסוליאוס

  1. ציוד פריסה לכריתת שריר (איור 1A).
  2. הרדמו עכברים מסוג C57BL/6 בהזרקה תוך-פריטונלית של תערובת הרדמה משולשת (0.5 מ"ל/גרם משקל גוף) המכילה 1 מ"ג/מ"ל מדטומידין הידרוכלוריד, 5 מ"ג/מ"ל מידאזולאם ו-5 מ"ג/מ"ל טרטראט בוטורפנול, ואז הורד את העכברים באמצעות ניתוק צווארי הרחם.
  3. בצע חתכים עוקבים בעור על הגפה האחורית וקילף את העור. הסר את הפאשיה השטחית.
  4. הפרדו את גיד פלנטאריס (PLA) מבין גיד הגסטרוקנמיוס (GAS) והסוליאוס (SOL). הסר בעדינות את ה-PLA על ידי משיכה מהגיד שלו (איור 1B).
  5. חתוך את חבילות גיד GAS ו-SOL וחשוף את השרירים. הכנס פין למרווח בין הגיד הפרוקסימלי של ה-GAS ל-SOL (איור 1C).
  6. החליק בזהירות את המחט לכיוון הקצה המרוחק כדי להפריד בין שריר SOL ל-GAS (איור 1D).
  7. חתוך את חבילות הגידים מצד ה-GAS (איור 1E).
  8. תן את ה-SOL על הגז. כוון בזהירות את מיקום ה-SOL כדי לחשוף את הגיד הפרוקסימלי וחתוך אותו עם זוג מספריים מיקרו (איור 1F).
  9. מקם את ה-SOL על שולחן החיתוך והסר את הגיד הנותר (איור 1G).
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי; הגיד הנותר אינו משפיע על התוצאה.

3. עיכול שרירי הסוליאוס

  1. העבר את הסולאוס השלם לצינור צנטריפוגה בנפח 25 מ"ל המכיל את תמיסת הקולגנאז המוכנה של 0.5%. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 130 דקות.
    הערה: כל 15–20 דקות ניתן לערבב ידנית את הדגימה כדי להפריד מעט סיבים ולתמוך בפעילות הקולגנאז.

4. בידוד סיבים בודדים תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ

  1. חתוך שתי פיפטות פסטר כדי ליצור אחת עם קדח רחב ואחת עם פתח צר (איור 2A). תחת להבה, סטריליזציה והחלקה של החורים כדי למנוע נזק לשרירים במהלך הטריטורציה.
  2. כדי למנוע הידבקות סיבית במהלך הבידוד, ציפו פיפטות פסטר ושלוש צלחות פטרי 50 מ"מ ב-5% BSA/PBS.
    הערה: מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ (איור 2B) שימש לאורך שלבי הבידוד.
  3. לאחר עיכול השריר, יש להשליך את עודף תמיסת הקולגנאז ולהעביר את הסולאוס למנה הראשונה המכילה DMEM עם 1% AB (איור 2C).
  4. באמצעות פיפטת פסטר רחבת הקיטור, שטפו בעדינות למעלה ולמטה כדי להפריד סיבים (איור 2D).
  5. עם פיפט פסטר צר הקינה, העבר סיבים בודדים שלמים לאורך סיבי השריר לצלחת השנייה. נצל את ההזדמנות כאן כדי להסיר פסולת ו/או סיבים מצומצמים (איור 2E,F).
  6. העבירו סיבים בודדים איכותיים (באורך מלא/שלם) לצלחת שלישית כדי להבטיח טוהר עם פיפטת פסטר צרת הקיטור (איור 2G,H).
  7. אסוף את הסיבים לתוך צינור צנטריפוגה מצופה BSA בנפח 25 מ"ל. ערבב בעדינות את המתלוי, ואז השאיר אותו 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לסיבים להצטבר לתחתית הצינור.
  8. באמצעות פיפט פסטר צר קינה, השליכו בזהירות את הסופרנטנט והסרו את כל הפסולת שנותרה. השאירו כ-500 מיקרוליטר מה-DMEM עם תמיסת AB של 1%. משקע זה יכיל אוכלוסייה מטוהרת מאוד של סיבי שריר בודדים (איור 2G,H).
    הערה: טכניקה זו יכולה להניב > 300 סיבים בודדים, אותם ניתן להשתמש בהם להפקת חלבונים ו-mRNA ולניתוח נוסף.

5. הקמת תרביות מיובלסט מטוהרות מאוד מסיבי סולאוס

  1. מדלל את מטריצת Matrigel ל-0.1 מ"ג/מ"ל והשתמש בו לציפוי צלחת תרבית של 100 מ"מ. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37°C למשך 30–60 דקות עד שהציפוי מתמיין באופן אחיד.
  2. הוסיפו כמות שווה של אקווטאז לתוואי סיבי השריר ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 10 מ"ל של מדיום גדילה (המורכב מ-DMEM ללא גלוקוז המכיל 30% סרום בקר עוברי, 1% GlutaMAX, 1% תמצית עובר-עובר, CEE, 1% AB, ו-0.01 מיקרוגרם/מ"ל פקטור גדילה בסיסי של פיברובלסטים, bFGF)44).
    הערה: כמות שווה של אקיוטאז במקרה זה היא 500 מיקרוליטר המתוארת בסעיף 4.8. אקוטאז מסייע בניתוק עדין של סיבי השריר ועוזר לשחרור תאי לוויין, התומך בהרחבה הבאה של תרבית המיובלסט.
  3. העבר את 10 מ"ל של תלייה סיבי שריר שטופלו באקוטאז לצלחת מצופה מטריג'ל. כ-4 סיבים בודדים לס"מ2 מוסיפים לצלחת תרבית בעובי 100 מ"מ. ודאו שהסיבים מפוזרים באופן שווה לאורך כל מנה התרבית.
  4. לאחר 3 ימים במדימת תרבית, ניתן לצפות במושבות מיובלסט. החלף את מדיום הגידול מדי יום עד שמיובלסטים מגיעים לאוכלוסייה הנדרשת. בדרך כלל, עד היום השישי, תרביות המיובלסט מתאחדות מספיק לשלב הניסוי (איור 3A).
  5. הפרדו את המיובלסטים מהצלחת המקורית שלהם באמצעות טריפסין ודגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. באמצעות המוציטומטר, ספרו את התאים והזרעים בהתאם לגודל הבאר ולמפגש התאים הנדרש להתקדמות המיוגנית.
    הערה: לצלחת של 100 מ"מ, הוסיפו 1 מ"ל טריפסין.

תוצאות

הטכניקה שלנו מראה כי סיבים מבודדים של שרירי הסוליאוס (SOL) ושריר האצבעה הארוכה (EDL) יכולים להיות מסומנים ביעילות נגד Pax7 (איור 3B). הסיבים המבודדים הללו יכולים להישמר במדיום תרבית צפה (המורכב מ-DMEM + GlutaMAX עם 10% סרום סוסים, 1% AB, 0.5% CEE) למשך 3 ימים, ולאחר מכן תווית חיסון (איור 3B). לא מומלץ לשמור על סיבים צפים ליותר מ-4 ימים. בתנאי הסיבים הצפים המתוארים, המיוסיבים נוטים להצטבר לאחר תקופה זו, מה שפוגע בניתוח האימונוליבלינג שלאחר מכן.

הטכניקה המוצגת יכולה לשמש גם לאימונובליטינג על פני תוכנית המיוגנית (איור 3C). למעשה, מיובלסטים שמקורם ב-SOL ו-EDL צופים ללוחות של 24 בארות בנקודת מפגש של כ-70%. התאים נשמרו בתווך גדילה במשך יום אחד (מיובלסטים) או הושרדו להתמיינות במשך יומיים או ארבעה ימים (מיוטובובים מוקדמים ומיוטובים מומיינים, בהתאמה). חמישה מיקרוגרם חלבון הועמסו לניתוח אימונובליטינג.

ביטוי MyHC I התבטא כמעט באופן ספציפי בסיבי שריר שמקורם ב-SOL, עם ביטוי מינימלי במיוטבובסים וזניח במיובלסטים (איור 3C). MyHC II התבטא הן בסיבי שריר SOL והן ב-EDL. ביטוי זה משקף את ה-SOL, המורכב בעיקר מסוגים I ו-IIa, בעוד שה-EDL מורכב בעיקר מסיבי IIx ו-IIb. המיובלסטים לא ביטאו את MyHC II, אך ביטויו גדל בהדרגה במהלך התמיינות. החלבונים הקשורים לחמצון PGC-1α ו-COXIV הראו ביטוי גבוה צפוי בסיבים שמקורם ב-SOL. כמו כן, זוהה ביטוי גבוה יותר של GLUT4 בסיבי SOL מבודדים בהשוואה לסיבי EDL. בעיה שעלולים להתמודד איתה ביולוגים של שרירי שלד היא שחלבוני בית נפוצים ואמצעי בקרת עומס, כגון α-טובולין, β-אקטין, GAPDH וצבעי חלבון כולל Ponceau S, אינם נשארים יציבים בין מיובלסטים, מיוטיובסים וסיבי שריר מבודדים, כאשר כל אחד מהם מציג שונות ייחודית. עוצמת האות של α-טובולין ו-β-אקטין הייתה הגבוהה ביותר במיוטובובלס, בעוד שצביעת Ponceau S הייתה חלשה יחסית במיובלסטים. לעומת זאת, GAPDH הראה ביטוי חזק יותר בסיבי שריר EDL. עם זאת, בהתאם למטרת הניסוי, אחד מחלבוני הניקיון הללו עשוי עדיין להיות רלוונטי, וניתן לחקור גורמי נרמול חלופיים כמו חלבון הלם חום 70 (HSP70).

איור 1
איור 1. ניתוח שריר סולאוס. (א) ציוד הנדרש לפירוק. 1: מספריים מיקרו, 2: מלקחיים דקים, 3: מספריים לניתוח, ו-4: סיכות חתך. (B) גיד PLA נחתך מחבילות גידים של GAS ו-SOL (חץ צהוב). גיד ה-PLA הדיסטלי (החץ הלבן) הורם באמצעות מלקחיים. (ג) פין חיתוך הוכנס למרווח שבין הגיד הפרוקסימלי של ה-SOL (חץ אדום) ל-GAS (חץ ירוק). (D) SOL הופרדה מ-GAS באמצעות פין חיתול. (E) חבילות גיד GAS ו-SOL נחתכו בצד ה-GAS. (F) גיד הפרוקסימלי של SOL נחתך לאחר מכן במספריים מיקרו. (ז) הוסרו חבילות גיד דיסטליות נוספות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2
איור 2. בידוד סיבי סולאוס. (א) ציוד הנדרש לבידוד. 1: פיפטות צרות ו-2: פיפטות פסטר רחבות קינה. (ב) סטריאומיקרוסקופ המשמש לבידוד. (ג) סולאוס מעוכל בקולגנאז הועבר ל-DMEM עם 1% AB. (D) סיבי סולאוס שהתנתקו מהשריר לאחר 10 השטיפות הראשונות. (ה) סיבים בודדים שהועברו לצלחת השנייה. (F) תמונה המציגה סיבים נקיים שהוסרו מפסולת וסיבים מצומצמים. (G) סיבים בודדים נטולי פסולת שהועברו לצלחת השלישית. (H) סיבים בודדים שלמים גלויים בבירור. פס קנה מידה = 10 מ"מ. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 3
איור 3. הרחבת תרבית תאים וניתוח דגימות שמקורן ב-EDL וב-SOL. (א) לאחר 6 ימים לאחר הבידוד, דגימות המדיום שהתרבו מראות תרבית מיובלסט טהורה שהושגה מסיבי סולאוס מבודדים. פס קנה מידה = 100 מיקרון. (B) סיבים בודדים שמקורם ב-SOL ו-EDL, מיד או 3 ימים לאחר הבידוד, מראים תאי לוויין מסומנים ל-Pax7 (ירוק). היעדר MyoD (אדום) מאשר שתאי לוויין עדיין לא התחייבו להפעלה מיוגנית. הסיבים צוברו בצבע DAPI (כחול). התאים נצפו לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פס סקאלה = 20 מיקרומטר. (C) 5 מיקרוגרם חלבון שימש לאימונובלוטינג של מיובלסטים, מיוטבובסים ודגימות שמקורן במיוסיבר. לוחות אימונובלוטינג מראים ביטוי של MyHC I, MyHC II, PGC-1α, COX IV, GLUT4, α-tubulin, β-actin ו-GAPDH שימשו כמטרות לניהול בית/נרמול. צבע Ponceau S שימש כבקרה מלאה על טעינת חלבון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

המפתח הראשון לבידוד מספר רב של סיבי שריר מהסולאוס (SOL) הוא שמירה על שלמות המבנה של השריר במהלך הדיסקציה. אם האפימיזיום של ה-SOL נקרע או אם השריר נמשך בעוצמה, במיוחד לאורך הציר האורכי שלו, במהלך הדיסקציה, תפוקת הבידוד תיפגע קשות. שגיאות החיתוך הללו בדרך כלל קלות לזיהוי לאחר מכן. למעשה, לאחר עיכול הקולגנאז, השריר מתכווץ באופן אחיד ויוצר גוש לבן ודחוס. בתנאים כאלה, רק מספר קטן מאוד של סיבים ברי קיימא יכולים להתנתק.

הגורם המכריע השני לבידוד סולאוס מוצלח הוא יעילות עיכול הקולגנאז מסוג I. כאשר הקולגנאז פועל בצורה מיטבית, ניתן להשיג כ-100–200 סיבי סולאוס בעשרת סשנים הראשונים. לעומת זאת, כאשר העיכול לא אופטימלי, אפילו לאחר 20 השטיפות הראשונות, פחות מ-50 סיבים עשויים להשתחרר. כדי להשיג תפוקת סיבים גבוהה יותר, נדרשים שטיפה נמרצת יותר ומחזורי שטיפה נוספים. עם זאת, מכיוון שסיבי SOL שבריריים במיוחד, לעיתים קרובות זה גורם להתכווצצות הסיבים במהלך השטיפה.

להקמת תרבות מיובלסט ראשונית טהורה שמקורה ב-SOL, עיכול הקולגנאז שוב משחק תפקיד מרכזי. כאשר העיכול יעיל, פחות סיבים נשארים מחוברים לרקמה שנותרה והעברת הסיבים לתוך מדיום התרבית גורמת לזיהום מינימלי בפיברובלסטים. לעומת זאת, כאשר ה-SOL מעוכל בצורה לקויה, סיבים מנותקים נשארים מחוברים לרקמה שאריתית, ויזהמו את תרבית המיובלסט בפיברובלסטים. חוקרים צריכים לחפש את הסימנים הטיפוסיים לזיהום פיברובלסטים בדגימות התאים הזרועים; אלה כוללים גודל תא גדול בהרבה ובליטות ציטוסקלטליות נרחבות, בהשוואה לתאי לוויין קטנים בהרבה בצורת ציר בצלחות מצופות מטריג'ל דבוקות. אם תתרחש זיהום, חוקרים עשויים לחשוף תאים לשלבים מוקדמים לציפוי כפי שמתואר במקום אחר45. לזמן קצר, ה-SC מגדלים במשך 3 ימים לאחר הבידוד, ואז מעובדים בטריפסין ומצפים מראש לזמן קצר על כלים מצופים קולגן. במהלך 15–30 דקות של דגירה, הפיברובלסטים נדבקים בעוד הפיברובלסטים נשארים תלויים ומועברים לפלטות טריות מצופות מטריג'ל.

כפי שצוין לעיל ובהתאם לניסינו, סיבי SOL ארוכים ושבריריים יותר מסיבי ה-extensor digitorum longus (EDL) ו-flexor digitorum brevis (FDB). זה מקשה על העברת סיבים באמצעות פיפטות פסטר. חשוב לשאוב סיבים לאורך ציר האורך שלהם במקום למשוך אותם מהמרכז; אחרת, הסיבים מתקפלים ומתכווצים תחת המתח. מלבד הגורמים המכריעים שקובעים ישירות אם בידוד הסיבים יצליח, כמה שלבים טכניים נוספים חיוניים לשיפור תפוקת סיבי הסוליאוס. אחד מהם הוא לצפות את כל הפיפטים, הכלים וצינורות האיסוף של פסטר ב-5% BSA. דבר זה מונע מסיבי שריר שהתנתקו טריים להידבק למשטחים, ובכך מונע קיפול סיבים והתכווצות לאחר מכן. מומלץ להכין פיפטות פסטר חדשות מחוטאות בחום ומצופות BSA בכל פעם שמבודדות דגימות שריר. חלופה לכך היא שחוקרים יכלו להכין סט של פיפטות פסטר לשימוש ארוך טווח. אם כן, יש לחטא בחום בכל פעם ולצפות מחדש ב-BSA לפני השימוש.

הפרוטוקול הקונבנציונלי לבידוד סיבי שריר בודד היה מותאם בעיקר לשרירים גליקוליטיים כגון FDB ו-EDL37. עם זאת, שרירים חמצניים, כמו ה-SOL, מובחנים מבחינה מבנית. ניתוחים טרנסקריפטומיים הראו כי ביטוי גנים הקשור למטריקס חוץ-תאית (ECM) שונה בין SOL ל-EDL46, כולל גנים כמו דיסטרופין, חלבון קישור ציטוסקלטלי של שריר השלד44. כתוצאה מכך, התנאי הסטנדרטי לעיכול שריר EDL עם קולגנאז של 0.2% (2 מ"ג/מ"ל) למשך 60–90 דקות אינו אופטימלי לשרירי SOL, מה שמוביל לחבילות סיבים דחוסות או סיבים מצומצמים לאחר העיכול. במחקר זה, אופטימיזציה של מספר שלבים מרכזיים כדי להתאים את הפרוטוקול לשרירי SOL חמצניים. על ידי התאמת ריכוז הקולגנאז מסוג I ל-0.5% (5 מ"ג/מ"ל), הארכת תקופת הדגירה ל-130 דקות, והפחתת העומס המכני במהלך השטיפה, ניתן להשיג באופן עקבי 300–500 סיבים שלמים מעכבר אחד. בהשוואה ל-EDL, מספר הסיבים והתפוקה של דגימות SOL נשארים נמוכים יותר (ה-EDL יכול להניב > 500 סיבים); עם זאת, מספר הסיבים, וחשוב מכך, האיכות הגבוהה של הסיבים שמקורם ב-SOL הם עמידים ומתאימים ליישומים במעלה הזרם כמו אימונובלוטינג ואימונובלוטינג. למרות שתוצאות האימונובלוטינג שלנו כללו דגימות סיב בודד מאוחדות, הטכניקה המוצגת בדוח זה מסוגלת לחלץ סיבים בודדים שלמים באופן אמין, מה שהופך אותם למתאימים ליישומים בהמשך כמו אימונובלוטינג, פרוטאומיקה וריצוף RNA47 ברזולוציה של סיב יחיד. חוקרים בתחום יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור הבדלים מטבוליים וכיווצים בין סיבי שריר חמצניים לגליקוליטיים.

בסך הכול, פרוטוקול זה מספק שיטה ניתנת לשחזור ונגישה לבידוד סיבים חמצניים שלמים מהשריר הסוליאוס, ומרחיב את ערכת הכלים הזמינה לחקר פיזיולוגיה ומנגנונים מולקולריים ספציפיים לסוג סיבי שריר.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הקמת מלגות אוניברסיטאיות ליצירת חדשנות מדעית-טכנולוגית (JST, מענק מס' JPMJFS2139 ל-T.H.) ומענקים מהחברה היפנית לקידום המדע (KAKENHI 23H00457 הוענק ל-N.L.F., 20J12849 ל-Y.Mi., 24K222254 ל-Y. Ma). מחקר זה נתמך גם על ידי מענק מחקר מתקדם של ממשלת טוקיו מטרופולין [R2-2] ל-Y.Ma., ל-N.L.F., וקרן המחקר האסטרטגי של TMU למחקר חדשני [R3] ל-N.L.F. תודה ליאסורו פורואיצ'י על עצותיו ותגובותיו המועילות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Basic fibroblast growth factorPeprotech450-33
Bovine serum albuminSigmaA9418
Butorphanol tartrateMeiji Yakuka Co., Ltd711-12שם מוצר: Vetorphale Injection
Chicken Embryo ExtractUS BiologicalC3999
Collagenase type IWorthingtonM9B2717
DAPISigma-AldrichD9542
Fetal bovine serumGibco10437-028
Glucose-free DMEMGibcoA14430-01
GlutaMAXGibco10569
High-glucose DMEM+GlutaMAXGibco10569-010
Horse serumLife technology16050-130
Low-protein binding filterMilliporeSLGVR33RB
MatrigelCorning354230
Medetomidine hydrochlorideKyoritsu Seiyaku Co., Ltd8816שם מוצר: Dorbene Injection
MidazolamMaruishi Pharmaceutical Co., Ltd4987211762100שם מוצר: Dormicum Injection
Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspensionWako161-23181
Ponceau S stain solutionSigma-Aldrich24-3875-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056
Equipment
Centrifuge tubes (25 mL)IWAKI2362-025
Fluorescence microscopeKeyenceBZ-X810
Pasteur pipettesIWAKI5 3/4 IK-PAS-5P
StereomicroscopeLeicaM165C
Sterilin dishes (100-mm)Thermo Scientific3020-100מוזכר כצלחת פטרי במאמר
Anbitodies לסימון אימונולוגי
Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-327231:400
Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-110121:400
Mouse Anti-Myosin Heavy ChainR&D SystemsMAB44701:400
Mouse Anti-Pax7DSHBAB-5284281:100
Rabbit Anti-MyoDSanta Cruz Biotechnologysc-7601:100
Anbitodies לאימונובלוטינג
HRP-conjugated Anti-mouse IgGCytivaNA9311:1000/ חומצה פרוקסידאז סוסיות
HRP-conjugated Anti-Rabbit IgGCytivaNA9341:1000/ חומצה פרוקסידאז סוסיות
Mouse Anti-MyHC ISigmaM84211:1000/ Myosin Heavy Chain I
Mouse Anti-MyHC IISigmaM42761:1000/ Myosin Heavy Chain II
Mouse Anti-PGC-1αSanta Cruz Biotechnologysc-5173801:1000/ Pparg coactivator 1 alpha
Mouse Anti-α-tubulinCell Signaling Technology#38731:1000/ Alpha tubulin
Rabbit Anti-COXIVCell Signaling Technology#48501:1000/ Cytochrome c oxidase IV
Rabbit Anti-GAPDHCell Signaling Technology#22181:10000/ Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase
Rabbit Anti-GLUT4Cell Signaling Technology#22131:1000/ Glucose Transporter 4
Rabbit Anti-β-actinProteintech20536-1-AP1:2000/ Nonmuscle Beta-actin

מקורות

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18–88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).
  3. Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: The stem cell that came in from the cold. J Histochem Cytochem. 54 (11), 1177-1191 (2006).
  4. Zammit, P. S., et al. Pax7 and myogenic progression in skeletal muscle satellite cells. J Cell Sci. 119 (9), 1824-1832 (2006).
  5. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  6. Günther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  7. Gnocchi, V. F., White, R. B., Ono, Y., Ellis, J. A., Zammit, P. S. Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite cells. PLoS One. 4 (4), e5205(2009).
  8. Halevy, O., et al. Pattern of Pax7 expression during myogenesis in the posthatch chicken establishes a model for satellite cell differentiation and renewal. Dev Dyn. 231 (3), 489-502 (2004).
  9. Biressi, S., Rando, T. A. Heterogeneity in the muscle satellite cell population. Semin Cell Dev Biol. 21 (8), 845-854 (2010).
  10. Zammit, P. S. All muscle satellite cells are equal, but are some more equal than others. J Cell Sci. 121 (18), 2975-2982 (2008).
  11. Ortuste Quiroga, H. P., Fujimaki, S., Ono, Y. Pax7 reporter mouse models: A pocket guide for satellite cell research. Eur J Transl Myol. 33 (4), (2023).
  12. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  13. Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
  14. Ahmetov, I. I., Vinogradova, O. L., Williams, A. G. Gene polymorphisms and fiber-type composition of human skeletal muscle. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 22 (4), 292-303 (2012).
  15. Guth, L., Samaha, F. J. Qualitative differences between actomyosin ATPase of slow and fast mammalian muscle. Exp Neurol. 25 (1), 138-152 (1969).
  16. Aguilera-Alcala, N., Morales-Reyes, Z., Martin-Lopez, B., Moleon, M., Sanchez-Zapata, J. A. Role of scavengers in providing non-material contributions to people. Ecol Indic. 117, 11(2020).
  17. Sullivan, S. M., Pittman, R. N. Relationship between mitochondrial volume density and capillarity in hamster muscles. Am J Physiol. 252 (1), H149-H155 (1987).
  18. Fujita, N., et al. Changes in lipid metabolism and capillary density of the skeletal muscle following low-intensity exercise training in a rat model of obesity with hyperinsulinemia. PLoS One. 13 (5), e0196895(2018).
  19. Narusawa, M., et al. Slow myosin in developing rat skeletal muscle. J Cell Biol. 104 (3), 447-459 (1987).
  20. Faerman, A., Shani, M. The expression of the regulatory myosin light chain 2 gene during mouse embryogenesis. Development. 118 (3), 919-929 (1993).
  21. Denardi, C., et al. Type 2x-myosin heavy chain is coded by a muscle fiber type-specific and developmentally regulated gene. J Cell Biol. 123 (4), 823-835 (1993).
  22. Ciciliot, S., Rossi, A. C., Dyar, K. A., Blaauw, B., Schiaffino, S. Muscle type and fiber type specificity in muscle wasting. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2191-2199 (2013).
  23. Talbot, J., Maves, L. Skeletal muscle fiber type: Using insights from muscle developmental biology to dissect targets for susceptibility and resistance to muscle disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (4), 518-534 (2016).
  24. Celegato, B., et al. Parallel protein and transcript profiles of FSHD patient muscles correlate to the D4Z4 arrangement and reveal a common impairment of slow to fast fibre differentiation and a general deregulation of MyoD-dependent genes. Proteomics. 6 (19), 5303-5321 (2006).
  25. Ganassi, M., Muntoni, F., Zammit, P. S. Defining and identifying satellite cell-opathies within muscular dystrophies and myopathies. Exp Cell Res. 411 (1), 112906(2022).
  26. Gallagher, P., et al. Effects of 84-days of bedrest and resistance training on single muscle fibre myosin heavy chain distribution in human vastus lateralis and soleus muscles. Acta Physiol Scand. 185 (1), 61-69 (2005).
  27. Grimby, G., Broberg, C., Krotkiewska, I., Krotkiewski, M. Muscle fiber composition in patients with traumatic cord lesion. Scand J Rehabil Med. 8 (1), 37-42 (1976).
  28. Shenkman, B. S. From slow to fast: Hypogravity-induced remodeling of muscle fiber myosin phenotype. Acta Naturae. 8 (4), 47-59 (2016).
  29. Ohira, T., Kawano, F., Goto, K., Ohira, Y. Responses of skeletal muscles to gravitational unloading and/or reloading. J Physiol Sci. 65 (4), 293-310 (2015).
  30. Higashino, K., et al. Early changes in muscle atrophy and muscle fiber type conversion after spinal cord transection and peripheral nerve transection in rats. J Neuroeng Rehabil. 10, 46(2013).
  31. Webster, C., Silberstein, L., Hays, A. P., Blau, H. M. Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy. Cell. 52 (4), 503-513 (1988).
  32. Pedemonte, M., Sandri, C., Schiaffino, S., Minetti, C. Early decrease of IIx myosin heavy chain transcripts in Duchenne muscular dystrophy. Biochem Biophys Res Commun. 255 (2), 466-469 (1999).
  33. Rafael, J. A., et al. Dystrophin and utrophin influence fiber type composition and post-synaptic membrane structure. Hum Mol Genet. 9 (9), 1357-1367 (2000).
  34. Kotelnikova, E., et al. Novel approach to meta-analysis of microarray datasets reveals muscle remodeling-related drug targets and biomarkers in Duchenne muscular dystrophy. PLoS Comput Biol. 8 (2), e1002365(2012).
  35. Banerji, C. R. S., Zammit, P. S. Pathomechanisms and biomarkers in facioscapulohumeral muscular dystrophy: Roles of DUX4 and Pax7. EMBO Mol Med. 13 (8), e13695(2021).
  36. Lassche, S., et al. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurology. 80 (8), 733-737 (2013).
  37. Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev Biol. 115 (1), 129-139 (1986).
  38. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (10), 773-779 (1995).
  39. Collins, C. A., Zammit, P. S. Isolation and grafting of single muscle fibres. Methods Mol Biol. 482, 319-330 (2009).
  40. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system—a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  41. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods Mol Biol. 946, 431-468 (2013).
  42. Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 248-261 (2020).
  43. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14(2018).
  44. Omairi, S., et al. Regulation of the dystrophin-associated glycoprotein complex composition by the metabolic properties of muscle fibres. Sci Rep. 9 (1), 2770(2019).
  45. Moyle, L. A., Zammit, P. S. Isolation, culture and immunostaining of skeletal muscle fibres to study myogenic progression in satellite cells. Methods Mol Biol. 1210, 63-78 (2014).
  46. Hettige, P., Tahir, U., Nishikawa, K. C., Gage, M. J. Comparative analysis of the transcriptomes of EDL, psoas, and soleus muscles from mice. BMC Genomics. 21 (1), 808(2020).
  47. Blackburn, D. M., Lazure, F., Soleimani, V. D. RNA sequencing of single myofibers from Mus musculus. Bio Protoc. 10 (4), e3525(2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מבחן בידוד סיב יחיד להערכת התנהגות סיבי מיו חמצונית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.