הנדסת מודל עכבר פרה-קליני באיכות גבוהה לגרורות מוח באמצעות טכניקת הזרקה פועמת אינטרלוק ותיקון כלי דם מיקרוכירורגי

סיכום

מחקר זה מבסס מודלים מדויקים של עכברים של גרורות מוח באמצעות הזרקה תוך-קרוטידית חולפת לתאי גידול באמצעות הזרקת אינטרלוק פולסטילית ותיקון מיקרוכירורגיה. הוא שומר על זרימת הדם המוחית, מונע סתימה של עורק הקרוטיד המשותף, ומספק מודלים פרה-קליניים משופרים עם שיעורי גרורות גידול משופרים והפחתת תמותה.

תקציר

גרורות מוח נותרות בעיה קלינית הרסנית. אתגר מרכזי במחקר גרורות מוח הוא היעדר מודלים איכותיים שמסכמים במדויק את תהליך הגרורות, ובכך מאפשרים תובנות מכניות לגבי האופן שבו תאי סרטן מתיישבים במוח. מודלים מסורתיים של הזרקת עורק תוך-קרוטידי לצורך גרורות מוח דורשים לעיתים קשירה קבועה של עורק הקרוטיד הנפוץ (CCA), מה שמשנה את ההמודינמיקה המוחית ופוגעת בשלמות מחסום הדם-מוח (BBB). הפרוטוקול מציג שיטה משופרת להקמת מודל עכבר מדויק במיוחד של גרורות מוח. החידוש המרכזי כולל את טכניקת Interlock Pulsatile Injection (IPI) להעברת תאי הגידול, ואחריה שחזור עורקי מיקרוכירורגי באתר הניקוב לשיקום זרימת הדם הפיזיולוגית ב-CCA. בהשוואה למודל הקשירה הקונבנציונלי של CCA, שיטת IPI–תיקון מיקרוכירורגי הפחיתה משמעותית את התמותה סביב הניתוח (2.86% לעומת 25.71%) והגבירה את שיעור היווצרות גרורות המוח (94.12% לעומת 65.38%). טכניקת ה-IPI עושה שימוש בתצורת מזרק טנדם כדי למזער החזרת תאי במהלך הזרקת תוך-קרוטיד. לאחר עירוי תאי הגידול, ה-CCA מתוקן בקפידה באמצעות תפרים מיקרוכירורגיים תחת סטריאומיקרוסקופ, ובכך נמנעת חסימה קבועה. דבר זה שומר על ההמודינמיקה המוחית הטבעית ושלמות ה-BBB בזמן כניסת תאי הגידול, תוך שיפור משמעותי בשיעורי הצלחת הניתוח והפחתת התמותה. הנגעים התוך-גולגולתיים הגרורתיים מאומתים באמצעות הדמיה ביולוגית סדרתית והיסטופתולוגיה. השיטה מספקת פלטפורמה מצוינת לחקר הפתופיזיולוגיה של גרורות מוח ולהערכה טיפולית פרה-קלינית, ובכך מסכמת את תהליך הגרורות.

מבוא

גרורות מוח מייצגות את הסוג הנפוץ ביותר של גידול מוחי ממאיר במבוגרים, ומתרחשות בערך פי עשרה יותר מאשר גידולי מוח ראשוניים¹. ההערכה היא ש-10%–20% מהחולים עם סרטן מערכתית יפתחו גרורות מוח בשלבים המתקדמים של המחלה, שהיא סיבה מובילה לתמותה ^1,2. למרות התקדמות משמעותית בטיפול בסרטן ראשוני, התחזית לחולים עם גרורות מוח נותרה נמוכה. שיעור ההישרדות לשנה של חולים עם גרורות מוח הוא פחות מ-20%³. המנגנון מדוע וכיצד חלק מהסרטנים מתפשטים למוח נותר לא ידוע. האתגר הטיפולי מחמיר בשל הביולוגיה הייחודית של גרורות המוח, כולל נוכחות ה-BBB, המיקרוסביבה החיסונית הייחודית של המוח, ואינטראקציות מורכבות של תאי הגידול^{עם תאי} נוירוגליה^.

גם מחקר פרמקודינמי וגם מחקר פתוגנזה על גרורות מוח מסתמכים במידה רבה על מודלים פרה-קליניים מדויקים של בעלי חיים שמסכמים במדויק את תהליך המחלה האנושית. מודלים בעלי חיים עכשוויים של גרורות מוח, אף שהם בשימוש נרחב, מבוססים בעיקר על השתלה אורתוטופית תוך-גולגולתית, הזרקה תוך-ורידית או וריד זנב, הזרקה תוך-לבבית, או הזרקת עורק תוך-קרוטידי 6,7,8,9,10. עם זאת, מודלים אלו משקפים באופן לא מושלם את התקדמות המחלה האנושית, ולעיתים נכשלים ללכוד שלבים מרכזיים כמו התפשטות תאי הגידול על פני BBB שלם בתנאי זרימה פיזיולוגיים¹¹. הזרקות תוך-ורידיות ותוך-לביות גורמות ליעילות נמוכה ביצירת גידולים ספציפיים למוח ולעיתים מובילות לגרורות חוץ-גולגולתיות נרחבות, הגורמות למוות מוקדם של בעלי חיים לפני התפתחות גרורות מוח משמעותיות¹². שיטת ההזרקה המסורתית לעורק תוך-קרוטידי מגבירה את שיעור היווצרות הגידולים התוך-גולגולתיים אך דורשת קשירה קבועה של ה-CCA. על ידי שינוי ההמודינמיקה המוחית, קישור זה עלול לגרום לאיסכמיה באזורים מוחיים דו-צדדיים ולפגוע בדפוסי זרימת הדם הפיזיולוגיים הנדרשים להעברת תאי הגידול, ובכך להשפיע על התפוצה המרחבית ונישת ההתיישבות במוח^13,14.

מודלים איכותיים של בעלי חיים שיכולים לחקות בצורה נאמנה יותר את הפתופיזיולוגיה של גרורות המוח הם קריטיים¹⁵. מודל גרורות מוח אידיאלי צריך לסכם את כל מפל הגרורות, כולל הכוונה של תאי הגידול לכלי דם מוחיים, אקסטרווזציה על פני מחסום הדם-מוח (BBB), ואינטראקציות דינמיות עם מיקרו-סביבת המוח¹⁶. נאמנות מודלים גבוהה היא קריטית הן למחקרים מכניים והן להערכה טיפולית⁶. עם זאת, מודלים קיימים של הזרקת תוך-קרוטיד אינם משחזרים באופן מלא מצבים פיזיולוגיים מרכזיים, במיוחד את שימור זרימת הדם המוחית התקינה ואת התפוצה הטבעית של תאי הגידול במחזור הדם.

כדי להתגבר על מגבלות המודלים הפרה-קליניים הקיימים של גרורות מוח, פותח מודל בעלי חיים באיכות גבוהה שמסכם בצורה מדויקת יותר את מפל הגרורות המבוסס על טכניקת IPI ותיקון עורקים מיקרוכירורגי. שיטה זו כוללת חסימה עורקית חולפת לאחר הזרקת תאי הגידול, ולאחר מכן תיקון מדוקדק של אתר הניקוב העורקי כדי לשחזר את זרימת הדם הפיזיולוגית ל-CCA המקביל. גישה זו לא רק משפרת את עקביות המודלים ושיעורי ההצלחה, אלא גם, באופן קריטי, משמרת את ה-BBB על ידי שמירה על המודינמיקה המוחית הטבעית. על ידי מזעור הפרעות בזרימת הדם המוחית, מודל ההזרקה התוך-קרוטיד המותאם מספק פלטפורמה מדויקת יותר שמסכמת בצורה מדויקת יותר את תהליך ההתיישבות הטבעי של גרורות מוח, ובכך מציעה כלי משופר לחקר מנגנוני גרורות מוח ולהערכת טיפולים פוטנציאליים.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המכון לביופיזיקה, האקדמיה הסינית למדעים (מספר אישור: SYXK2021124). בעלי חיים שהגיעו לנקודות קצה מוגדרות מראש הושמתו בהתאם להנחיות להמתת חסד של בעלי חיים של ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC) של המכון לביופיזיקה, האקדמיה הסינית למדעים, והנחיות AVMA להמתת חסד של בעלי חיים (2020)¹⁷.

1. הכנת המתלה התא היחיד

1. תרבית תאי B16F10 ו-4T1 במדיום RPMI-1640 מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
2. שמרו על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO₂.
3. אשר את ביטוי הלוציפראז ואמת היעדר זיהום מיקופלזמה יום לפני הניתוח.
4. ביום הניתוח, יש לקצור תאים כאשר הם מגיעים ל-80% מפגש על ידי שטיפה ראשונה עם מלח מפוזר פוספט (PBS) לפני טריפסיניזציה (0.25%) למשך פחות מ-3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
5. הוסיפו 10% מדיום RPMI-1640 המכיל FBS לתאים כדי לדכא את הטריפסין של 0.25%.
6. צנטריפוגה את התאים ב-300 × גרם למשך 3 דקות. שטוף תאים פעמיים ב-PBS כדי להסיר סרום שנותר, ואז ספר אותם עם המוציטומטר.
7. השתמשו במבחן Trypan Blue כדי לוודא שחיוניות התאים נשארת ב-90%–95% במהלך ההזרקה.
8. החזירו את התאים ב-PBS ב-2 ×-10⁶ תאים למ"ל. שמור על התאים על הקרח עד ההזרקה.
   הערה: ניתן להשתמש בתאי B16F10 ו-4T1 מסומנים בלוציפראז. B16F10 מוצג כדוגמה מייצגת.

2. הכנה לעכברים והכנה סביב הניתוח

1. השתמש בעכברים זכרים בני 7–8 שבועות C57BL/6.
2. הניחו כרית חימום מתחת ללוח הניתוח כדי למנוע היפותרמיה. הדליקו את כרית החימום 30 דקות לפני הניתוח.
3. חטא את כל כלי הניתוח, לוח הניתוח והכלוב עם אוטוקלאב. חטא את הסטריאומיקרוסקופ ושולחן הניתוח עם 75% אתנול.
4. פריטים אחרים שלא ניתן לחטא באמצעות אוטוקלבינג צריכים להיות מחוטאים באמצעות קרינת UV ו-75% אתנול (איור 1A).
5. שקלו את העכבר לפני ההרדמה ורשמו את המשקל לפני הניתוח כקו בסיס.
6. הוסף 10 גרם טריברומואתנול לצינור צנטריפוגה, ואז הוסיף 10 מ"ל אלכוהול אמיל שלישוני. נער את הצינור עד שהטריברומואתנול נמס לחלוטין.
   הערה: טריברומואתנול עלול לגרום לתופעות לוואי, כולל תמותה; עוקב בקפידה אחרי עומק ההרדמה.
7. סנן את התמיסה דרך פילטר של 0.22 מיקרון להכנת תמיסה מלאה של 100%.
8. מדלל את תמיסת המקור של 100% עם 0.9% NaCl מלח או מדלל לתמיסה עובדת של 2.5% (דילול 1:40). יש לבדוק את היעילות של כל תמיסה עובדת טרייה בהרדמה בעכברים.
9. הרדמה עכברים על ידי הזרקה תוך-פריטוניאלית (i.p.) של 2.5% טריברומואתנול במשקל 0.2 מ"ל/10 גרם משקל גוף. בעת הצורך, האריך את ההרדמה על ידי מתן מינון נוסף בשליש מנפח ההרדמה המקורי (איור 1B).
   הערה: התאימו את מינון ההרדמה בהתאם למשקל הגוף ועקוב באופן רציף אחרי הנשימה.
10. ודאו שהעכבר מורדם לחלוטין על ידי הפעלת גירוי קל (למשל, צביטת האצבעות) וצפייה בתגובה מוטורית.
11. תגלח את הפרווה באזור הצוואר ותעשה סימן גזירת אצבעות אחרי ההרדמה.
12. מרח משחה עיניים כדי להגן על העיניים מיובש.
13. הנח את העכבר על פלטת ניתוח ואבטח את ארבעת הגפיים והחותכות העליונות עם דבק (איור 1C).
14. מעקב אחרי עומק ההרדמה על ידי הערכת קצב הנשימה ורפלקס הצביטה כדי להבטיח שהעכברים נשארים ללא כאב וללא תנועה במהלך ההליך.
15. בעלי החיים מחולקים באקראי לקבוצות ניסוי, וניתוח הדמיה בוצע על ידי חוקרים עיוורים להקצאת קבוצות.

3. הליכים כירורגיים סטנדרטיים בטכניקת IPI ותיקון מיקרוכירורגי

1. חטא את אזור הצוואר באמצעות תמיסת פובידון-יוד ותן לעור להתייבש לחלוטין לפני התהליך (איור 1D).
2. פרוש את העכבר באופן אספטי באמצעות וילון כירורגי סטרילי, תוך חשיפה רק של אזור הצוואר (איור 1E).
3. בצע חתך צוואר הרחם במרכז באורך של כ-0.8–1 ס"מ באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים, עם מלקחיים עדינים למשיכת רקמות (איור 2A).
4. בצע ניתוח קהה של הפאשיה השטחית והשרירים התחתונים באמצעות מלקחיים בזווית עדינה לחשיפת מעטפת הקרוטיד הימנית (איור 2B1, איור 2C1).
5. בודד את עורק התרדמה החיצוני הימני (ECA) מעטפת הקרוטיד וקשור את ה-ECA הימני כדי למנוע דליפת תאים לענפים החוץ-גולגולתיים (איור 2B2, איור 2C2).
6. בודדו בזהירות את ה-CCA הימני בתוך מעטפת התרד, תוך שמירה על עצב הואגוס הממוקם בצדדים ומתחת לכלי הדם (איור 2C1).
7. הניחו חתיכה קטנה של כפפת גומי וכדור כותנה רטוב במי מלח מתחת ל-CCA הימני המבודד ככרית כדי להרים ולייצב את הכלי.
   הערה: הרמת ה-CCA מייצבת את הכלי ומקלה על ניקוב והזרקה מדויקים. (איור 2B4, איור 2C4).
8. מניחים שני קשרים לא מהודקים עם לולאות פתוחות על ה-CCA דיסטלי ופרוקסימלי לכדור הכותנה, ואז קשור את הקשר הפרוקסימלי (איור 2B3, איור 2C3).
9. הניחו קליפס מיקרווסקולרי על ה-CCA ליד הקשר הדיסטלי הלא מהודק כדי לחסום זמנית את זרימת הדם של ה-CCA (איור 2B4, איור 2C4).
10. השתלת תאי סרטן
    1. פנצ'ר בנעילת אינטרלוק
       1. נקב את הקטע המוגבה של ה-CCA הימני באמצעות מחט 32G כשהזדמון פונה כלפי מעלה.
       2. הוציא את המזרק הראשוני תוך שמירה על מיקום הנקבה.
       3. מערבב את תאי הסרטן במערבב ושואב 100 מיקרוליטר למזרק המיקרוליטר, כך שמבטיח שלא יישאפו בועות אוויר.
       4. הכנס את קצה המחט של מזרק המיקרוליטר לאתר הדקירה שנוצר בשלב 3.10.1.1 והחזק אותו ביציבות מבלי להתחיל בהזרקה כדי להבטיח מיקום יציב לפני מתן התא (איור 2B5, איור 2C5, איור משלים 1).
          הערה: השתמש במזרק 32G לניקוב ובמזרק מיקרוליטר להזרקה כדי להבטיח מיקום יציב ומשלוח מבוקר. איור משלים 1 מציג את הפרמטרים של שני המזרקים. הקוטר החיצוני של מזרק 32G הוא 0.22 מ"מ, בעוד שמחט המיקרוליטר הוא 0.26 מ"מ, מה שמקל על החדרה בטוחה והזרקה מבוקרת.
    2. הזרקה פולסטילית (איור 2C5)
       1. הסר את הקליפ המיקרווסקולרי שהוחל בשלב 3.9.
       2. התחל בהזרקת תאי הגידול לתוך ה-ICA דרך מזרק המיקרוליטר.
       3. למסור את המתלה באמצעות תנועת הזרקה פולסטילית, תוך התקדמות עדינה של הבוכנה בפולסים קטנים במקום בלחץ רציף.
       4. מתן השעיה לפי אחד מהקריטריונים הבאים: קריטריון מחזור הלב, הזרקת ~1 מיקרוליטר של תלות תאי כל 8 מחזורי לב, בהנחיית זרימת דם פועמת רטרוגרדית בעורק הקרוטיד הפנימי הדיסטלי; או קריטריון קצב ההזרקה, הזרקת ~1 מיקרוליטר לשנייה תוך הבטחת שהקצב לא יעלה על 60 מיקרוליטר/דקה.
       5. עקוב אחרי הכלי בזמן ההזרקה. מתן מוצלח מצוין כאשר הכלי האדום הופך לשקוף זמנית כאשר התלייה עוברת דרך הלומן, ללא אקסטרווזציה נראית לעין סביב אתר הניקוב.
       6. לאחר סיום ההזרקה, משוך בזהירות את מזרק המיקרוליטרים.
       7. הדק מיד את הקשר הדיסטלי בצורה מבוקרת כדי לאטום את הכלי ולהפחית הקאה (איור 2B6, איור 2C6).
          הערה: הזרקת פולסאטיל מפחיתה פרפוזיה מופרזת ומצמצמת את הסיכון לעליית לחץ תוך-גולגולתי.
11. תיקון מיקרוכירורגי (איור 2B6, איור 2C6)
    1. השתמשו בתפר מיקרוכירורגי ניילון 10-0 כדי לסגור את אתר הדקירה בצורה אטומה למים, תוך מיקום נקודות הכניסה והיציאה של המחט מיד סמוכות לשוליים של הפגם כדי למזער דליפת כלי דם ולשמור על פטנסי האור.
    2. העבר את מחט התפר המיקרוכירורגית דרך חור הדקירה בדופן כלי הדם בהגדלה גבוהה והשאיר את התפר פתוח זמנית.
    3. שטפו את שדה הניתוח עם סליין הפריטיני.
    4. אבטח את התפר עם שניים עד שלושה קשרים מרובעים.
    5. קצץ את קצות התפר החופשיים לכ-1–2 מ"מ כדי למנוע התרופפות תוך הפחתת עומס גופים זרים.
       הערה: פרוצדורות כירורגיות סטנדרטיות של טכניקת IPI ותיקון מיקרוכירורגי מתוארים בסרטון משלים 1.

4. שיקום זרימת הדם של ה-CCA

1. שחרר בהדרגה את הקשר הפרוקסימלי.
2. שטוף את הלומן כדי להסיר כל קריש מיקרוסקופי פוטנציאלי. הניחו כדור כותנה יבש בשדה הניתוחים כדי לעקוב אחר דימום מופרז.
3. לאחר שאין איפוזיה פעילה מאתר הניקוב, יש לשחרר בזהירות את הקשר הדיסטלי כדי לשחזר את זרימת הדם הקרוטידי (איור 2B7, איור 2C7).

5. אישור תיקון מוצלח

1. שיקום הפולסציה
   1. צפו ב-CCA לפולסים חזקים, המצביעים על פרפוזיה מוצלחת.
2. אימות תקינות ושלמות הכלי
   1. בדוק את אתר התיקון כדי לוודא שהוא נקי מהיצרות ושהלומן נשאר פטנט ורציף עם מקטע הכלי הפרוקסימלי.

6. שטיפת פצעים וסגירה

1. השטוף היטב את שדה הניתוח במי מלח רגילים ללא הפריטין להסרת פסולת וקרישי דם.
2. סגרו את חתך העור באמצעות תפר רציף.
   הערה: שמרו על שדה ניתוח לח ובצעו את כל המניפולציות בעדינות כדי למזער פגיעה ברקמות.

7. טיפול לאחר הניתוח

1. תמיכה נוזלית: מתן 0.5–1 מ"ל סליין סטרילי חם תת-עורי מיד לאחר הניתוח כדי לפצות על אובדן נוזלים סביב הניתוח.
2. מניעת זיהומים: אם משך הניתוח עולה על 40 דקות, יש לתת אנרופלוקסאצין (5 מ"ג/ק"ג, פעם ביום) למשך 3 ימים רצופים. אין צורך באנטיביוטיקה אם ההליך נמשך פחות מ-40 דקות.
3. תזונה והידרציה: יש לספק הידרוג'ל או מזון מרכך לפחות שבוע לאחר הניתוח כדי להבטיח הידרציה ותזונה מספקת.
4. ניטור יומי: לבצע הערכות בריאות יומיות, לעקוב אחרי התנהגות מעגלית, ליקויים נוירולוגיים, זיהום פצעים וירידה במשקל.
5. מהלך צפוי לאחר הניתוח: במהלך 48 השעות הראשונות, עכברים עשויים להראות ירידה בפעילות, זקפה קלה וירידה במשקל עד 15% מהבסיס לפני הניתוח, ואחריה החלמה הדרגתית.
6. הקלה בכאבים: מתן מלוקסיקאם (5 מ"ג/ק"ג, תת-עורית) פעם ביום למשך 2–3 ימים להקלה על הכאב ולקידום ההחלמה.

8. קריטריוני הערכה להקמת מודלים מוצלחים של בעלי חיים

1. ניטור משקל גוף
   1. שקלו את העכברים מדי יום ורשמו את משקל הגוף.
2. הערכה קלינית
   1. העריכו סימנים קליניים מדי יום, כולל יציבה והתנהגות מעגלית.
3. הדמיה ביולומינצנצנטית
   1. הפעל את מתגי ההפעלה של מכשיר ההדמיה והמחשב.
   2. הפעל את תוכנת ניתוח הדמיית ביולומינצנציה (גרסה 4.7.2) ולחץ על "אתחול" כדי לאתחל את מערכת ההדמיה הביולומינסנטית.
   3. במהלך האתחול, נורית מצב הטמפרטורה בלוח הבקרה של מערכת ההדמיה תיראה באדום. בצע הדמיה רק לאחר שאור מצב הטמפרטורה הופך לירוק.
   4. הרחק אוכל ומים מעכברים למשך 6 שעות לפני ההדמיה כדי למנוע שאיבה במהלך הרדמה.
   5. הכינו את מצע ההדמיה בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל, מוגן מאור לאורך כל ההליך. חשב את נפח ההזרקה במשקל גוף של 10 מיקרוליטר/גרם.
   6. הרסן את העכבר להדמיה. נקה את אתר ההזרקה בבטן השמאלית התחתונה עם 75% אלכוהול רפואי.
   7. השתמש במקלון כותנה כדי לגרות בעדינות את דופן הבטן באתר ההזרקה כדי למזער את הסיכון שהמחט תיכנס למעי.
   8. לאחר ניקוב דופן הבטן, שאיבו בעדינות כדי לאשר את היעדר הדם, ואז הזריקו לאט את מצע ההדמיה בתוך החיים .
   9. לאחר 4 דקות ו-30 שניות לאחר הזרקת המצע, העבר את העכבר לתא הרדמה.
   10. השרה הרדמה באמצעות איזופלורן 3%. לאחר שהרפלקסים של ההתיישרות והצביטה אובדים, הפחיתו את ריכוז האיזופלוראן ל-2% לצורך תחזוקה.
   11. הניחו את העכבר המורדם בתא ההדמיה, ודאו שחרוט האף מכסה במלואו את הפה והאף. סגור היטב את דלת תא ההדמיה.
   12. בלוח הבקרה של מערכת ההדמיה, בחרו במצב "Luminescent" כמצב הדמיה. הגדר את זמן החשיפה ל-60 שניות ידנית. בחר "צילום", "שכבה" ו"רשת יישור".
   13. הגדר את שדה הראייה ל-D להדמיית שלושה עכברים. כוון את גובה ההדמיה ל-1.5 ס"מ. בחר "חסימה" עבור מסנן ההתרגשות ו"פתח" עבור מסנן הפליטה.
   14. 10 דקות לאחר הזרקת המצע, לחץ על "רכוש" כדי לצלם את התמונה.
   15. לאחר רכישת התמונה, עברו לפלטת הכלים ובחרו "ROI Tools". השתמש בכלי "Circle" כדי להגדיר את אזור העניין (ROI), ואז לחץ על "Measure ROIs" לקבלת נתונים כמותיים.
4. ניתוח היסטולוגי
   1. קצור רקמות מוח בנקודת הקצה של הניסוי וחשוף אותן לניתוח היסטולוגי.
   2. זהה ואישור נגעים גרורתיים על ידי צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E).

9. נקודות קצה הומניות

1. כדי להבטיח את רווחת בעלי החיים ועמידה בסטנדרטים אתיים, נקבעו נקודות קצה הומניות מוגדרות מראש כקריטריונים להמתת חסד מיידית.
2. עכברים עוברים המתת חסד באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני (CO₂), ואחריו ניתוק צוואר הרחם כאמצעי פיזיקלי משני לאישור המוות.
3. יש לבצע המתת חסד מיידית אם מתרחש אחד מהמצבים הבאים.
   1. ליקויים נוירולוגיים
      1. תפקוד מוטורי: אטקסיה (הליכה לא יציבה, התנדנדות), סיבוב, שיתוק, המיפרזיס או רעד.
      2. שינויים התנהגותיים או מודעים: עייפות, תרדמת או תרדמת.
      3. סימנים לעלייה בלחץ תוך-גולגולתי: יציבה לא תקינה (למשל, גב כפוף המצביע על מצוקה) או הטיית ראש.
      4. התקפים: עוויתות כלליות או מוקדיות.
   2. שינויים במשקל הגוף ובתפקוד הפיזיולוגי
      1. ירידה במשקל הגוף שעולה על 20% או חוסר יכולת לאכול או לשתות באופן עצמאי עקב עומס גידול או חולשה חמורה.
      2. קוצר נשימה (נשימות כבדות או נשימות כבדות) או אי שליטה במתן שתן/צואה.
   3. מצב הגידול
      1. סיימו את הניסוי מיד אם מתגלה כיב, זיהום או נמק הקשורים לגידול.
   4. עומס הגידול המקסימלי הנסבל
      1. עכברים עוברים הדמיה ביולומינצנציית פעמיים בשבוע.
      2. כאשר אות הגידול התוך-גולגולתי נכנס לשלב גדילה אקספוננציאלי (למשל, הכפלה בין שני מפגשי הדמיה רצופים), הניטור הנוירולוגי מוגבר לפעמיים ביום.
      3. המתת חסד בוצעה מיד עם תחילת האטקסיה או התקפים, ללא קשר לערך האות ביולומינציה.

תוצאות

הדמיה ביולוגית וניתוח כמותי
בהתאם לפרוטוקול הכירורגי הסטנדרטי, מודל העכבר האופטימלי של גרורות מוח הדגים אותות ביולומינסנטיים תוך-גולגולתיים יציבים בהדמיה סדרתית בגוף לאחר הניתוח. הדמיה ביולוגית מתמשכת ב-vivo (איור 3A) וניתוח כמותי (איור 3B) במשך 4 שבועות לאחר חיסון תוך-קרוטיד הראו שתאי B16F10 גרורתיים התרבו בתוך מיקרו-סביבת המוח. ניטור משקל גוף לאחר ניתוח הראה ירידה הדרגתית במשקל בעכברים נוש...

דיון

מודלים פרה-קליניים חזקים שמסכמים במדויק גרורות מוח חיוניים להבהרת מנגנונים פתופיזיולוגיים ולהערכת יעילות טיפולית. מודל ההזרקה התוך-קרוטידי המסורתי דורש קשירת עורק התרדמה הרגיל (CCA), אשר משנה את זרימת הדם המוחי באופן לא פיזיולוגי, מה שעלול לגרום לפציעה איסכמית איפסילטרלית ולהפרת מחסום הדם-מוח (BBB)^9,11,15,16. למודל זה יש שלוש מגבלות עיקריות: החזרת תאי הגידול הק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10-0 microsurgical suture with needle	לינגקיו	2650798	תפר מיקרוכירורגי לתיקון חור החדרה בעורק הצוואר המשותף
100 µL microliter syringe	Bolige Tools	100UL	מזרק מיקרוליטרי להעברת תאים של גידול במהלך הזרקה פולסטילית
100 µL pipette	Eppendorf	3123-000250	פיפטה להשקיה במלח של שדה הניתוח
32G 1 mL insulin syringe	Kindly	YY0497	מזרק אינסולין המשמש ליצירת חור החדרה ראשוני של עורק
4-0 silk suture	Ethicon	W501	חומר תפר לסגירת חתך העור
4T1 breast cancer cell line	הושג מהמעבדה של שנגדיאן וואנג, המכון לביופיזיקה, האקדמיה הסינית למדעים	CRL-2539	קו תאים של גידול המשמש למודל של גרורות מוחיות תוך-עורקיות
75% Ethanol	Annjet	Q/371402AAJ008	חומר חיטוי לניקוי אתר ההזרקה
7–8-week-old male C57BL/6J mice	Charles River Laboratories	1.10011E+17	בעלי ניסוי המשמשים למודל של גרורות מוחיות B16F10
8-week-old female BALB/c mice	Charles River Laboratories	1.10011E+17	בעלי ניסוי המשמשים למודל של גרורות מוחיות 4T1
Angled-tip forceps	Kewo Tools	—	מלקטים מיקרוכירורגיים לניתוח רקמות ולטיפול בכלי דם
B16F10 melanoma cell line	הושג מהמעבדה של שנגדיאן וואנג, המכון לביופיזיקה, האקדמיה הסינית למדעים	CRL-6475	קו תאים של מלנומה המשמש למודל של גרורות מוחיות תוך-עורקיות
Bioluminescence imaging analysis software	Living Image (גרסה 4.7.2)	—	תוכנה לניתוח נתונים של הדמיה זורחת ביולוגית
DMEM	Xigong Bio Tech	M1805	מדיום תרביות תאים לתחזוקת תאים של גידול
Enrofloxacin (אנטיביוטיקה)	MCE	HY-B0502	אנטיביוטיקה המשמשת למניעת זיהומים לאחר ניתוח
Eosin Y solution	Beyotime	E301879	חומר צביעה היסטולוגי לצביעת יאזין
Eye ointment	Baiyunshan	H44023089	משחה עיניים להגנה על העיניים במהלך הרדמה
Fetal bovine serum (FBS)	Pan Sera Tech	ST30-3302	תוסף סרום למדיום תרביות תאים
GraphPad Prism	גרסה 4.7.2	—	תוכנת ניתוח סטטיסטי לעקומות הישרדות וניתוח נתונים כמותי
Hematoxylin solution	Beyotime	C0105S	חומר צביעה היסטולוגי לצביעת המטוקסילין
Isoflurane	H.F.Q. Biotechnology	101357015	חומר הרדמה להשאיפה המשמש בהליכי הדמיה
IVIS Spectrum in vivo imaging system	Lumina Series III	—	מערכת הדמיה לצילום ביולוגי זורח ביולוגית in vivo
Meloxicam (analgesic)	Qilu Animal Health	150252467	תרופה אנטי-דלקתית שאינה סטרואידית המשמשת להרדמה לאחר ניתוח
Microsurgical scissors	Kewo Tools	—	מספריים מיקרוכירורגיים לניתוח רקמות
Mini vessel clip	Zheyong Tools	200521	קליפ מיקרו-כלי דם לחסימה זמנית של העורק הצוואר המשותף
Needle holder	Jiangxin Tools	1420 20Cr13	מכשיר כירורגי לטיפול בתפרים מיקרוכירורגיים
Paraformaldehyde (4%)	Zhongsheng Wanda Tech	20240411	חומר קיבוע לשימור רקמת המוח לפני ניתוח היסטולוגי
Penicillin	Gibco	1758-9324	אנטיביוטיקה לתרביות תאים
Povidone-iodine solution	Sihuanpai	Q/PGSHW0009	תמיסת חיטוי לחיטוי עור כירורגי
RPMI-1640 medium	Xigong Bio Tech	12-115F	מדיום תרביות תאים לצמיחת תאים של גידול
Scilogex mixers	Scilogex	MX-S	מיקסר וורטקס להמוגניזציה של השעיית תאים של גידול
Steam indicator tape	3M-Comply	1322-24MM	סרט מחוון עיקור לכלי ניתוח מעוקרים
Stereomicroscope	Olympus	SZ61	מיקרוסקופ המשמש להדמיה במהלך פרוצדורות מיקרוכירורגיות
Zeiss Stemi 508 stereomicroscope	Zeiss	Stemi 508	מיקרוסקופ סטריאומסקופי המשמש להדמיה כירורגית בהגדלה גבוהה
Sterile saline (0.9%)	Kelun	25M14D07	תמיסת השקיה סטרילית המשמשת לשמירה על לחות שדה הניתוח
Streptomycin	Gibco	1758-9319	אנטיביוטיקה לתרביות תא