מאמר מחקר

הערכת השפעת מסננים מצופים ומסננים מקדימים על ההדבקה והריכוז של וירוס Phi6 שהתרומם

DOI:

10.3791/70877

⸱

29 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Atmospheric Composition Research, Finnish Meteorological Institute, 2Department of Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences, University of Helsinki, 3Department of Microbiology, Faculty of Agriculture and Forestry, University of Helsinki, 4Department of Otorhinolaryngology and Phoniatrics-Head and Neck Surgery, Helsinki University Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים מחקר להערכת היעילות האנטי-ויראלית של ציפויים מבוססי נחושת וכסף על מסנני אוויר. באמצעות תא ביואירוסול ובקטריופאג' Phi6, שיטה זו מכמת את השבתה של הנגיפים ואת יעילות הסינון המכנית לטכנולוגיות חיטוי עצמי של אוויר פנימי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח טכנולוגיות סינון אוויר פנימיות יעילות זכה לתשומת לב בעקבות מגפת הקורונה 2019 (COVID-19). מטרת המחקר היא להעריך את היעילות האנטי-ויראלית של ציפויים שונים מבוססי נחושת וכסף למסנני אוויר באמצעות תא ביואירוסול סטנדרטי והבקטריופאג' העטוף Phi6 כתחליף לוירוסים נשימתיים. בדיקות שטח אישרו שכל הציפויים הראו פעילות אנטי-ויראלית, כאשר נוסחת הציפוי הספציפית מבוססת נחושת (B4) השיגה השבתה מלאה של נגיף Phi6 תוך 10 דקות, A6 תוך 25 דקות, ו-VS-B תוך 60 דקות; הירידה המוקדמת בזיהום נבעה בעיקר מהתייבשות הטיפות. ניסויי אירוסול הראו כי מסנני אוויר חלקיקים (HEPA) יעילים מאוד ומסננים מוקדמים הפחיתו משמעותית את ההדבקה הנגיפית גם ללא ציפויים, כאשר סינון מכני גורם להפחתה של 1.0–2.0 לוגריתם, ומסנני סיבי זכוכית GF-2 בעלי יעילות גבוהה מבטלים וירוס זיהום שניתן לזיהוי. הציפויים לא שיפרו משמעותית את יעילות הסינון, ככל הנראה בשל מגע מוגבל עם וירוסים עם משטחים מצופים. מסנני GF-2 ששימשו הראו שיפור בהסרת וירוסים, המיוחס להצטברות חלקיקים וצפיפות מסננים, בעוד שהציפויים לא שינו את מספר העותקים של הווירוסים העוברים דרכם. מסננים מצופים VS-B הראו תכונות ליפופיליות, מה שמרמז על יתרונות פונקציונליים נוספים. שיטה זו מדגישה שבעוד שיעילות המסנן מונעת בעיקר על ידי לכידה מכנית והצטברות חלקיקים, הציפויים המשולבים מספקים מנגנון חיטוי עצמי על ידי השבתת חלקיקי ויראליים כלואים; שילוב אור אולטרה סגול (UV) מוצע ככיוון מחקר עתידי לשיפור יעילות המערכת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההבנה של העברת וירוס באוויר התקדמה משמעותית במהלך מגפת הקורונה. בהינתן שסביבות פנימיות מציבות סיכון גבוה משמעותית להדבקה מאשר סביבות חיצוניות, יש צורך דחוף לפתח אסטרטגיות הגנה יעילות יותר 1,2. בהקשר זה, מערכות מיזוג אוויר וטיהור אוויר בעלי ביצועים גבוהים מהווים רכיבים חיוניים להפחתת העברת הווירוסים במרחבים סגורים.

סינון אוויר הוא אחת השיטות הנפוצות ביותר במערכות טיהור אוויר, בהתבסס על תכונות סינון פיזיקליות פנימיות וסינון רב-שכבתי 3,4,5. לעיתים קרובות זה כולל מסנן מקדים, מסנן גס הלוכד חלקיקים גדולים; מסנן בעל יעילות בינונית, לדוגמה, מסנן פחמן; ומסנן אוויר חלקיקי (HEPA) יעיל מאוד שמסיר לפחות 99.97% מהחלקיקים עם גודל חלקיקים חד ביותר של 0.3 מיקרומטר 6.7. התכונות הפיזיקליות של המסננים מכילות יתרונות אנטי-מיקרוביאליים רבים. הוכח בעבר שחומרים נקבוביים יכולים לנטרל וירוסים על ידי לכידתויבוש 8,9,10. הידרופוביות או הידרופיליות יכולות לשמש גם בהתאם. וירוסים עם שכבות הידרופוביות מעדיפים משטחים הידרופוביים לספיעה, בעוד שמשטחים הידרופיליים מושכים וירוסים הידרופיליים11,12. בנוסף, ניתן להשתמש בציפוי אנטי-ויראלי לשיפור נוסף של הטיהור. ציפוי המסננים נועד לנטרל פתוגנים מיד כאשר הם נוגעים במסנן13,14. תכונות אלו עשויות לשפר את הבטיחות התפעולית, במיוחד בבתי חולים, אך גם בסביבות ציבוריות במהלך מגפות ומגפות.

ליישומים מעשיים, אפקט השבתה של ציפויי המסנן חייב להיות מהיר מספיק כדי שישמש בזרימת אוויר. לכן, שטח הפנים למגע ישיר בין הציפוי לחלקיקי הווירוס צריך להיות מספיק, והציפוי צריך להיות מסוגל לנטרל את הווירוס בזמן המגע הנתון. מתכות כבדות, כמו נחושת וכסף, ידועות כבעלות השפעות אנטי-ויראליות 15,16,17. השפעה אנטי-ויראלית זו נצפתה עבור וירוסים כגון פוליו-וירוס, וירוס ווקסיניה, הרפס סימפלקס 1, Phi6, פפו-וירוס SV-40, אדנו-וירוס, וירוס סטומטיטיס וזיקולרי, SARS-קורונה, בקולווירוס ווירוס פריטוניטיס זיהומי חתולי 18,19,20,21,22. המנגנונים כוללים שחרור יוני נחושת וכסף ויצירת מיני חמצן תגובתיים (ROS), המגיבים עם חלבוני וירוס ומחמצנים חומצות גרעין 23,24,25,26,27,28,29,30.

למחקר זה פותח תא בדיקה למסנן אירוסול עם תכונות דגימה מתכווננות של אירוסולים ווירוסים, בהתבסס על מערכת תא קודמת שהוצגה על ידי סופיבה ואח' (2022) (ראו איור 1 ואיור משלים 1)31). התא המותאם תוכנן כמערכת סגורה שבה וירוסים מודלים לווירוסים הגורמים למחלות נשימה פתוגניות מושפעים מהמסננים, ומעריך את היעילות האנטי-ויראלית של המסננים המצופים והלא מצופים. הבקטריופאג' העטוף Phi6 נבחר כתחליף לוירוסים נשימתיים, משום שמדובר במודל נחקר ונפוץ המתאים למחקרי אירוסולים ויראליים. מכיוון ש-Phi6 אינו פתוגני לבני אדם ומסווג כרמת בטיחות ביולוגית 1 (BSL-1), הוא מאפשר הערכה בטוחה ומעשית של ציפויים אנטי-ויראליים בסביבת מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) בהתאם להנחיות בטיחות מוסדיות. יתרה מזאת, ל-Phi6 יש דמיון מבני עם וירוסים עטופים הגורמים למחלות נשימה, כגון נגיפי הקורונה 1 ו-2 (SARS-CoV-1 ו-SARS-CoV-2). מעטפת הליפידים שלו מעניקה גם רגישות מיוחדת לייבוש ולנטרול כימיקלים, ומספקת מודל מייצג להערכת היעילות של ציפויים אנטימיקרוביאליים ומערכות סינון מול פתוגנים עטופים 32,33,34,35,36,37,38,39.

מטרת המחקר הייתה תחילה לנתח את היעילות האנטי-ויראלית של חומרי הציפוי הנבחרים המכילים נחושת וכסף לפי פני השטח, באמצעות בדיקות שטחיות עם חיידקי Phi6 לפני השימוש בסינון אוויר. בהמשך, חומרי הטיפול המשטחיים המבוססים על נחושת וכסף נבדקו על מסנני אוויר מוקדמים כדי להעריך את יכולתם לשפר את תכונות הסינון וההסרה מפני וירוסים באוויר.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספירת וירוסים, זנים, מדיומים לגדילה וווירוסים זיהומיים
הבקטריופאג' Phi6, שסופק במקור לקבוצת המחקר על ידי ד"ר אן ק. וידבר40, הופץ באמצעות Pseudomonas syringae pv. פאזאוליקולה HB10Y הוא חיידק המארח. המארח גודל במדיום לוריה–ברטני (LB) בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס. מלאי אגר Phi6 הוכנו מחומר קפוא באמצעות דילול סדרתי, בהתאם לפרוטוקול של Bamford ואחרים (1995)41, ושימשו הן לבדיקות עמידות פני שטח והן לטיהור וירוסים.

טיהור וריכוז Phi6 בוצעו בהתאם לפרוטוקול שפותח על ידי Bamford ואח' (1995)41. המתלה שהתקבלה דוללה בבופר פספט אשלגן (K₃PO₄) של 20 מילימטר המכיל 1 מילימטר מגנזיום כלוריד (MgCl₂), מותאם ל-pH 7.2, כדי להניב טיטר סופי של 5 ×10 10–10 11 יחידות יצירת פלאק למיליליטר (PFU/mL). המתלה המוכן הזה שימש לאחר מכן לניסויים בייצור אירוסולים.

ספירת חלקיקי ויראליים מדבקים בוצעה באמצעות בדיקת פלאק שכבת אגר דו-שכבתית סטנדרטית, שאופטימלית לבקטריופאג' Phi642. בקצרה, הוכנו דילול סדרתי ראשוני במדיום LB לכל דגימת וירוס או ביקורת, ולאחר מכן נוספו ל-100 מיקרוליטר מכל דילול, 200 מיקרוליטר של השענת חיידק מארח ו-3 מ"ל אגר רך. תערובות האגר הרכות הונחו מעל לוחות אגר LB והצלחות דגרו בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. לאחר מכן נספרים פלאקים ומספר ה-PFU/mL מחושב כ(פלאקים × גורם דילול) / נפח מצוף.

ניתוח qRT-PCR
הכנת הדגימה לתגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (qRT-PCR) עברה לפי הפרוטוקול של גרגורובה ואח' (2022)43. עקומות סטנדרטיות ל-RNA של P2 ו-P8 נוצרו באמצעות סדרת דילול של 10 פעמים, הנעה בין 10ל-2 עד 10 9 מולקולות ל-5 מיקרוליטר. כל דילול עובד באופן זהה לדגימות ניסיוניות, כולל הוספת כלורופורם, וורטקסינג, צנטריפוגציה ב-10000 × גרם למשך דקה אחת ב-22 מעלות צלזיוס, ומחזור (מידע על מחזור ופריימר בטבלה המשלימים 1 ובטבלה משלימה 2). בקרות שליליות הוכנו על ידי החלפת 5 מיקרוליטר מים אולטרה-טהורים בתבנית ה-RNA. נתוני qRT-PCR נותחו באמצעות תוכנת עיצוב וניתוח ספציפית (ראו טבלת חומרים).

הגדרת תא אירוסול
פותח תא אירוסול מותאם אישית לאירוסוליזציה ובדיקות סינון של וירוסים, בהשראת מערכת31 שתוארה קודם. תא הניסוי כלל גוף זכוכית גלילי עם מכסה תואם, פיגום מתכתי פנימי ואטמים מבודדים להבטחת אטימה אטומה (ראו טבלת חומרים ואיור משלים 1).

מבנה המחקר הכולל, כולל התא, מוצג באיור 1. כדי להבטיח קלט יציב וניתן לשחזור של אירוסולים ויראליים, נעשה שימוש בנבולייזר בשילוב עם משאבת אוויר (ראו טבלת חומרים).

בתוך החדר, הנבולייזר יצר זרימת אירוסולים של 8 ליטר לדקה. כשלושה רבעים מהזרימה הזו הופנתה לפליטה דרך מסנן HEPA, בעוד הרבע הנותר (2 ליטר לדקה) נכנס לתא. פיצול זה תוכנן להפחית לחות במהלך מדידות ממושכות. אירוסולים הוכנסו לתא דרך משפך מתכתי, שהנחה את הזרימה אל פני המסנן או פני הפילטר.

ניסויי אירוסול בוצעו בתוך ארון בטיחות ביולוגית. לאחר המעבר דרך התא, זרימת האוויר עברה ללחות במייבש כדי להגן על מסנן ה-HEPA ומד הזרימה מפני לחות מופרזת. משאבה חיצונית תמכה עוד יותר בזרימת האוויר, יצרה לחץ שלילי בתוך המערכת והבטיחה פליטה יעילה דרך פתח היציאה.

figure-protocol-1
איור 1: סכמטי של תא האירוסולים הניסיוני ואוסף הדגימות. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה רחבה יותר של איור זה.

עיצוב המחקר
מחקר זה העריך את התכונות האנטי-ויראליות של ציפויים וחומרים מסננים/סינון מוקדם המפורטים בטבלה 1, טבלה משלימה 3 וטבלה משלימה 4 (ראו גם טבלת חומרים). החקירה נערכה בשני שלבים: בדיקות שטח ובדיקות סינון מקדים בתא האירוסול.

בבדיקות שטח, כל חומרי הציפוי הוערכו תחילה על חלקי בדיקה שטוחים כדי לקבוע את פעילותם האנטי-ויראלית. חלקי הבדיקה המצופים סופקו על ידי Clean Touch Medical LTD (טבלה 1 וטבלת החומרים). כל הציפויים מבוססים על רכיבים פעילים מנחושת ו/או כסף המוטמעים במטריצות קנייניות; ההבדלים בין הנוסחאות נוגעים בעיקר להרכב המתכת, ריכוז ותאימות פני השטח (למשל, משטחים שטוחים לעומת מסננים נקבוביים) (טבלה משלימה 3).

בדיקות סינון מקדים בתא האירוסול: מבין הציפויים הזמינים, ניתן היה להחיל רק ציפוי VS-B מבוסס נחושת וכסף על מסננים מוקדמים במהלך המחקר. לכן מסננים מוקדמים שטופלו ב-VS-B נבדקו בתא האירוסול כדי להעריך את ביצועיהם האנטי-ויראליים בתנאי חשיפה לאירוסולים. תמונות של כל המסננים והמסננים ששימשו במחקר מוצגות באיור המשלים 2.

היעילות האנטי-ויראלית נמדדה בשתי שיטות משלימות: בדיקת פלאק למדידת מספר חלקיקי הווירוסים המדבקים (ראו סעיף "וירוס, זנים, מדיום גדילה וספירות וירוסים זיהומיים"), ו-PCR כמותי (qPCR) לקביעת מספרי עותקי הגנום הוויראלי (ראו סעיף "ניתוח qRT-PCR").

מסננים ומסננים מוקדמיםמסנן מסופק על ידיציפויים
(כולם סופקו על ידי Clean Touch Medical)
פוליאסטר קדם-פילטר FMR-5, ללא ציפוי (FMR-5)M-filter LTDסוכן שטח ניסיוני מבוסס נחושת A6 (A6)
סוכן שטח ניסיוני מבוסס נחושת B4 (B4)
סוכן שטחי נחושת וכסף Viral Safe (VS)
סוכן שטחי נחושת וכסף Viral Safe B (VS B)
פוליאסטר FMR-5, מצופה ב-VS B (FMR-5 VS B)
פלטר מוקדם פוליאסטר S-11, לא מצופה (S-11)
פלטר מוקדם פוליאסטר S-11, מצופה ב-VS B (S-11 VS B)
פילטר סיבי זכוכית דו-שכבתי GF-2, לא מצופה, (מסנן מסוג HEPA) (GF-2)
בולפרן פרה-פילטר BP-6, 6 מ"מ, לא מצופה (BP-6)קלין טאץ' מדיקל בע"מ
פרה-פילטר בולפרן BP-6, 6 מ"מ, מצופה ב-VS B (BP-6 VS B)

טבלה 1: מסננים וציפויי שטח ששימשו במחקר זה.

יעילות ציפויי פני השטח האנטי-ויראלי
פותחה בדיקת כדאיות שטחית להערכת עמידות ההדבקה הוויראלית על חומרי ציפוי שונים. בקצרה, 20 מיקרוליטר של חומר Phi6 (ראו סעיף "וירוס, זנים, מדיות גדילה וספירות וירוסים זיהומיים") הושפכו על חלקי הבדיקה המצופים ופוזרו באופן שווה על שטח של 2 ס"מ × 2 ס"מ באמצעות משולש זכוכית סטרילי. הדגימות נדגרו בארון בטיחות ביולוגית בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס למשך דקה, 5 דקות, שעה או 3 שעות.

הווירוסים נאספו על ידי הוספת 180 מיקרוליטר של ציר LB טרי לפני השטח ושטיפה באמצעות פיפטינג חוזר. צלחת פטרי מפלסטיק שימשה כמשטח הבקרה. כל הניסויים נערכו בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס. מספר חלקיקי הווירוס המדבקים נמדד באמצעות בדיקת פלאק41.

השפעת הציפוי האנטי-ויראלי VS-B על יעילות המסנן/קדם-סינון
איסוף וירוסים ובדיקות יעילות סינון בוצעו באמצעות שיטת חסימה עם צלחת פטרי המכילה בופר HEPES של 20 מ"מ (pH 7.2) או באמצעות אימפינגר מסתובב מזכוכית מלאה (להלן "האימפינג'ר"; ראו טבלת חומרים)44. לדגימת פגיעה, צלחת פטרי הוצבה ישירות מתחת למסנן כדי למקסם את הצטברות החלקיקים (איור 1). בניסויים עם מסנני GF-2 שהיו בשימוש במשך 3 חודשים, השתמשו באימפינגר במקום צלחת הפטרי לשיפור הרגישות. האימפינגר הוא מכשיר זכוכית המצויד בשלושה פיות ודורש משאבה חיצונית לדגימת אוויר לנוזל. זרימת האוויר דרך הפיות יוצרת תנועה מסתחררת של נוזל האיסוף לאורך הקיר הפנימי, ומאפשרת הסרה עדינה של חלקיקים. בתצורה זו, זרימת האוויר דרך המסנן נשמרה על 2 ליטר לדקה, וביציאה מהחבית, שסתום נוסף הגדיל את סך זרימת האוויר ל-10 ליטר/דקה. אירוסולים נלכדו ב-5 מ"ל של בופר HEPES של 20 מ"מ (pH 7.2), כאשר בופר המאודה מתמלא מחדש כל 30 דקות. בניסויי האימפינגרים, גם צלחת הפטרי וגם פילטר הבולפרן (משמש לאקוליזציה של זרימת אוויר; איור משלים 1 ואיור משלים 2B) הוסרו.

פרוטוקול הדגימה המפורט מוצג בטבלה 2. אירוסולים ויראליים נאספו על ידי איסוף 1 מ"ל של תלייה מצלחות פטרי המכילים 20 מ"ל של בופר HEPES של 20 מ"מ (pH 7.2). מתוכם, 800 מיקרוליטר שימשו לניתוח qRT-PCR ו-200 מיקרוליטר לטיטרציה של וירוסים. כל מסנן או מסנן מוקדם נבדק בשלושה עותקים, וריצות בקרה ללא פילטר/פרה-פילטר בוצעו במשך 15 דקות לפני ואחרי כל ניסוי תא. לאחר בקרת הניסוי, הפילטר או המסנן המקדים הוכנס לתא, שהופעל במשך 3 שעות, ולאחר מכן הוסר המסנן/המסנן המקדים ונערך ריצת בקרה לאחר הניסוי. נאספו דגימות qRT-PCR ודגימות טיטרציה של וירוסים כל 30 דקות, והניבו שמונה דגימות qRT-PCR ושמונה דגימות טיטרציה בכל ניסוי. בניסויי האימפינגר, דגימות טיטרציה נאספו רק פעם אחת בסיום הריצה של 3 שעות. כל דגימת qRT-PCR הוקפאה בחנקן נוזלי ונשמרה בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף, בעוד דגימות טיטרציה של וירוסים עובדו מיד לאחר הניסוי באמצעות בדיקת פלאק. תמיסת הווירוס ששימשה בנבולייזר עברה טיטרציה הן לפני והן אחרי כל ניסוי כדי לעקוב אחר יציבות.

שלושה מסננים מוקדמים שונים, BP-6, S-11 ו-FMR-5, ומסנן GF-2 (טבלה 1 ואיור משלים 2, טבלה משלימה 4) צופו ב-VS-B. המסננים המוקדמים כללו חומרים סיביים סינתטיים עם צפיפויות מבניות משתנות, שנועדו בעיקר להסרת חלקיקים גסים ולייצוב זרימת אוויר, בעוד שמסנן GF-2 הוא מסנן סיבי זכוכית יעיל מאוד עם ביצועים מסוג HEPA. מסננים מוקדמים ללא ציפוי ומערכת ללא פילטר נבדקו בתא האירוסול להשוואה.

נקודת זמןהכנהדגימות
שליטה0-15 דקותאין פילטר/פלטר מוקדם, צלחת פטרי עם 20 מ"ל HEPES200 מיקרוליטר לטיטרציה, 800 מיקרוליטר מוקפאים ל-qRT-PCR
ניסוי0-30 דקותפילטר/פרה-פילטר מעניין, צלחת פטרי חדשה עם 20 מ"ל HEPES
30-60 דקותהמסנן/מסנן המוקדם שמעניין אותו, אותו צלחת פטרי עם 19 מ"ל HEPES
60-90 דקותפילטר/פרה-פילטר שמעניין אותו, אותו צלחת פטרי עם 18 מ"ל HEPES
90-120 דקותמסנן/מסנן מוקדם שמעניין אותו, אותו צלחת פטרי עם 17 מ"ל HEPES
120-150 דקותמסנן/מסנן מוקדם שמעניין אותו, אותו צלחת פטרי עם 16 מ"ל HEPES
150-180 דקותהמסנן/המסנן המוקדם שמעניין אותו, אותו צלחת פטרי עם 15 מ"ל HEPES
שליטה0-15 דקותאין פילטר/מסנן מוקדם, צלחת פטרי חדשה עם 20 מ"ל HEPES

טבלה 2: ציר זמן של איסוף הדגימות.

השפעת הציפוי האנטי-ויראלי VS על מסננים בשימוש
עמידות ההשפעה האנטי-ויראלית על מסנני GF-2 מסוג HEPA מצופים בסוכן פני נחושת-כסף Viral Safe (VS) הוערכה על ידי מדידת יעילות הסינון של מסננים שהיו בשימוש במשך 3 חודשים, בהתבסס על ספירת וירוסים זיהומיים ומספרי עותקי הגנום הוויראלי. לניסויים אלו נעשה שימוש בארבעה מטהרי אוויר (ראו טבלת חומרים), כל אחד מצויד במסנן HEPA ושכבת פחם פעיל. המסננים הופעלו במשך תקופה של 3 חודשים בשתי מסעדות לפני האיסוף והניתוח: אחת הייתה מסעדת גורמה, והשנייה קפיטריה של צוות במפעל (מידע נוסף באיור משלים 3 ואיור משלים 4). הביצועים של מסננים אלו הושוו לאלו של מסנני GF-2 נקיים וללא ציפוי.

לפני בדיקות התא, המסננים המשומשים הוסרו מכלובי המתכת של מטהר האוויר, נפתחו ונחתכו לחתיכות בגודל מתאים לתא האירוסול בתוך מכסה זרימה למינרי, כדי להבטיח בטיחות ביולוגית ולמזער זיהום צולב. מסנני GF-2 שנאספו ממסעדת יוקרה ומקפיטריה של הצוות נבדקו לאחר מכן במערך הניסויי המתוארת בסעיף "עיצוב המחקר", תוך שימוש באימפינגר 5 מ"ל מותאם לאיסוף אירוסולים.

בנוסף ליעילות האנטי-ויראלית, הוערכו תכונות המשטח הפיזיקליות של המסננים. הליפופיליות הוערכה על ידי מריחת 50 מיקרוליטר טיפות שמן לאפה, בעוד שההידרופוביות נקבעה על ידי מריחת 50 מיקרו-ליטר טיפות מים דה-יוניים על רצועות סינון חתוכים. זוויות המגע תועדו בצילום בהתאם להליך של שיאו וויסנר (2012)45. דחיית המים נמדדה באמצעות מדידות זמן חדירת טיפת מים (WDPT) כפי שתוארו על ידי Lichner ואחרים (2006), כאשר כל הערכים עולים על 7200 שניות46.

ניתוח סטטיסטי
ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות תוכנה סטטיסטית סטנדרטית (ראו טבלת חומרים) כדי להעריך את המשמעות של הבדלים שנצפו בין חומרי הציפוי שנבדקו למסננים. הניתוח הסטטיסטי בוצע בשני שלבים בכל הניסויים: מבחן Kruskal-Wallis H ומבחן הפוסט-הוק Games-Howell. מבחן Kruskal-Wallis H שימש להערכת האם נצפו הבדלים משמעותיים, והשונות הספציפית בין סוגי המדגם נקבעה באמצעות השוואות ממוצע מרובות למבחן הפוסט-הוק של Games-Howell.

בדיקות יעילות הציפוי נותחו סטטיסטית על ידי השוואת הירידה בריכוזי הווירוסים המדבקים בהפרש של דקה ו-5 דקות ביחס לריכוזי ההתחלה. בשל המטרה של שימוש בציפויים על המסננים, חיפשנו סטייה מובהקת סטטיסטית בחיוניות הווירוס בהשוואה לביקורת בתוך הדקות הראשונות של הבדיקה.

ניתוח סטטיסטי שקבע הבדלים משמעותיים ביעילות המסננים המוקדמים עם ובלי ציפוי מבחינת ספירת זיהומים ותוצאות qPCR בוצע לכל נקודת זמן, 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות, 120 דקות, 150 דקות ו-180 דקות, בנפרד. הנתונים קובצו לאחר מכן לפי סוג המסנן המקדים ונוכחות הציפוי על פני השטח של המסנן המקדים. באופן דומה, תוצאות מסנני GF-2 ששימשו הוערכו ליעילות מבחינת השבתת וירוסים ויעילות סינון על ידי קיבוץ הנתונים לפי מיקום ונוכחות ציפוי על פני הפילטר.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יעילות ציפויי פני השטח האנטי-ויראלי
בדיקות הקיימות של פני השטח אישרו שכל חומרי הציפוי שנבדקו היו בעלי תכונות אנטי-ויראליות, כאשר ציפוי VS הראה את קצב השבלת הווירוס האיטי ביותר (איור 2A). הניתוח הסטטיסטי אישר ירידה משמעותית בריכוזי הווירוסים המדבקים בהפרש של דקה ו-5 דקות ביחס לריכוז ההתחלתי לכל ציפוי וביקורת (p < 0.001, איור 2B, טבלה משלימה 5). ציפוי השטח הניסיוני מבוסס נחושת B4 השיג את ההפחתה המהירה ביותר, והפחית את מספר הווירוסים המדבקים עד שלושה סדרי גודל בתוך 5 דקות, והווירוסים היו בלתי ניתנים לזיהוי לאחר 15 דקות (מגבלת גילוי: 100 PFU/מ"ל). ציפויים אחרים, A6 ו-VS-B, השיגו גם הם השבתה מוחלטת של Phi6 בתוך 25 ו-60 דקות, בהתאמה (איור 2A).

figure-results-1
איור 2: השפעה אנטי-ויראלית של ציפויי משטח על זיהום הווירוסים. (א) אובדן חלקיקים מדבקים כפונקציה של זמן. (B) יחס אובדן חלקיקי וירוס זיהומי לעומת נקודת הזמן המינימלית 0. מפרטי הציפוי מפורטים בטבלה 1 ובטבלה משלימה 3. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

בהשוואה לביקורת, בתוך 5 הדקות הראשונות, השבתה של הווירוס הייתה הכי פחות יעילה עם ציפוי A6 (p = 0.006 בדקה אחת ו-p = 0.012 ב-5 דקות, טבלה משלימה 6), ואחריה בציפוי VS (p = 0.001 בדקה אחת ו-p = 0.017 ב-5 דקות, טבלה משלימה 6). ציפוי B4 הציג ירידה בהשבתות בהשוואה לקבוצת הביקורת בנקודת הזמן של דקה אחת (p = 0.001, טבלה משלימה 6) אך לא היה שונה משמעותית מהביקורת בנקודת הזמן של 5 דקות (p > 0.05, טבלה משלימה 6). במהלך פרק זמן ארוך יותר, VS-B הראה עלייה בהשבתת הווירוסים בדומה ל-B4 ו-A6. תוצאות מפורטות של ניתוח סטטיסטי מוצגות בטבלה משלימה 6.

השפעת הציפוי האנטי-ויראלי VS-B על יעילות המסנן/קדם-סינון
הניסויים הראו שכל שלושת המסננים המוקדמים שנבדקו, BP-6, S-11 ו-FMR-5, היו יעילים באותה מידה בהפחתת מספר הווירוסים המדבקים העוברים דרכם ב-1.5–2.0 סדרי גודל לעומת מערכת ללא מסנן (איור 3A, טבלה משלימה 7). מסנני GF-2 הורידו את העומס הנגיפי לפחות בשישה סדרי גודל, ולא זוהו פלאקים זיהומיים של וירוס Phi6 בתוך גבול הגילוי (המסומן כנתונים שלא זוהו (*) באיור 3A).

ציפוי VS-B לא השפיע באופן משמעותי על יעילות סינון וירוסים זיהומיים (איור 3B). עבור מסנני קדם S-11 ו-FMR-5, ההבדל במספר הווירוסים המדבקים שעוברים דרך המסננים המצופים והלא מצופים היה בתוך סטיית התקן (SD), מה שמעיד על חוסר המשמעות של ההבדל (טבלה משלימה 8). למרבה ההפתעה, הפרה-פילטר BP-6 הלא מצופה תפקד טוב יותר מה-BP-6 המצופה במהלך 90 הדקות הראשונות. עם זאת, ההבדלים בין מסנני קדם-מצופים לבלתי מצופים הוכחו כחסרי מובהקות סטטיסטית (עמ' > 0.05, טבלה משלימה 8).

figure-results-2
איור 3: ריכוזי הווירוס המדבק הממוצע של וירוס ה-Phi6 הנבוליי על לוחות חסימה. (A) עבור מסנן GF-2, הגדרת ללא פילטר, ופרה-פילטרים לפני סינון. (ב) לפילטרים מוקדמים בלבד. פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן (SD), וסוגי המסננים מפורטים בטבלה 1. VS-B מציין מסננים מצופים. נתוני מסנן GF-2 התקבלו מתחת לגבול הגילוי ומסומנים בקו מקווקו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תוצאות ניסוי qRT-PCR הראו כי מסננים מורידים את מספר עותקי הגנום של הווירוסים שעוברים דרך המסננים המוקדמים עד שני סדרי גודל, בעוד שמסנן GF-2 הראה ירידה של עד ארבעה סדרי גודל בהשוואה למערכת ללא מסנן (איור 4A, טבלה משלימה 9). במהלך 30 הדקות הראשונות, ההבדלים בין מסננים מוקדמים למערכת ללא פילטר נותרו קטנים, בעוד מנקודת הזמן של 60 דקות, המסננים הראשונים הראו יעילות סינון מכנית מוגברת (איור 4A, טבלה משלימה 10). ציפוי VS-B לא השפיע על מספר עותק הגנום של הווירוס שעבר דרך המסנן (איור 4B). ההבדלים במספר עותקי הגנום היו בתוך סטיית התקן (עמ' > 0.05, טבלה משלימה 10).

figure-results-3
איור 4: ממוצע ריכוזי מספר העתק הגנום של וירוס ה-Phi6 המבוזר על לוחות החסימה. (א) עבור מסנן GF-2, הגדרה ללא פילטר, ומסננים מוקדמים. (ב) לפילטרים מוקדמים בלבד. פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן (SD), וסוגי המסננים מפורטים בטבלה 1. VS-B מציין מסננים מצופים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איורים 3 ואיור 4 מראים שמספר הווירוסים המדבקים (PFU/mL) ביחס לסך מספר העתקי הגנום של הווירוס העוברים דרך המסנן קטן בכ-2 סדרי גודל עבור מסננים מוקדמים ומסנן GF-2, ורק סדר גודל קטן יותר ללא מסנן. זה מרמז שהשפעת הסינון, אפילו עם זרימת אוויר עדינה, עלולה להיות הרסנית מכנית לחלקיקי הווירוס, ולהוביל לאובדן זיהום.

בהתבסס על זרימת האוויר הניסיונית (2 ליטר לדקה) ושטח הפנים המסנן המשוער (~20ס"מ 2), מהירות הפאה הייתה כ-0.01–0.02 מ"ש. ערכי נקבוביות טיפוסיים למסננים סיביים נעים בין כ-0.7 ל-0.98, בהתאם לחומר ולצפיפות האריזה, כאשר מסנני HEPA מסיבי זכוכית מציגים בדרך כלל נקבוביות נמוכה יותר (~0.7–0.9) בהשוואה למסננים סינתטיים פתוחים יותר (~0.85–0.98)47,48. בהתחשב בנקבוביות המסנן ובתנאי הזרימה הפנימית, המהירות הבין-מרחבית בתוך מטריצת המסנן הוערכה כמעט גבוהה יותר ממהירות הפאה (0.02–0.03 מ"ש). באמצעות עובי מסנן ושילוב גורמי סיבוב (1.2–2.0), הוערך זמן השהייה האפקטיבי של חלקיקי האירוסול במבנה המסנן בטווח של כ-0.03 ל-0.4 שניות49. זמני אינטראקציה תת-שנייה אלו מצביעים על כך שמגע וירוס-משטח הוא חולף מאוד, מה שמגביל את תרומת הציפויים האנטי-ויראליים במהלך סינון חד-מעבר.

השפעת הציפוי האנטי-ויראלי VS על מסננים בשימוש
מסנני GF-2 מצופים ולא מצופים ששימשו במטהרי אוויר במשך 3 חודשים בשתי המסעדות שנבחרו (איור משלים 3 ואיור משלים 4) נבדקו מבחינת יכולת הסינון שלהם. באותם תנאים ניסיוניים, מסננים לא בשימוש ולא מצופים (מבוקרים) עברו דרך 1.23 × 102 PFU/מ"ל של וירוסים זיהומיים. מסננים משומשים, לא מצופים מהמסעדה היוקרתית ומהקפיטריה, העבירו ~3 PFU/מ"ל ו-2.3 ×-10 PFU/מ"ל של וירוסים זיהומיים, בהתאמה. לעומת זאת, מסננים מצופים VS בשימוש ממסעדת גורמה וקפיטריה של צוות עברו 5.3 × 101 PFU/מ"ל ו-4.6 × 101 PFU/מ"ל של וירוסים זיהומיים, בהתאמה (איור 5). נצפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בספירות הווירוסים המדבקים בין המסננים, כאשר מסנני GF-2 ללא ציפוי במשך 3 חודשים הראו את הירידה הבולטת ביותר (איור 5; χ2(2) = 11.432, p = 0.022, טבלה משלימה 11). התוצאות שהושגו באמצעות מסנני GF-2 מצופים בני 3 חודשים סיפקו תוצאות דומות למסנני GF-2 הלא מצופים הלא בשימוש ב-p > 0.05 (טבלה משלימה 12).

figure-results-4
איור 5: ריכוזי וירוסים זיהומיים לאחר בדיקת מסננים של תינוק בן שלושה חודשים. כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע של שלושה ניסויים ואת סטיית התקן המחושבת בשלוש חזרות. VS = חומר שטחי נחושת וכסף בטוח לוויראלים; GF-2 = מסנן סיבי זכוכית דו-שכבתי GF-2, לא מצופה (מסנן מסוג HEPA); הקופסאות מציגות רווח בר-סמך של 95% עבור ממוצע, שהוא הקו השחור בין טווח האמון התחתון לעליון. פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן (SD) עבור כל סוג מסנן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תוצאות qRT-PCR של המסננים המשומשים, הלא בשימוש, המצופים והלא מצופים מוצגות באיור 6. נתוני qRT-PCR של מסננים (ביקורתיים) לא בשימוש ולא מצופים הציגו 2.7 ×-10עותקים 3 למ"ל של עותקי גנום ויראליים. נתוני מסננים משומשים, לא מצופים ממסעדת האוכל היוקרתי ומהקפיטריה של הצוות הציגו 3.6 × 102 עותקים/מ"ל ו-2.4 × 103 עותקים/מ"ל של עותקים ויראליים, בהתאמה, בעוד שמסננים מצופים ב-VS ממסעדת הגורמה ומקפיטריה של הצוות הציגו 2.8 × 103 עותקים למ"ל ו-4.6 × 103 עותקים/מ"ל של עותקים ויראליים, בהתאמה (איור 6). מסנן GF-2 המשומש, ללא ציפוי ממסעדת הגורמה, היה יעיל משמעותית בהפחתת מספר עותקי הגנום הוויראלי בהשוואה למסנן הלא מצופה בשימוש מהקפיטריה של הצוות (p = 0.012), או המסנן המשומש מצופה ממסעדת גורמה (p < 0.001), או המסנן המשומש מצופה VS מקפיטריית הצוות (p = 0.005) (טבלה משלימה 13 וטבלה משלימה 14). עם זאת, בהשוואה למסנן GF-2 שלא נעשה בו שימוש ולא מצופה, מסנן GF-2 הלא מצופה במסעדת הגורמה לא הביא להבדל מובהק סטטיסטית (p>0.05). תוצאות ניתוח סטטיסטי מפורטות מוצגות בטבלה משלימה 14.

figure-results-5
איור 6: ריכוז מספרי עותקי הגנום הוויראלי לאחר בדיקת מסננים שהשתמשו בגיל שלושה חודשים. כל נקודת נתונים מייצגת את ממוצע שלושה ניסויים ואת סטיית התקן המחושבת. VS = חומר שטחי נחושת וכסף בטוח לוויראלים; GF-2 = מסנן סיבי זכוכית דו-שכבתי GF-2, לא מצופה (מסנן מסוג HEPA); הקופסאות מציגות רווח בר-סמך של 95% עבור ממוצע, שהוא הקו השחור בין טווח האמון התחתון לעליון. פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן (SD) עבור כל סוג מסנן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

כדי להבהיר את ההבדלים שנצפו בביצועי המסננים, בוצעו בדיקות הידרופוביות וליפופיליות. כל המסננים ששימשו במסעדת הגורמה ובקפיטריה של הצוות הציגו הידרופוביות גבוהה בשני המשטחים (הצד הפנימי—הפונה לזרימת האוויר הנכנסת; הצד החיצוני—פונה לזרימת האוויר היוצאת), כאשר זווית המגע הראשונית של טיפות המים עלתה בעקביות על 120 מעלות, כפי שצולם בתמונות (לא מוצג). מדידות זמן חדירת טיפת מים (WDPT) הצביעו על תכונה חזקה לדוחה מים, כאשר כל הערכים עולים על 7200 שניות. השונות בין בדיקות חוזרות הייתה גדולה יותר מזו בין סוגי המסננים, ככל הנראה בשל הפרעות מכניות במסננים שבהם השתמשו. כתוצאה מכך, לא זוהו הבדלים משמעותיים בין המסננים שהשתמשו בשיטות אלו.

הליפופיליות הוערכה על ידי מריחת טיפות שמן לנופה על פני המסננים. מסננים לא מצופים הציגו באופן עקבי ליפופיליות נמוכה, כאשר זווית המגע של הטיפה נשארה מעל 120 מעלות לאורך כל הבדיקה. לעומת זאת, מסנני Viral Safe-Cated הראו התפשטות מהירה של טיפות, עם זווית משוערת של פחות מ-30 מעלות שנרשמה 60 שניות לאחר היישום (איור משלים 5). עדיין לא ברור אם הליפופיליות המוגברת נבעה מהציפוי עצמו או מתהליך היישום עצמו.

זמינות נתונים
נתונים גולמיים התומכים בממצאי מחקר זה זמינים בקובץ המשלים 1.

איור משלים 1: תא אירוסול מותאם אישית ורכיביו.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: תמונות של מסננים, מסננים מוקדמים וציפויים. (א) פוליאסטר FMR-5 קדם-פילטר, (ב) בולפרן BP-6 פרה-פילטר, (ג) פוליאסטר S-11 קדם-פילטר, (ד) פילטר זכוכית דו-שכבתי GF-2. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3: תכנון חדר המסעדה היוקרתית שבו השתמשו במטהרי אוויר (ראו טבלת חומרים), המסומנים במלבנים כחולים. מלבנים צהובים מסמנים שולחנות, ומלבן אפור כהה מסמן את הדלת. ריבוע אחד ברשת מייצג 1 מטר2. גודל החדר ~60מ' 2. כ-30 אורחים מבקרים ביום. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 4: תכנון מפעל הממתקים, קפיטריה של הצוות, שם השתמשו במטהרי אוויר (ראו טבלת חומרים), המסומנים במלבנים כחולים. מלבנים צהובים מסמנים שולחנות, מלבנים אפורים כהים מסמנים דלתות, מלבנים אפורים מסמנים שולחנות שירות עצמי, ומלבנים שחורים מסמנים עמודי תמיכה. ריבוע אחד ברשת מייצג 1 מטר2. גודל החדר ~160מ' 2. כ-20-50 אורחים מבקרים ביום. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 5: טיפות שמן קנוטה (50 מיקרוליטר) על משטחי מסנן GF-2 ששימשו בניסויים במסעדות. מסננים שכוסו בציפוי Viral Safe (VS) (1–5) היו בעלי דחיית שומנים פחות משמעותית מאשר המסננים הלא מצופים (1, 6–7). התמונות צולמו דרך העין של מיקרוסקופ הכנה עם הגדלה של פי 40 60 שניות לאחר יישום הטיפה. "In" מציין את הצד של המסנן אליו נכנס זרם האוויר; "החוצה" מציין את הצד היוציא מהאוויר. הציפוי של VS-B נמצא בחוץ. 1 מתייחס למסנן ישן משומש ממסעדת הגורמה; 2 ו-3 היו מסננים מצופים VS-B ששימשו במסעדת הגורמה; 4 ו-5 היו פילטרים מצופים VS-B ששימשו בקפיטריה של הצוות; ו-6 ו-7 היו פילטרים לא מצופים ששימשו בקפיטריה של הצוות. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 1: מידע על מחזור qRT-PCR. טמפרטורת מכסה 105 מעלות צלזיוס, 45 מחזורים, איסוף נתונים במהלך שלב של 62 מעלות צלזיוס. מותאם מ-Gregorova ואחרים. 43. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 2: מידע על מדריך qRT-PCR. מותאם מ-Gregorova ואחרים. 43. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 3: תיאור מפורט של חומרי הציפוי ששימשו במחקר זה. ההרכבים הכימיים המדויקים של הציפויים הם קנייניים ליצרן (Clean Touch Medical Ltd.). התיאורים מבוססים על סיווג פונקציונלי ורכיבים פעילים ידועים (נחושת ו/או כסף). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימים 4: תיאור מפורט של חומרי המסננים ששימשו במחקר זה. הרכבי החומרים המדויקים של מסננים מוקדמים מסחריים אינם נחשפים במלואם על ידי היצרנים; התיאורים מבוססים על חומרים טיפוסיים המשמשים במערכות סינון מיזוג אוויר ותכונות מבניות שנצפו בהם. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 5: סטטיסטיקות בדיקות: ניתוח Kruskal–Wallis של זיהום וירוס על פני ציפויים אנטי-ויראליים. משתנה הקיבוץ הוא סוג הציפוי. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 6: הבדלים מובהקים סטטיסטית בזיהום הווירוס בין הציפויים בנקודות זמן של דקה ו-5 דקות לפי תוצאות בדיקות לאחר בדיקות Games-Howell Multiple Reports. המובהקות הסטטיסטית מסומנת ככן בשני הפאנלים הראשונים של הטבלה, בנקודות זמן של דקה וחמש דקות. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 7: סטטיסטיקות בדיקות: ניתוח קרוסקל–ווליס של זיהום וירוס בין סוגי מסננים ותנאי ללא מסנן. משתנה הקיבוץ הוא סוג המסנן. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 8: תוצאות בדיקות השוואות מרובות של זיהום ויראלי בין מסננים מוקדמים להגדרות ללא פילטר בנקודות זמן של 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות, 120 דקות, 150 דקות ו-180 דקות לפי בדיקות השוואות מרובות של Games-Howell לאחר מבחן השוואות.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 9: סטטיסטיקות בדיקות: תוצאות בדיקות Kruskal–Wallis שמעריכות הבדלים במספר עותקי הווירוס בין סוגי המסנן המקדים, מסנן GF-2, וההגדרה ללא מסנן. משתנה הקיבוץ הוא סוג מסנן. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 10: תוצאות לבדיקות השוואות מרובות של מספרי עותקי וירוס בין מסננים מוקדמים, מסנן GF-2 והגדרת ללא פילטר בנקודות זמן של 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות, 120 דקות, 150 דקות ו-180 דקות לפי בדיקות Games-Howell Multiple Test.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 11: סטטיסטיקות בדיקה: תוצאות מבחן קרוסקל–ווליס השוות בין זיהום ויראלי בין מסנני GF-2 לא בשימוש לבין מסננים במסעדות. משתנה הקיבוץ הוא סוג מסנן. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 12: תוצאות מבחן ההשוואות המרובות של זיהום ויראלי בין מסננים מוקדמים להגדרות ללא פילטר לפי מבחן השוואות מרובות של Games-Howell לאחר מבחן.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 13: תוצאות ניסוי Kruskal–Wallis השוות את מספר עותקי הווירוס בין סוגי מסננים מוקדמים, מסנן GF-2, וההגדרה ללא מסנן. משתנה הקיבוץ הוא סוג מסנן. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 14: תוצאות מבחן ההשוואות המרובות של מספרי עותקי וירוס בין מסננים מוקדמים, מסנן GF-2 והגדרה ללא פילטר לפי מבחן השוואות מרובות של Games-Howell לאחר מבחן השוואות.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 1: נתונים גולמיים של מחקר זה.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול להערכת היעילות של פילטרים אנטי-ויראליים וציפויים לפני סינון בתא אירוסול מיקרוביולוגי. התא המיוצר מציע מערכת מבוקרת וסגורה המתאימה לניתוחים מיקרוביולוגיים אספטיים, שכן הוא אוטוקלבי, נייד, שקוף וקטן (3 ליטר) בהשוואה לחלק מהחדרים שתוארו בעבר 31,50,51.

כל חומרי הציפוי שנבדקו במחקר זה אושרו כבעלי פעילות אנטי-ויראלית (איור 2A), כאשר ציפוי השטח הניסיוני מבוסס נחושת B4 הראה את היעילות הגבוהה ביותר, והפחית את הזיהום של הווירוס מתחת לגבול הגילוי בתוך 10 דקות. ציפוי מבוסס נחושת A6 הגיע מיד, והשיג השבתה מוחלטת של הווירוס תוך 25 דקות (איור 2A). ממצאים אלו תואמים לדיווחים קודמים על התכונות האנטי-ויראליות של נחושת וכסף 17,18,20,21,22,52. לא נצפה השבתת וירוס במהלך חמש הדקות הראשונות לפני ייבוש הטיפות, מה שמעיד כי הירידה המוקדמת בזיהום נבעה בעיקר מהתייבש ולא מהציפוי עצמו (ביקורת, איור 2A, איור 2B)36. ציפויים B4 ו-A6 הציגו קינטיקה מהירה יותר של השבתה לעומת ציפויי VS ו-VS-B, בעוד ש-VS-B דרשו עד 60 דקות להגיע למגבלת הגילוי (איור 2A). מסננים מוקדמים עם ציפויי B4 ו-A6 לא היו זמינים; לכן, VS-B נבחר לניסויי אירוסול מסננים מאוחרים יותר.

תוצאות מחקר זה מדגישות שמסנני HEPA ומסננים מוקדמים מפחיתים ביעילות את מספר הווירוסים העוברים דרכם גם בהיעדר ציפוי אנטי-ויראלי. העומס המכני על וירוסים אירוסוליים במהלך הסינון הוביל לירידה של 1.0–2.0 לוגריתם בזיהום הווירוס (מ~8 × 105 – 1 × 107 PFU/mL ל~5 × 104 – 105, איור 3A). הפחתה זו נצפתה בעקביות בכל מבחני קדם-הסינון, ותמכה בממצאים קודמים 50,53,54. במסנן מסוג GF-2 מסוג HEPA, אובדן הזיהום הוויראלי היה אף גדול יותר, ללא חלקיקים זיהומים ניתנים לזיהוי בתוך גבולות הרגישות של השיטה (איור 3A). ההדבקה הנמוכה יותר ביחס לסך כל מספרי העתקי הגנום מרמזת שסינון גורם לנזק מכני לחלקיקי הווירוס, תופעה בולטת במיוחד עבור וירוס Phi6 המוקיף. מכיוון שוירוסים עטופים רגישים יותר להפרעות מכניות, ההבדל הזה עשוי להיות קטן יותר עבור וירוסים לא עטופים55.

בניסויי אירוסול, הציפויים לא השפיעו באופן מובהק סטטיסטית על ביצועי הסינון של מסננים מוקדמים. סביר להניח שזה משקף מגע מוגבל בין הציפוי לווירוסים העוברים דרך המסנן, מה שמייצר תוצאות דומות עבור מסננים מוקדמים מצופים ולא מצופים (איור 3B, איור 4B). זמני השהייה המחושבים בתת-שניות מצביעים על כך שקינטיקה אנטי-ויראלית חייבת להתרחש בקנה מידה מהיר מאוד כדי להיות יעילה בתנאי זרימת אוויר ריאליסטיים. בנוסף, התוצאות שלנו מצביעות על כך שהציפויים שנבדקו אינם מציגים את הזיקה האלקטרוסטטית האופיינית של יוני נחושת למולקולות ביולוגיות טעונות שלילית, שעלולות למשוך וירוסים למסנן ולהפחית את המעברשלהם. לכן, היתרון העיקרי של ציפויי קדם-סינון עשוי להיות בתכונות החיטוי העצמי לאחר הלכידה, כפי שמודגם בבדיקות שטח, ולא בשיפור יעילות הסינון המכנית. חשוב לציין שהניסויים שנערכו במחקר זה מייצגים תנאי סינון חד-מעגליים, שבהם חלקיקים אירוסוליים מתקשרים עם המסנן רק פעם אחת. כתוצאה מכך, זמני שהייה קצרים מאוד ומגע מוגבל בין וירוס למשטח, מה שמפחית ככל הנראה את ההשפעה הנראית של ציפויים אנטי-ויראליים. לעומת זאת, מערכות טיהור אוויר אמיתיות פועלות בדרך כלל בתנאי מחזור חוזר, שבהם מעבר אוויר חוזר מגדיל את המגע המצטבר ועשוי לשפר את יעילות הציפויים.

התוצאות שלנו מצביעות על כך שמסנני GF-2 הראו שיפור בהסרת וירוסים זיהומיים לאחר שלושה חודשי שימוש רציף במטהרי אוויר במסעדת האוכל היוקרתי ובקפיטריה של הצוות (איור משלים 3 ואיור משלים 4) בהשוואה למסננים שלא נעשה בהם שימוש (איור 5). שיפור זה ניתן לייחס למספר גורמים. ראשית, דווח כי הצטברות אבק וחלקיקים אחרים משביתה את הווירוסים57. שנית, הצטברות הדרגתית של מזהמי אוויר פנימי יכולה לצפוף את מבנה המסנן, מה שעשוי לשפר את יעילותו זמנית 57,58,59. ראוי לציין כי נוכחות הציפויים לא השפיעה באופן משמעותי על זיהום הווירוס או על מספרי עותקי הגנום שזוהו על ידי qRT-PCR. מעבר חלקיקי וירוס לא זיהומיים היה דומה גם הוא ללא קשר לציפויים או לשימוש במסננים, מה שמעיד כי יעילות הסינון הנצפית של מסנני GF-2 מסוג HEPA והמסננים המקדים משקפת בעיקר את תכונותיהם המכניות. למרות זאת, הצטברות חלקיקים מסוננים על פני מסנן GF-2 השפיעה באופן בולט על הפחתת מספר הווירוסים המדבקים העוברים (איור 5).

כדי להבין את ההבדלים בביצועי המסננים שנצפו באיור 5 ובאיור 6, בוצעו בדיקות נוספות. כל המסננים הפגינו הידרופוביות חזקה כאשר נחשפו לטיפות מים, בעוד שבדיקות טיפות שמן חשפו הבדלים משמעותיים, כאשר מסננים מצופים VS הציגו ליפופיליות בולטת. המנגנון הבסיסי לשונות זו נותר לא ברור, אך תוצאות אלו מצביעות על כך שגיל המסנן או היסטוריית השימוש אינם עשויים להיות הגורמים העיקריים לביצועים. במקום זאת, סוג הטיפול המקדים על פני השטח עשוי לשנות את התכונות הפיזיקליות של המסנן, ובכך להשפיע על החזקת וירוסים ומעבר הווירוסים. ביחד, ממצאים אלו מצביעים על כך שציפויים אנטי-ויראליים מספקים יתרונות פונקציונליים מעבר לסינון מכני, בעיקר בזכות פוטנציאל החיטוי העצמי שלהם, שעשוי להפחית סיכונים בריאותיים לעובדים המטפלים במסננים בשימוש.

בעוד שפרוטוקול זה מספק מסגרת איתנה להערכת סינון אנטי-ויראלי, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות. ראשית, הבקטריופאג' המוקף Phi6 שימש כתחליף לפתוגנים נשימתיים אנושיים. למרות ש-Phi6 חולק דמיון מבני וכימי עם נגיפי הקורונה, הבדלים ביציבות הסביבה ובחלבוני שטח עשויים להשפיע על קינטיקת השבתה מדויקת. שנית, בעוד שחלק מהציפויים הראו יעילות משמעותית, מחקר זה העריך סט מוגבל של נוסחאות בתנאי אירוסול מסוימים; מחקר עתידי צפוי להרחיב את ההיקף לכלול טווח רחב יותר של סוכנים אנטימיקרוביאליים. לבסוף, הניסויים נערכו בתא אירוסול מבוקר עם זרימת אוויר ולחות מוסדרות. למרות שתנאים אלה מבטיחים שחזוריות, הם אינם משכפלים במלואם את זרימת האוויר המורכבת והסוערת ואת הפרמטרים הסביבתיים המשתנים שנמצאים בסביבות פנימיות אמיתיות.

בסך הכול, מחקר זה מראה שבעוד שמסנני סיבי זכוכית GF-2 ומסננים מוקדמים מסירים ביעילות וירוסים זיהומיים, במיוחד לאחר שימוש ממושך עקב צפיפות חלקיקים, התפקיד העיקרי של ציפויים מבוססי נחושת וכסף הוא השבתת וירוסים במגע ישיר. ממצאים אלו מדגישים את עמידות הסינון המכני בשליטה על וירוסים באוויר ומצביעים על מחקרים עתידיים להעריך את שילוב הציפויים האנטי-ויראליים עם התערבויות משלימות, כגון קרינת UV, כדי להפחית עוד יותר את סיכון ההדבקה. לפני פילטר60,61. כמו כן, מחקרי שטח עתידיים שישלבו ציפויים אלו במערכות אוורור קיימות של מבנים יהיו חיוניים לאימות ביצועיהם במקום.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סארי קורונן זוכה לתודה על הסיוע הטכני המצוין. פבלינה גרגורובה מוערכת על ייעוץ בנוגע לפרוטוקול qRT-PCR. אנו מודים לפרופסור דניס ה. באמפורד ז"ל על תרומתו היקרת ערך בעיצוב מבנה התא ועל כל תמיכתו לאורך כל הניסויים. ד"ר א.-פ. הייברינן מודה על העזרה בהקמת תא הניסוי של האירוסול. המתקנים והמומחיות של יחידת Instruct-HiLIFE Biocomplex באוניברסיטת הלסינקי, חברה במרכז Instruct-ERIC פינלנד, FINStruct ו-Biocenter Finland, מוערכים בהכרת תודה. המחקר מומן על ידי מועצת המחקר של פינלנד, 335681 מימון מיוחד לקורונה, ומימון 368144 ל-NSA. מועצת המחקר של פינלנד מוכרת על מימון הדגל של ACCC (מענק מס' 337552). אנו חושפים את התמיכה המימונית מ-Clean Touch Medical LTD, M-Filter LTD ו-UniqAir LTD לסיום הניסויים, ללא כל תפקיד של החברות בעיצוב, ביצוע, דיווח או כתיבת כל חלק מהכתבי היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Aerosol chamber glass cylinder and lidLaborexin OyN/Aגליל זכוכית וכיסוי מותאם אישית להכלת אירוסולים.
Aerosol chamber inner metal scaffoldClean Touch Medical Ltd.N/Aמבנה תמיכה מנירוסטה מותאם אישית להרכבת מסנן.
Aerosol chamber lid insulating gasketsEtra Oy (Etola Group)N/Aחומרי איטום מגומי מותאמים אישית לאיטום אטום.
Air pump, WI 53082Thomas Industries Inc.N/Aמשאבת סרעפת המשמשת לשמירה על זרימת אוויר מבוקרת דרך התא.
BioSamplerSKC Inc.https://international.skcinc.com/products/air/bioaerosol-samplers/biosamplerמכשיר סיבוב זכוכית להספקה גבוהה לאיסוף נגיפים באוויר.
Coated test piecesClean Touch Medical Ltd.www.cleantouchmedical.comשקופיות נייר מבריק מצופות בפורמולציות אנטי-מיקרוביאליות לבדיקת יעילות משטחים.
CompAir Pro NE-C900 nebulizerOmron HealthcareNE-C900 נבולייזר מדחס תפוקה גבוהה המשמש לייצור אירוסולים ויראליים.
SPSS Statistics softwareIBM Corp.https://www.ibm.com/products/spssתוכנת ניתוח סטטיסטי, גרסה 28.0.
QuantStudio Design and Analysis SoftwareThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/technical-resources/software-downloads.html#pcrתוכנה המשמשת לניתוח נתוני qRT-PCR, גרסה 1.3.1.
UniqAir PRO air purifierUniqAir Oyhttps://www.uniqair.fi/יחידת טיהור אוויר מדרגה מסחרית המשמשת לניקוי התא.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beggs, C. B., et al. Airborne transmission of SARS-CoV-2: the contrast between indoors and outdoors. Fluids. 9 (3), 54 (2024).
  2. Qian, H., et al. Indoor transmission of SARS-CoV-2. Indoor Air. 31 (3), 639-645 (2021).
  3. Han, S., Kim, J., Ko, S. H. Advances in air filtration technologies: structure-based and interaction-based approaches. Materials Today Advances. 9, 100134 (2021).
  4. Wang, P., Liu, Z., Chen, D. R. Performance of composite filters assembled from multiple layers of basic filtration media. Aerosol Air Qual Res. 20 (11), 2299-2308 (2020).
  5. Xu, Z. . Fundamentals of air cleaning technology and its application in cleanrooms. , (2014).
  6. Mao, N. . Advances in technical nonwovens. , (2016).
  7. Xie, Q., et al. The effect of pre-filter and main-filter media matching on the performance of an ultra-high-efficiency two-stage filtration system. Processes. 13 (4), 1075 (2025).
  8. Chattopadhyay, D., Chattopadhyay, S., Lyon, W. G., Wilson, J. T. Effect of surfactants on the survival and sorption of viruses. Environ Sci Technol. 36 (19), 4017-4024 (2002).
  9. G, R., et al. Bactericidal–bacteriostatic foam filters for air treatment. ACS Appl Polym Mater. 2 (4), 1569-1578 (2020).
  10. Xue, X., et al. All surfaces are not equal in contact transmission of SARS-CoV-2. Matter. 3 (5), 1433-1441 (2020).
  11. Tiwari, A., et al. Survival of two avian respiratory viruses on porous and nonporous surfaces. Avian Dis. 50 (2), 284-287 (2006).
  12. Yasui, M., et al. Virus removal by microfiltration: effects of electrostatic and hydrophobic interactions. Sep Purif Technol. 350, 127902 (2024).
  13. Kaushik, R., et al. . Indoor environmental quality. , (2024).
  14. Watson, R., et al. Efficacy of antimicrobial and anti-viral coated air filters to prevent the spread of airborne pathogens. Sci Rep. 12 (1), 2803 (2022).
  15. Jung, S., et al. Sustainable antibacterial and anti-viral high-performance copper-coated filter produced via ion beam treatment. Polymers. 14 (5), 1007 (2022).
  16. Lee, K. H., et al. Development of nano-sized copper-deposited antimicrobial air filters using a mixed melt-blown process. Nanomaterials. 13 (14), 2071 (2023).
  17. Rakowska, P. D., et al. Anti-viral surfaces and coatings and their mechanisms of action. Commun Mater. 2 (1), 53 (2021).
  18. Bright, K. R., et al. Assessment of the anti-viral properties of zeolites containing metal ions. Food Environ Virol. 1 (1), 37 (2009).
  19. Govind, V., et al. Anti-viral properties of copper and its alloys to inactivate COVID-19 virus: a review. Biometals. 34 (6), 1217-1235 (2021).
  20. Han, J., et al. Efficient and quick inactivation of SARS coronavirus and other microbes exposed to the surfaces of some metal catalysts. Biomed Environ Sci. 18 (3), 176-180 (2005).
  21. Montes, L. F., et al. Response of varicella zoster virus and herpes zoster to silver sulfadiazine. Cutis. 38 (6), 363-365 (1986).
  22. Silvestry-Rodriguez, N., et al. . Reviews of environmental contamination and toxicology. , (2007).
  23. Carubelli, R. Cytotoxic effects of autoxidative glycation. Free Radic Biol Med. 18 (2), 265-269 (1995).
  24. Chaturvedi, U. C., Shrivastava, R. Interaction of viral proteins with metal ions: role in maintaining the structure and functions of viruses. FEMS Immunol Med Microbiol. 43 (2), 105-114 (2005).
  25. Ermini, M. L., Voliani, V. Antimicrobial nano-agents: the copper age. ACS Nano. 15 (4), 6008-6029 (2021).
  26. Foster, A. W., et al. Metal preferences and metallation. J Biol Chem. 289 (41), 28095-28103 (2014).
  27. Kubo, A. L., et al. Antibacterial and anti-viral effects of Ag, Cu and Zn metals, respective nanoparticles and filter materials thereof against coronavirus SARS-CoV-2 and influenza A virus. Pharmaceutics. 14 (12), 2549 (2022).
  28. Thurman, R. B., et al. The molecular mechanisms of copper and silver ion disinfection of bacteria and viruses. Crit Rev Environ Control. 18 (4), 295-315 (1989).
  29. Warnes, S. L., et al. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl Environ Microbiol. 81 (3), 1085-1091 (2015).
  30. Zhang, Y., et al. Probing the viral metallome: searching for metalloproteins in bacteriophage λ–the hunt begins. Metallomics. 3 (5), 472 (2011).
  31. Sofieva, S., et al. Effects of temperature and salinity on sea-spray-aerosol formation simulated with a bubble-generating chamber. Aerosols/Laboratory Measurement/Instruments and Platforms. , (2022).
  32. Aquino de Carvalho, N., et al. Evaluation of Phi6 persistence and suitability as an enveloped virus surrogate. Environ Sci Technol. 51 (15), 8692-8700 (2017).
  33. Barros, J., et al. Bacteriophage Φ6 as surrogate and human-harmless viruses to study anti-SARS-CoV-2 approaches. COVID-19 Pandemic Case Studies Opin. 2 (1), 175-177 (2021).
  34. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 18, 273-279 (1953).
  35. Fedorenko, A., et al. Virus survival in evaporated saliva microdroplets deposited on inanimate surfaces. Microbiology. , (2020).
  36. Prussin, A. J., et al. Survival of the enveloped virus Phi6 in droplets as a function of relative humidity, absolute humidity, and temperature. Appl Environ Microbiol. 84 (12), e00551-e00618 (2018).
  37. Sanmark, E., et al. Safe use of PHI6 in experimental studies. Heliyon. 9 (2), e13565 (2023).
  38. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;. Anti-viral characterization of advanced materials: use of bacteriophage Phi 6 as surrogate of enveloped viruses such as SARS-CoV-2. Int J Mol Sci. 23 (10), 5335 (2022).
  39. Turgeon, N., et al. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Appl Environ Microbiol. 80 (14), 4242-4250 (2014).
  40. Vidaver, A. K., et al. Bacteriophage φ6: a lipid-containing virus of Pseudomonas phaseolicola. J Virol. 11 (5), 799-805 (1973).
  41. Bamford, D. H., et al. . Methods in molecular genetics. , (1995).
  42. Gratia, A. . Annales de l’Institut Pasteur. , (1936).
  43. Gregorova, P., et al. An improved RT-qPCR method for direct quantification of enveloped RNA viruses. MethodsX. 9, 101737 (2022).
  44. Grinshpun, S. A., et al. . Manual of environmental microbiology. , (2015).
  45. Xiao, Y., Wiesner, M. R. Characterization of surface hydrophobicity of engineered nanoparticles. J Hazard Mater. 215–216, 146-151 (2012).
  46. Lichner, L., et al. Evaluation of different clay minerals as additives for soil water repellency alleviation. Appl Clay Sci. 31 (3-4), 238-248 (2006).
  47. Lee, K. W., Liu, B. Y. H. Theoretical study of aerosol filtration by fibrous filters. Aerosol Sci Technol. 1 (2), 147-161 (1982).
  48. Lee, K. W., Liu, B. Y. H. Experimental study of aerosol filtration by fibrous filters. Aerosol Sci Technol. 1 (1), 35-46 (1982).
  49. Piekaar, H. W., Clarenburg, L. A. Aerosol filters—the tortuosity factor in fibrous filters. Chem Eng Sci. 22 (12), 1817-1827 (1967).
  50. Cao, G., et al. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321 (2011).
  51. Dubuis, M. E., et al. Ozone efficacy for the control of airborne viruses: bacteriophage and norovirus models. PLoS ONE. 15 (4), e0231164 (2020).
  52. Law, C. K., et al. . Proceedings of the 5th International Conference on Building Energy and Environment. , (2023).
  53. Ge, S., et al. Airborne virus survivability during long-term sampling using a non-viable Andersen cascade impactor in an environmental chamber. Aerosol Sci Technol. 48 (12), 1360-1368 (2014).
  54. Holton, J., Webb, A. R. An evaluation of the microbial retention performance of three ventilator-circuit filters. Intensive Care Med. 20 (3), 233-237 (1994).
  55. Firquet, S., et al. Survival of enveloped and non-enveloped viruses on inanimate surfaces. Microbes Environ. 30 (2), 140-144 (2015).
  56. Imani, S. M., et al. Antimicrobial nanomaterials and coatings: current mechanisms and future perspectives to control the spread of viruses including SARS-CoV-2. ACS Nano. 14 (10), 12341-12369 (2020).
  57. Joe, Y. H., et al. Evaluation of Ag nanoparticle coated air filter against aerosolized virus: anti-viral efficiency with dust loading. J Hazard Mater. 301, 547-553 (2016).
  58. Thomas, D., et al. Clogging of fibrous filters by solid aerosol particles: experimental and modelling study. Chem Eng Sci. 56 (11), 3549-3561 (2001).
  59. Zhang, W., et al. Modeling the surface filtration pressure drop of PTFE HEPA filter media for low load applications. Build Environ. 177, 106905 (2020).
  60. Barnewall, R. E., Bischoff, W. E. Removal of SARS-CoV-2 bioaerosols using ultraviolet air filtration. Infect Control Hosp Epidemiol. 42 (8), 1014-1015 (2021).
  61. Shang, M., et al. Removal of virus aerosols by the combination of filtration and UV-C irradiation. Front Environ Sci Eng. 17 (3), 27 (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HEPA

מאמרים קשורים