מאמר סקירה

התקדמות מחקרית באסטרטגיות הערכת יעילות תיקון נזקי DNA

DOI:

10.3791/71031

⸱

23 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 2School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 3Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 4Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקות יעילות לתיקון נזקי DNA יכולות להיות מסווגות לשלוש קבוצות: בדיקות פונקציונליות מבוססות תאים, בדיקות ביוכימיות במבחנה , ובדיקות סמן מולקולרית. גישות אלו מאפשרות הערכה איכותית או כמותית של יעילות התיקון במספר מסלולי תיקון נזקי DNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA גנומי תאי חשוף כל הזמן לגורמים אנדוגניים וחיצוניים שגורמים לצורות שונות של נזק ל-DNA. בתאי יונקים, עומס הנזק היומי ל-DNA עשוי להגיע ל-104–10 5 נגעים לתא. נזק ל-DNA שנמשך לשלב S יכול להוביל למוטציות. כאשר מוטציות כאלה מתרחשות באונקוגנים, בגנים מדכאי גידולים או בגנים המעורבים בהתרבות תאים, הן עשויות לקדם טרנספורמציה תאית וקרצינוגנזה. לכן, תיקון נזקי DNA ממלא תפקיד קריטי בשמירה על יציבות גנומית ובמניעת התפתחות סרטן. הערכת יכולת תיקון ה-DNA מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי מדידת הפעילות התפקודית של מערכות תיקון DNA. מסלולי תיקון נזקי DNA ויעילותם רלוונטיים מאוד לפיתוח תרופות כימותרפיות, אימות תפקוד גנים וטיפול בסרטן. בהתאם לכך, חקירת יעילות התיקון של מסלולי תיקון נזקי DNA בודדים היא בעלת משמעות תיאורטית ומעשית חשובה. סקירה זו מסכמת את מסלולי תיקון נזקי ה-DNA העיקריים, השיטות להערכת יעילות התיקון, ואת היתרונות והמגבלות של גישות אלו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת תיקון נזקי ה-DNA היא מנגנון הגנה תאי קריטי השומר על יציבות גנומית על ידי הפחתת תדירות המוטציות ודיכוי קרצינוגנזה1. סוגים שונים של נזקי DNA מתוקנים באמצעות מסלולי תיקון מובחנים אך מקושרים2. לדוגמה, אי-התאמות בסיסים שנוצרות במהלך שכפול DNA מתוקנות באמצעות תיקון אי-התאמה (MMR), בעוד שבסיסים שעברו התאמה כימית, כמו בסיסים אלקילטיים, מתוקנים בעיקר באמצעות תיקון כריתת בסיס (BER)3. 6-4 תוצרי פוטופולטור המושרים על ידי אולטרה סגול (UV) ותוספי נוקלאוטידים גדולים הנוצרים על ידי חומרים כימיים מסוימים מוסרים באמצעות תיקון כריתה בנוקלאוטידים (NER). נזק בין-קשתית (ICL) מתוקן באמצעות פעילויות מתואמות של חלבונים הקשורים למסלול אנמיה פאנקוני4. שבירות חד-גדיליות (SSBs) מתוקנות דרך מסלול תיקון שבירה חד-גדילית (SSBR), בעוד שבירות דו-גדיליות (DSB) מתוקנות בעיקר באמצעות חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) או רקומבינציה הומולוגית (HR). ברוב המקרים, נגעים מורכבים ב-DNA נפתרים באמצעות אינטראקציות מתואמות ביןמסלולי תיקון DNA מרובים.

הערכת נזק DNA ויעילות התיקון בתאים מתבססת בדרך כלל על שילוב של גישות ניסיוניות, כולל מבחן קומט, אימונופלואורסצנציה (IF), ווסטרן בלוטינג (WB), הפעלה מחדש של תאי מארח (HCR) ובדיקות תיקון מבוססות פלסמיד. שיטות אלו מעריכות נזק ותיקון DNA על ידי זיהוי שברי גדילי DNA, סמני נזק ל-DNA והבעה או מיקום של חלבונים הקשורים לתיקון6. עם זאת, כימות מדויק של יעילות התיקון התאית דורש בדרך כלל בדיקות דינמיות מבוססות אתגר. בגישות אלו, נגעי DNA ספציפיים מושרים בניסוייה, ותאים נמדגים בנקודות זמן עוקבות כדי לעקוב אחר היווצרות ופינוי אותות הנזק. השוואת רמות הנזק השאריתי לאורך זמן ביחס לנטל הנזק ההתחלתי מאפשרת הערכה כמותית של קינטיקת התיקון ותפקוד המסלול.

כדי להשוות באופן שיטתי את המאפיינים והיישומים של בדיקות יעילות תיקון נזקי DNA הזמינות כיום, סקירה זו מסכמת שיטות גילוי עיקריות לפי חמישה פרמטרים: ספציפיות נגע/תת-קרב, רזולוציה אנליטית, רגישות, יכולת כמותית ודרישות מכשור (טבלה 1). סקירה זו שואפת לספק מדריך מתודולוגי מעשי לבחירת גישות מתאימות לחקר מסלולי תיקון נזקי DNA במחקר בסיסי, תרגומי וקליני.

שיטת גילויספציפיות לנגע/תת-קרקערזולוציה אנליטיתרגישות/סף זיהויתוצר כמותי לעומת איכותנידרישות מכשור
כתם מערביCPDs, 6-4PPs, חלבוני תיקון (למשל, MGMT, RAD51)אוכלוסייהבינוניחצי-כמותיאלקטרופורזה של חלבונים, העברת ממברנה, מערכת דימות כימילומינסנציה
אימונופלואורסצנציהCPDs, מוקדי DSB (למשל, γ-H2AX, RAD51)תא יחידבינוניחצי-כמותימיקרוסקופ פלואורסצנציה
HPLC-MS/MSCPDs, 6-4PPs, נזק חמצוני ואלקיטיבי לבסיסיםאוכלוסייה/Invitroגבוה מאודכמותיHPLC-MS/MS
בדיקת פעילות האנזימים של MGMTנזק אלקילציוני O⁶-meGאוכלוסייה/Invitroגבוהכמותיקורא מיקרופלט
מבחן שביטSSBs, DSBs, בסיסים מחומצנים (עם טיפול מקדים FPG/OGG)תא יחידגבוהכמותימערכת מיקרוסקופ/אלקטרופורזה פלואורסצנטית
מבחן חתךאתרי AP, חתכי NER, חתכי BERאוכלוסייה/Invitroגבוהכמותיהדמיית ג'ל, תיוג רדיו/זיהוי פלואורסצנציה
מערכת תיקונים מחודשתנזק בסיסי ספציפי למקום, אתרי AP, שבירות חוטיםInvitroגבוהכמותיאלקטרופורזה ג'לית, זיהוי פלואורסצנציה/טרשת נפוצה
מבחן תיקון מבוסס פלסמידנזק ספציפי לאתראוכלוסייהבינוניכמותיקורא מיקרופלט, ציטומטר זרימה, ספירת מושבות
מבחן כתבנזק ספציפי למקום; בר, נר, HR, NHEJ, MMRאוכלוסייהגבוהכמותיקורא מיקרופלטות, ציטומטר זרימה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי
HCR/FM-HCRנזק UV, קישורי פלטינה, נזק ספציפי לאתראוכלוסייהגבוהכמותיציטומטר זרימה, גלאי פלואורסצנציה/כימילומינסנציה
RADDנזק DNA רחב טווחתא יחידגבוה מאודכמותימיקרוסקופ פלואורסצנציה חד-מולקולי
qPCRנזקי UV, נגעים החוסמים שרשרתאוכלוסייהבינוניכמותימכשיר qPCR בזמן אמת
זיהוי MSIאי יציבות מיקרו-לווייתית הקשורה לחוסר MMRאוכלוסייהבינוניאיכותימכשיר PCR/אלקטרופורזה קפילרית
DR-GFP/EJ5-GFPתיקון DSB בתיווך HR ו-NHEJאוכלוסייהגבוהכמותימיקרוסקופ ציטומטר זרימה/פלואורסצנציה
ברכה/אושרמיפוי DSB ברמת הגנוםתא יחידגבוה מאודכמותיסיקוונסר בתפוקה גבוהה
iPONDחלבוני DDR במזלגות שכפול/תיקון הקשור ל-TLSמזלג/פרוטאום לשכפולגבוהחצי-כמותיפלטפורמת ספקטרומטריית מסה/רצף

טבלה 1: השוואה שיטתית של שיטות לזיהוי יעילות תיקון נזקי DNA. השוואה בין שיטות נפוצות להערכת יעילות תיקון נזקי DNA במספר מסלולי תיקון. הטבלה מסכמת את הספציפיות של הנגע או הסובסטרט, רזולוציה אנליטית, רגישות, יכולת כמותית ודרישות מכשור לכל בדיקה, כולל גישות ביוכימיות, מולקולריות ותאיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

סקירה ופרספקטיבה

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תיקון ישיר (DR)

תיקון ישיר (DR) הוא הצורה הפשוטה ביותר של תיקון DNA ומתייחסת לשחזור ישיר של DNA פגום ללא הסרת בסיסים או נוקלאוטידים7. DR מתקן בעיקר שני סוגים עיקריים של נגעי DNA. הראשון הוא נזק דימר ציקלבוטאן פירימידין (CPD) הנגרם מקרינת אולטרה סגול (UV). ברבים מהאורגניזמים, פוטוליאז מזהה וקושר דימרים פירימידינים. בחשיפה לאור נראה, הפוטוליאז מופעל, הופך ישירות את נזק ה-DNA, ואז מתנתק ממולקולת ה-DNA. מנגנון הפוטוראקטיבציה הזה חשוב במיוחד בצמחים ובאורגניזמים נמוכים. עם זאת, יונקים שלייתיים, כולל בני אדם, חסרים פוטוליאז פונקציונלי ולכן אינם יכולים לבצע פוטוראקטיבציה מחדש. כתוצאה מכך, נזק CPD המושג על ידי UV בתאים אנושיים מתוקן בעיקר באמצעות תיקון כריתה בנוקלאוטידית (NER)8.

הסוג השני העיקרי של נזק המתוקן באמצעות DR הוא נזק בסיסי שנגרם מאלקילציה. התיקון מתווך על ידי O 6-אלקילגואנין-DNA אלקילטרנספראז (AGT), הידוע גם בשם O6-מתילגואנין-DNA מתילטרנספראז (MGMT). אנזים זה מעביר קבוצות אלקיל ממיקום O6 של שאריות גואנין אליו, ובכך משחזר ישירות את בסיס ה-DNA הפגוע.

שיטות לזיהוי יעילות DR

  1. זיהוי יעילות תיקון לנזק CPD שנגרם על ידי קרינת אולטרה סגולה (UV)
    1. מבחן Western Blot (WB) לזיהוי שינויים בתוכן CPD
      באמצעות נוגדנים ייעודיים ל-CPD, חוקרים יכולים לזהות שינויים בשפע CPD בנקודות זמן שונות לאחר הקרנת UV ולהסיק יעילות תיקון מרמת הנזק השאריתי. יעילות תיקון גבוהה יותר מתאימה להסרה מהירה יותר של CPD. זיהוי CPD מבוסס WB הוא גישה קלאסית ויעילה להערכת פעילות תיקון DNA; עם זאת, קיימות מספר מגבלות. ראשית, הבדיקה מודדת את רמות הנזק הממוצעות באוכלוסיות תאים ולכן חסרה רזולוציה של תא יחיד. שנית, וחשוב יותר, הבדיקה אינה יכולה להבחין בין מסלולי תיקון. מכיוון ש-CPDs בתאים אנושיים מתוקנים בעיקר באמצעות NER, ניתוח WB לבדו אינו יכול להבחין האם פעילות תיקון נצפית משקפת פעילות תיקון מתווכת פוטוליאז או פעילות NER ללא הקשר ניסויי נוסף.
    2. שינויים דינמיים של מיקוד CPD במיקום אימונופלואורסצנציה (IF)
      תאים שנחשפו לקרינת UV וטיפול בפוטוריפר יכולים להיות צובעים באמצעות נוגדנים ספציפיים ל-CPD, ושינויים במוקדי CPD גרעיניים ניתנים לצפייה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניתוח כמותי של היווצרות וניקוי מוקדי CPD מאפשר הערכת יכולת תיקון DNA הן ברמת האוכלוסייה והן ברמת התא היחיד. שיעור היעלמות מוקדי CPD משקף ישירות את יעילות התיקון. IF מספק ויזואליזציה מרחבית וזמנית של דינמיקת התיקון בתוך תאים בודדים ומאפשר זיהוי הטרוגניות בין תאים. עם זאת, אותות פלואורסצנציה רגישים לכיבוי, וניתוח כמותי לעיתים קרובות מסתמך על ספירה ידנית, שמכניסה סובייקטיביות. בתאים יונקים חסרי פעילות פוטור-ריאקטיבציה, שיטה זו משקפת בעיקר יעילות תיקון מתווכת NER.
    3. כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה בעלת ביצועים גבוהים (HPLC-MS/MS) לניתוח CPD כמותי
      ה-DNA המופק מתעכל אנזימטית לנוקלאוזידים, ולאחר מכן CPDs מופרדים מנוקלאוזידים רגילים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). ניתוח כמותי מתבצע לאחר מכן באמצעות ספקטרומטריית מסה טנדם (MS/MS). יעילות התיקון נקבעת על ידי השוואת שפע CPD לפני ואחרי התיקון9. HPLC-MS/MS מספק ספציפיות גבוהה מאוד ורגישות ברמת פיקומולר; עם זאת, השיטה דורשת ציוד יקר, הכנת דגימות מורכבות, ואינה משקפת את מצב התיקון המקומי של תאים שלמים. בדגימות תאים אנושיות, תוצאת התיקון הנמדדת משקפת בעיקר פעילות NER.
  2. יעילות תיקון נזק לבסיסי DNA הנגרמת על ידי חומרים אלקילטיביים
    1. בדיקת פעילות האנזימים של MGMT
      יעילות התיקון של נזק DNA הנגרם על ידי סוכני אלקילטינג מוערכת לעיתים קרובות על ידי מדידת פעילות MGMT10. תת-DNA מתילציה מתויגים רדיואקטיביים משמשים למעקב אחר העברת קבוצות מתיל מ-DNA פגום לחלבון MGMT, ובכך מאפשרים הערכה כמותית של יעילות התיקון.
    2. דיווח על בדיקת גנים לזיהוי יעילות תיקון O6-meG
      ניתן לבנות פלסמידים מדווחים המכילים נגעי O 6-מתילגואנין (O6-meG) להערכת יעילות התיקון. הנגע שהוכנס מדכא את ביטוי הגנים של המדווח עד שתיקון מתווך MGMT משיב את פעילות המדווח. יעילות התיקון נמדדת לאחר מכן על ידי מדידת רמות ביטוי הגנים של המדווח. בדיקות גן Reporter מספקות הערכה אינטואיטיבית וכמותית של פעילות התיקון בתאים חיים11. עם זאת, בדיקות אלו דורשות בניית וקטורים ספציפיים לנגע וכוללות מחזורי ניסוי יחסית ארוכים12.
  3. יעילות תיקון נזקים בעת גילוי שבירת שרשרת
    1. מבחן שביט
      מבחן הקומט, הידוע גם כאלקטרופורזה ג'ל חד-תאית (SCGE), הוא שיטה רגישה לזיהוי שבירות גדילי DNA ברמת תא יחיד. שברי DNA פגומים נודדים מהגרעין במהלך האלקטרפורזה, ויוצרים זנבות דמויי שביט, בעוד שה-DNA השלם נשאר מרוכז באזור הגרעיני. פרמטרים כמו אורך זנב השביט, תכולת ה-DNA בזנב ומומנט הזנב ניתנים לכימות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ותוכנות ניתוח תמונה. מדדים אלו מאפשרים הערכה כמותית של חומרת שבירת גדילי DNA. על ידי השוואת פרופילי שביטים מיד לאחר השראת נזק ל-DNA לאלו שהתקבלו לאחר תיקון, ניתן להעריך את יעילות התיקון13.
      מבחן הקומט מציע מספר יתרונות, כולל פעולה פשוטה, עלות יחסית נמוכה, רגישות גבוהה ורזולוציית תא יחיד. שיפור נוסף בשיטה זו הוביל לפיתוח וריאנטים מותאמים באנזימים ובדיקות תיקון DNA מבוססות שביטים במבחנה , שניתן להשתמש בהן להערכת פעילויות BER ו-NER.

2. תיקון כריתת בסיס (BER)

תיקון כריתת בסיס (BER) הוא מסלול תיקון DNA שמור מאוד, אשר בעיקר מסיר נגעי בסיס קטנים שנוצרים מחמצון, אלקילציה ודהאמינציה14. ל-BER יש חפיפה מכנית משמעותית עם תיקון שבירה חד-גדילית (SSBR), ואירועים מסוימים ב-SSBR נחשבים להרחבות של BER. לפי אורך התיקון, BER מחולק ל-BER קצר-פאץ' (SP-BER) ו-BER ארוך-פאץ' (LP-BER).

BER מופעל על ידי גליקוזילאזות DNA שמזהות וחותכות בסיסים פגועים על ידי ניתוק הקשר N-גליקוזידי בין הבסיס לדאוקסיריבוז, ובכך יוצרים אתרי apurinic/apyrimidinic (AP)15. אנדונוקלאז AP 1 (APE1) חותך לאחר מכן את עמוד השדרה של ה-DNA בצד 5′ של אתר AP, ומייצר קצות 3′-OH ו-5′-דאוקסיריבוז פוספט (dRP). במהלך SP-BER, קבוצת dRP מוסרת, DNA פולימראז β (Polβ) ממלא את פער הנוקלאוטידים היחידים, ו-DNA ליגאז III (LigIII) משלים את הליגציה.

תיקון שברים חד-גדיליים המושרים על ידי אלקילציה המכילים קצה חסום ב-3′ פועל במנגנון דומה אך דורש עיבוד נוסף בקצה. פולינוקלאוטידים קינאז 3′-פוספטאז (PNKP) מסיר תחילה קצוות לא תקינים של 3′ כדי ליצור קבוצה תקינה של 3′-OH. פולβ ממלא לאחר מכן את הנוקלאוטיד החסר, וליגIII אוטם את הפצע לתיקון מלא.

שיטות לזיהוי יעילות BER

  1. מבחן שביט מותאם באנזים
    מבחן קומט מותאם לאנזימים מרחיב את מבחן הקומט הסטנדרטי על ידי שילוב אנזימי תיקון ספציפיים לנגעים. אנזימים אלו מזהים וחותכים בסיסים פגועים, וממירים נגעים שאינם ניתנים לזיהוי לשברים בגדילים. עוצמת זנב השביט שנוצרת משקפת את רמת נזק ה-DNAב-16˒17.
    להערכת יעילות BER, נעשה שימוש בגליקוזילאז DNA פורממיטופירימידין (FPG) או ההומולוגיה היונקית שלו 8-אוקסוגואנין DNA גליקוזילאז (OGG1) להמרת נגעי בסיס מחומצנים לשברים חד-גדיליים, אשר מנותחים לאחר מכן באמצעות מבחן Comet18.
  2. מבחן חתך
    בדיקת החיתוך היא גישה בסיסית במבחנה להערכת פעילות BER. סובסטרטים של DNA המכילים אתרי AP מודגרים עם אנזימים מטוהרים או תמציות תאיות, ויחס תת-ה-DNA המפורק נמדד. בדיקה זו משקפת ישירות פעילות חתך המתווכת על ידי APE1 ומספקת ספציפיות ורגישות גבוהות תוך מזעור הפרעות מהסביבה התוך-תאית19.
    עם זאת, מבחן החתך אינו משחזר במלואו את פעילות ה-BER בתאים חיים, משום שאינו יכול להעריך ויסות דינמי של תהליך התיקון המלא, כולל זיהוי נגעים, כריתת בסיס, חיתוך אתר AP, סינתזת DNA וקשירה20.
  3. מערכת תיקונים מחודשת
    מערכת התיקון המחודשת היא פלטפורמה ניסיונית במבחנה שמשחזרת מסלולי תיקון DNA באמצעות חלבוני תיקון מטוהרים. מערכת זו מאפשרת ניתוח מפורט של הפונקציות המולקולריות והאינטראקציות של חלבוני תיקון בודדים, ומשמשת באופן נרחב למחקרים מכניים ולבדיקות תרופות.
    כדי להעריך את יעילות ה-BER, דגרים ברצף גליקוזילאזים מטוהרים, אנדונוקלאזים AP, פולימראזות DNA וליגזות עם סובסטרטים פגומים ב-DNA כדי לשחזר זיהוי, כריתתה, סינתזה וקשירה. מוצרי תיקון מנותחים באמצעות אלקטרופורזה ג'לית, תיוג פלואורסצנצי, או ספקטרומטריית מסה21. למרות שגישה זו מאפשרת מחקרים מכניים מבוקרים מאוד, היא אינה מתחשבת במבנה הכרומטין או בוויסות התאים הגלובלי של פעילות התיקון22.
  4. מבחן תיקון מבוסס פלסמיד
    בדיקות תיקון מבוססות פלסמידים כוללות הכנסת פלסמידים המכילים נגעי DNA מוגדרים לתאי המארח או דגירה עם תמציות תאיות המכילות אנזימי תיקון, ולאחר מכן הערכת יעילות התיקון באמצעות בדיקות מדווח, ציטומטריית זרימה או ניתוח היווצרות מושבות23.
    כדי להעריך את יעילות ה-BER, פלסמידים המכילים נזק חמצוני ל-DNA מדוגרים עם תמציות תאיות ומומרת לאחר מכן לזני חיידקים חסרי תיקון, כגון Escherichia coli. יעילות התיקון מוערכת לאחר מכן מקצב היווצרות מושבה.
  5. בדיקת גנים של Reporter
    בדיקות גן מדווח מעריכות בעקיפין את יעילות תיקון ה-DNA או פעילות רגולטורית גנטית על ידי מדידת שיקום ביטוי הגנים של המדווח24. במבחנים אלו, נגעי DNA או אלמנטים רגולטוריים משולבים במבני המדווח, ויעילות התיקון נמדדת באמצעות שינויים בפעילות המדווח לאחר התיקון.
    לצורך ניתוח BER, ניתן להכניס נגע 8-oxoG לאזור המקודד של גן דיווח לוסיפראז. אם הנגע נשאר לא תוקן, התרגום מופרע; תיקון מוצלח משחזר ביטוי חלבון באורך מלא. פלסמידים שלא נפגעו, כגון וקטורי pRL-TK רנילה לוסיפראז, משמשים לעיתים קרובות כבקרות פנימיות.
  6. הפעלה מחדש של תאי מארח (HCR)
    הפעלה מחדש של תאי מארח (HCR) היא מבחן קלאסי שמעריך בעקיפין את יעילות תיקון ה-DNA על ידי מדידת יכולת תאי המארח לשחזר ביטוי מפלסמידים פגומים של מדווח25. פלסמידים הנושאים נגעים מוגדרים, כגון דימרים פירימידינים המושרים על ידי UV או קישורים משולבים שנגרמו כימית, מועברים לתאי המארח. יעילות התיקון נמדדת לאחר מכן על ידי מדידת ביטוי גנים של מדווח.
    בדיקות HCR מספקות רגישות גבוהה ומאפשרות הערכת פעילות התיקון כלפי סוגי נגעים ספציפיים. עם זאת, נדרשים טרנספקציה יעילה והכנת פלסמידים פגומים באיכות גבוהה. מגבלה מרכזית של HCR קונבנציונלי היא שטיפול בפלסמידים עם חומרים המזיקים ל-DNA יוצר לעיתים אוכלוסיות נגעים הטרוגניות בכל הפלסמיד, ובכך מסבך את הפרשנות המכניסטית26.
    כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פותחו בדיקות הפעלה מחדש של תאי מארח מבוססות זרימה-ציטומטריה (FM-HCR) באמצעות פלסמידים חד-נגעיים ספציפיים למקום. FM-HCR מאפשר ניתוח כמותי מהיר של פעילות התיקון בתאים חיים, אם כי הבדיקה דורשת מכשור מיוחד ויש לה מגבלות לניתוח מכני סימולטני של מסלולי BER מרובים27.
    בדיקות הפעלה מחדש של תאי מארח פלאק (PL-HCR) המבוססות על תת-תאי BER ספציפיים לנגע פותחו גם הן לחקר מנגנוני BER בתאים חיים (איור 1)28. בגישה זו, פלסמידים המכילים נגע יחיד של 1,N 6-אתנואדנין (εA) מוכנסים לתאי יונקים. לאחר התיקון, DNA של הפלסמיד נשלף, מתעכל עם אנזימי הגבלה, מומר ל-E. coli ומכומת באמצעות ניתוח היווצרות פלאק. פלסמידים שתוקנו לחלוטין הופכים לליניאריים לאחר עיכול הגבלה ואינם מייצרים פלאקים, בעוד שפלסמידים שלא תוקנו או לא תוקנו לחלוטין נשארים עגולים ויוצרים פלאקים. לכן, יעילות BER נקבעת על ידי כימות פלאק.
  7. זיהוי נזקים בסיוע תיקון
    זיהוי נזק בסיוע תיקון (RADD) הוא שיטה חד-מולקולרית לזיהוי וכימות נזק DNA29. בגישה זו, אנזימי תיקון ספציפיים לנגעים מזהים ומסירים בסיסים פגומים, ולאחר מכן פולימראזות DNA משלבות נוקלאוטידים מסומנים בפלואורסצנציה בתוך הפערים הנוצרים. מולקולות DNA מוצגות לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מה שמאפשר זיהוי וכימות ישיר של נגעי DNA (איור 2)30.
    RADD מספק ניתוח איכותני וכמותי רגיש במיוחד של נזק ל-DNA ברמת מולקולה בודדת. עם זאת, השיטה מודדת בעיקר את עומס נזקי ה-DNA ולא הערכת קינטיקה של תיקון או יעילות תיקון כוללת באוכלוסיות תאים.

figure-protocol-1
איור 1: הפעלה מחדש של תאי מארח פלאק (PL-HCR). DNA חד-גדילי מעגלי M13mp18 המכיל נגע מוגדר מועבר לתאים מקצועיים. לאחר הטרנספקציה, תאים מתרבתים על לוחות אגר כדי לאפשר היווצרות פלאק. DNA M13 בצורת רפליקטיבי מבודד לאחר מכן מרובדות, מעוכל עם אנזימי הגבלה, ומנותח באמצעות אלקטרופורזה ג'ל כדי להבחין בין מוצרים מוטנטיים למוצרים פראיים ולקבוע האם התרחשה תיקון נגעים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-2
איור 2: זיהוי נזקים בסיוע תיקון (RADD). פערים חד-גדיליים הנוצרים במהלך תיקון DNA מתמלאים בנוקלאוטידים מסומנים בביוטין. אבידין או סטרפטווידין מסומן פלואורסצנטי משמש אז לזיהוי נוקלאוטידים משולבים, המאפשר הערכה כמותית של רמות נזק DNA באמצעות ניתוח פלואורסצנטי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. תיקון כריתה בנוקלאוטידית (NER)

תיקון כריתת נוקלאוטידים (NER) הוא מסלול מרכזי לתיקון DNA האחראי להסרת נגעים כבדים ב-DNA שמעוותים את ה-DNA Double Helix31. סובסטרטים של NER כוללים דימרים ציקלובוטנים פירימידינים (CPDs) המושרים על ידי UV, 6-4 פירימידין-פירימידון פוטופרוקטים (6-4PPs), נגעי פורין חמצוניים, אדוקטים כימיים מגושמים, וקישורים תוך-גדיליים32 המושרים על ידי ציספלטין. פגמים ב-NER קשורים להפרעות כמו קסרודרמה פיגמנטוזום, המאופיינת ברגישות קיצונית לקרינת UV וברגישות מוגברת לסרטן.

NER מורכב משני תתי-מסלולים עיקריים: הגנום הגלובלי NER (GG-NER)33 ו-NER (TC-NER)34 המקושר לשעתוק. GG-NER סוקר את כל הגנום לאיתור נגעים המעוותים להליקס, ובכך מדכא מוטגנזה וקרצינוגנזה. לעומת זאת, TC-NER מסיר באופן סלקטיבי נגעים החוסמים שעתוק מגנים שהועתקו באופן פעיל וחיוני לשמירה על שלמות השעתוק. פגמים ב-TC-NER תורמים להפרעות כמו תסמונת קוקיין ותסמונת רגישות לקרינת UV35.

שיטות לזיהוי יעילות NER

  1. מבחן חתך
    מבחן החתך מעריך את יעילות NER על ידי זיהוי חתכי גדלים שהוכנסו באתרי נזק DNA על ידי חלבוני תיקון. במבחן זה, תת-קרקעי DNA פגועים, כגון DNA מקרין UV המכיל CPDs, מודגרים עם חלבוני תיקון או תמציות תאיות, ומוצרים חותכים מזוהים לאחר מכן36.
    ניתן להשתמש בתיוג רדיואלי או סימון פלואורסצנטי לשיפור הרגישות ולאפשר ניטור מדויק של פעילות החתך37. הבדיקה מודדת ישירות את פעילות חלבוני NER מרכזיים האחראים לזיהוי נזק ולכריתתה. עם זאת, יישום מוצלח דורש הכנת סובסטרטים פגומים איכותיים ותמציות חלבון פעילות.
  2. בדיקת תיקון אנזימים לשביט
    ניתן גם להעריך את יעילות NER באמצעות בדיקות שביט מותאמות באנזים. בגישה זו, אנדונוקלאז T4 V מודגר עם תאים פגועים כדי להמיר דימרים פירימידינים לשברים חד-גדיליים ניתנים לזיהוי, אשר מנותחים לאחר מכן באמצעות מבחן Comet38.
  3. PCR כמותי פלואורסצנציה בזמן אמת (qPCR)
    PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) מעריך בעקיפין את יעילות תיקון ה-DNA על ידי מדידת ההשפעות המעכבות של נגעי DNA על הגברת PCR39. במהלך ניתוח NER, הקרנת UV משמשת לראשונה להשראת דימרים פירימידינים. נגעים אלו מעכבים את התקדמות DNA פולימראז ומפחיתים את יעילות ההגברה, מה שמוביל לעלייה בערכי סף המחזור (Ct). לאחר תיקון במסלול NER, שלמות ה-DNA משוחזרת, ויעילות ההגברה משתפרת, מה שמוביל לערכי Ct נמוכים יותר. לכן, ניתן לכמת את יעילות התיקון על ידי השוואת הגברה לפני ואחרי תיקון ביחס לאזור בקרה פנימי40 שלא ניזוק.
    בנוסף, qPCR יכול לשמש להערכת רמות הביטוי של גנים המעורבים במסלולי איתות ותיקון נזק DNA, כולל ATM, ATR, BRCA1, CDKN1A ו-XPC, ובכך משקף בעקיפין את יכולת תיקון ה-DNA41.
  4. הפעלה מחדש של תאי מארח מבוססי ציטומטריה זרימה (FM-HCR)
    בדיקות FM-HCR משתמשות בפלסמידים המכילים נגעים ספציפיים לאתר המועברים לתאי מארח ומכימות את יעילות התיקון באמצעות ניתוח זרימה ציטומטרי של עוצמת הפלואורסצנציה ויחס התאים הפלואורסצנטיים (איור 3)42˒43). עוצמת פלואורסצנציה מוגברת בדרך כלל משקפת יכולת תיקון DNA גדולה יותר44˒45.
  5. רצף תיקון כריתה (XR-seq)
    ריצוף תיקון כריתה (XR-seq) הוא טכניקה כלל-גנומית למיפוי פעילות NER ברזולוציה של נוקלאוטיד יחיד. שיטה זו מעשירה ומריצה באופן סלקטיבי אוליגונוקלאוטידים המכילים נזק שנלקחו במהלך NER, ובכך יוצרת מפות ברזולוציה גבוהה של פעילות תיקון ברחבי הגנום. XR-seq מאפשר ניתוח כמותי של יעילות התיקון ודפוסי התפלגות הקשורים למסלולי GG-NER ו-TC-NER, ומייצג התקדמות טכנולוגית משמעותית במחקר NER.
    מכיוון ש-NER מורכב משני תת-מסלולים מובחנים מבחינה מכנית וכולל חלבוני תיקון רבים, נדרשות מספר שיטות משלימות להערכה מקיפה של פעילות התיקון46˒47. בנוסף לשיטות שתוארו לעיל, ניתן גם להעריך את יעילות ה-NER באמצעות בדיקות Western blotting, בדיקות אימונופלואורסצנציה, בדיקות תיקון מבוססות פלסמידים ובדיקות גן מדווח.

figure-protocol-3
איור 3: עקרון הזיהוי של הפעלה מחדש של תאי מארח מבוססי ציטומטריה זרימה (FM-HCR). פלסמידים המכילים ארבעה סוגים מובחנים של נזק DNA מועברים יחד לתאי יונקים מתורבתים. קיבולת תיקון ה-DNA (DRC) נמדדת לאחר מכן באמצעות ציטומטריית זרימה המבוססת על עוצמת פלואורסצנציה של מדווח. DRC, יכולת תיקון DNA. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. תיקון אי-התאמה (MMR)

תיקון אי-התאמה (MMR) הוא מסלול תיקון שגיאות לאחר שכפול, האחראי לתיקון אי-התאמות בסיס, כגון אי-התאמות בין G-T ו-A-C, וכן לולאות קטנות של הכנסה-מחיקה שנוצרות במהלך שכפול DNA48. MMR מופעל כאשר MutS מזהה בסיסים לא תואמים, ולאחר מכן MutL מגייס גורמי תיקון ואקסונוקלאזים במורד הזרם כדי להפעיל את תהליך התיקון49. שלב קריטי ב-MMR הוא הבחנה בין גדילי ה-DNA ההוריים לבין גדילי ה-DNA החדשים50.

בפרוקריוטים, הבחנה בין גדיליות מושגת באמצעות מתילציה של DNA, המסמנת את גדיל ההורה. באאוקריוטים, זהות הגדילים נקבעת באמצעות חתכים חולפים ב-DNA מסונתז לאחרונה ואינטראקציות עם אנטיגן גרעיני מתפשט של תא (PCNA). MMR משפר משמעותית את נאמנות השכפול ומשחק תפקיד חיוני בשמירה על יציבות גנומית51. פגמים ב-MMR קשורים חזק למספר סוגי סרטן, כולל תסמונת לינץ'.

שיטות להערכת היעילות של MMR

  1. בדיקות אי-יציבות מיקרו-לווית
    MMR פגום גורם לכישלון בתיקון שגיאות החלקה בשכפול במיקומי מיקרו-לוויין, מה שמוביל לאי-יציבות מיקרו-לווית (MSI). בדיקות MSI כוללות הגברה של PCR של סמנים מייצגים של מיקרו-לוויינים ואחריה ניתוח קטעים מבוסס אלקטרופורזה קפילרית. חוסר יציבות במספר לוקוסים מציין פגיעה בפעילות MMR, בעוד שפרופילים יציבים של מיקרו-לוויין מצביעים על תפקוד MMR שלם. בדיקות MSI מספקות רגישות וספציפיות גבוהות לזיהוי חסר MMR; עם זאת, הוא נותר מדד עקיף לתפקוד ה-MMR ואינו מעריך כמותית את יעילות התיקון.
    פלסמידים של מדווח המכילים אי-התאמות מוגדרות או לולאות הכנסה-מחיקה יכולים לשמש גם להערכת יעילות MMR באמצעות בדיקות גן מדווח. בנוסף, בדיקות Western bloting ואימונופלואורסצנציה המיועדות לחלבונים הקשורים ל-MMR עשויות לספק הערכה עקיפה של פעילות המסלול.

5. תיקון שבירת שני חוטים (DSB)

שבירות כפולות (DSB) הן בין הצורות הטוקסיות ביותר של נזק DNA. כישלון בתיקון DSB בצורה מדויקת עלול לגרום למוטציות, מחיקות כרומוזומליות, טרנסלוקציות, חוסר יציבות גנומית ויצירת גידולים. תיקון DSB מתרחש בעיקר באמצעות רקומבינציה הומולוגית (HR) וחיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ), הפועלים בהעדפה בשלבים שונים במחזור התא52.

שיטות להערכת יעילות תיקון DSB

  1. בדיקת מוקדי גמא-H2AX
    מבחן מוקדי ה-γ-H2AX הוא אחת השיטות הנפוצות ביותר לזיהוי עקיף של DSB. לאחר היווצרות DSB, היסטון H2AX מזרחן במהירות ב-Ser139 ליצירת מוקדי γ-H2AX. מספר מוקדי ה-γ-H2AX קשור להיקף היווצרות DSB, ויעילות התיקון ניתנת להסקה על ידי ניטור קצב היעלמות המוקדים לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית.
    מבחן זה מציע מספר יתרונות, כולל רגישות גבוהה, רזולוציה תאית בודדת ופרוטוקולים ניסיוניים מבוססים, מה שהופך אותה לשיטה מרכזית במחקר תגובה לנזק DNA (DDR).
  2. ברכה ואושר
    BLESS (Breaks Labeling, Enrichment on Streptavidin, and Sequencing) ו-BLISS (Breaks Labeling In Situ and Sequencing) הן שיטות מיפוי DSB כלל-גנומיות המבוססות על תיוג מקומי וריצוף בתפוקה גבוהה. שתי הגישות מזהות אתרי DSB באמצעות קישור ישיר של מתאמי ריצוף לקצוות DNA שבורים, ומאפשרות מיקום וכימות מדויק של DSBs ברחבי הגנום. שיטות אלו יכולות לשמש גם להערכת קינטיקת תיקון DSB כוללת.
    בנוסף, בדיקות גן מדווח ספציפיות ל-DSB יכולות להעריך כמותית את יעילות תיקון DSB ולהבחין בין תיקון מתווך HR לתיקון מתווך NHEJ (איור 4). עם זאת, למרות שבדיקות γ-H2AX, BLESS ו-BLISS מודדות ביעילות את עומס ה-DSB העולמי ואת קינטיקת התיקון, הן אינן יכולות לקבוע אם התיקון התרחש במיוחד דרך מסלולי HR או NHEJ.

figure-protocol-4
איור 4: בדיקת גן דו"ר לתיקון שבירת דו-גדילית (DSB). פלסמידים של מדווחי DSB מוכנסים לתאי היעד. לאחר תקופת תיקון מתאימה לאחר הטרנספקציה, פלואורסצנציה של גן המדווח מנוטרת באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה להערכת יעילות תיקון DSB. DSB, שבירת דו-גדילית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

6. תיקון רקומבינציה הומולוגית (HR)

רקומבינציה הומולוגית (HR) היא מסלול תיקון DNA באיכות גבוהה שפועל בעיקר במהלך שלבי S ו-G2 במחזור התא, כאשר כרומטיד אחות לא פגוע זמין כתבנית תיקון53. לאחר יצירת DSB, קומפלקס MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) מזהה את קצות ה-DNA ומתחיל כריתת קצה ה-DNA בשיתוף פעולה עם CtIP54. תהליך זה יוצר בליטות DNA חד-גדיליות (ssDNA) באורך 3′.

ה-ssDNA המתקבל מצופה בתחילה על ידי חלבון שכפול A (RPA), שמגן על ה-DNA מפני פירוק נוקלאז ומונע היווצרות מבנים משניים55. בהמשך, BRCA2 מתווך החלפת RPA ב-RAD51 רקומבינאז, מה שמוביל להיווצרות חוט נוקלאופרוטאיןRAD51 56. חוט זה מחפש רצפי DNA הומולוגיים על הכרומטיד האחות ומקדם פלישה של גדילים לתבנית ה-DNA הדופלקסית ההומולוגית, ויוצר מבנה לולאת הזזה (D-loop)57˒58. סינתזת DNA והחלפת גדלים ממשיכה לתיקון מלא.

ניתן להעריך את יעילות משאבי האנוש באופן כמותי באמצעות מערכות דיווח DR-GFP במבחני גנים של מדווח. חלופה לכך היא לבצע הערכה עקיפה באמצעות בדיקות Western bloting או אימונופלואורסצנציה המיועדות לחלבונים הקשורים לדופק.

7. חיבור קצה DNA לא הומולוגי (NHEJ)

חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) מתקן DSBs מבלי לדרוש הומולוגיה רצפית נרחבת בין קצות ה-DNA59. במקום זאת, קצות DNA שבורים מעובדים ומקושרים ישירות, מה שהופך את NHEJ למסלול תיקון נוטה לשגיאות. מכיוון שקצוות DNA עשויים לעבור פירוק לפני קשירה, וקצוות של DSBים לא קשורים עשויים להתחבר יחד, NHEJ עלול לגרום למוטציות, מחיקותוסידור מחדש של כרומוזומים.

שלוש צורות עיקריות של תיקון לא הומולוגי מוכרות: NHEJ קלאסי, חישול חד-גדילי (SSA), וחיבור קצה מתווך מיקרוהומולוגיה (MMEJ).

  1. NHEJ קלאסי
    NHEJ קלאסי פועל לאורך כל מחזור התא. ההטרודימר של Ku70/Ku80 מזהה ראשון וקושר את קצוות DSB61. קומפלקס זה מגייס תת-יחידה קטליטית של חלבון קינאז תלוי DNA (DNA-PKcs), מה שמוביל להפעלת איתות קינאז והתחלת NHEJ. אנזימי עיבוד סופי, כולל נוקלאזים ופוספטאזים, מעבדים לאחר מכן קצות DNA פגועים לפני שקומפלקס XRCC4-DNA ליגאז IV מתווך קשירת קצוות62 של DNA. מכיוון שעיבוד סופי גורם לעיתים קרובות לאובדן נוקלאוטידים או לחיבור מחדש לא מדויק, NHEJ נחשב למסלול תיקון מוטגני63˒64.
  2. אנילינג חד-גדילי (SSA)
    אנילינג חד-גדילי (SSA) מתקן DSBs המתרחשים בין רצפים הומולוגיים חוזרים. לאחר היווצרות DSB, נוקלאזים חותכים את קצות ה-DNA בגודל 5′, ויוצרים בליטות מוארכות של 3′ ssDNA. RAD52 מתווך חישילה בין חזרות הומולוגיות משלימות65. בהמשך, קומפלקס האנדונוקלאז XPF-ERCC1 מסיר את דפי ה-DNA הלא מזווגים, ו-SLX1-SLX4 עשוי גם להשתתף בעיבוד סופי. ליגאז DNA אוטם את הפערים שנותרו. מכיוון שרצפים הממוקמים בין חזרות הומולוגיות נמחקים במהלך התיקון, SSA נחשב למנגנון תיקון מהיר אך מוטגניבמהותו.
  3. חיבור קצה מתווך-מיקרוהומולוגיה (MMEJ)
    חיבור קצה מתווך-מיקרוהומולוגיה (MMEJ), המכונה גם NHEJ חלופי (Alt-NHEJ), הוא נתיב נוסף לתיקון DSB67 המועד לשגיאות. ב-MMEJ, רצפים מיקרוהומולוגיים קצרים הממוקמים בקרבת קצוות שבירת DNA משמשים ליישור קצות DNA שבורים לפני התיקון. לאחר זיהוי האזורים המיקרו-הומולוגיים הללו, קצות ה-DNA מחוברים דרך תהליך דמוי רקומבינציה68. מכיוון ש-MMEJ מסתמך על רצפים הומולוגיים קצרים מאוד, מחיקות וסידורים גנומיים מתרחשים לעיתים קרובות במהלך התיקון.
    יעילות NHEJ ניתנת להערכה כמותית באמצעות מערכות דיווח EJ5-GFP במבחני גנים של מדווח. חלופה לכך היא שפעילות התיקון יכולה להיות מוערכת בעקיפין באמצעות Western blotting וניתוח אימונופלואורסצנציה של חלבונים הקשורים ל-NHEJ.

8. תיקון קישור בין חדרים (ICL)

קישורי צולב בין גדיליים (ICLs) הם נגעי DNA רעילים מאוד המקשרים קוולנטית בין שני הגדילים של סליל ה-DNA הכפול, ובכך חוסמים שכפול DNA ושעתוק. תיקון ICL הוא מורכב מבחינה מכנית וכולל בעיקר את מסלול אנמיה פנקוני (FA) ואת מסלול NEIL369.

במסלול FA, FANCM מזהה נגעים ב-ICL ומקדם מונוביקוויטינציה של קומפלקס FANCI-FANCD2, ובכך מפעיל חלבוני תיקון במורד הזרם70. נוקלאזים ספציפיים למבנה חותכים לאחר מכן DNA סמוך לקישור הצלב כדי להפריד בין שני גדילי ה-DNA, וה-DSB המתקבלים מתוקנים באמצעות מסלולי HR או NHEJ.

במסלול NEIL3, גליקוזילאז ה-DNA NEIL3 חותך קשרים גליקוזידיים הקשורים לנגע ICL, ויוצר אתרי AP שעוקפו לאחר מכן על ידי סינתזת טרנסלציה (TLS) פולימראזות71. מכיוון ש-ICLs מונעים הפרדת גדלים הנדרשים לשכפול ושעתוק, נגעים אלו הם ציטוטוקסיים מאוד ותורמים להזדקנות, ניוון עצבי וסרטן72˒73.

ניתן להעריך את יעילות תיקון ICL באמצעות בדיקות תיקון מבוססות פלסמיד, בדיקות גן מדווח, בדיקות הפעלה מחדש של תאי מארח, ומערכות תיקון מחודשות במבחנה .

9. סינתזת טרנסלציה (TLS)

סינתזת טרנסלציה (TLS) היא מנגנון סבילות לנזק DNA שמאפשר המשך השכפול על פני נגעי DNA שלא תוקנו74. TLS עוסק בעיקר בפולימראזות DNA מיוחדות, כולל פולימראזות κ, η, ι ו-ζ. כאשר שכפול ה-DNA נעצר באתרים פגועים, פולימראזות TLS עוקפות את הנגע ומאפשרים לשכפול להתקדם, ובכך שומרים על יציבות הגנום75.

בניגוד ל-BER, NER, MMR, HR ו-NHEJ, שמסירים או מתקנים ישירות נגעי DNA, TLS אינו מסיר נזק DNA. במקום זאת, הוא עוקף נגעים שלא תוקנו במהלך שכפול ה-DNA ולכן מסווג כמנגנון סבילות נזק ולא כמסלול תיקון DNA קנוני76.

TLS ניתן לחלק למסלולי עקיפה נטולי שגיאות ולמסלולי עקיפה חשופים לשגיאות. TLS נטול שגיאות מכניס את הנוקלאוטיד הנכון מול הפצע, בעוד ש-TLS רגיש לשגיאות לעיתים קרובות מכניס נוקלאוטידים שגויים ותורם למוטגנזה. TLS הרגיש לשגיאות נחשב למנגנון מרכזי שבו חומרים מסרטנים סביבתיים גורמים למוטציות גנומיות. כתוצאה מכך, מודולציה של מסלולי TLS הרגישים לשגיאות עשויה לייצג אסטרטגיה פוטנציאלית למניעת סרטן וטיפולב-77.

שיטות להערכת היעילות של TLS

  1. בידוד חלבונים ב-DNA מתהוות (iPOND)
    בידוד חלבונים על DNA מתהוות (iPOND) הוא טכניקה המשמשת לניתוח חלבונים הקשורים ל-DNA מסונתז חדש במזלגות שכפול תקועים. מכיוון שפעילות TLS מתרחשת לעיתים קרובות במזלגות תקועים, iPOND מאפשרת ניתוח דינמי של גיוס והרכבה של פולימראזות TLS וחלבוני תגובה לנזק DNA (DDR) במהלך מאמצי שכפול. לכן, שיטה זו יכולה לשמש להערכת פעילות TLS ותהליכי תיקון מקושרים-שכפול.
    יעילות ה-TLS עשויה להיבחן גם באמצעות פלסמידים של מדווח המכילים נגעים DNA ספציפיים ל-TLS בבדיקות גן מדווח. בנוסף, בדיקות Western bloting ואימונופלואורסצנציה המיועדות לחלבונים הקשורים ל-TLS עשויות לספק הערכה עקיפה של פעילות המסלול.

10. שיקולי בקרת איכות ושחזוריות בתכנון ניסוי

  1. שכפול ביולוגי ושכפול טכני
    הבחנה ברורה בין שכפולים ביולוגיים לשכפולים טכניים היא חיונית להבטחת אמינות ושחזוריות במחקרי תיקון DNA. באופן כללי, יש לכלול לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים לכל ניסוי, בעוד שמספר השכפולים הטכניים צריך להיקבע בהתאם לשונות של פלטפורמת הגילוי.
    לבדיקות חד-תאיות, כגון בדיקת קומט וניתוח מוקדים מבוססי אימונופלואורסנציה, יש לנתח לפחות 50–100 תאים בכל שכפול ביולוגי כדי למזער הטיית דגימה. בבדיקות דיווח מבוססות ציטומטריית זרימה, כולל בדיקות DR-GFP ו-FM-HCR, יש לאסוף לפחות 10,000 אירועי תאים חיים לכל מדגם כדי להבטיח עמידות סטטיסטית.
  2. אסטרטגיית התקינה
    השוואה כמותית מדויקת של יעילות התיקון בין דגימות שונות או אצוות ניסוי דורשת הליכי נרמול קפדניים כדי למזער שונות שיטתית הנובעת מהבדלים ביעילות הטרנספקציה, עמידות התאים, עומס הדגימה וביצועי המכשירים. אסטרטגיות נורמליזציה נפוצות כוללות את הבאות:
    1. קו-טרנספקציה של פלסמידי נרמול
      במבחני HCR, בדיקות תיקון מבוססות דיווח ובדיקות תיקון מבוססות פלסמיד, מומלץ לבצע קו-טרנספקציה עם פלסמיד נורמליזציה שאינו מושפע מנזק DNA. בקרים נפוצים כוללים פלסמידים של pRL-TK רנילה לוסיפראז או וקטורי GFP המבוטאים באופן קונסטרנטיבי. יעילות התיקון מנורמלת על ידי חישוב היחס בין אות המדווח הניסיוני לאות המדווח הבקרה.
    2. נרמול באמצעות חלבוני ניקיון או צביעת חלבון כוללת
      בניתוחי Western Blot שמעריכים ביטוי חלבוני תיקון או רמות CPD שאריתיות, יש לבצע נרמול באמצעות חלבוני משק בית, כגון GAPDH, β-אקטין או היסטון H3, או באמצעות שיטות צביעה מלאה של חלבון, כולל Ponceau S או צביעת REVERT.
    3. בקרות לא פגועות.
      בבדיקות תיקון מבוססות qPCR, יש להגביר אזורים גנומיים שלא פגועים כבקרים פנימיים, ולחשב את רמות הנזק היחסיות באמצעות שיטת ΔCt. באופן דומה, בדיקות HCR צריכות לכלול בקרות פלסמיד לא פגועות, המייצגות את ביטוי המדווח המקסימלי, ולאפשר ביטוי יעילות תיקון ביחס לפלסמידים ייחוס שלא ניזוקו.
    4. נרמול מספר תאים
      בבדיקות מבוססות ציטומטריית זרימה, כולל בדיקות FM-HCR ו-DR-GFP, יש לנתח מספר שווה של תאים ברי קיימא בין דגימות שונות. יעילות התיקון צריכה להיות מדווחת לאחר מכן כאחוז התאים החיוביים או כשינויים יחסיים בעוצמת הפלואורסצנציה.
  3. ממד קינטי של מדידת יעילות התיקון
    תיקון DNA הוא תהליך דינמי, ומדידות שמתקבלות מנקודת זמן אחת עשויות לא להבחין בין תיקון מאוחר לבין חוסר מסלול מלא. לכן, מומלץ מאוד עיצובים ניסיוניים במסלול זמן.
    לאחר השראת נזק DNA, יש לאסוף דגימות במספר נקודות זמן רצופות, כגון 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12 ו-24 שעות, כדי לעקוב אחר הצטברות וניקוי סימני נזק או מוצרי תיקון. הקינטיקה של היעלמות האותות מספקת מידע חשוב בנוגע לקצב התיקון, שלמות המסלול ויעילות התיקון הכוללת.
  4. תיקון בדיקת השערות מרובות:
    גישות בתפוקה גבוהה ומולטיפלקס כוללות לעיתים ניתוח סימולטני של מסלולי תיקון מרובים או תנאי ניסוי, ובכך מגבירים את הסיכון לממצאים חיוביים שגויות עקב השוואות סטטיסטיות מרובות. דוגמאות כוללות הערכה סימולטנית של פעילויות BER, NER, HR ו-NHEJ באמצעות בדיקות FM-HCR; ניתוח DSB כלל-גנומי באמצעות BLESS או BLISS; וניתוח מבוסס מערך qPCR של ביטוי גנים לתיקון DNA.
    בהתאם לכך, שיטות תיקון סטטיסטי לבדיקות השערות מרובות צריכות להיות מוגדרות מראש במהלך תכנון הניסוי. שיטות התיקון הנבחרות וספי המובהקות המותאמים צריכים להיות מדווחים בבירור במדורי חומרים ושיטות וניתוח סטטיסטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

מסקנות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי מדויק וניתוח כמותי של תהליכי תיקון נזקי DNA חיוניים להבנת המנגנונים המולקולריים שמאחורי תיקון DNA, להערכת ההשפעות הביולוגיות של חשיפות סביבתיות ולהערכת תגובות טיפוליות78. לכן, חקירה מעמיקה של מסלולי תיקון נזקי DNA ויעילות התיקון היא בעלת חשיבות משמעותית הן במחקר בסיסיוהן ביישומים קליניים.

מחקרים רבים הראו שתאי גידול יכולים לרכוש עמידות לכימותרפיה דרך הפעלה לא תקינה שלמסלולי תיקון DNA...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים או מערכות יחסים אישיות שיכלו להשפיע על העבודה שדווחה במחקר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מרכז המחקר ההנדסי של מחוז ג'יאנגסו לפיתוח ותרגום טכנולוגיות מפתח למניעה ושליטה במחלות כרוניות; צוות המחקר החדשני למדע וטכנולוגיה של מוסד ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו (2021); תוכנית מרכז המחקר הטכנולוגי להנדסה במכללה המקצועית של ג'יאנגסו (2023); הקרן המרכזית למדעי הטבע של מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו בסין (מענק מס' 24KJA310008); התוכנית המרכזית של מכללת הבריאות המקצועית של סוז'ואו (מענק מס' szwzy202406); ומעבדת המדינה המרכזית לרפואה והגנה מפני קרינה, אוניברסיטת סוצ'או (מענק מס' GZK1202506).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNADNA

מאמרים קשורים