הדמיה בזמן אמת ללא תוויות וניתוח כמותי של מורפודינמיקת מקרופאגים באמצעות טומוגרפיית דיפרקציה אופטית

סיכום

פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה מבוסס טומוגרפיה דיפרקציה אופטית ללא תוויות להדמיה בזמן אמת וניתוח כמותי של מורפודינמיקת מקרופאג'ים. השיטה מאפשרת מעקב רציף אחר מורפולוגיה והגירה של תא יחיד, ומספקת מדידות מתוכננות בזמן של שטח, היקף ומהירות נדידה ממוצעת במהלך הדמיה ארוכת טווח של תאים חיים.

תקציר

מחקר זה מקים תהליך עבודה מבוסס טומוגרפיה אופטית ללא תוויות (ODT) להדמיה וניתוח של תאים חיים לצפייה בשינויים מורפולוגיים תלויי זמן במאקרופאגים. השיטה מאפשרת רישום רציף של מורפולוגיה ותנועה של תא יחיד לאורך תקופות ממושכות בתנאי סביבה יציבים, ומאפשרת חילוץ פרמטרים כמותיים, כולל שטח צפוי, פרימטר ומהירות נדידה ממוצעת. תהליך עבודה זה מספק גישה מעשית ללכידת התנהגויות תאיות דינמיות ברמת תא יחיד ללא תיוג חיצוני. באמצעות מודל של RAW264.7 מקרופאג'ים, בוצעה הדמיית טיים-לאפס תחת גירוי ליפופוליסכריד עם טיפול מוקדם בבייקלין כדי ללכוד שינויים תאיים דינמיים בתנאים שונים. נבחרו תאים מייצגים למעקב וניתוח כמותי. התוצאות מראות שתהליך עבודה זה תומך במעקב יציב וארוך טווח של תא יחיד ומשקף שינויים זמניים במורפולוגיה ובתנועתיות התא. גישה זו מספקת שיטה ללא תוויות לצפייה בהתנהגויות תאיות דינמיות בתגובה לגירויים שונים ויכולה לשמש כהשלמה שימושית לבדיקות מבוססות קצה קונבנציונליות. ייתכן שיישים גם לסוגי תאים דבקים אחרים למחקרים של מורפודינמיקה של תאים.

מבוא

מקרופאגים ממלאים תפקיד מרכזי בתגובות החיסוניות המולדות ובהומאוסטזיס הרקמות, ומצבם התפקודי יכול להשתנות באופן דינמי בתגובה לגירויים מיקרוסביבתיים. באופן מסורתי, מקרופאגים תוארו כמאמצים פנוטיפים פרו-דלקתיים או אנטי-דלקתיים/תיקונים ^1,2. עם זאת, ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהפעלת המקרופאגים היא תהליך רציף ופלסטי ולא מצב בינארי בדיד. תחת גירויים שונים, המאקרופאגים עוברים שינויים הדרגתיים לאורך זמן, בליווי שינויים במורפולוגיית התאים ובהתנהגות הנדידה⁵. לכן, אפיון זמני של שינויים מורפולוגיים ונדידים ברמת תא יחיד מספק גישה חשובה לחקר תגובות תאיות דינמיות.

הגישות הנוכחיות לחקר מצבי מקרופאגים מתבססות בעיקר על צביעת חיסונים, ציטומטריית זרימה, וניתוחים טרנסקריפטומיים או פרוטאומיים⁶. שיטות אלו מבוססות בדרך כלל על דגימות קבועות או נקודות זמן נפרדות, מה שמגביל את יכולתן לעקוב אחר שינויים רציפים באותו תא בתנאים חיים⁷. הדמיה של תאים חיים מבוססת פלואורסצנציה מאפשרת תצפית דינמית אך עלולה להיות מושפעת מפוטוטוקסיות ופוטוליצ'ינג במהלך ניסויים ארוכי טווח ^8,9. טומוגרפיית דיפרקציה אופטית (ODT) היא טכניקת דימות ללא תווית המשחזרת את התפלגות מקדם השבירה התלת-ממדי של התאים כדי לספק מידע מבני כמותי¹⁰. מכיוון שאינו דורש תיוג חיצוני, ODT מתאים להדמיה ארוכת טווח של תאים חיים ומפחית הפרעות בהתנהגות תאים. בשנים האחרונות, ODT יושם במחקרים דינמיים במודלים שונים של תאים¹¹, כאשר מחקרים קודמים התמקדו בעיקר ביכולת דימות ואפיון מבני. לעומת זאת, המחקר הנוכחי קובע זרימת עבודה סטנדרטית וללא תוויות לניתוח תא יחיד ארוך טווח של מורפודינמיקת מקרופאגים בתנאי גירוי מבחנה מוגדר.

תהליך העבודה מודגם באמצעות מודל מקרופאגים RAW264.7 במבחנה עם גירוי ליפופוליסכרידים (LPS) וטיפול מוקדם בבייקלין (BAI). BAI שימש כמודולטור ניסיוני מייצג לקביעת תנאי מוגדר להדגמת תהליך העבודה. הדמיה רציפה מאפשרת חילוץ פרמטרים כמותיים של תא יחיד, כולל שטח מוערך, היקף ומהירות נדידה ממוצעת, ומאפשרת אפיון זמני של שינויים מורפולוגיים והתנהגותיים. גישה זו נועדה לספק ניתוח תיאורי של שינויים פנוטיפיים דינמיים ולא להגדיר מצבים פונקציונליים או קיטוב, ועשויה לשמש כשיטה משלימה לבדיקות מבוססות נקודת קצה על ידי מתן מידע זמני. זרימת העבודה מאומת במערכת מודל זו והיא עשויה להתאים לסוגי תאים נאמנים אחרים.

פרוטוקול

1. תרבות מקרופאגים

אזהרה: בצע את כל ההליכים בארון בטיחות ביולוגית תוך לבישת כפפות מעבדה וחלוק מעבדה.

1. הכינו מדיום תרבית מלא (מדיום איגל מותאם (DMEM) של Dulbecco עם רמות סוכר גבוהות, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין–סטרפטומיצין).
2. הפשיר בקבוקון של תאי מאקרופאג RAW264.7 באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך פחות מדקה אחת.
3. העבר את ההשעיה התאית ל-DMEM עם רמות רמות גבוהות בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
4. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות.
5. זרוק את הסופרנטנט.
6. החזירו את התאים למדיום טרי ומלא.
7. זרעו תאים לצלחות בגודל 60 מ"מ ב-2–5 × 10^{או 5} תאים בכל צלחת.
8. דגרו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
9. אין להחליף את המדיום בתוך 12–24 שעות לאחר ההפשרה.
10. החלף את המדיום כל 2–3 ימים.
11. מעקב אחרי מורפולוגיית התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
12. תאי מעבר במפגש של 80–90% באמצעות פיפטינג עדין.
    הערה: הימנע משימוש בטריפסין. השתמש בתאים בקטעים 6–18. בחר תאים עם מורפולוגיה אחידה וללא ואקווליזציה לניסויים. קו התאים אומת באמצעות פרופיל STR ועבר בדיקות בקרת איכות. דוחות מפורטים וסיכום באנגלית מסופקים בקבצים המשלימים (Supplementary Files).

2. טיפול תאי

1. אסוף תאים בשלב הצמיחה הלוגריתמי על ידי פיפטינג עדין.
2. החזירו את התאים למדיום שלם.
3. מדדו צפיפות תאים באמצעות מונה תאים.
4. כוון את צפיפות התאים ל-4 × 10⁴ תאים/מ"ל.
5. זרע 2 מ"ל של מתלה תא בכל צלחת 35 מ"מ.
6. הקצה מנות לשתי קבוצות: (i) קבוצת LPS, (ii) קבוצת BAI + LPS.
7. דגרו תאים בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ למשך 12–16 שעות.
8. הכן תמיסת BAI בנפח 50 mM ב-DMSO. אחסן את תמיסת המלאי של ה-BAI בטמפרטורה של −20°C.
9. הוסף BAI לקבוצת BAI + LPS לריכוז סופי של 100 מיקרומון. מדלל את תמיסת המאגר של BAI ישירות בתווך תרבית כדי להגיע לריכוז העבודה הסופי.
10. הוסיפו נפח שווה של DMSO לקבוצת LPS.
11. הכינו תמיסת LPS (1 מ"ג/מ"ל) במדיום מלא.
12. מוסיפים LPS לשתי הקבוצות לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל. מדלל את תמיסת המלאי של LPS ישירות במדיום גידול כדי להגיע לריכוז העבודה הסופי.
13. המשיכו מיד להדמיה ואל תחליפו את המדיום במהלך ההדמיה.

3. רכישת טומוגרפיה בדיפרקציה אופטית

1. הפעל את מערכת ההדמיה ODT והפעל את מודול הבקרה הסביבתית.
2. הגדר את טמפרטורת הבמה ל-37 מעלות צלזיוס.
3. הגדר את ריכוז ה-CO₂ ל-5%.
4. אפשר למערכת לאזן לפחות 20 דקות.
5. פתח את תוכנת הרכישה.
6. הנח את מנה התרבות על במת ההדמיה.
7. השתמש במטרה של 60x (NA = 1.42) כדי לאתר תאים.
8. בחר תאים מבודדים עם גבולות ברורים להדמיה.
9. הגדר את מרווח ההדמיה ל-8 דקות.
10. הגדר את מספר הפריימים הכולל ל-181.
11. הפעל את פונקציית הפוקוס האוטומטי לשמור על המיקוד במהלך הדמיית טיים-לפס.
12. התחל ברכישת טיימלפס.
13. מעקב אחר יציבות המערכת במהלך הרכישה.
    הערה: ייצוב פוקוס אוטומטי יושם לאורך כל הניסוי כדי למזער סטיית מוקד.

4. שחזור תמונה וניתוח כמותי

1. לאחר רכישת התמונה, התוכנה מבצעת אוטומטית שחזור תמונה.
2. באמצעות האלגוריתם הסטנדרטי המובנה.
3. חכה עד שסרגל ההתקדמות יושלם.
4. פתח את תוכנת הניתוח (Intellyseg, v2.1.0).
5. ייבא את מערך הנתונים הגולמי על ידי בחירת ייבוא נתונים גולמיים.
6. גולש לתיקיית היעד.
7. בחר את קובץ היעד וייבא את מערך הנתונים.
8. לחץ על "Cell" כדי לבצע סגמנטציה אוטומטית באמצעות הגדרות עקביות בין מערכי נתונים¹³.
9. בחרו תאים על פי הקריטריונים הבאים: (i) אין חפיפה עם תאים שכנים, (ii) אינם במגע עם גבולות התמונה, (iii) ניתנים למעקב רציף לאורך סדרת הזמן.
10. בחר מספר קבוע של תאים (n = 8) לכל שדה ראייה לניתוח עקבי בין מערכי נתונים.
11. פתח את מודול "מעקב ארוך טווח".
12. הכירו את המסגרת ההתחלתית והמסגרת הסופית.
13. לחץ על "Track" כדי להתחיל מעקב, המבוסס על עקביות מיקום התא בין פריימים^{עוקבים 14}.
14. תיקון ידני של שגיאות מעקב במידת הצורך כדי להבטיח המשכיות מסלול: (i) לחיצה ימנית על מסכות שגויות ובחירת "מחיקת פריט", (ii) פתח "סגמנטציה ידנית", (iii) בחר "תא" ולחץ על "הוספה", (iv) השתמש ב"Click" או "Box" להוספת מסכות נכונות.
15. לחץ על "ייצוא", ואז בחר "ייצוא נתונים".
16. בחר "ייצוא וידאו" ובחר רכיבי פלט.
17. נכנס לתמונה הפריימים ההתחלתיים והסוף.
18. בחר את נתיב השמירה ופורמט הקובץ.
19. לחץ על "אישור" לייצא את הווידאו.
20. לחץ על "ייצוא", ואז בחר "מערכת תרשימים".
21. בחר "מצעד שירים".
22. בחר "תא" כקטגוריית סגמנטציה.
23. הכירו את טווח מסגרת המעקב.
24. בחר פרמטרי פלט (למשל, שטח, היקף).
25. לחץ על "ייצוא תמונה או אקסל" ושמור את הקובץ.
26. חשב את מהירות הנדידה הממוצעת (μm/h) לכל תא בהתבסס על הסטת המרכז לאורך כל סדרת הזמן.

5. הצגת נתונים

1. מדידות כמותיות מוצגות באופן תיאורי. לא בוצעה הסקה סטטיסטית. כל קבוצת טיפול כללה חמישה דגימות עצמאיות.
   סקירה של זרימת העבודה הניסיונית מוצגת באיור 1. מגבים מרכזיים, מכשירים ותוכנה מופיעים בטבלת החומרים. מצבי ההדמיה מסוכמים בטבלה 1.

תוצאות

כדי להעריך את ביצועי זרימת העבודה המבוססת על ODT, בוצעה הדמיית טיים-לאפס לשתי קבוצות טיפול (LPS ו-BAI + LPS), עם חמישה דגימות עצמאיות בכל קבוצה. כל הדגימות נאספו בתנאי הדמיה זהים. עקב עומס העבודה הגבוה הקשור למעקב ארוך טווח של תא יחיד וניתוח כמותי, נבחר מדגם מייצג אחד מכל קבוצה לניתוח חד-תאי והדמיה. התוצאות מוצגות באופן תיאורי ואינן מיועדות להסקה סטטיסטית.

דינמיקת מורפולוגיה של טיים-לאפס

הדמיית ODT בזמן-לאפס הראתה כי שיטה זו מאפשרת רישום רציף של שינ...

דיון

מחקר זה מקים תהליך עבודה מבוסס ODT ללא תוויות להדמיה רציפה וניתוח כמותי של מורפודינמיקת מקרופאגים ברמת תא יחיד. הגישה מאפשרת מדידה מדויקת בזמן של שטח, היקף ומהירות נדידה ממוצעת במהלך הדמיה ארוכת טווח של תאים חיים. צפיפות זריעת תאים היא גורם מרכזי המשפיע על סגמנטציה ומעקב אחר ביצועים. צפיפות גבוהה גורמת לחפיפות תאים, בעוד שצפיפות נמוכה מפחיתה את מספר התאים הניתנים לניתוח. לכן, יש לייעל את תנאי הזריעה לפני ההדמיה. מרווח ההדמיה נקבע על בסיס ניסויים ראשוניים לאיזון בין רזולוציה זמנית, נפח הנ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ODT imaging system	Pellucid Optics	MH-PanoView	משמש להדמיה של תאים חיים ללא תווית
תוכנת רכישה	Pellucid Optics	Lucida-Pano v2.1.0	משמשת לרכישת תמונות
תוכנת ניתוח	Pellucid Optics	Intellyseg v2.1.0	משמשת לשיחזור תמונות, פילוח ומעקב
RAW264.7	Wuhan Zishan Biotechnology	STCC20020P	קו מקרופאג'ים מוריני המשמש לניסויי קוטביות והדמיה in vitro.
באייקלין (BAI)	Shanghai Yuanye	JB246114	משמש לטיפול מוקדם של תאים
ליפופוליסכריד (LPS)	Solarbio	L8880	משמש לגירוי מקרופאג'ים
מדיום DMEM	Gibco	C11995500BT	מדיום לתרבית תאים
סרום פרה עוברית	Procell	164210	תוסף לתרבית תאים
פניצילין–סטרפטומיצין (100x)	Procell	PB180120	אנטיביוטיקה לתרבית תאים
צלחת תרבית 60 מ"מ	Corning	CLS430166	משמשת לתרבית תאים
צלחת תרבית עם תחתית זכוכית 35 מ"מ	Cellvis	D35-10-1.5-N	משמשת להדמיה ODT
מיקרוסקופ הפוך	OLYMPUS	CKX53	משמש לתצפית שגרתית של תאים ולמעקב במהלך התרבית.
מונה תאים	RWD Life Science	C100	משמש לקביעת צפיפות תאים