העברה מיטוכונדריאלית חיצונית בדיפוציטים חומים מבחינים ופרה-אדיפוציטים חסרי AGPAT2

סיכום

מיטוכונדריה חיצונית ממקור אנושי ועכברי ניתנת להפנמה על ידי הבדלת פרה-אדיפוציטים ולעקוב אחריה לאורך התמיינות אדיפוגנית באמצעות הדמיה וכלים גנטיים. בעוד שהמיטוכונדריה הללו מתקשרות פיזית עם רשת המיטוכונדריה האנדוגנית, הן אינן מגבירות את הביטוי של סמנים הקשורים לשומנים חומים בוגרים.

תקציר

מיטוכונדריה הן מרכזי איתות מרכזיים; עם זאת, האם התפשטות המסה המיטוכונדרית נדרשת מבחינה מכנית להגזרה נותרה שאלה פתוחה. AGPAT2 מזרז את המרת חומצה ליזופוספטידית לחומצה פוספטית, וחסרו מוביל לחסר ברקמת השומן ולפגיעה באדיפוגנזה הקשורה להפחתת מסת המיטוכונדריה. השפעת התרחבות המסה המיטוכונדריאלית על האדיפוגנזיס הוערכה על ידי העברת מיטוכונדריה אקסוגנית לשומנים חומים ממיינים. נבדק גם האם העברת המיטוכונדריה יכולה להציל את הפגיעה באדיפוגנזה של תאים חסרי AGPAT2. מיטוכונדריה אנושית ועכברית הועברה בהצלחה והשתלבה ברשת המיטוכונדריאלית האנדוגנית של פרה-אדיפוציטים מבדילים בעכברים, והמשיכה להתקיים לאורך כל האדיפוגנזה החומה. נדרשה התמיינות אדיפוגנית לשימור מיטוכונדריה שהועברה. העברת מיטוכונדריה לא שינתה את הביטוי של סמנים מולקולריים של שומנים חומים בוגרים או תכולת טיפות ליפידים, אם כי היא השפיעה על ההתפלגות היחסית של גודל טיפות השומנים באופן תלוי במין. ב-Agpat2^-/- פרה-אדיפוציטים, העברת המטוכונדריה לא הצליחה להציל את האדיפוגנזה, מה שמעיד כי התפשטות המסה המיטוכונדריאלית לבדה אינה מספיקה כדי להפוך את המנגנונים המובילים לליפודיסטרופיה במודל זה. תוצאות אלו מצביעות על כך שלמרות שניתן לשלב מיטוכונדריה חיצונית של בני אדם ועכברים ברשת המיטוכונדריאלית של שומנים ממיילים, הן אינן משפיעות ישירות על התוכנית האדיפוגנית.

מבוא

מעבר לתפקידיהם הביואנרגטיים העיקריים, המיטוכונדריה משמשות כמרכזי איתות בתהליכים תאיים רבים, כולל התמיינות תאים 1,2,3,4. רקמת שומן חומה (BAT) מחזיקה במסה מיטוכונדרית גבוהה במיוחד התומכת בפעילות התרמוגנית שלה, מה שמדגיש את תפקידה באיזון האנרגיה של כל הגוף ובפתוגנזה של השמנה⁵. בעוד שמסה מיטוכונדריאלית מווסתת על ידי האיזון בין ביוגנזה למיטופגיה, עדיין לא ברור אם התרחבות מסת המיטוכונדריה במהלך התמיינות שומנים חומים נדרשת פונקציונלית לאדיפוגנזה, או שהיא רק תוצאה של התהליך.

העברת מיטוכונדריה פיזיולוגית בין תאים תועדה הן במבחנה והן בחיים, שם היא תורמת להסתגלות רקמה בתנאים פתולוגיים, כולל תפקוד לקוי של רקמת השומן הקשורה להשמנה ועמידות לאינסולין ^6,7. יתרה מזאת, הוכח כי העברת מיטוכונדריה מלאכותית במבחנה משפרת את יכולת הנשימה של תאי המקבל⁸. יחד, ממצאים אלו תומכים ברעיון שהעברת מיטוכונדריה יכולה לשנות את תפקוד המטבוליזם התאית ויכולה לתרום להסתגלות רקמה בתנאי לחץ ביואנרגטי ^9,10,11. בהשוואה לאסטרטגיות פרמקולוגיות או גנטיות שמעודדות ביוגנזה אנדוגנית של מיטוכונדריה על ידי הפעלת תוכניות שעתוק גרעיניות ומיטוכונדריאליות, העברת מיטוכונדריה מספקת ישירות אברונים לתאי המקבל, ומאפשרת שינוי מהיר של מסת המיטוכונדריה ללא תלות במניפולציות שעתוק^12,13. גישה זו קריטית לתיקון ליקויים במחלות מיטוכונדריאליות, אך גם מאפשרת לחקור פעולות מיטוכונדריאליות ללא השפעות פוטנציאליות לא מדויקות של גישות פרמקולוגיות או גנטיות¹⁴.

במחקר הנוכחי, חקרנו את השפעת העלאה מלאכותית של מסת המיטוכונדריה באמצעות העברת מיטוכונדריה חיצונית על הבדלת שומנים חומים. גישה זו אפשרה הערכה ישירה של השפעת מסת המיטוכונדריה על תוכנית האדיפוגנית. כדי להשיג זאת, פרוטוקולי העברת מיטוכונדריה שפותחו במקור לתאי גזע מזנכימיים הותאמו¹⁵ באמצעות תאי כבד אנושיים ופרה-אדיפוציטים של עכברים כתורמים למיטוכונדריה. שיטה למעקב אחר מיטוכונדריה אנושית בתאי עכברים מתמיינים פותחה באמצעות כלים גנטיים בשילוב עם טכניקות הדמיה, המדגימה כי מיטוכונדריה משני המקורות משולבות ברשת המיטוכונדריה האנדוגנית ונמשכות לאורך כל ההתמיינות האדיפוגנית.

למידול אדיפוגנזיס פגום הקשור למסה מיטוכונדרית נמוכה, נעשה שימוש בדיפוציטים חומים שמקורם בעכברים חסרי 1-אצילגליצרול-3-פוספט-O-אצילטרנספראז 2 (AGPAT2)-חסר (Agpat2^-/-). AGPAT2 מתבטא מאוד ברקמת השומן, שם הוא מזרז את היווצרות חומצה פוספטידית במסלול הביוסינתזה של הגליצרוליפידים. חסר ב-AGPAT2 גורם לליפודיסטרופיה חמורה הן בבני אדם והן בעכברים, ומפחית את האדיפוגנזה במודלים של שומנים לבנים וחומים בקשר להפחתת מסת המיטוכונדריה 16,17,18. שילוב מיטוכונדריה אקסוגנית בפרה-אדיפוציטים הממיינים שינה במעט את התפלגות גודל טיפות הליפידים אך לא הגביר את הביטוי של סמני שומן חומים בוגרים או הציל את הפגיעה האדיפוגנית של פרה-אדיפוציטים Agpat2^-/-

פרוטוקול

נהלי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה הקתולית של צ'ילה, פרוטוקול 210609003. עכברים יילודים מסוג פראי ו-Agpat2^-/- P0.5 משני המינים, שמקורם ברקע גנטי מעורב C57BL/6J ו-129J, שימשו במחקר זה. ציוד מגן אישי (PPE): לבש חלוק מעבדה, משקפי בטיחות וכפפות ניטריל. ראו קובץ משלים 1 לפרטים נוספים על הפרוטוקול וטבלה 1 עבור המאגרים הנדרשים לפרוטוקול זה.

כל הפסולת הכימית הרעילה שנוצרת במהלך הכנת מיקרוסקופיית אלקטרונים, קיבוע פאראפורמלדהיד והפקת חומצות גרעין חייבת להיות מופרדת בקפדנות לנחלים מסומנים ומסומנים בבירור, בהתאם לתקנות הבריאות והבטיחות הסביבתית (EHS) המוסדיות. בשום פנים ואופן אסור לשחרר אף אחד מהחומרים הללו לכיור המעבדה או למערכת הביוב הציבורית. כל פסולת כימית מסוכנת שנוצרת חייבת להיות מופרדת לפי סיווגי EHS מוסדיים.

1. תרבית תאים

1. בידוד, התמיינות ותחזוקה של שומניות ראשוניות (iBAT)
   הערה: ראו קובץ משלים 1 לתיאור קצר של הנהלים וטבלה 1 להרכב הפתרונות הנדרשים. הסבר מלא ומפורט לפרוטוקול ההבדלה האדיפוגנית החומה שלנו במבחנה ניתן למצוא אצל Figueroa ואחרים^.
   1. בודד פרה-אדיפוציטים מרקמת השומן החומה הבין-סקפולרית (iBAT) של עכברים יילודים (P0.5) לאחר הליכי עיכול כירורגיים ואנזימטיים שתוארו על ידי Figueroa ואחרים^.
   2. להבדיל ולשמר את תרבות השומן החומה בהתאם ללוח הזמנים של קוקטייל ההבחנה והחלפת המדיה.
      הערה: כדי להבדיל אדיפוגני מוצלח, חשוב מאוד שהתרביות יגיעו למפגש של 90–100% לפני תחילת האינדוקציה האדיפוגנית.
2. תרבות HepG2
   1. תרבית תאי HepG2 ב-DMEM עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B. שמרו על התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח עם 5%_CO2.
      הערה: תאים אלו גדלים באשכולות ועלולים להיראות תת-מתכנסים למרות צפיפות גבוהה עקב גדילה רב-שכבתית.

2. בידוד והעברה מיטוכונדריאלית

1. בידוד מיטוכונדריאלי
   הערה: בצע את כל השלבים בארון בטיחות ביולוגית בטמפרטורה של 4°C או על קרח. השתמש בהכנה תוך שעתיים.
   1. זרעים 2 ×^{10 תאי} תורם (HepG2 או פרה-אדיפוציטים) במנות תרבית של 100 מ"מ. גדל תאים עד שהם מגיעים למפגש של 80% (HepG2) או 100% (פרה-אדיפוציטים).
   2. תאי תורם צבע עם 100 ננומטר MitoTracker Deep Red FM במדיום ללא FBS למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%_CO2 .
   3. שטוף את התאים פעמיים עם מדיום גדילה כדי להסיר צבע עודף.
   4. נתקו תאים באמצעות טריפסין, אספו את המתלים, וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   5. החזירו את הכדור ל-1 מ"ל של בופר בידוד מיטוכונדריאלי (MIB) בתוספת BSA, מעכבי פרוטאז ומעכבי פוספטאז. לשבש את ממברנת הפלזמה על ידי העברת המתלה דרך מזרק טוברקולין 5x. הומוגניזציה של התנועה על ידי העברתה דרך מזרק אינסולין לפחות פי 10 עד שהתמיסה הופכת לחומה בהירה וללא גושים נראים לעין.
      הערה: לניתוח כתם מערבי, יש להפריד 50 מיקרוליטר מהליזאט הכולל ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
2. צנטריפוגה את ההומוגנט ב-900 × גרם למשך 11 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: אם הסופרנטנט לאחר סיבוב של 900 × גרם אינו מעורפל, סביר להניח שניתוק התאי אינו שלם.
   1. אספו את הסופרנטנט והצנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לפזר את המיטוכונדריה. שטוף את הכדור המיטוכונדריאלי שלוש פעמים עם MIB בתוספת BSA.
   2. בצע השעיה סופית ב-100 מיקרוליטר של MIB ללא BSA. כמת את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבון BCA.
3. בדיקת העברת מיטוכונדריה (MTA) בפרה-אדיפוציטים
   1. פרה-אדיפוציטים של מקבל הזרע ב-5 × 10^תאים לבאר בלוחות 12 בארות (עם כיסויי 18 מ"מ למיקרוסקופיה) 24 שעות לפני הבדיקה.
   2. הוסיפו מיטוכונדריה מבודדת מבודדת ישירות למדיום המקבל ביחס של 10 מיקרוגרם חלבון מיטוכונדריאלי ל-10^{או 5} תאים. נדנדו בעדינות את הלוחות כדי לפזר את המיטוכונדריה. דגרו תאים למשך 24–120 שעות (המתאימים לימים 1, 3 ו-5 של ההתמיינות) בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח עם 5% CO₂ לפני הניתוח.

3. צריכת חמצן מיטוכונדריאלית ויעילות MTA

1. רספירומטריה מיטוכונדריאלית
   1. כוון את אמבט המים החיצוני ל-25 מעלות צלזיוס וודא שיווי משקל תרמי יציב במעטפת התא לפני תחילת מדידות.
   2. בצע כיול פאזה נוזלית דו-נקודתית באמצעות תוכנת הרכישה של המכשיר.
      1. כיול רוויה באוויר (High Point): הוסף 500 מיקרוליטר מים דה-מינרליים רוויים לתא. כוון את המערבל המגנטי ל-60 סל"ד והקליט את האות עד שהוא מתייצב על רמה (>1,500 מ"וולט).
      2. כיול ללא חמצן (נקודה נמוכה): מוסיפים כמות קטנה (~3 מ"מ) של סולפיט נתרן לתא כדי להזיז את האוויר שנותר. הקליטו עד שהאות יורד לרמה יציבה (~1% מהאות הבסיסי, ~20 mV).
   3. התחל הקלטה בזמן אמת (זמן ריצה כולל: ~10 דקות).
   4. הקלטה של 3 דקות עד שמושגת קריאה ליניארית יציבה.
   5. החזיר את השעיית מיטוכונדריה מבודדת ב-200 מיקרוליטר של בופר בדיקה מיטוכונדריאלי (MAS)²⁰, בתוספת 5 mM גלוטמט ו-2.5 mM מלט.
      הערה: בעבודה הנוכחית, כדור המיטוכונדריה הכוללת הוצא משני לוחות תאים בקוטר 100 מ"מ.
   6. העבר את המתלה לתא האוקסיגרף וסגור היטב את בומפה האטומה, כדי לוודא שלא יישארו בועות אוויר.
   7. צריכת חמצן שיא במשך 3 דקות.
   8. הוסף 150 מיקרומום ADP כדי להפעיל נשימה מקושרת מיטוכונדריאלית ולמדוד נשימה משולבת בסינתזה ATP למשך 3 דקות.
   9. הגדר ידנית את המקטעים היציבים והליניאריים המתאימים לכל שלב נשימה. חלצו את ערכי השיפוע האוטומטיים שחושבים על ידי התוכנה, המובעים כקצב צריכת חמצן ב-nmol∙^mL-1∙^min-1.
      הערה: לניקוי תא בין הלוחות, שטוף את התא פעמיים ב-1 מ"ל מים דה-מינרליים וודא שהפנים יבש לחלוטין. הוסיפו 100 מיקרוליטר PBS לתא לפני המעבר לפלטה הבאה.
2. ציטומטריית זרימה
   הערה: שמרו את כל הדגימות בקפאה לאורך כל התהליך כדי לשמור על שלמות התאים והביואנרגיה.
   1. בידוד מיטוכונדריה וביצוע בדיקת העברת מיטוכונדריה (MTA), כפי שמתואר בסעיפים 2.1 ו-2.2, בהתאמה, בצלחות תרבית בקוטר 35 מ"מ, באמצעות תאי תורם שסומנו בעבר ב-MitoTracker Deep Red FM.
   2. שאופי את מדיום התרבית ושוטפים את שכבת התא פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS סטרילי.
   3. הוסף 500 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין-אדטה ודגר את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שנצפה היפרדות תא מלאה תחת מיקרוסקופ.
   4. לנטרל טריפסין על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום גדילה מלא (DMEM עם 10% FBS). העבר את כל הנפח לצינור קוני של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   5. השליכו את הסופרנטנט בשאיבה ושמרו על כדור התא. החזירו את הכדור ל-500 מיקרו ליטר של PBS קר על ידי פיפטינג עדין.
   6. ניתחו את הדגימות באמצעות ציטומטר זרימה המצויד בלייזר 640 ננומטר (ראו קובץ משלים 1 לפרטים על רכישת וניתוח ציטומטריית זרימה).
      1. הגדר את אוכלוסיית התאים באמצעות גרפים של פיזור קדמי (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) ויישום אסטרטגיית שער כדי להוציא פסולת וכפולות תאים.
      2. כמת את עוצמת הפלואורסצנציה בערוץ האדום הרחוק (מסנן פליטה 670/30 ננומטר) כדי לזהות מיטוכונדריה מסומנת על ידי MitoTracker פנימית.
      3. בצע ניתוח באמצעות Floreada.io (ראה קובץ משלים 1 לפרטי פרוטוקול גייטינג).
         הערה: כלול בקרה שלילית (תאי מקבל ללא MTA) כדי לקבוע את קו הבסיס לפלואורסצנציה אוטומטית ברקע.
3. מיקרוסקופיה קונפוקלית ואלקטרונית
   1. בדיקת הדמיה של תאים חיים
      1. פרה-אדיפוציטים ראשוניים של זרעים שמקורם בעכברי יילוד P0.5 ללוחות של 12 בארות המכילים כיסויי 18 מ"מ, בהתאם לדרישות הצפיפות התאיות והמדיה הספציפיות המפורטות בסעיף 1.
      2. לבודד מיטוכונדריה ולבצע את מבחן העברת המיטוכונדריה (MTA) באמצעות תאי תורם שסומנו בעבר ב-MitoTracker Deep Red FM, כפי שמפורט בסעיף 2.
      3. שמרו על תרביות המקבל בדוגמה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2 למשך 24 שעות כדי לאפשר קליטת מיטוכונדריה.
      4. הכינו תמיסת MitoTracker ירוקה של 70 ננומטר על ידי דילול המלאי במדיום תרבית ללא FBS.
      5. שאפו את מדיום הגידול מפלטות ה-12 בארות והחליפו בתמיסת MitoTracker Green של 70 ננומטר. דגרו את הלוחות למשך 25 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5%_CO2 כדי לנטרל את כל רשת המיטוכונדריאלים.
      6. הסר את תמיסת הכתמים ושטוף את הכיסוי פעמיים עם 1 מ"ל מדיום חמים ומלא של תרבית.
      7. החלף את הנפח הסופי במדיום מלא ללא פנול אדום כדי למזער אוטו-פלואורסצנציה ברקע במהלך הרכישה.
      8. העבר את הכיסוי או את הלוח לשלב המיקרוסקופ הקונפוקלי. כוון את תא הדגירה של המיקרוסקופ לשמור על סביבה קבועה של 37°C ו-5%_CO2.
      9. צלם תמונות מיד באמצעות הגדרות התרגשות/פליטה מתאימות לערוצי האדום הרחוק (MitoTracker, Deep Red FM) וירוקים (MitoTracker Green). ראו תיק משלים 1 לפרטים נוספים.
         הערה: יש לבצע את כל שלבי הצביעה והטיפול בתנאי תאורה חלשה כדי למנוע הלבנה פוטוגרפית של הפלואורופורים. השתמש באובייקט טבילה בשמן עם פתח מספרי גבוה (NA) (60x או 100x) לרזולוציה מיטבית של מורפולוגיית מיטוכונדריה.
   2. בדיקת אימונופלואורסצנציה קונפוקלית עם תאים קבועים
      הערה: לאחר קיבוע התאים, תמיסות פאראפורמלדהיד וגלוטראלדהיד רעילות מסווגות כאורגניים לא הלוגניים. תוצרי לוואי של חילוץ חומצות גרעין דורשים הפרדה קפדנית: יש להשליך תערובות פנול/כלורופורם כחומרים אורגניים הלוגניים, בעוד שבופרים מבוססי גואנידיניום מסווגים כאורגניים קורוזיביים.
      1. פרה-אדיפוציטים ראשוניים של זרעים שמקורם בעכברים ניונאליים P0.5 ללוחות 12 בארות המכילים כיסויי 12 מ"מ, כפי שמתואר בסעיף 1.
      2. בידוד מיטוכונדריה וביצוע בדיקת העברת מיטוכונדריה (MTA) בהתאם להליכים המפורטים בסעיף 2.
      3. דגרו את התרביות למשך 24 שעות כדי לאפשר קליטת מיטוכונדריה.
      4. השרתו התמיינות אדיפוגנית חומה על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר בקובץ המשלים 1 ועיינו בטבלה 1 להרכב המאגרים הנדרש.
      5. תקבע את התאים ביום השביעי של התמיינות (168 שעות). שאופי את מדיום הגידול והוסף 500 מיקרוליטר של 4% פאראפורמלדהיד (PFA) לכל באר. דגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      6. שטוף את הכיסוי פעמיים על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS קרח לכל באר. חדירה וחסימת התאים על ידי דגירה של כיסויי כיסוי ב-PBS המכילים 0.05% סאפונין ו-0.2% BSA למשך שעה בטמפרטורת החדר. הנח את הפלטה על מנער אורביטלי תחת ערבוב עדין.
      7. שטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS. לצבוע את הגרעינים וטיפות השומן בו זמנית. יש להחיל 1 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst 33342 ו-1 מיקרוגרם/מ"ל BODIPY שהוכן בבופר החסימה/חדירה. דגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לוודא שהצלחת מוגנת מהאור.
      8. שטוף את הכיסוי פעמיים עם 1 מ"ל של PBS קר כקרח. התקן את הכיסויים על מחסניות זכוכית נקיות. יש לשחרר 10 מיקרו-ליטר של מתקן על הסלייד ומניח את צד תא הכיסוי כלפי מטה על מדיום ההרכבה. אפשר לדגימות להתייבש בלילה בסביבה חשוכה בטמפרטורת החדר לפני ההדמיה.
      9. לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש בשני ערוצי פלואורסצנציה המכוילים לספקטרום הפליטה של Hoechst ו-BODIPY. ראו קובץ משלים 1 לפרטים נוספים על הדמיה.
      10. בצע ניתוח טיפות ליפידים באמצעות ImageJ v1.54s. פתח את ערוץ טיפות השומן, זהה טיפות בודדות ידנית באמצעות כלי Freehand selections ו-ROI Manager , וחשב את שטח הטיפה באמצעות ניתוח | מדוד פקודה.
      11. לעבד ולנתח את הנתונים המתקבלים באמצעות סקריפטים של R המסופקים בקובץ המשלים 2 בסביבת RStudio v4.5.2.
          הערה: רכוש בדיוק חמש תמונות לכל כיסוי בהגדלה של פי 10 כדי להבטיח דגימה מייצגת. השתמש בגרסת R 4.5.2 ומעלה לצורך תאימות לסקריפטים שסופקו.
   3. מיקרוסקופ אלקטרונים בהעברה (TEM)
      הערה: לתוצרי לוואי במיקרוסקופ אלקטרוני, יש לאסוף אוסמיום טטרוקסיד רעיל מאוד ובופרים נתרן קקודילט המכילים ארסן כפסולת מתכות כבדות רעילה, בעוד שאורניל אצטט מנוהל בנפרד כפסולת מתכות כבדות רדיואקטיבית לפי פרוטוקולי בטיחות קרינה מוסדיים.
      1. צנטריפוגה את המיטוכונדריה המבודדת, מחלק 2, בעוצמה של 10,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לקבל פלט קומפקטי.
      2. תקן את הכדור על ידי הוספת 2.5% גלוטראלדהיד בבופר קקודילט נתרן של 0.1 מיליון (pH 7.0). דגרו במשך שעתיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
         הערה: תמיד יש לטפל בתמיסות גלוטראלדהיד ולבצע שלבי קיבוע ראשוניים בתוך מכסה אדים כימי. ללבוש כפפות ניטריל ומשקפי מגן להגנה על העיניים. הימנע מכל מגע עם מקורות חימום, שכן גלוטראלדהיד מחומם משחרר אדים מגרים מאוד.
      3. שטפו את ההכנה המיטוכונדריאלית למשך 3 ×-10 דקות עם בופר קקודילט נתרן של 0.05 מ', וצ'נטריפוגה לזמן קצר כדי לשמור על הכדור בין החלפות הבופר.
      4. לאחר קיבוע הדגימה על ידי הוספת 1% טטרוקסיד אוסמיום מימי (OsO₄). דגרו 15 דקות בטמפרטורת החדר.
         הערה: יש לפתוח ולטפל בטטרוקסיד אוסמיום רק בתוך מכסה אדים כימי מוסמך ומתפקד במלואו. לבשו חלוק מעבדה, משקפי מגן בטיחות או מגן פנים מלא, וכפפות עבות או כפולות ניטריל (החליפו כפפות מיד אם מתרחשת התזה, שכן OsO₄ יכול לחדור ניטריל דק עם הזמן).
      5. שטפו את הדגימה במשך 3 × 5 דקות עם מים מזוקקים כפול. צבעי את הכדור באצטט אורניל מימי של 1% למשך 15 דקות.
         הערה: עבוד על נייר שולחן חד-פעמי עם גב פלסטיק. הקדישו אזור מסוים במעבדה לצביעה רדיואקטיבית. לבש כפפות כפולות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן. שטוף ידיים היטב לאחר סיום ההליך.
      6. ייבשו את ההכנה באמצעות סדרת אתנול מדורגת. דגרו את הכדור ב-30%, 50%, 70%, 95% ו-100% אתנול למשך 5 דקות בכל ריכוז.
      7. הטמיעו את החלקים המיטוכונדריאליים. דגרו בתמיסת אפון/אתנול 1:1 למשך 30 דקות, ואחר כך עם שרף אפון טהור למשך שעה.
      8. העבר את הדגימות לתבניות משובצות ופולימר בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
      9. חבר את בלוקי השרף לאולטרה-מיקרוטום וחתוך קטעים דקים מאוד (80 ננומטר).
      10. אסוף חלקים על רשתות. צבעו את הרשתות ב-1% אורניל אצטט מימי למשך 4 דקות. שטוף במים מזוקקים כפול.
      11. לצבוע עם ציטראט עופרת במשך 5 דקות לפי שיטת ריינולדס²¹. שטוף היטב. תדמיין את הרשתות באמצעות ה-TEM. ראו קובץ משלים 1 לפרטים על שיטת ריינולדס ורכישת תמונות TEM.

4. כימות מולקולרי

1. עקומת סטנדרט של DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA)
   1. זרעי תאי HepG2 לחמישה צלחות תרבית בקוטר 100 מ"מ. דגרו את התרביות עד שיגיעו ל-80% מהמפגש.
   2. בודדו את המיטוכונדריה מהתאים שנקטפו על ידי ביצוע ההליך הטכני המפורט בסעיף 2.
   3. הפקת DNA מלא מהכדור המיטוכונדרי המתקבל באמצעות שיטת חומצה-גואנידיניום-פנול-כלורופורם כפי שמתואר בסעיף 4.2.6. מדדו את ריכוז ה-DNA והערכו טוהר (A₂₆₀/_{A 280} ו-(A 260/_{A יחס 230}) באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-ווליום UV-Vis.
   4. הכינו סדרת דילול סדרתית תוך שימוש במים ללא נוקלאז כמדלל. דיללו את מאגר ה-DNA כדי להגיע לכמויות סופיות של 1, ^10-1, ^10-2, ^10-3, ^10-4, ו-10-5 ng לכל נפח תגובה. מערבולות כל דילול במשך 5 שניות כדי להבטיח הומוגניות מלאה לפני המעבר לשלב הבא בסדרה.
      הערה: כוון את טווח הריכוז של העקומה הסטנדרטית בהתבסס על ריכוז הדגימה הספציפי ונפח התגובה הסופי של PCR.
2. זיהוי mtDNA אנושי בתאי המקבל
   1. פרה-אדיפוציטים ראשוניים בזרעים שמקורם בעכברי ניאונטל P0.5 לתוך צלחות תרבית של 60 מ"מ, בהתאם לצפיפות ותנאי המדיה המפורטים בסעיף 1.
   2. בודד מיטוכונדריה מתאי HepG2 תורמים ובצע את בדיקת העברת המיטוכונדריה (MTA) כפי שמפורט בסעיף 2.
   3. דגרו את התרביות במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%_CO2.
   4. השרה התמיינות אדיפוגנית חומה למשך 24–120 שעות (בימים 1, 3 ו-5) על ידי ביצוע פרוטוקול החלפת המדיה המתואר בסעיף 1.
   5. שאף את מדיום התרבית ושוטף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS קר כקרח.
   6. חילוץ DNA כולל באמצעות שיטת חומצה-גואנידיניום-פנול-כלורופורם²².
      הערה: תמיד יש לבצע הפרדת פאזה בתוך מכסה האדים כדי להימנע משאיפת אדי פנול רעילים. השתמש בכפפות ניטריל כפולות או כפפות עמידות לכימיקלים חזקות.
   7. בצע הפרדת פאזה והשליך את כל הפאזה המימית הממוקמת מעל האינטרפאזה.
      שלב קריטי: הסרת השלב המימי לחלוטין כדי למנוע זיהום ולהבטיח טוהר DNA גבוה ל-qPCR במורד הזרם.
   8. הוסיפו 0.3 מ"ל של 100% אתנול לכל 1 מ"ל מהמקור הראשוני. סגור את הצינור וערבב בעוצמה על ידי היפוך.
   9. תן לו לעמוד 3 דקות בטמפרטורת החדר ולצנטריפוגה ב-2,000 × גרם במשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לשחרר את ה-DNA.
   10. העבר את סופרנטנט הפנול-אתנול לצינור נפרד לצורך בידוד חלבוני פוטנציאלי. החזירו את כדור ה-DNA ב-1 מ"ל של 0.1 מיליון נתרן ציטראט (ב-10% אתנול, pH 8.5) לכל 1 מ"ל של תגובת חילוץ בשימוש.
   11. תן לו לעמוד 30 דקות בטמפרטורת החדר, להפוך אותו בעדינות כמה פעמים, ובצנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט.
   12. חזור על שלבי שטיפת הנתרן ציטראט פעמיים נוספות.
   13. שטפו את הכדור המתקבל ב-2 מ"ל של 75% אתנול לכל 1 מ"ל של תגובת חילוץ ראשונית.
   14. תן לו לעמוד 20 דקות בטמפרטורת החדר ולצנטריפוגה על 2,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   15. זרקו את הסופרנטנט וייבשו את הכדור באוויר למשך 10 דקות. המיס את ה-DNA על ידי הוספת 0.3–0.6 מ"ל של 8 mM NaOH ופיפטינג חוזר עד שהכדור נעלם.
   16. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס להסרת פסולת בלתי מסיסה. העבר את הסופרנטנט לצינור סטרילי וכיוון את ה-pH ל-7–8 באמצעות HEPES.
   17. מדוד ריכוז וטוהר DNA (יחס (A(260)/A(280) ו-(A(260)/A(230)) באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-ווליום UV-Vis.
   18. מדלל את התבנית לכמות סופית של 15 ng של DNA במים נטולי נוקלאז. לבצע PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) עבור mtDNA אנושי באמצעות לוחות אופטיים מסוג 96 בארות כפי שמפורט בסעיף 4.3.
   19. נתח את תוצאות ההגברה על ידי יישום מודל רגרסיה לוגריתמי.
       הערה: בצע את ניתוח הרגרסיה הלוגריתמית באמצעות ריכוז DNA וערכי מחזור סף (Ct) תואמים כמשתנים.
3. RT-qPCR לביטוי גנים
   1. הכנת תאים והבדילה
      1. פרה-אדיפוציטים ראשוניים של זרעים שמקורם בעכברי יילוד P0.5 בצלחות תרבית בקוטר 60 מ"מ כפי שמפורט בסעיף 1.1.
      2. לבודד מיטוכונדריה ולבצע את בדיקת העברת המיטוכונדריה (MTA) בהתאם להליכים בסעיף 2. דגרו את התרביות ל-24 שעות.
      3. השרה אדיפוגנזיס חום למשך 24–120 שעות (דגימה בימים 1, 3 ו-5 של ההתמיינות) בהתאם לפרוטוקול בסעיף 1.
   2. בידוד RNA מלא
      1. הסירו את מדיום התרבית והוסיפו 1 מ"ל של תגובת חומצה-גואנידיניום-פנול-כלורופורם לכל 1 ×-10-6 תאים ישירות לצלחת. הומוגניזציה של הדגימות על ידי פיפטציה חוזרת עד שהליזאט אחיד.
         הערה: תמיד יש לבצע הפרדת פאזה בתוך מכסה האדים כדי להימנע משאיפת אדי פנול רעילים. השתמש בכפפות ניטריל כפולות או כפפות עמידות לכימיקלים חזקות.
      2. הוסיפו 0.2 מ"ל כלורופורם לכל 1 מ"ל של תגובת מחלץ שהשתמשו. סגור את הצינורות היטב ונער חזק ביד במשך 15 שניות. תן לו לעמוד 3 דקות בטמפרטורת החדר ולצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      3. העבר בזהירות את השלב המימי העליון לצינור חדש ללא נוקלאז. הימנע ממגע עם האינטרפאזה. תשאירו את הדגימות על הקרח.
      4. הוסף 0.5 מ"ל איזופרופנול לכל 1 מ"ל של תגובת מחלץ שהשתמשו בו. ערבבו בעדינות באמצעות הפיכה ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      5. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להוציא את ה-RNA. השליכו את הסופרנטנט על ידי היפוך.
      6. שטוף את כדור ה-RNA עם 1 מ"ל של 75% אתנול. מערבולת לזמן קצר וצנטריפוגה ב-7,500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      7. השליכו את הסופרנטנט וייבשו את כדור ה-RNA באוויר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. החזירו את הכדור ל-30 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להבטיח מסיסות מלאה.
      8. קבעו את ריכוז וטוהר ה-RNA (יחס_{A 260}/_{A 280} ) באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-ווליום UV-Vis.
      9. אימות שלמות ה-RNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
   3. טיפול ב-DNase
      1. הוסף 0.1 נפחים של בופר DNase של 10× ו-1 מיקרוליטר של אנזים DNase לכל דגימת RNA. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג. דגרו את התגובות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      2. השעתי מחדש את מגיב ההשבתה של DNase על ידי הקלה או מערבולת עד שהתערובת תהיה הומוגנית. הוסיפו את תגובת ההשבתה (0.1 נפחים של דגימת ה-RNA או 2 מיקרוליטר, לפי הגדול מביניהם) וערבבו היטב. דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הפך את הצינורות 3 פעמים במהלך תקופה זו כדי לשמור על התגובה במצב תלוי.
      3. צנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך דקה וחצי. העבר את הסופרנטנט המכיל RNA לצינור חדש.
         שלב קריטי: ודא שלא יישאר מגיב השבתה של DNase הלאה, שכן הוא מעכב סינתזת cDNA מאוחרת.
   4. תמלול הפוך (RT)
      1. כמת את ה-RNA המטופל ודילל במים נטולי נוקלאז כדי להשתמש עד 2 מיקרוגרם RNA כולל לכל תגובה של 20 מיקרוליטר.
      2. הכינו את תערובת המאסטר של RT על הקרח בהתאם להוראות היצרן. מפזר את התערובת לצינורות תגובה והוסף את דגימות ה-RNA.
      3. טען למחזור תרמי והפעיל את תוכנית השעתוק ההפוכה כפי שמוגדר על ידי יצרן הקיט.
   5. PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)
      1. השתמש ב-cDNA שנוצר בסעיף 4.3.4 כתבנית PCR. מדלל את ה-cDNA במים ללא נוקלאז לריכוז עבודה של 20 ng לכל תגובה של 10 מיקרוליטר. תשאירו את כל החומרים על הקרח.
      2. הכינו תערובת ראשית המכילה SYBR ירוק, פריימרים ומים ללא נוקלאז. כלול נפח עודף עבור אובדן פיפטינג. פזר 10 מיקרוליטר מתערובת התגובה לכל באר של לוח qPCR אופטי.
      3. אוטם את הפלטה עם סרט דבק אופטי וצנטריפוגה לזמן קצר כדי לאסוף את הנוזל בתחתית. טעין את הפלטה למכשיר PCR בזמן אמת ובצע הגברה באמצעות מצב מחזור מהיר.
      4. קבעו את ערכי מחזור הסף (Ct) ומבצעים כימות יחסי באמצעות שיטת ΔΔCt. כלול ניתוח עקומת התכה בסוף הריצה כדי לאמת את ספציפיות ההגברה.
         הערה: נרמול שפע mRNA יעד לרמות mRNA של 36B4 כגן הבית האנדוגני. הרץ את לוחות ה-qPCR בטווח של 2 שעות מההתקנה; אחרת, יש לאחסן את הלוחות האטומים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. כתם מערבי
   1. כמת את ריכוז החלבון מתמציות תא מלא ומיטוקונדריאליות (ראו סעיפים 2.1.8 ו-2.1.12) באמצעות בדיקת BCA.
   2. הכינו 30 מיקרוגרם חלבון לכל דגימה והוסיפו את הנפח המתאים של בופר טעינת דגימות SDS-PAGE (למשל, בופר Laemmli).
   3. דניטורציה של הדגימות על ידי חימום ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (או בהתאם לדרישות טמפרטורה ספציפיות לחלבוני ממברנה).
   4. טעין את הדגימות לבארות של ג'ל פוליאקרילאמיד. הפרדו חלבונים באמצעות אלקטרופורזה של סודיום דודסיל סולפט–פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) במתח קבוע (למשל, 80–120 וולט) עד שהחזית של הצבע מגיעה לתחתית הג'ל.
   5. הפעל ממברנת PVDF על ידי טבילה ב-100% מתנול למשך דקה, ולאחר מכן איזון בבופר העברה.
   6. הרכיבו את כריך ההעברה, תוך הבטחת היעדר בועות אוויר בין הג'ל לממברנה.
   7. העבר את החלבונים אל ממברנת ה-PVDF על ידי אלקטרובלוטינג ב-400 mA למשך 2 שעות. שמרו על המערכת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאורך כל התהליך.
   8. חסום אתרי קישור לא ספציפיים על ידי דגירה של הממברנה בחלב דל שומן 5% שהוכן במלח טריס-בופר המכיל 0.1% Tween 20 (TBS-T) למשך שעה בטמפרטורת החדר.
   9. דגרו את הממברנה בנוגדנים ראשוניים (מדוללים 1:1,000 בתמיסת חסימה) למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תחת ערבוב עדין.
   10. שטוף את הממברנה 3 × 15 דקות עם TBS-T.
   11. לדוג עם נוגדנים משניים מצומדים עם פרוקסידאז חזרת (HRP) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
   12. שטוף את הממברנה 3 פעמים עם TBS-T, ואחר כך שטיפה אחרונה של 5 דקות עם 1× טבלות.
   13. הצג את רצועות החלבון באמצעות סובסטרט כימילומינסנציה משופרת (ECL). ללכוד את האות באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית.
       הערה: התאימו את אחוז ג'ל הפוליאקרילאמיד (למשל, 8%, 10%, או 12%) בהתאם למשקל המולקולרי של החלבונים היעד. אם למתקן האלקטרוטרנסר אין מערכת קירור פעילה, החלף מיכלי קרח כל שעה ושמור על התא טבול באמבט קרח. מאחסנים ממברנות ב-1× TBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס אם הדמיה מתעכבת.

תוצאות

חילוץ מיטוכונדריאלי ושלמות מבנית ונשימתית

כדי להעריך את השפעת עלייה במסת המיטוכונדריה על האדיפוגנזיס החום, בוצעה בדיקת העברת מיטוכונדריה (MTA) בפרה-אדיפוציטים לא מובנים (איור 1A). מיטוכונדריה בודדה מפרה-אדיפוציטים ראשוניים של עכברים (mMito) ומקו התאים הכבדי האנושי HepG2 (hMito). ניתוח ווסטרן בלוט הראה ששני ההכנות היו מועשרות מאוד בסמן המיטוכונדריה TOMM20 בהשוואה לתמציות תא שלמות (איור 1B

דיון

השלכות ביולוגיות של העברת מיטוכונדריה באדיפוגנזה

התוצאות שלנו מראות שלמרות שניתן לשלב מיטוכונדריה חיצונית ממקורות אנושיים ושל עכברים ברשת המטוכונדריה האנדוגנית של פרה-אדיפוציטים מתמיינים, עלייה מלאכותית במסת המטוכונדריה אינה מספיקה כדי להניע את תוכנית האדיפוגנית החומה. ממצאים אלו מצביעים על כך שההתרחבות המיטוכונדריאלית האופיינית לאדיפוגנזה חומה היא תוצאה של התמיינות תאית ולא גורם מגביל מכני או מניע עיקרי. תצפיות אלו מנוגדות למחקרים קודמים בתא...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100 mm plate	SPL Life Science	10101SPL
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
12 mm glass coverslips	Marienfeld	111520
12-well plate	SPL Life Science	30012SPL
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Invitrogen	28908
18 mm glass coverslips	HART	-
24-well plate	SPL Life Science	30024SPL
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma	T6397
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Calbiochem	410957
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	1610158
35 mm plate	SPL Life Science	20035SPL
6-well plate	SPL Life Science	30006SPL
60 mm culture dish	SPL Life Science	20060SPL	שימש לניסויים ראשוניים של פריאדיפוציטים ו-DNA/qPCR; ספק/קטלוג לא נמסר
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 UI/mL (Insulin)	Novo Nordisk	A10AB01
ADP	Merck	117105
Agarose	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	שימש לאימות שלמות ה-RNA; ספק/קטלוג לא נמסר
Ammonium Persulfate	BioRad	1610700
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074
Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7077
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
Axio Observer inverted microscope stand	Carl Zeiss	431007-9901-000	נמסר משיטות משלימות
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	D49328
BD Cytometer Setup and Tracking beads	BD Biosciences	-	נמסר משיטות משלימות; קטלוג לא נמסר
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	נמסר משיטות משלימות
BD LSRFortessa X-20 cell analyzer	BD Biosciences	-	ערך קיים סטנדרטי להתאמה לקובץ השלמה
BioRender	BioRender	-	שימש ליצירת זרימת העבודה של איור 1
Blotting-grade blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
cDNA Reverse Transcription Kit	Invitrogen	4374966
Cell Strainer 100 μm, nylon	Falcon	352360
Cell Strainer 40 μm, nylon	Falcon	352340
Collagenase type II	Gibco	17101-015
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM Powder, High Glucose, Pyruvate	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, no phenol red	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	ממס עבור מדיום אינדוקציה; ספק/קטלוג לא נמסר
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolute	Merck	100983
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Fetal bovine serum	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	תוכנת ניתוח ציטומטריה זרימה
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
GAPDH Antibody	Santa Cruz	sc-32233
Glucose	Gibco	15023-021
Glutamate	Sigma	G1626
Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16210
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	תוכנת ניתוח סטטיסטי/רגרסיה לוגריתמית
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78442
HEPES	Biological Industries	41-122-100
Histone H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	NIH	-	תוכנת ניתוח טיפות שומן
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulin syringe	Cranberry	AAJECIN3	שימש להומוגניזציה של תאים; ספק/קטלוג לא נמסר
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568