In-Vitro ניתוח פונקציונלי של תאי T רגולטוריים: התמקדות בהתרבות ובהתמיינות

סיכום

פרוטוקול זה מספק אסטרטגיית קו-קולטורציה במבחנה לחקר השפעות תאי T רגולטוריים על התרבות והבדייל של תאי T אפקטוריים.

תקציר

תאי T רגולטוריים (Treg) ממלאים תפקידים מרכזיים בשמירה על ההומאוסטזיס החיסוני. חריגות בתפקוד תאי טרג קשורות למחלות שונות, כולל מחלות אוטואימוניות, דחיית השתלת איברים, זיהום וסרטן. מניפולציה של תאי טרג נחשבת לאסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית לטיפול במחלות דלקתיות, כולל מחלות אוטואימוניות, דחיית השתלת איברים מוצקים, מחלת שתל מול מארח ומחלות אלרגיות. בדיקות הדיכוי הקלאסיות של Treg במבחנה בוחנות בעיקר את ההשפעה המעכבת של תאי Treg על התרבות תאי T (Teff) האפקטורים. עם זאת, בנוסף להתפשטות, התמיינות תאי T חשובה לתאי T לביצוע תפקודי מערכת החיסון שלהם. לכן, פרוטוקול זה מספק מבחן דיכוי תאי טרג במבחנה מותאמת לחקירת השפעות תאי טרג על התרבות וההתמיינות של תאי טף. בפרוטוקול זה מוצגת תחילה הכנת תאי טרג עכבריים ותאי T נאיביים, ואחריה אסטרטגיית קו-קולטורציה לחקר ההשפעות הרגולטוריות של תאי טרג על רבייה והבדילה של תאי טף, כולל תאי Th1 ו-Th17, ולבסוף מוצגת אסטרטגיית הצביעה לציטומטריית זרימה לאחר קו-קולטורציה. ניתוח תפקודי זה במבחנה של תאי Treg יכול לשמש לחקירת השפעות תאי Treg על התרבות וקיטוב תאי T.

מבוא

^CD4+CD25^+Foxp3+ תאי T רגולטוריים (Treg) הם מתווכים חשובים של הומאוסטזיס חיסוני¹. תאי טרג מדכאים באופן פעיל תגובות חיסוניות מופרזות ושומרים על סבילות עצמית, ובכך מונעים תגובות חיסוניות לפגוע ברקמות ואיברים תקינים². מניפולציה של תאי טרג נחשבת לאסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית לטיפול במחלות דלקתיות כגון מחלות אוטואימוניות, דחיית השתלת איברים מוצקים, מחלת שתל מול מארח, ומחלות אלרגיות ^3,4,5. בינתיים, עיכוב תפקוד תאי טרג נחשב לאסטרטגיה יעילה להפעלת חיסון אנטי-גידולי ^6,7. מחקרים קליניים חקרו טיפול רגולטורי מאומץ בתאי T או טיפול במינון נמוך ב-IL-2 למחלות אוטואימוניות, השתלות איברים מוצקים ומחלת שתל מול מארח ^8,9,10. יתרה מזאת, מחקרים על תאי Treg מהונדסים, כולל תאי קולטני אנטיגן כימרי (CAR)-Treg ותאי קולטני T (TCR)-Treg, זוכים גם הם לתשומת לב גוברת^11,12.

עד כה, טיפול בתאי טרג לא התבסס באופן נרחב בטיפול קליני שגרתי. כדי לתמוך ביישום הקליני של טיפול תאי טרג, מחקר שיטתי והערכת תפקידיו חשובים. אסטרטגיה נפוצה להערכת תפקודי תאי T רגולטוריים במבחנה היא בדיקת הדיכוי Treg in vitro ¹³, שיכולה לזהות את הפונקציה המדכאת של תאי Treg על התרבות תאי T אפקטור (Teff). עם זאת, בדיקת הדיכוי הסטנדרטית של Treg במבחנה אינה מעריכה את התמיינות תאי Teff. אם ניתן להעריך בו זמנית התרבות והבדילה של תאי T אפקטוריים, ניתן לקבל מידע נוסף על תפקוד תאי T רגולטוריים.

כאן אנו מציגים מבחן דיכוי תאי טרג במבחנה מותאם, הנקרא "ניתוח תפקודי במבחנה של תאי טרג" (איור 1). פרוטוקול זה מספק אסטרטגיית קו-קולטורה חוץ-גופית לחקר השפעות תאי Treg על התרבות וההתמיינות של תאי Teff.

פרוטוקול

כל הניסויים בעכברים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים בבית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (אישור מס' 20250814006, 20211212A). כל העכברים ששימשו בניסוי זה היו על רקע גנטי C57BL/6.

1. הכנת פתרונות

1. הכינו בופר מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS): 1× PBS המכיל 0.5% אלבומין סרום בקר (BSA).
2. הכינו בופר מיון תאים מופעל-מגנטי (MACS): 1× PBS המכיל 0.5% BSA ו-2 mM אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA).
3. הכן מדיום תרבית תאים: מדיום RPMI 1640 המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1 מילימטר נתרן פירובאט, 2 מ"מ L-גלוטמין, 10 מ"מ HEPES, 55 מיקרומום β-מרקפטואנול, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין.

2. הכנת לימפוציטים של עכבר C57BL/6

1. קחו את הטחול ובלוטות הלימפה ההיקפיות (LNs) של עכבר בן 6–8 שבועות עם C57BL/6 (זכר או נקבה) בתנאים סטריליים והניחו אותם בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל עם 5 מ"ל בופר FACS.
   הערה: ניתוח הטחול וה-LN צריך להתבצע בהתאם לנהלים הסטנדרטיים.
2. מניחים מסננת תאים של 70 מיקרון על צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, ואז מניחים את הטחול וה-LN על המסננת, והשתמשו בבוכנה של מזרק של 5 מ"ל לטחינת הרקמה בעדינות למשך דקה. במהלך הטחינה, שטוף את המסננת 3 פעמים עם בופר FACS. ודא שאתה טוחן את כל הרקמה במלואה ושוטף את התאים לצינור הצנטריפוגה. אחרי הטחינה, הסר את המסננת.
3. צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס, 350 × גרם למשך 7 דקות.
4. הסר את הסופרנאנט, החזיר את כדור התא ל-3 מ"ל של בופר ליזיס תאי דם אדומים, והשאר את הכדור בטמפרטורת החדר למשך 3–5 דקות.
5. מיד מוסיפים בופר FACS לצינור הצנטריפוגה בנפח של 15–20 מ"ל לסיום הליזה, וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 350 × גרם למשך 7 דקות.
6. הסר את הסופרנטנט, הוסף 10 מ"ל של בופר FACS, ותשהה בעדינות את כדור התא.
7. קח 10 מיקרוליטר של תליית תא והשתמש בצביעת כחול טרייפן כדי לספור את סך הלימפוציטים החיים.
   הערה: תאים אלו הם לימפוציטים מסוג CD45.2⁺ .

3. הכנת לימפוציטים של עכבר CD45.1

1. קחו את הטחול וה-LN של עכבר CD45.1 בן 6–8 שבועות (זכר או נקבה) בתנאים סטריליים והניחו אותם בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל עם 5 מ"ל בופר FACS.
2. הכינו לימפוציטים מעכבר CD45.1 על ידי ביצוע אותם שלבים שתוארו לעיל.
   הערה: תאים אלו הם לימפוציטים מסוג CD45.1⁺ .

4. הכנת תאי T נאיביים CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺

הערה: כל התהליך משתמש בערכת בידוד תא T CD4⁺CD62L⁺ עבור MACS. בופר ה-MACS מקורר מראש ב-4 מעלות צלזיוס, וכל תנאי הצנטריפוגה הם 4 מעלות צלזיוס, 350 × גרם למשך 7 דקות.

1. אספו את תליית התאים מעכברי C57BL/6, צנטריפוגות והשליכו את הסופרנאנט, הוסיפו 400 מיקרוליטר של בופר MACS ו-100 מיקרוליטר קוקטייל נוגדנים ביוטין של תאי CD4⁺ לתא T לצינור הצנטריפוגה לכל 1 ×-10⁸ תאים כוללים ראשוניים. ערבבו בעדינות ודגרו בטמפרטורה של 4°C למשך 5 דקות בחושך.
2. הוסף 300 מיקרוליטר של בופר MACS ו-200 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי אנטי-ביוטין לצינור הצנטריפוגה משלב 4.1 לכל 1 ×-10^{עד 8} תאים בסך הכול. ערבבו בעדינות ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בחושך.
3. הוסף 10 מ"ל של מאגר MACS, צנטריפוגה, וזרוק את הסופרנטנט. החזיר את כדור התא לתלות ב-2 מ"ל של בופר MACS.
4. הניחו את עמודת ה-LS על מפריד מגנטי מוכן ל-MACS מתאים. השתמש ב-3 מ"ל של בופר MACS כדי לשטוף את העמודה. חכה עד שהבופר בעמודה יתרוקן לגמרי לפני שתמשיך לשלב הבא.
   הערה: קיבולת הטעינה המקסימלית של עמודת LS היא 2 × 10⁹ תאים, כולל תאים חיוביים ושליליים, והמספר המקסימלי של תאים חיוביים שהיא יכולה ללכוד הוא 1 × 10⁸. בדרך כלל, עכבר אחד דורש רק עמודת LS אחת כאן.
5. טען את מתלה התא מהשלב 4.3 על עמודת ה-LS. כאשר מתלה התא זורם לחלוטין לתוך העמוד, השתמש ב-3 מ"ל של בופר MACS כדי לשטוף את העמוד. אסוף את כל הנוזל הזורם בצינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל.
   הערה: אלו הם סך כל תאי CD4⁺CD25^– T.
6. צנטריפוגה את סך תאי CD4⁺CD25^– T שהתקבלו בשלב 4.5, זרקו את הסופרנטנט, וקבלו את כדור התא.
7. הוסף 800 מיקרוליטר של בופר MACS ו-200 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי CD62L לפלט התא לכל 1 ×-^10-8 תאים כוללים ראשוניים. ערבבו בעדינות ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בחושך.
8. הוסף 10 מ"ל של בופר MACS לצינור הצנטריפוגה, צנטריפוגה והשליך את הסופרנטנט, ותהה מחדש את כדור התא ב-500 מיקרולטר של בופר MACS.
9. הניחו את עמודת ה-MS על מפריד מגנטי ממויין MACS מתאים והשתמשו בבופר MACS של 1 מ"ל כדי לשטוף את העמודה.
10. טען את מתלה התא על עמודת ה-MS. כאשר המתלה זורם לחלוטין לתוך העמוד, השתמש ב-1 מ"ל של בופר MACS כדי לשטוף את העמודה פעמיים.
11. הסר את עמודת ה-MS מהפריד המגנטי והנח אותו על צינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל. הוסיפו 1 מ"ל של בופר MACS לעמוד ולחצו מיד על הבוכנה בחוזקה כדי להפיל את התאים המסומנים בחרוזים מגנטיים.
12. לספור את התאים, לצנטריפוגה ולזרוק את הסופרנאנט, להחזיר את התאים בנפח מתאים של מדיום תרבית, ולהשאיר את הצינור על קרח.
    הערה: תאים אלו הם תאי T נאיביים CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ . בדרך כלל, כ-8 × 10⁶ עד 1 × 10⁷ תאי T נאיביים CD4⁺CD25^–CD62L⁺ ניתנים לטוהר מעכבר אחד; הכללת בלוטות לימפה פריפריאליות יכולה להגדיל את התפוקה.
13. קבעו את טוהר התאים המבודדים: קחו 5 ×-10⁴ תאי T מבודדים CD4⁺CD62L⁺ והחזירו אותם לתמיסת נוגדנים של 50 מיקרוליטר בצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    הערה: הכינו את תמיסת הנוגדן על ידי הוספת נוגדן Anti-Mouse CD4 PerCP-Cy5.5, נוגדן FITC CD62L ונוגדן PE נגד עכבר לבופר FACS ביחס של 1:100.
14. לאחר 20 דקות דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך, הוסף 1 מ"ל של בופר FACS לשטיפת התאים. צנטריפוגה את התאים, הסר את הסופרנאנט, והחזיר את הכדור ל-200 מיקרוליטר של בופר FACS.
15. לזהות את טוהר הדגימות באמצעות ציטומטריית זרימה.
    הערה: לפרטים על ניתוח ציטומטר זרימה, עיינו במדריך המשתמש של המכשיר או בפרוטוקול¹⁴ שדווח קודם לכן. טוהר תאי T נאיביים CD4⁺CD25^–CD62L⁺ צריך להיות גבוה מ-95% בדגימת תאי T המבודדת (איור 2).

5. הכנת תאי CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ מועשרים ב-Treg ותאים לא CD4⁺ מועשרים באנטיגן

הערה: כל התהליך עושה שימוש בערכת בידוד תאי T רגולטורית CD4⁺CD25⁺ עבור MACS, וההוראות בערכה מותאמות ^{לקבלת תאי} CD4+ לא CD4+ מעשירים באנטיגן (APC) ותאי CD4+^CD25+ מועשרים ב-Treg. בופר ה-MACS מקורר מראש ב-4 מעלות צלזיוס, וכל תנאי הצנטריפוגה הם 4 מעלות צלזיוס, 350 × גרם למשך 7 דקות.

1. אספו את תליית התאים מעכברי CD45.1, צנטריפוגה, והשליכו את הסופרנאנט, הוסיפו 400 מיקרוליטר של בופר MACS מקורר מראש ו-100 מיקרוליטר של קוקטייל ביוטין-נוגדנים של תאי T רגולטורי CD4⁺CD25⁺ לצינור הצנטריפוגה לכל 1 ×-10⁸ תאים כוללים ראשוניים. ערבבו בעדינות ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בחושך.
2. ללא שטיפה, הוסף ישירות 380 מיקרוליטר של בופר MACS מקורר מראש, 200 מיקרוליטר מיקרופידים אנטי-ביוטין, ו-20 מיקרוליטר נוגדן CD25-PE לכל 1 ×-10-8 תאים כוללים ראשוניים לצינור הצנטריפוגה החל משלב 5.1. ערבבו בעדינות ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך.
3. הוסיפו 10 מ"ל של בופר MACS לצינור הצנטריפוגה, צנטריפוגה, והשליכו את הסופרנטנט, ואז החזירו את כדור התא ל-500 מיקרוליטר של בופר MACS לכל 1 ×-^10-8 תאים כוללים ראשוניים.
4. הניחו את עמודת LD על מפריד מגנטי מוכן ל-MACS ושטפו את העמודה עם 2 מ"ל של בופר MACS. חכה עד שהבופר בעמודה יתרוקן לגמרי לפני שתמשיך לשלב הבא.
5. טען לאט את מתלה התא מהשלב 5.3 אל עמודת ה-LD. כאשר מתלה התא זורם לחלוטין לתוך העמוד, שטוף את העמודה פעמיים עם בופר MACS של 2 מ"ל. אסוף את כל הנוזל הזורם בצינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל.
6. הסר את עמודת ה-LD מהפריד המגנטי והנח אותו על צינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל. הוסף 3 מ"ל של בופר MACS לעמוד ה-LD, ודחוף מיד את הבוכנה בחוזקה כדי להוציא את התאים הלא CD4⁺ המסומנים על ידי Microbeads. ספירת התאים, צנטריפוגה, החזירה את התאים בנפח מתאים של מדיום תרבית תאים כדי להגיע לריכוז תאים של 1 ×^{10 7} תאים למ"ל, ושמור את הצינור על קרח.
   הערה: תאים שאינם ^CD4+ אלו מורכבים בעיקר מ-APCs כגון מקרופאג'ים, תאי דנדריט ותאי B. בפרוטוקול זה, תאים אלו משמשים ^כחלק שאינו CD4+ מועשר ב-APC.
7. צנטריפוגה את סך תאי ה-CD4⁺ T שנאספו משלב 5.5, זרקו את הסופרנאנט, וקבלו את כדור התא.
8. הוסף 900 מיקרוליטר של בופר MACS ו-100 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי אנטי-PE לגלגלת התא לכל 1 ×-^10-8 תאים ראשוניים. ערבבו בעדינות ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך.
9. הניחו את עמודת ה-MS על מפריד מגנטי מוכן ל-MACS ושטפו את העמודה עם 500 מיקרוליטר של מאגר MACS מקורר מראש. חכה עד שהבופר בעמודה יתרוקן לגמרי לפני שתמשיך לשלב הבא.
10. טען לאט את מתלה התא מהשלב 5.8 אל עמודת ה-MS. כאשר מתלה התא זורם לחלוטין לעמוד, שטוף את העמודה פעמיים עם 1 מ"ל MACS buffer. אסוף את הנוזל הזורם בצינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל.
    הערה: התאים בנוזל הזרימה בזמן זה הם תאי CD4⁺CD25^– T.
11. נתק את עמודת ה-MS מהמפריד המגנטי ומקם אותו מעל צינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל. הוסיפו 1 מ"ל של בופר MACS לעמודה, ואז לחצו מיד על הבוכנה כדי לשחזר את התאים המגנטיים המסומנים בחרוז CD4⁺CD25⁺ עם Treg.
12. לאחר ספירת התאים, צנטריפוגה את המתלה והסרת הסופרנטנט. תלה את הכדור בכמות מספקת של תרבית כדי לקבל ריכוז סופי של 2 × 10⁶ תאים/מ"ל, והשאיר את הצינור על הקרח.
    הערה: תאים אלו הם תאים מועשרים ב-CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ ב-Treg. בדרך כלל, כ-8 × 10⁵ עד 1 × 10 תאים^CD4+CD25⁺ יכולים להיות מזוהים מעכבר אחד; הכללת בלוטות לימפה פריפריאליות יכולה להגדיל את התפוקה.
13. קבעו את טוהר התאים המועשרים ב-CD4⁺CD25⁺ מבודדים: קחו 5 ×-10⁴ תאי CD4⁺CD25⁺ מבודדים מועשרים ב-Treg ו-5 ×-10-4 תאי APC מבודדים שאינם CD4⁺ מבודדים, בהתאמה, והחזירו אותם לתמיסת נוגדנים ב-50 מיקרוליטר.
    הערה: הכינו את תמיסת הנוגדן על ידי הוספת נוגדן CD4 PerCP-Cy5.5 ונוגדן PE אנטי-עכבר CD25 לתוך בופר ה-FACS ביחס של 1:100. השתמשו באותו נוגדן אנטי-עכבר CD25 PE כאן כדי לוודא שתאי CD4⁺CD25⁺ מסומנים כראוי ושאין תאי T מסוג CD4⁺CD25⁺ בחלק שאינו CD4⁺ . לצורך זיהוי קפדני יותר של תאי Treg, ניתן גם לבצע צביעה תוך-תאית בנוגדן Foxp3 PB אנטי-עכברי.
14. לאחר 20 דקות הדגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך, הוסף 2 מ"ל של בופר FACS לשטיפת התאים. צנטריפוגה את התאים, הסר את הסופרנאנט, והחזיר את הכדור ל-200 מיקרוליטר של בופר FACS.
15. לזהות את טוהר הדגימות באמצעות ציטומטריית זרימה.
    הערה: תדירות תאי CD4⁺CD25⁺ צריכה להיות ≥-95% כדי להבטיח שטוהר אוכלוסיית התאים העשירים ב-Treg עומדת בדרישות הניסוי (איור 2). תאים שאינם CD4⁺ המשמשים כחלק מועשר ב-APC צריכים להכיל לא יותר מ-5% תאי CD4⁺ T (איור 2).

6. תיוג תאי ^CD4+ T נאיביים עם צבע התרבות תאים

הערה: כל תנאי הצנטריפוגה הם 4 מעלות צלזיוס, 350 × גרם למשך 7 דקות. מאגר ה-PBS מאוזן מראש לטמפרטורת החדר לפני השימוש. תהליך התיוג מתבצע תחת הגנה מאור כדי למנוע הקפאת צבע.

1. קחו את המתלה הנאיבית של CD4⁺ T Cell Tel, צנטריפוגה, זרקו את הסופרנטנט, וקבלו את כדור התא.
2. דילל את צבע התרבות התאים eFluor 450 ב-PBS כדי לקבל ריכוז של 20 מיקרומום בטמפרטורת החדר.
3. הוסף 0.5 מ"ל PBS ל-1 ×-10⁷ תאים. שמור על הצינור מוטה בערך ב-45° ותליית בעדינות את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 50x.
4. הוסיפו נפח שווה של תמיסת צבע רביית תאים במהירות לתליית התא, כך שהריכוז הסופי של צבע התרבות התאים יהיה 10 מיקרומון. שמרו על הצינור מוטה בכ-45° וערבבו את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פי 50 כדי להבטיח מגע מלא בין התאים לצבע התרבות התאים.
5. עטוף מיד את צינור הצנטריפוגה בנייר אלומיניום כדי להימנע מחשיפה לאור. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. סחרור עדין בין התאים כל 5 דקות כדי למנוע הצטברות תאים.
6. הוסיפו 10 מ"ל מדיום תרבית תאים מקורר מראש לצינור הצנטריפוגה, צרו בעדינות מערבולת כדי לסיים את הצביעה, ואז צנטריפוגה, והשליכו את הסופרנטנט.
7. הוסף 5 מ"ל מדיום תרבית תאים מקורר מראש לכדור התא, לצנטריפוגה, ולהשליך את הסופרנטנט כדי לשטוף את התאים.
8. הוסף שוב 5 מ"ל של מדיום תרבית תאים מקורר מראש לכדור התא ותשהה מחדש את התאים.
9. סופרים את התאים, צנטריפוגות והשליכו את הסופרנאנט, החזירו את התאים בנפח מתאים של מדיום תרבית כדי להגיע לריכוז תאים של 2 × 10⁶ תאים/מ"ל, והשאירו את הצינור על קרח.

7. הקמת ניתוח תפקודי במבחנה של תאי Treg

1. מחשב את מספר הדגימות הנדרש לתרבות התאים, הכין כמות מתאימה של מדיום תרבית תאים המכיל 2.5 מיקרוגרם/מ"ל נוגדן CD3 נגד עכבר או ציטוקינים אינדוקציה המצוינים, וסחרור עדין בין תאי ה-CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ תאי T נאיביים, CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ מועשר ב-Treg, ותאי CD4⁺ לא מועשרים ב-APC.
   הערה: השתמשו בתאי T נאיביים CD45.2⁺CD62L⁺ כתאי T מגיבים (Tresp). ניסוי דוגמה זה בוחן את השפעת תאי Treg על התמיינות והתרבות של תאי Th1 ו-Th17. לכן, ישנם בסך הכל ארבעה דגימות לתרבות התאים: תאי טרספ שגודלו בתנאי השראה Th1 או Th17, בהיעדר או נוכחות של תאים מועשרים ב-Treg.
2. הוסף 100 מיקרוליטר של תאי T נאיביים CD45.2⁺CD4⁺ (2 ×-10⁵ תאים בכל באר) לפלטת 48 הבארות.
3. הוסף 100 מיקרוליטר ^של תאים לא-CD4+ מועשרים ב-APC (1 ×-^{10 6} תאים בכל באר) ללוח עם 48 בארות.
4. להוסיף 100 מיקרוליטר של CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ תאים מועשרים ב-Treg (2 ×-10⁵ תאים בכל באר) לבארות הניסוי, ולהוסיף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים לבארות הביקורת. יחס התא העשיר ב-Treg ל-Tresp בדגימות הניסוי הוא 1:1.
   הערה: ניתן להגדיר את היחס בין תאי Treg לתאי Tresp לפי הצורך, או לעצב לוח של יחסים מרובים. מספר תאי הטרספ קבוע בתרבות המשותפת, בעוד שניתן לשנות את מספר תאי הטרג לפי הצורך. בדרך כלל, היחסים בין Treg ל-Tresp בדגימות הניסוי כוללים 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 ו-0:1. יתרה מזאת, כל תנאי ניסוי יכול להיות מוכנה בשלושה עותקים כדי למזער שגיאת ניסוי אקראית. כאן, למען בהירות, בהתבסס על ניסיון מחקר קודם^15,16, משתמשים ביחס 1:1 כדוגמה.
5. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים המכיל 2.5 מיקרוגרם/מ"ל נוגדן CD3 נגד עכברים לכל באר.
   הערה: הריכוז הסופי של נוגדן CD3 נגד עכבר הוא 0.5 מיקרוגרם/מ"ל. בנוסף לדגימות הניסיוניות, קבע דגימת ביקורת ריקה ללא נוגדן CD3 נגד עכברים. בדגימה זו, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי T ללא נוגדן CD3 נגד עכבר כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנציה של תאי T שאינם מתרבים, או את עוצמת שיא 0. דבר זה מאפשר כיול מדויק של התפלגות ההתפשטות.
6. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים המכיל את הציטוקינים המסומנים לכל באר כדי להגיע לנפח הסופי של כל באר ל-500 מיקרוליטר.
   הערה: בניסוי זה, נעשה שימוש בעכבר רקומביננטי IL-12 p70 בריכוז סופי של 10 ng/mL ליצירת תאי Th1, ו-TGF-β1 האנושי הרקומביננטי בריכוז סופי של 2 ng/mL ו-IL-6 רקומביננטי בעכבר ב-50 ng/mL משמשים להשראת תאי Th17.
7. הוסף PBS לבארות הריקות שנותרו (500 מיקרוליטר/באר) כדי לשמור על לחות הפלטה ולהפחית את השפעות הקצה.
8. דגרו את לוח 48 הבארות באינקובטור של 5%_CO2 בטמפרטורה של 37°C למשך 3 ימים.
   הערה: במערכת קו-קולטורציה זו, נוגדן CD3 אנטי-עכברי מסיס מספק את אות קולטני תאי T (TCR) הראשי להפעלת תאי T, ותאי CD4⁺ שאינם CD4+ מועשרים ב-APC מספקים אותות קוסטימולטיביים להפעלה מלאה של תאי T. TCR ואותות קוסטימולציה יכולים להיות מופעלים גם על ידי נוגדן CD3 מצופה עכבר ונוגדן CD28 אנטי-עכבר מסיס. החוקרים יכולים לבחור את שיטת הגירוי לפי הצורך.

8. ניתוח תפקודי במבחנה של תאי Treg

הערה: כל תנאי הצנטריפוגה הם 4°C, 350 × גרם למשך 7 דקות.

1. יש פיפט עדין על התאים המגודלים כדי להחזיר אותם ולהעביר את המתלה לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. צנטריפוגה את התאים והסר את הסופרנטנט.
2. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים המכיל 5 ng/mL PMA, 1 מיקרוגרם/מ"ל יונומיצין, ומעכב העברת חלבון GolgiPlug מדולל 1:1,000 לכל צינורה, מערבולת עדינה להשעיית התאים, ודגר אותם באינקובטור 5%_CO2 בטמפרטורה של 37 °C למשך 3 שעות.
3. צנטריפוגה, זרוק את הסופרנטנט, הוסף 50 מיקרול PBS המכיל בדיקה אחת של צבע זומבי צהוב ונוגדן אנטי-עכבר מדולל 1:100 לכל דגימה, מערבולת, ודגירה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 15 דקות כדי לסמן תאים מתים ולחסום קולטני Fc.
4. צנטריפוגה, זרוק את הסופרנאנט, מוסיפים 50 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים שטחיים, מערבולת, ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 20 דקות.
   הערה: הוסיפו נוגדן אנטי-CD4 PerCP-Cy5.5, נוגדן FITC אנטי-CD45.1 ואנטי-CD45.2 APC-eFluor 780 לבופר ה-FACS ביחס 1:200 להכנת קוקטייל נוגדנים שטחיים.
5. הוסיפו 1 מ"ל של בופר FACS לכל צינור צנטריפוגה, צנטריפוגה, והשליכו את הסופרנטנט.
6. הוסיפו 300 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע וחדירות לכל צינור צנטריפוגה, מערבולת, ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 20 דקות.
7. הוסף 1 מ"ל של 1× פרמייביליזציה/שטיפה (פרם/שטיפה) לכל צינור צנטריפוגה, צנטריפוגה, והשליך את הסופרנטנט; לאחר מכן חזרו על שלב השטיפה הזה פעם אחת כדי להבטיח הסרה מלאה של הקיבוע ששאריתי.
8. הוסיפו 50 מיקרו-ליטר של קוקטייל נוגדנים ציטוקינים, מערבולת, ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 40 דקות.
   הערה: יש להוסיף נוגדן אנטי-IFN-γ PE ונוגדן PE-Cy7 נגד IL-17A ל-Perm/Wash Buffer ביחס של 1:100 להכנת קוקטייל נוגדני הציטוקינים.
9. שטוף כל דגימה עם 1 מ"ל של פרם/בופר ווש, צנטריפוגה את התאים, והסר את הסופרנטנט. החזירו את הכדור לתלות ב-300 מיקרוליטר של בופר FACS.
10. למדוד את השפעות וההתמיינות של תאי טרספ באמצעות ציטומטריית זרימה. השתמשו באסטרטגיית השער הבאה (איור 3): ראשית, חריגו את אוכלוסיית הלימפוציטים בין כל התאים והוציאו פסולת וזיהומים של תאים; שנית, שייט את אוכלוסיית התאים הבודדים בין הלימפוציטים בהתבסס על אותות פיזור; שלישית, מעבר לאוכלוסיית התאים החיים בין התאים הבודדים; רביעית, מעבר בין אוכלוסיית תאי ה-CD4⁺ T בין התאים החיים; חמישית, מעבר לאוכלוסיית התאים העשירה ב-Treg ב-CD45.1⁺ ולאוכלוסיית תאי Teff של CD45.2⁺ בין תאי T של CD4⁺ ; שישית, תאי שער CD45.2⁺CD4⁺IFN-γ⁺ תאי Th1, תאי CD45.2⁺CD4⁺IL-17A⁺ תאי Th17, ותאי T לא מתרבים CD45.2⁺CD4⁺ בין תאי ה-T של CD45.2⁺ .
11. לבצע איסוף נתוני ציטומטריית זרימה ולנתח את נתוני ציטומטריית הזרימה.
    1. השתמש בתאי T מתורבתים המסומנים בצבע רביית תאים eFluor 450 כצבע בקרה חד-צבוע. הכינו את צבע הצהוב הזומבי עם צביעה בודדת עם תאי T מתורבתים שלא סומנו בצבע התרבות תאים. הכינו את שאר הבקרות עם צביעות בודדות עם חרוזי פיצוי עבור כל פלואורופור בשימוש.
    2. השתמשו בתאי T המסומנים בצבע התרבות תאית eFluor 450 ובתרבתות ללא נוגדן CD3 אנטי-עכברי כדי להגדיר את שער התאים שאינם מתרבים.
    3. השתמשו בתאי T מתורבתים המסומנים בצבע התרבות תאים וצובעים בצבע צהוב זומבי, בכל נוגדני פני התא, ובבקרות איזוטיפ של נוגדן IFN-γ PE לעכברים ונוגדן IL-17A PE-Cy7 נגד עכברים כדי להגדיר שערים של תאי T IFN-γ⁺CD4⁺ ו-IL-17A⁺CD4⁺ .

תוצאות

בניסוי המייצג, תאי T נאיביים שימשו כתאי Tresp כדי לחקור את השפעות התאים העשירים ב-Treg על התרבות וההתמיינות של תאי Th1 ו-Th17. בניסוי זה, תאי Tresp הופעלו על ידי תאי CD3 אנטי-עכבריים ו-APC שאינם CD4⁺ מועשרים, ולאחר מכן התמיינו לתאי Th1 בהשראת IL-12 p70 או לתאי Th17 בהשראת TGF-β1 ו-IL-6. בתנאי ההשראה הללו, שינויים בהתרבות ובהתמיינות של תאי טרספ נחקרו לאחר הוספת תאים מועשרים בטרג ביחס של 1:1.

כאשר תאי Tresp CD45.2⁺CD4⁺ עברו תרביות משותפת עם תאים מועשרים ב-Treg ב-...

דיון

במחקר זה, תוצאות הקו-קולטורה בתנאי השראה של Th1 תואמות דיווחים קודמים כי תאי Treg יכולים לדכא התרבות והבדילה של תאי Th1^1. תאים מועשרים ב-Treg גם עיכבו את התרבות תאי Tresp בתנאי השראה של Th17. עם זאת, בתנאי הקיטוב של Th17 המשמשים כאן, תדירות תאי IL-17A⁺ Tresp עלתה בנוכחות תאים מועשרים ב-Treg, דבר שונה מדיווחים קודמים לפיהם תאי Treg יכולים לעכב התמיינות תאי Th17^19,20

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 mL צינור צנטריפוגה	Thermo Fisher Scientific	3457IW	או שווה ערך
12.5 μL טיפים מסוננים לפיפטה	Thermo Fisher Scientific	94420043	או שווה ערך
1250 μL טיפים מסוננים לפיפטה	Thermo Fisher Scientific	94420813	או שווה ערך
15 mL צינורות צנטריפוגה חרוטיים	Thermo Fisher Scientific	339650	או שווה ערך
200 μL טיפים מסוננים לפיפטה	Thermo Fisher Scientific	94420318	או שווה ערך
צלחות 48 באר	Corning Incorporated	3548	או שווה ערך
5 mL בוכנה מזרק	Shifeng Medical	SB2-061(A)	או שווה ערך
50 mL צינורות צנטריפוגה חרוטיים	Thermo Fisher Scientific	339652	או שווה ערך
50 μL טיפים מסוננים לפיפטה	Thermo Fisher Scientific	94420258	או שווה ערך
מסנן תאים 70 μמ	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	או שווה ערך
נוגדן Anti-mouse CD28	BioXcell	BE0015-1	או שווה ערך
נוגדן Anti-mouse CD3	BioXcell	BE0001-1	או שווה ערך
Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	או שווה ערך
Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	או שווה ערך
Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	או שווה ערך
Beckman CytoFLEX S ציטומטר זרימה	Beckman Coulter	N/A	לאקטת נתונים ציטוטוריים של דגימות תאים חיסוניות
אלבומין בקטריה (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	או שווה ערך
עכברי C57BL/6	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	לאקטת לימפוציטים ראשוניים ותת-קבוצות תאי T
נוגדן מונקלונלי CD25 (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	או שווה ערך
ערכת בידוד תאים רגולטוריים CD4+CD25+, עכבר	Miltenyi Biotec	130-091-041	לאקטת תאים
ערכת בידוד תאי T CD4+CD62L+, עכבר	Miltenyi Biotec	130-106-643	לאקטת תאים
עכברי CD45.1	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	לאקטת לימפוציטים ראשוניים ותת-קבוצות תאי T
נוגדן מונקלונלי CD45.1 (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	או שווה ערך
נוגדן מונקלונלי CD45.2 (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	או שווה ערך
נוגדן מונקלונלי CD62L (L-Selectin) (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	או שווה ערך
ערכת פתרון קיבוע/חדירה Cytofix/Cytoperm	BD Biosciences	554714	או שווה ערך
צבע ריבוי תאים eBioscience eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	או שווה ערך
חומצה אתילנדיאמין טטרא-אצטית (EDTA)	Solarbio Life Sciences	E1170	או שווה ערך
סרום בקטריאלי עובר	Thermo Fisher Scientific	A5669701	או שווה ערך
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	תוכנה לניתוח נתונים ציטוטוריים
מעכב מעבר חלבון Golgi-Plug	BD Biosciences	555029	או שווה ערך
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	או שווה ערך
TGF-beta1 אנושי	PEPROTECH	100-21C	או שווה ערך
מלח סידן איונומצין	Millipore Sigma	I3909	או שווה ערך
עמודי LD	Miltenyi Biotec	130-042-901	לאקטת תאים
L-גלוטמין (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	או שווה ערך
עמודי LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	לאקטת תאים
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	לאקטת תאים
עמודי MS	Miltenyi Biotec	130-042-201	לאקטת תאים
מפרידים OctoMACS	Miltenyi Biotec	130-042-109	לאקטת תאים
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	או שווה ערך
PE Rat IgG1, κ נוגדן בקרת איזוטיפ	BioLegend	400408	או שווה ערך
נוגדן בקרת איזוטיפ PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	או שווה ערך
פניצילין-סטרפטומיצין	Thermo Fisher Scientific	151