טכניקות זיהוי יעילות ל-61 זני תה שמן (Camellia oleifera abel) באמצעות אסטרטגיית MCID וסמני DNA

סיכום

מחקר זה השתמש בדיאגרמת זיהוי זנים ידנית (MCID) שמקורה בדפוסי פסים של DNA פולימורפי מוגבר אקראי (RAPD) כדי לזהות ביעילות ובאופן שכפול 61 זני Camellia oleifera Abel לשימוש במשאבי גרמפלזמה ולזיהוי זני תה שמן.

תקציר

חשוב לזהות חומרים וזני ג'רמפלזמה של Camellia oleifera Abel [תה שמן (Ot)] להערכת משאבי הגרמפלזמה ולהערכת מנגנונים להגנה על זני Ot. מחקר זה השתמש בטכניקת RAPD אופטימלית על ידי הארכת אורך הפריימר של ה-RAPD וסינון טמפרטורת החישול של ה-PCR, שזיהתה 61 זני Ot מאזורים שונים. בנוסף, פותח MCID לעיצוב סימני RAPD יעילים לזיהוי זנים. מתוך 80 פריימרים שרירותיים של 11-NT ב-RAPD, נבחרו 10 פריימרים שמייצרים פסים פולימורפיים ברורים (PBs) לניתוח PCR של 61 הזנים. יתרה מזאת, שימשה אסטרטגיית MCID להבחנה ידנית בין 61 זנים בהתבסס על PBs שנצפו בטביעות אצבע DNA לבין 10 הפריימרים, שיצרו את דיאגרמת זיהוי הזן Ot (Ot-CID). Ot-CID זה סימן כל זן בנפרד, תוך שימוש ב-PBs לזיהוי הזן, כאשר הפריימרים המתאימים ממוקמים במדויק על ה-Ot-CID. אסטרטגיית MCID מספקת גישה פשוטה ומעשית לזיהוי צמחים באמצעות סמני DNA. יתרה מזאת, גישה זו מספקת שיטה מעשית ויעילה לזיהוי זנים. ה-Ot-CID שנוצר של 61 זני Ot הבחין ביעילות בין וריאנטים של Ot באמצעות סמני RAPD, ובכך אפשר את ההבדלה של הזנים להגנה על זנים וזיהוי מוקדם של שתילים בתעשיית המשתלה.

מבוא

קמליה אוליפרה אבאל [תה שמן (Ot)] הוא אחד ממיני עצי השמן האכילים העצים החשובים^{ביותר בעולם}. סין נחשבת למרכז המוצא והמגוון של האוטו, עם משאבי גרמפלזמה בשפע². המסורת העתיקה של ה-Ot, ריבוי צמחי ותוכניות רבייה גלובליות מגוונות הביאו להופעתם של זנים רבים³. הגידול הנרחב ברחבי העולם של תרבית האוט הוביל לזנים עם הומונימים (זנים מובחנים באותו שם) ומילים נרדפות (זנים עם יותר משם ^אחד). לכן, חשוב לפתח טכניקות לניהול מגוון רחב של ג'רפלזמת Ot ולהבחין במדויק בין זנים שונים ^3,5.

למרות יישום סמנים מולקולריים מבוססי DNA באפיון זנים, מחקר גנטי וזיהוי Ot, שיכולים להבהיר גיוון גנטי ולהבדיל פרטים מהצמחים, אף מחקר לא זיהה בהצלחה מספר משמעותי של זני Ot או סיפק בסיס אמין להבדלת זנים 6,7,8,9 . היעדר שיטות אמינות הוא המגבלה העיקרית בשימוש בסמני DNA בזיהוי גידולי צמחים. ייתכן שהסיבה לכך היא שהטכניקות האנליטיות המשמשות לטביעות אצבע DNA אינן מספקות מידע רלוונטי שמגדיר בבירור פריימרים וסמנים פולימורפיים להבחנה בין הזנים הדורשים זיהוי. הטכניקות האנליטיות לדפוסי פסי DNA (הנקראים ניתוחי אשכולות) אינן מתאימות להבחנה יעילה בין זנים או מינים.

למרות שכרטיסי זיהוי מולקולריים של DNA (IDs) פותחו עבור למעלה מ-200 זני Ot המשתמשים בסמנים SNP ^2,3,10,11, עדיין קיימים מספר אתגרים: (1) הגנום של Ot מורכב, כאשר רוב הקמליות המגודלות הן הקספלואידיות, בעוד שגנום הייחוס המשמש לבניית מזהי מולקולרית DNA הוא טריפלואידי, מה שעלול לגרום לאי-דיוק מסוים³. (2) ריצוף גנום מלא יקר, במיוחד למעבדות עם מתקנים מוגבלים, מה שמונע את השימוש הנרחב שלו בניתוח זנים בקנה מידה גדול. יתרה מזאת, מוצרי הגברת PCR מחייבים ריצוף או זיהוי פלואורסצנציה, מה שמסבך עוד יותר את תהליך¹². (3) בהיעדר סימני הבחנה לזנים חדשים, יש צורך לפתח פריימרים חדשים לסמן, מה שידרוש גם קידוד מחדש של קודי תעודות זהות לסוגים קיימים. דבר זה מוביל לכמות עצומה של מיקומי קוד, מה שמפחית את יעילות ההבדלה בין מניות. לכן, חיוני להשתמש בטכניקה המספקת אימות קל, אמין, מתייחס ומעשי של זני Ot עבור מגזר משתלות ה-Ot, עסקים חקלאיים, הגנה על פטנטים על צמחים, ושימור והערכה^{של משאבים} גנטיים.

האסטרטגיות המסורתיות לזיהוי זנים התבססו על מאפיינים מורפולוגיים, פיזיולוגיים ואגרונומיים, אך לתכונות אלו יש מגבלות שכן הן רגישות להשפעות סביבתיות ודורשות הערכה מקיפה של צמחים מפותחים^{לחלוטין 13,14}. יתרה מזאת, לסמנים מולקולריים יש יתרון ברור בכך שהם אינם מושפעים ממשתנים סביבתיים, ולכן משמשים ככלי יעיל לאפיון מדויק של זנים^14,15. לאחרונה הוקמו אינדקסים מבוססי DNA שונים להערכת טביעות אצבע, גיוון גנטי, זן וטוהר 16,17,18,19,20,21,22. סמן ה-RAPD מועיל לניתוח זנים בשל פשטותו, יעילותו וחוסר הדרישה לנתוני רצף קודמים^23,24. ניתן לשפר את גישת ה-RAPD על ידי בחירת פריימרים של 11 נוקלאוטידים (nt) יחד עם טמפרטורת החישול של PCR שנקבעה ליישום בטביעת אצבע צמחית, ובכך קבעה את RAPD כשיטה מועדפת לזיהוי זני צמחים והערכת גיוון גנטי^25,26. סמנים אלו שימשו רבות במחקרי התמיינות גידולים וקורלציה גנטית של מיני צמחים שונים, כולל משמש²⁷, אפרסק נוי²⁸, רימון²⁹, גזעי ארץ²⁰, ואגוז³⁰ (Çilesiz ואח', 2025). למרות השימוש הנרחב בהן, גישות רבות מבוססות סימוני DNA נותרות לא מעשיות או ממוקדות מספיק לזיהוי שגרתי של זני צמחים.

לכן, מחקר זה השתמש בטכניקה אנליטית חדשנית לזיהוי שכפול של זני Ot שונים. ה-MCID נגזר מדפוסי פסים של RAPD הבדיל 61 זני Ot לשימוש במשאבי הגרמפלזמה ולזיהוי זנים.

אסטרטגיית RAPD-MCID המתוארת כאן (איור 1) מתאימה ביותר לאפיון גנטיות בקנה מידה קטן עד בינוני במעבדות עם תשתית סטנדרטית של PCR ואלקטרופורזה ג'ל, אך גישה מוגבלת למתקני ריצוף. הוא גם מתאים מאוד לסינון ראשוני מהיר וחסכוני לפני ניתוח גנטי מפורט יותר. הגבולות התפעוליים העיקריים של השיטה כוללים את התלות בסמנים דומיננטיים ואת הצורך בסטנדרטיזציה קפדנית של תנאי PCR כדי להבטיח שחזוריות בין המעבדות. לבנקים ג'רמפלזמים בקנה מידה גדול או לרישום זנים חוקיים, מומלץ להשתמש במשלים בסמנים דומיננטיים כמו SSRs או SNPs.

פרוטוקול

1. חומר צמחי

1. אסוף עלים צעירים מנצרים בריאים ופעילים של כל זן תה שמן ממאגר הגנטי הלאומי של קמליה, מחוז שוצ'נג, מחוז אנחווי.
2. עיין בטבלה 1 לשמות ולמקורות הזנים הללו.

2. חילוץ DNA גנומי

1. יש להפיק DNA גנומי מלא באמצעות ערכת חילוץ DNA צמחית לפי הוראות היצרן.
2. ה-DNA הוחלף באמצעות 1× TE. לאחר ההסרה, ודאו שתמיסת ה-DNA שהופקה נראית צלולה וחסרת צבע. מדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
3. כוון את ריכוז ה-DNA ל-30 ng·^μL-1 עם 1× TE buffer ואחסן את תמיסת ה-DNA המתוקנת בטמפרטורה של -20°C.

3. בחירת פריימרים של RAPD

1. פתח 80 פריימרים אקראיים לניתוח RAPD ונתח אותם באמצעות כמה גנוטיפים. בחרו פריימרים של RAPD 11-NT שמייצרים דפוסי פסים ברורים וחד-משמעיים בכל הגנוטיפים שנבדקו.
2. השתמשו בפריימרים שנבחרו לגנוטיפינג כדי להגדיל את האמינות של הקטעים המוגברים. בחרו 10 פריימרים מפוזרים היטב עם פסים ניתנים לשחזור לניתוח נוסף, כפי שמפורט בטבלה 2.

4. DNA פולימורפי מוגבר אקראי (RAPD) PCR

1. הכינו את תגובות ההגברה על ידי שינוי קל בשיטה^{שתוארה קודם לכן 23}. הכינו את פתרונות התגובה בהתאם להרכב המפורט בטבלה S1.
2. לבצע PCR באמצעות מחזור תרמי עם התנאים הבאים: קדם-דהנאטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 42 מחזורי דנאטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, אנילינג למשך דקה אחת בטמפרטורה האופטימלית המפורטת בטבלה 2, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; והארכה אחרונה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

5. זיהוי וניתוח של מוצרי PCR

1. הפרדו את שברי ה-DNA המוגברים באמצעות אלקטרופורזה ג'לית ב-100 וולט ב-1.3% אגרוז (w/v) שהוכנו ב-1× בופר TAE המכיל 0.001 M EDTA ו-0.04 M טריס-אצטט ב-pH 8.0. צבע את הג'לים באתידיום ברומיד בעוצמה של 0.5 מיקרוגרם·^{מיקרוליטר-1}.
   אזהרה: אתידיום ברומיד הוא מוטגן חזק. לבשו ציוד מגן אישי מתאים בעת טיפול בתמיסות אתידיום ברומיד או ג'לים מוכתמים.
2. הרץ את הג'ל במתח קבוע של 100 וולט למשך 45–60 דקות, או עד שחזית הצבע הכחול ברומופנול נדדה בערך שני שלישים מאורך הג'ל. לאחר צביעה והסרת צבעים, התבוננו בג'ל תחת הבהרה מ-UV.
   הערה: אשר שרצועות DNA מובחנות נראות בבירור תחת הארה מהירה-UV. ודא שסולם ה-DNA מציג רצועות חדות ומופרדות היטב בטווח של 100 bp עד 2,000 bp.
3. רשמו את הפסים הפולימורפיים (PBs) של הזנים בהתבסס על נוכחותם או היעדרם תחת אור אולטרה סגול.
4. בצע כל הגברה של PCR בשלוש עותקים כדי להבטיח שחזוריות. לדרג רק רצועות שנמצאות בעקביות או נעדרות בכל שלושת השכפולים העצמאיים לניתוח במורד הזרם. אשר ששיעור ההתאמה של ניקוד הפס בין השכפולים עולה על 95%.

6. ניתוח נתונים

1. דירגו את הפסים לזיהוי זן בהתבסס על נוכחותם או היעדרותם על ידי הקצאת "+ o" לרצועות גלויות ו-"−" לרצועות חסרות במיקום המולקולרי המתאים בכל הזנים. כלול רק רצועות שנצפות בעקביות בשלושה שכפולים עצמאיים.
2. סווג זנים עם פסים מובחנים בטביעת האצבע שנוצרו על ידי פריימר יחיד באופן עצמאי. סווג זנים עם דפוסי פסים זהים לאותה תת-קבוצה. יש להבדיל את כל זני תה השמן בהדרגה ובאופן מלא על פי פרמטרים אלו.

7. היישום והיעילות של הדיאגרמה בזיהוי זנים

1. בחרו באקראי שתי קבוצות זני תה שמן מתוך הקבוצות הפנימיות והבין-קבוצתיות כדי לוודא את היישום והפונקציונליות של הדיאגרמה המדגימה 61 זני תה שמן. בצע את הבחירה ידנית על ידי התייחסות לענפים שונים של דיאגרמת Ot-CID, ללא שימוש בתוכנה.
   הערה: 2 קבוצות זני Ot נבחרו באקראי כדי לאמת את היישום והפונקציונליות של הדיאגרמה המדגימה 61 זני Ot.
2. יש לסמן את שתי הקבוצות שנבחרו כ"א" ו"ב". סנן את המדריכים הרלוונטיים לכל קבוצה מתוך ה-OT-CID.

8. הנחיות לטיפול בפסולת מסוכנת

1. הכינו וטפלו בכל תמיסות אתידיום ברומיד באזור ייעודי. לאסוף את כל הפסולת המוצקה והפסולת הנוזלית המזוהמת בברומיד אתידיום בנפרד להטמנה בהתאם להנחיות מוסדיות לפסולת מסוכנת.
2. להשליך את כל החומרים המזוהמים בברומיד אתידיום במיכלי פסולת מסוכנת ייעודיים. פנה למשרד הבריאות והבטיחות הסביבתית המוסדי לקבלת הליכי סילוק מאושרים אם אין ודאות.

תוצאות

התוצאות המייצגות המוצגות כאן ממחישות את כל תהליך האסטרטגיה של RAPD-MCID, מסינון ראשוני של פריימרים דרך הבחנה היררכית בין זנים ועד לאימות סופי. תהליך ההבחנה ההדרגתי מתועד באיור 2, איור 3, איור 4, איור 5, איור 6, שמדגימים יחד כיצד סט מוגבל של 10 פריימרים של ...

דיון

סמני DNA הם כלים רבי עוצמה המשמשים לזיהוי זני צמחים ומינים²⁴. סמנים אלו פותחו ושימשו באלפי מחקרים על ניתוח גנטי, זיהוי זנים ועוד; עם זאת, הם אינם קלים או בשימוש נרחב בגנוטיפינג^24,31. הסיבה לכך היא המחסור בשיטות יעילות וקלות המשתמשות בסמני DNA לזיהוי זנים, עצים פילוגנטיים או טביעות אצבע. למרות ששימוש בסמני DNA לפיתוח מזהים מולקולריים או ברקודי DNA יכול לקודד נתונים לזנים שונים

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Centrifuge	Eppendorf,Germany	5427R	משמש למיצוי DNA גנומי מעלים של תה שמן
Hi-DNAsecure Plant Kit	Tiangen, China	DP350	משמש למיצוי DNA גנומי מעלים של תה שמן
מכשיר PCR להגברת גנים	Monad, China	MP60901	משמש להגברה PCR
SolarRed Agarose LE	Solarbio, China	A8202	משמש לאלקטרופורזה של שבר PCR
TAE	Tsingke, China	TSG001	משמש לאלקטרופורזה של שבר PCR
TaKaRa Ex Taq	Takara, Japan	RR001A	משמש להגברה PCR
ספקטרופוטומטר Thermo Scientific NanoDrop 2000C	ABI,USA		משמש לקביעת ריכוז RNA