מאמר שיטה

בידוד ואימות תת-אוכלוסיות תאי גזע מזנכימליים חיוביים לפודופלנין באמצעות אסטרטגיית חרוז מגנטי עקיפה

DOI:

10.3791/71365

⸱

23 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Joint Surgery and Sports Medicine, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, 2Biomedical Innovation Center, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיון מבוססת חרוזים מגנטיים המשתמשת בנוגדני ציטומטריית זרימה המסומנים על ידי פיקואריתרין (PE) ומיקרו-חרוזי אנטי-PE, לבידוד תת-אוכלוסיות תאי גזע מזנכימליות ספציפיות עם חיוביות גבוהה לסמן מטרה לאחר מיון ושימור פעילות מטבולית מבוססת CCK-8 בתנאים שנבדקו, ללא צורך במיוני תאים יקרים או חרוזים מותאמים ספציפיים למטרה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקר ההטרוגניות התפקודית בתאי גזע מזנכימליים נשען על בידוד יעיל של תת-אוכלוסיות ספציפיות (למשל, תאי פודופלנין (PDPN)). עם זאת, עבור רוב מטרות חלבוני הממברנה, חרוזי מגנטיים מסחריים זמינים ישירות למיון מוגבלים. כדי להתמודד עם זה, המעבדה שלנו הקימה ובדקה פרוטוקול סטנדרטי למיון חרוזים מגנטיים המבוסס על עקרון הקישור העקיף של "נוגדני ציטומטריית זרימה מסומנים בפיקואריתרין (PE)/חרוזים מגנטיים אנטי-PE." באמצעות תאים חיוביים ל-PDPN כאוכלוסיית יעד למודל, פרוטוקול זה מעשיר את חלק התא המטרה מבלי להסתמך על ממייני תאים ציטומטריים יקרים.

חוקרים יכולים להשתמש בנוגדני ציטומטריית זרימה תואמים המסומנים ב-PE המכוונים לחלבונים נגישים מפני פני התא ולשלב אותם עם מיקרו-חרוזי אנטי-PE זמינים מסחרית כדי להקים תהליך מיון למטרות נבחרות לאחר אופטימיזציה ספציפית למטרה. גישה זו נמנעת מזמני אספקה ארוכים ועלויות גבוהות הכרוכים בהתאמת או הזמנת חרוזים מגנטיים ספציפיים לכל מטרה חדשה, מה שהופך אותה למתאימה במיוחד לסמנים נגישים של משטח שהם נדירים או לא נחקרו. במערכת מודל ה-PDPN שנבדקה כאן, הפרוטוקול אפשר העשרת תת-האוכלוסייה היעד עם חיוביות גבוהה ל-PDPN לאחר המיון ושימר על התפשטות/פעילות מטבולית מבוססת CCK-8 בהשוואה ל-MSCs לא ממוינים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתחום האורתופדיה, פציעות כמו נזק לסחוס ונגעים באזור הווסקולרי (האזור הלבן) של המניסקוס גורמות לעיתים להריסת מפרקים בלתי הפיכה ואובדן תפקוד, ובסופו של דבר מובילות לאוסטיאוארתריטיס. הדבר נובע בעיקר מיכולת ההתחדשות הירודה של רקמות אלו, שנובעת מחוסר באספקה ישירה של דם ולימפה, וכן מנוכחות תאים ממוינים מאוד עם יכולת מוגבלת להתרבות והגירה 1,2,3,4. כדי להתמודד עם אתגר זה, נבדקו אסטרטגיות קליניות שונות, כולל שימוש באקסוזומים 5,6, השתלת כונדרוציטים אוטולוגית או אלוגנית 7,8, וגישות הנדסת רקמות 9,10,11,12. בשנים האחרונות, תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הפכו למקור תאים מבטיח לתיקון רגנרטיבי, בזכות פוטנציאל ההתמיינות הרב-שושלתית שלהם ותכונות אימונומודולטוריות, המציעים תקווה חדשה להתחדשות סחוס 13,14,15,16.

למרות הפוטנציאל הטיפולי שלהם, MSCs מציגים הטרוגניות משמעותית. אפילו בתוך מקור רקמה יחיד, כמו מח עצם או חבל הטבור, תת-אוכלוסיות מובחנות של MSCs יכולות להראות שונות משמעותית ביכולת השתרבות, פוטנציאל התמיינות רב-שושלתית (במיוחד התמיינות כונדרוגנית), ותפקוד רגנרטיבי בגוף 17,18,19. לכן, זיהוי מדויק ובידוד של תת-אוכלוסיות MSC מוגדרות פונקציונלית — כגון אלו עם יכולת כונדרוגנית מוגברת — חיוניים לקידום הבנתנו את תכונותיהן הביולוגיות ולשיפור יעילות תיקון הסחוס. זהו שלב קריטי במחקר שלנו.

ככל שהמחקר מתקדם, מספר הולך וגדל של חלבוני ממברנה חדשים זוהו כסמנים לתת-אוכלוסיות MSC מובחנות פונקציונלית. עם זאת, תרגום התגליות הללו לאסטרטגיות מיון תאים יעילות נותר אתגר טכני. מיון תאים מופעל פלואורסצנציה קונבנציונלי (FACS), אף שהוא עוצמתי, דורש מכשור מיוחד ומומחיות טכנית, מה שמגביל את הנגישות שלו במעבדות רבות. מצד שני, מיון תאים אימונומגנטיים — אף שהוא בשימוש נפוץ יותר — מוגבל בשל זמינות מוגבלת של מגיבים מסחריים, המיועדים בעיקר למספר מטרות ממברנות מבוססות. כתוצאה מכך, עבור סמנים רבים שהתגלו לאחרונה בעלי משמעות ביולוגית פוטנציאלית, אין חרוזים מגנטיים זמינים מסחרית, מה שמקשה להעשיר באופן ספציפי את תת-האוכלוסיות החשובות הללו.

כדי להתגבר על מגבלה זו, המחקר הנוכחי שואף לקבוע ולתקן פרוטוקול גמיש, חסכוני ויעיל לבחירה חיובית של תאים. גישה זו מבוססת על הצמדה עקיפה של נוגדנים מצומדים בפיקואריתרין (PE) הזמינים מסחרית עם חרוזים אימונומגנטיים אנטי-PE. דוחות קודמים הראו כי MSCs חיוביים לפודופלנין (PDPN+) מחזיקים ביכולת תחזוקה והבחנה גבוהה יותר של גבעול לעומת מקביליהם ב-PDPN20. יתרה מזאת, המעורבות של PDPN+ MSCs בהתחדשות הסחוס והתקדמות אוסטיאוארתריטיס (OA) תועדה בספרות21,22. באמצעות פודופלנין (PDPN)—סמן מועמד שזוהה לאחרונה לתתי-אוכלוסיות MSC פונקציונליות—כמטרה במודל, מיין תאים חיוביים ל-PDPN מתאי MSC שמקורם במח עצם. אנו מספקים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב הכולל הכנת השעיה חד-תאית, סימון נוגדנים וחרוזים מגנטיים, והפרדה מגנטית. בנוסף, אנו מעריכים את התפוקה, החיוביות ל-PDPN לאחר המיון, והתרבות/פעילות מטבולית מבוססת CCK-8 של התאים הממוינים. על ידי סטנדרטיזציה של פרוטוקול זה, אנו שואפים לספק לחוקרים שיטה ורסטילית ונגישה לבידוד תת-אוכלוסיות תאי יעד באמצעות נוגדנים תואמים מול סמנים נגישים על פני שטח התא, ובכך להקל על מחקר בסיסי של תאי גזע ויישומים תרגומיים עתידיים ברפואה רגנרטיבית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSCs שמקורם במח עצם אנושי נרכשו מסחרית (ראו טבלת החומרים). הספק אישר את זהות ה-MSC באמצעות ביטוי חיובי של CD73, CD90 ו-CD105; ביטוי שלילי של CD34, CD45 ו-HLA-DR; ופוטנציאל התמיינות תלת-קווית. התאים הורחבו בתרבות ושימשו במקטעים 3–5. כל עבודת התאים שמקורם בבני אדם בוצעה בארון בטיחות ביולוגי מסוג Class II בתנאים סטריליים. מכיוון שהתאים נרכשו מסחרית ולא גויסו או נבדקו אנושיים ישירות בפרוטוקול זה, לא נדרשה אישור ישיר של ה-IRB.

1. הכנת תלייה חד-תאית

הערה: איכות המתלים החד-תאיים משפיעה ישירות על יעילות המיון. ודא שהתאים מפוזרים היטב, חיוניים מאוד וללא גושים. יש לפזר גושים נראים על ידי פיפטינג עדין חוזר עד שהגושים אינם נראים עוד.

  1. MSCs נבחרים (קטעים 3–5) שהגיעו למפגש של 80–90%. לזרוק את מדיום התרבות.
  2. שטוף את התאים עם 2 × 10 מ"ל של PBS מחומם מראש. נדנד בעדינות את הכלי וזרוק את ה-PBS.
  3. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3–5 דקות. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ עד שהם מתעגלים כלפי מעלה ומתחילים להתנתק.
  4. הוסף 4 מ"ל מדיום תרבית המכיל 16.5% FBS (ראו טבלת החומרים) כדי לנטרל את הטריפסין. הפיפט בעדינות על התאים כדי להבטיח ניתוק מוחלט. העבר את תליית התא לצינור צנטריפוגה בקוטר 15 מ"ל.
    הערה: בדוק תחת המיקרוסקופ שכל התאים נאספו.
  5. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 3 דקות וזרקו את הסופרנטנט.
  6. החזיר את כדור התא לתלות ב-1 מ"ל של בופר (ראו טבלת החומרים). המשך לספירת תאים.

2. ספירת תאים והתאמת ריכוז

הערה: אם מספר התאים הכולל קטן מ-1 × 107, עדיין יש להוסיף את הנוגדן והריאגנטים המגנטיים בהתאם לנפח הסטנדרטי של תאים 1 × 107 כדי להבטיח יעילות תיוג.

  1. צנטריפוגה את מתלי התא שוב ב-300 × גרם למשך 3 דקות וזרוק את הסופרנטנט.
  2. החזירו את התאים לבופר כדי להגיע לצפיפות של 1 ×10 8 תאים למ"ל.
    הערה: לדוגמה, כדי לעבד תאים 1 × 107 , יש להחזיר את הכדור ל-100 מיקרוליטר של בופר.
  3. העבר את מתלה התא לצינור 5 מ"ל פוליסטירן עם תחתית עגולה.

3. סימון נוגדנים

  1. הוסיפו 10 מיקרוליטר של חוסם FC גמא RII (ראו טבלת החומרים) לכל 1 ×-107 תאים. מערבבים בעדינות ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  2. הוסיפו 5 מיקרו-ליטר של נוגדן PDPN אנטי-אנושי מצומד PE (ראו טבלת החומרים) לכל 1 ×-107 תאים, בהתאם לרכוז המומלץ על ידי היצרן. ערבבו בעדינות ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15–20 דקות, מוגנים מאור.
    הערה: יש להתאים את נפח הנוגדנים בהתאם לגיליון הנתונים של נוגדן ציטומטריית הזרימה הספציפי בו משתמשים, שכן הריכוזים עשויים להשתנות בין המוצרים.

4. סימון חרוזים מגנטיים

הערה: שמרו את כל החומרים על קרח לפני השימוש והחזירו אותם לקרח מיד לאחר כל תוספת כדי לשמור על פעילות ועקביות.

  1. הוסף 10 מיקרוליטר של קוקטייל סלקציה לכל 1 × 107 תאים (ראו טבלת החומרים). ערבבו בעדינות ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  2. הוסף 5 מיקרו ליטר של חרוזים מגנטיים לכל 1 × 107 תאים (ראו טבלת החומרים). מערבבים בעדינות ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    הערה: יש לערבב את הבקבוקון המגנטי בכוח במשך 30 שניות לפני השימוש כדי להבטיח פיזור אחיד.

5. הפרדה מגנטית

  1. הניחו צינור פוליסטירן עגול תחתית בנפח 5 מ"ל המכיל את דגימת התא המסומנת במעמד ההפרדה המגנטית (ראו טבלת החומרים).
  2. הוסיפו בופר לצינור כדי להביא את הנפח הכולל ל-2.5–3 מ"ל. דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. בצע את ההפרדה: החזקת המגנט והצינור יחד כיחידה אחת, הפוך אותם כדי לשפוך את הסופרנטנט לצינור איסוף חדש. חלק זה מכיל את התאים השליליים ל-PDPN; תשאיר את הצינור הזה על קרח.
    הערה: אל תסירו את הצינור מהסטנד המגנטי במהלך שלב זה, כי הדבר יפגע בהפרדה ויגרום לכישלון ההליך.
  4. חזור על צעדים 5.1–5.3 3x. בכל פעם, הוסיפו בופר לצינור המקורי במגנט, המתינו 5 דקות, ושפכו את הסופרנטנט לאותו צינור איסוף שברים שליליים ששימשו בשלב 5.4.
  5. לאחר הכביסה הסופית, הסר את הצינור המכיל את התאים הקשורים מגנטית מהעמוד. צינור זה מכיל את חלק התאים החיובי ל-PDPN.
  6. הוסף 3 מ"ל של בופר כדי להחזיר את התאים החיוביים. העבר את המתלה הזה לצינור חדש ומסומן (צינור השבר החיובי).

6. איסוף, תרבית ואימות של תאי מטרה

  1. ספרו את התאים משני צינורות השבר החיובי והשלילי. רשמו את תפוקת התאים עבור כל שבר.
  2. צנטריפוגה את תאי השבר החיובי ב-300 × גרם למשך 3 דקות. זרוק את הסופרנטנט.
  3. החזירו את הכדור התא למדיום תרבית אלפא MEM המכיל 16.5% FBS. כוונו את צפיפות התאים לפי הצורך וזרעו את התאים בלוחות תרבית או בקבוקונים.
  4. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5% CO₂.

7. הכנת דגימה לטוהר ולאימות פונקציונלי

  1. ספרו את התאים וזרעו אותם בצלחת תרבית של 100 מ"מ בצפיפות של 3 × 10או 6 תאים בכל צלילה ב-12 מ"ל של מדיום תרבית. עשרים וארבע שעות לאחר הזריעה, יש לצפות בחיבור תאים. החלף את מדיום התרבית במדיום טרי כדי להסיר שאריות חרוזים מגנטיים ותאים לא דביקים.
  2. קצור את התאים על ידי טריפסיניזציה. הפיפט בעדינות למעלה ולמטה 10–15 פעמים כדי לשחרר ולהסיר חרוזים מגנטיים ונוגדנים שנותרו.
  3. הערכו את אחוז התאים החיוביים ל-PDPN-PE באמצעות ציטומטריית זרימה (ראו קובץ משלים 1 לפרוטוקול המפורט).
  4. לאסוף תאים במהלך שלב הצמיחה הלוגריתמי. זרעו אותם בפלטת של 96 בארות. בנקודות זמן שונות (0 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות), יש להוסיף תגובת CCK-8 (ראו טבלת החומרים) ולמדוד את הספיגה לפי הוראות היצרן. שרטט עקומת התפשטות בהתבסס על הנתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העיקרון הכללי וזרימת העבודה של הניסוי מוצגים באיור 1. כל הנתונים הניסיוניים הבאים מבוססים על תאי מעבר 5. לאחר הפרדה מגנטית, תאי ה-PDPN+ שהתקבלו תורבו במשך 24–48 שעות. לאחר החלפת מדיום התרבית להסרת תאים לא דבוקים וחרוזים מגנטיים פוטנציאליים שנותרו (איור 2A), הערכנו את יעילות המיון ואת תפוקת התאים. החל מאוכלוסייה ראשונית של 1 ×-107 MSCs, ספירת התאים הסופית לאחר חסימת קולטני Fc, סימון נוגדנים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, קבענו פרוטוקול מגנטי מבוסס חרוזים לבידוד תאי PDPN+ מתאי MSC שמקורם במח עצם. גישה זו מאפשרת העשרה יעילה של תת-האוכלוסייה החיובית ל-PDPN תוך שמירה על התפשטות/פעילות מטבולית מבוססת CCK-8 בתנאים שנבדקו.

בהשוואה לשיטות מיון אימונומגנטיות ישירות קונבנציונליות, היתרון המשמעותי ביותר של אסטרטגיה זו הוא הרב-גוניות שלה. גישות מסורתיות דורשות פיתוח או התאמה אישית של חרוזים מגנטיים ספציפיים לכל סמן חדש שמעניין23, תהליך שהוא גם גוזל זמן וג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להביע את תודתנו לפרופסור ביאן לימינג ולפרופסור ג'אנג קוניו מבית הספר למדעי הביו-רפואה והנדסה, הקמפוס הבינלאומי, אוניברסיטת דרום סין לטכנולוגיה, על מתן הפלטפורמה הניסיונית וההכוונה. עבודה זו מומנה על ידי קרן המדעים הפוסט-דוקטורנטית של סין (2023M734022), קרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגדונג (2023A15151111162), וקרן המדעים הטבעיים הלאומית של סין (82502983).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת בדיקת חיוניות תאים 7-AADKeyGENKGD1202-50
חוסם אנטי-אדם CD32 (חוסם Fc gamma RII)STEMCELL Technologies18520
מאגרSTEMCELL Technologies20104מאגר
CCK-8MeilunbioMA0218-5
חלקיקי דקסטרן מגנטייםSTEMCELL Technologies50100חלקיקים מגנטיים
סרום בקר עובריGibco16050-122
מגנטSTEMCELL Technologies18000מעמד הפרדה מגנטית
MEM Alpha MediumGibcoC12571500BTMEM Alpha Medium (82.5%) + FBS (16.5%) + פניצילין-סטרפטומיצין (1.0%)
MSCsKeyGENKGG5575-1תאי גזע מזנכימליים שנגזרו מעצם האדם
נוגדן אנטי-אדם PDPN מצומד PEABclonalA26770PDPN-PE
תערובת בחירה PESTEMCELL Technologies18151תערובת בחירה
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140122
טריפסין-EDTAGibco25200-072

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PE

מאמרים קשורים