בידוד מיקרוביום הקשור לזרעי עגבניות באמצעות נביטה מבוקרת וגידול השוואתי

סיכום

פרוטוקול זה משלב עיקור סטנדרטי של פני הזרעים עם נביטה מבוקרת כדי לאפשר בידוד חוזר של מיקרוביוטה הקשורה לזרעי עגבניות במהלך המעבר מזרע לנבט. הגישה משפרת את שיקום המיקרואורגניזמים הניתנים לגידול המיוצגים בחסר בזרעים יבשים ותומכת במחקרים תרבותיים השוואתיים במהלך התפתחות השתילים המוקדמת.

תקציר

עיקור פני השטח הוא שלב קריטי אך לעיתים קרובות לא מותאם במחקרים שמטרתם לבודד מיקרואורגניזמים הקשורים לזרעים, שכן טיפולים קשים מדי עלולים להפחית או לעוות אוכלוסיות מיקרואורגניזם אנדוגניות. פרוטוקול זה מציג גישה שכפולה לבידוד מיקרוביום הקשור לזרעי עגבניות הניתנים לגידול באמצעות תנאי עיקור שטחיים המבוססים על שיטות מאומתות קודמות, בשילוב עם נביטה מבוקרת של זרעים. במקום להגדיר טיפולי עיקור אופטימליים באופן אוניברסלי, הגישה מיישמת תנאים סטנדרטיים שניתן להתאים לפי מאפייני הזרעים, תוך מזעור הטיה ושימור אוכלוסיות מיקרוביאליות אנדוגניות.

כדי לשפר את שיקום המיקרואורגניזמים הניתנים לגידול הקשורים למעבר מהזרע לנביעה, הפרוטוקול משלב שלב נביטה מבוקר לפני בידוד מיקרוביאלי. בניגוד לגישות המקובלות המבוססות על השריית זרעים יבשים ולא נביטים, נביטה מבוקרת מעודדת הפעלה מיקרוביאלית במהלך המעבר מהזרע לנבט בתנאים סטריליים. ניתוחים השוואתיים מבוססי יחידות יצירת מושבות (CFU) של שכפולים ביולוגיים שווים, שכל אחד מהם כלל חומר מאוגד מ-3–5 זרעים יבשים או 3–5 שתילים שנבטו, חשף שינוי משמעותי בקהילת הגידול לאחר הנביטה. סוגים שמיוצגים באופן חלש בזרעים יבשים הועשרו לאחר הנביטה, בעוד שטקסונים אחרים שהיו נפוצים יותר בזרעים יבשים ירדו בייצוג יחסי, מה שתמך במחקרים של אינטראקציות מוקדמת בין צמחים למיקרואורגניזמים במהלך הקמת הנבטים.

בין השכפולים הביולוגיים, סוגים כמו Stutzerimonas, Stennottrophomonas ו-Priestia הועשרו בעקביות בקרב מבודדים שנמצאו משתילים שנבטו, בעוד ש-Paenibacillus נותרו נפוצים בתנאים שונים אך הראו שינויים משמעותיים בהרכב המין. על ידי שילוב תנאי עיקור סטנדרטיים עם נביטה מבוקרת וניתוח השוואתי של חומר יבש ונבוט, פרוטוקול זה מספק מסגרת איתנה וניתנת לשחזור לבידוד תרבותי של מיקרוביוטה הקשורה לזרעים עם רלוונטיות פונקציונלית פוטנציאלית במהלך התפתחות הנבטים המוקדמת ותומך במחקרים של אינטראקציות מוקדמת בין צמחים למיקרובים במהלך הקמת השתיל.

מבוא

הזרעים מכילים קהילות מיקרוביאליות מגוונות המורכבות מחיידקים ופטריות הקשורים הן לרקמות פנימיות והן למשטחים חיצוניים ^1,2,3. מיקרואורגניזמים אלו מוכרים יותר ויותר כרכיבים אינטגרליים בביולוגיה של הצמח, משום שהם יכולים להשפיע על ביצועי הצמח כבר משלבים מוקדמים של ההתפתחות, כולל נביטה, התבססות השתילים ותגובות ללחץ ביוטי וא-ביוטי ^1,2,3. במונחים אקולוגיים, זרעים משמשים לא רק ככלי להתרבות הצמחים אלא גם כמאגרים של חיסון מיקרוביאלי, מה שהופך אותם לנקודת כניסה קריטית להבנת האופן שבו מיקרוביום הקשור לצמחים מתחילים ומתחזקים לאורך מחזור החיים^של הצמח ^1,2,3.

מיקרואורגניזמים הקשורים לזרעים עשויים להוות את החיסון המיקרוביאלי הראשון שבו נתקל הצמח המתפתח, ולכן יכולים לתרום להרכבת המיקרוביום במהלך המעבר מהזרע לנבטים ^1,3,4. החיסון המוקדם הזה עשוי להשפיע על הקהילות המיקרוביאליות שמתיישבות לאחר מכן בשורשים ובתאים אחרים של הצמח, עם השלכות על היווצרות הצמח ובהמשך האינטראקציות בין הצמח למיקרובים ^1,4. בנוסף, חלק מהמיקרוביום של הזרע יכול להיות מועבר אנכית דרך מבני רבייה כמו פרחים, ביציות ואבקנים, מה שמאפשר לאוכלוסיות מיקרוביאליות להתקיים לאורך דורות הצמח ^4,5. המשכיות בין-דורית זו מרמזת שחלק מהמיקרואורגניזמים הנובעים מזרעים עשויים לתרום באופן עקבי לכושר והסתגלות הצמח.

מבחינה פונקציונלית, מיקרואורגניזמים הקשורים לזרעים עשויים להשפיע על ביצועי המארח באמצעות מספר מנגנונים, כולל ייצור פיטוהורמונים, תרכובות אנטימיקרוביאליות ומטבוליטים ביואקטיביים נוספים המווסתים את התפתחות הצמח או מדכאים מתחרים ופתוגנים ^5,6,7. אוכלוסיות מיקרוביאליות המועברות על ידי זרעים נראות גם הן מתקיימות במקביל באמצעות שימוש שונה במשאבים וחלוקה אקולוגית, מה שמרמז שהזרע מייצג בית גידול סלקטיבי ולא מיכל פסיבי^{של מגוון} מיקרוביאלי. ביחד, ממצאים אלו תומכים ברעיון שזרעים מארחים אוכלוסיות מיקרוביאליות שעשויות להשפיע על התפתחות הצמח המוקדמת ומייצגות מועמדים לאפיון תפקודי^במורד הזרם 2,3,5,7.

כדי לחקור מיקרואורגניזמים הקשורים לזרע בצורה פונקציונלית אינפורמטיבית וניסיונית, יש צורך לשחזר אוכלוסיות מיקרוביאליות ברות קיימא מחומר זרעים. בהקשר זה, בידוד מיקרוביאלי מספק גישה למיקרואורגניזמים חיים שניתן לאפיין אותם ניסיונית ולהעריך אותם במבחנים במורד הזרם הרלוונטיים לאינטראקציות בין צמחים למיקרובים. זה חשוב במיוחד במערכות זרעים, שבהן מיקרואורגניזמים הקשורים לזרע עשויים לתרום להתבססות מוקדמת של הצמח ולהוות מועמדים לסינון תפקודי ולשימוש עתידי.

השבת מיקרואורגניזמים הקשורים לזרעים רגישה מאוד להליכי הכנת דגימות, במיוחד לעיקור פני השטח, עיבוד רקמות ולשלב ההתפתחות של החומר שנדגם. רגישות זו רלוונטית במיוחד במערכות זרעים, שכן ביומסה מיקרוביאלית לעיתים נמוכה, והבדלים פרוצדורליים קטנים יכולים להשפיע רבות הן על ספירת יחידות יוצרות מושבות והן על הרכב הבידודים. מבין המשתנים הללו, עיקור פני השטח הוא אחד הקריטיים והקשים ביותר לאופטימיזציה. עיקור הכרחי להפחתת זיהום אפיפיטי לפני בידוד מיקרוביאלי, אך חשיפה מופרזת לסטרילינטים עלולה להפחית את החיוניות או הגידול של מיקרואורגניזמים אנדוגניים, בעוד שעיקור לא מספק עלול לאפשר לטקסונים הקשורים למשטחים להשתלט על תרביות מאוחרות^{יותר 8,9,10}. בהתאם לכך, מטרת העיקור אינה למקסם את החשיפה הכימית, אלא ליישם את הטיפול העדין ביותר שמדכא ביעילות זיהום שמקורו במשטח תוך שמירה על מיקרואורגניזמים פנימיים ניתנים לשיקום ^5,11.

מכיוון שיעילות הסטריליזציה תלויה במיני הצמח, במבנה הרקמה, בתכונות פרווה של הזרע ובקהילה המיקרוביאלית הנלווה, יש לבחור פרוטוקולים מתוך מתודולוגיות שאמתו מראש ולאחר מכן להתאים בזהירות למערכת הנדרשת ^8,12,13. בחומרים בעלי ביומסה נמוכה כמו זרעי עגבניות, איזון זה חשוב במיוחד: עיקור יתר עלול להפחית באופן חד את התאוששות המיקרוביאלית, בעוד שעיקור חלקי יתר מעלה את הסיכוי שמזהמים על פני השטח שגדלים במהירות ישתלטו על המבודדים המתקבלים. מסיבה זו, יש לבדוק את יעילות העיקור באופן שגרתי ולא להניח אותה. ציפוי מי השטיפה הסופית מספק שליטה מעשית על זיהום חיצוני שנותר, אך יש לפרש בבקרה זו תמיד יחד עם התאוששות מיקרוביאלית מהומוגנטים של זרעים או שתילים. פרוטוקול שמניב בקרות שטיפה סטריליות אך מעט או ללא מיקרוביום פנימי שניתן לשחזר עשוי להיות לא מתאים כאשר המטרה היא בידוד מיקרוביאלי השוואתי ולא ניקוי מקסימלי 6,8,10,14.

לכן, השוואות משמעותיות דורשות תקינה פרוצדורלית חזקה. בדגימות בעלות ביומסה נמוכה, אי-עקביות בשטיפה, העברה, הומוגניזציה, דילול, ציפוי או דגירה יכולים לשנות הן את ההתאוששות הכוללת של המיקרוביאלים והן את הייצוג הנראה של טקסונים בודדים. זה חשוב במיוחד בהשוואה בין חומר יבש לנבוט, שבו שונות מתודולוגית עלולה להתבלבל עם שינוי ביולוגי.

מגבלה עיקרית של פרוטוקולי מיקרוביולוגיה של זרעים רבים היא שהם מסתמכים אך ורק על זרעים יבשים ולא נבטים כחומר התחלה. למרות שזה מספק בסיס שימושי לחלק המיקרוביאלי שהיה קיים לפני הפעלת הזרע, ייתכן שהוא מזלזל במיקרואורגניזמים שנמצאים רדומים, לא פעילים מטבולית, במתח, או בתחילה בשפע יחסי נמוך ^2,15.

במצב יבש, הזרעים מייצגים סביבה פיזיולוגית שקטה שבה גם רקמות המארח וגם המיקרואורגניזמים הנלווים עשויים להישאר יחסית לא פעילים. כתוצאה מכך, אוכלוסיות המיקרוביאליות שמתקבלות ישירות מזרעים יבשים עשויות שלא לייצג במלואן את אלו שהופכות לניתנות לשיקום קלה יותר לאחר תחילת הנביטה.

במהלך הנביטה, הזרעים עוברים קליטת מים, הפעלה מחדש מטבולית, מוביליזציה של חומרים מזינים וארגון רקמות מחדש, כולם משנים את הסביבה המקומית הזמינה למיקרואורגניזמים קשורים^11,16. שינויים אלו יכולים לקדם צמיחה מיקרוביאלית, לשנות את הייצוג היחסי של אוכלוסיות מיקרוביאליות, ולהקל על גילוי או התאוששות של טקסונים שבעבר היו נדירים או שנמצאו בצורה לקויה בזרעים יבשים. בנוסף, הופעת רדיקל יוצרת תא צמחי חדש שעשוי לתמוך בהתרבות והפצה מחדש של מיקרוביה, מה שהופך את המעבר מהזרע לנבטים לשלב אינפורמטיבי במיוחד לניתוח מיקרוביולוגי ^1,17.

מסיבה זו, עיבוד מקביל של זרעים יבשים ונבטים מספק עיצוב ניסויי אינפורמטיבי יותר מאשר ניתוח של זרעים יבשים בלבד. זרעים יבשים קובעים בסיס לאוכלוסיות הניתנות לגידול שנמצאות לפני ההפעלה, בעוד שהחומר הנביט מאפשר הערכה השוואתית של טקסונים שהופכים לניתנים לשיקום בקלות רבה יותר בהתפתחות המוקדמת. גישה זו שימושית במיוחד כאשר המטרה היא לא רק לקטלג מיקרואורגניזמים ניתנים לשחזור, אלא גם לזהות טקסונים הקשורים למעבר מהזרע לנביעה ולתעדף מבודדים לאפיון במורד הזרם (איור 1).

איור 1: סקירה מושגית ופרוצדורלית של זרימת העבודה של בידוד השוואתי. (א) ייצוג מושגי של תנאי זרעי העגבניות היבשים לפני הנביטה. (ב) ייצוג מושגי של מצב זרעי העגבניות הנבוטים במהלך המעבר מהזרע לנתיל. (ג) תהליך עבודה סכמטי של הפרוטוקול, כולל עיקור פני זרעים, הערכת שטיפה-בקרה, עיבוד ישיר של זרעים יבשים או נביטה מבוקרת, הומוגניזציה של שכפולים ביולוגיים מאוגדים, דילול וציפוי סדרתי, כימות מבוסס CFU, שחזור בידוד, זיהוי טקסונומי וניתוח השוואתי של חומר יבש ונבוט. נקודות בקרה קריטיות שהודגשו בזרימת העבודה כוללות יעילות עיקור, שכפולים ביולוגיים שקולים, וניתוח ציפוי ו-CFU עקבי. פאנלים A ו-B הוכנו כאיורים קונספטואליים בעזרת בינה מלאכותית לייצוג חזותי בלבד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מכיוון שהפרוטוקול נועד להשוות בין התאוששות מיקרוביאלית מחומר יבש ונבט, עקביות מתודולוגית קפדנית היא חיונית. כל ההשוואות צריכות להתבצע באמצעות אותו חלקת זרעים, תנאי עיקור זהים, אותו מדיום תרבית, והליכי דילול, ציפוי ודגרה. ללא רמת תקינה זו, ההבדלים הנראים לעין בין דגימות יבשות לנבוטות עשויים לשקף שונות טכנית ולא העשרה ביולוגית משמעותית. דבר זה חשוב במיוחד בתהליכי בידוד, שבהם החלק המשוחזר מעוצב הן על ידי הדגימה הביולוגית והן על ידי ההשפעות הסלקטיביות של הליך הניסוי עצמו ^4,15.

שכפול ביולוגי הוא גם חיוני. טקסונים בעלי שפע נמוך עשויים להשתנות בין אצוות הזרעים, והשחזור המיקרוביאלי מדגימות ביומסה דלות הוא מטבעו סטוכסטי גם בתנאים מבוקרים בקפידה. מומלץ לפחות חמישה שכפולים ביולוגיים עצמאיים לכל מצב לצורך השוואה חזקה. בתהליך עבודה זה, כל שכפול ביולוגי מורכב מחומר מאוגד מ-3–5 זרעים יבשים או 3–5 שתילים שנבטו המעובדים כדגימה אחת. בנוסף, כל המניפולציות לאחר העיקור צריכות להתבצע בתנאים אספטיים כדי למזער זיהום משני ולשמור על יכולת הפרשנות של קבוצת הבידוד שנוצרת.

יש לבחור גם את משך הנביטה בקפידה. היא חייבת להיות ארוכה מספיק כדי לאפשר הופעת רדיקל והתפתחות מוקדמת של שתילים, אך לא ממושכת כל כך שהצמיחה המאוחרת של הצמח תוסיף מורכבות אקולוגית נוספת שאינה קשורה למעבר המיידי מהזרע לשתיל. עבור עגבנייה, תקופת נביטה של עד 5 ימים בתנאים סטריליים מספקת חלון מעשי שבו הנבט נשאר קשור קשר הדוק לסביבת הזרע, בעוד שהפעלה והפצה מחדש של מיקרואורגניזם מוקדמת כבר יכולה להתרחש. תזמון עקבי בין ניסויים הוא חיוני, משום שהבדלים בשלב ההתפתחותי עשויים להשפיע על דפוסי ההתאוששות המיקרוביאלית. תהליך עבודה זה מתאים במיוחד לשחזור השוואתי של מיקרוביוטה מגדלים ממערכות זרעים בעלות ביומסה נמוכה, כאשר המטרה היא להעריך שינויים הקשורים לנביטה בתנאים סטנדרטיים. הוא פחות מתאים להערכה ישירה של מגוון המיקרוביום הכולל של הזרעים או למערכות ניסוי שבהן נדרשות גישות בלתי תלויות בתרבות כדי ללכוד את הקהילה המיקרוביאלית הרחבה יותר.

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מסגרת שכפולה לבידוד מיקרוביוטה הקשורה לזרעי עגבניות הניתנת לגידול, על ידי שילוב עיקור סטנדרטי על פני השטח עם נביטה מבוקרת של זרעים. השיטה מאפשרת ניתוח השוואתי של זרעים יבשים ונבטים באמצעות שכפולים ביולוגיים שווים, שכל אחד מהם מורכב מחומר מאוגד מ-3–5 זרעים יבשים או 3–5 שתילים שנבטו, כדי להעריך שינויים התלויים בנביטה בהתאוששות יחידות יצירת מושבות (CFU) ובהרכב הטקסונומי. על ידי מזעור הטיית סטריליזציה וקידום התאוששות מיקרוביאלית במהלך המעבר מהזרע לנתילים, גישה זו מקלה על בידוד מיקרואורגניזמים בעלי רלוונטיות תפקודית פוטנציאלית במהלך התפתחות השתילים המוקדמת ותומכת במחקרים בהמשך הזרם של אינטראקציות מוקדמת בין צמחים למיקרובים.

פרוטוקול

1. הכנת מגבים, מדיה וחומרים סטריליים

1. הכינו תמיסת אתנול של 70% (v:v) באמצעות מים מזוקקים סטריליים.
2. הכינו תמיסה עובדת של 20% (v:v) מאקונומיקה מסחרית המכילה 5% היפכלוריט נתרן זמין על ידי דילול 20 מ"ל אקונומיקה ב-80 מ"ל מים מזוקקים סטריליים.
3. הכינו מים מזוקקים סטריליים לשלבי הכביסה.
4. הכינו NaCl סטרילי של 0.45% להומוגניזציה ודילול סדרתי, והשתמשו בפתרון זה באופן עקבי לאורך כל תהליך העבודה.
5. הכינו את מדיום תרבית האגר Luria Bertani (LB) (לליטר: 10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם NaCl ו-15 גרם אגר) ושפכו את הצלחות מראש בתנאים סטריליים.
6. סטריליזציה של כל הכלים שיגעו בזרעים או בשתילים לאחר עיקור, כולל מלקחיים, עלים, מפזרים, מספריים ומדפי צינורות, באמצעות אוטוקלבינג או טיפול אספטי מאומת.
7. סדר צלחות פטרי סטריליות, צינורות, קצות פיפטה וצלחות תרבית בתוך מכסה זרימה למינרי לפני תחילת טיפול בזרעים.
   הערה: מכיוון שביומסה מיקרוביאלית הקשורה לזרעים עלולה להיות נמוכה, חשוב למזער את זמן הטיפול המיותר ולהכין את כל החומרים לפני תחילת העיקור. עיכובים בין טיפולים כימיים, כביסה, צילוי או הנביטה עשויים לגרום לשונות בהתאוששות. מאגרים סטריליים חלופיים עשויים לשמש במערכות ניסוי אחרות, אך יש לשמור על בופר יחיד לאורך כל ניסוי השוואתי. מדיות נוספות כמו Reasoner 2A (R2A) או מדיה סלקטיבית עשויות להיכלל בתהליכי עבודה תרבותיים מורחבים, אך LB agar שימש כמדיום סטנדרטי לפרוטוקול ההשוואתי המתואר כאן.

2. בחירה והקצאת זרעים

1. השתמשו בזרעים מגרעיני עגבניות אחת לכל ניסוי ככל האפשר.
   הערה: בזרימת העבודה המייצגת המתוארת כאן, זרעי עגבניות מגרעיני זרעים בודדים של CV. Money Maker שימשו בכל ניסוי.
2. בדוק ויזואלית זרעים וזרוק זרעים פגומים, שבורים או מעוותים.
3. חלק את הזרעים לקבוצות הניסוי הנדרשות למחקר. לפחות, הקצה זרעים ל: בידוד זרעים יבש לאחר עיקור, ונביטה ואחריה בידוד שתילים.
4. אם יש לבדוק יותר מתנאי עיקור אחד, יש להקצות זרעים באקראי בין טיפולי החיטוי כדי למנוע הטיית טיפול הנגרמת מגודל הזרע או מצבו.
   הערה: כל ההשוואות במורד הזרם חזקות יותר כאשר הן מבוססות על אותו אצווה זרעים שעובדה במקביל. תהליך העבודה עשוי להיות מותאם לגנוטיפים או זנים אחרים של עגבניות, אך כל השוואה בתוך ניסוי צריכה להתבצע באמצעות גרעית זרע אחת המעובדת במקביל.

3. עיקור זרעי עגבניות על פני השטח

1. העבר 3–5 זרעים לכל צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 2 מ"ל בתוך מכסה זרימה למינרי.
2. הוסיפו 1 מ"ל של 70% אתנול (v:v) לכל צינור כדי לטבול את הזרעים במלואם.
3. דגרו את הצינורות במשך 5 דקות עם ערבוב עדין על ידי סיבוב צינורות ב-25 סל"ד.
4. הסר את האתנול לחלוטין באמצעות פיפטה סטרילית.
5. מיד הוסיפו 1 מ"ל מתמיסת העובדת של 20% (v:v) נתרן היפוכלוריט לכל צינור כדי לטבול את הזרעים במלואם.
6. דגרו את הצינורות במשך 10 דקות עם ערבוב עדין על ידי מסובב הצינור ב-25 סל"ד.
7. הסר לחלוטין את תמיסת הנתרן ההיפוכלוריט באמצעות פיפטה סטרילית.
8. שטוף את הזרעים שלוש פעמים עם 1 מ"ל מים מזוקקים סטריליים בכל שטיפה.
   1. בכל שטיפה, הוסיפו מים סטריליים, ערבבו בעדינות במשך 30 שניות, תנו לזרעים לשקוע ל-30 שניות אם צריך, והסירו את תמיסת השטיפה לחלוטין לפני הוספת מים סטריליים טריים.
9. שמור את מי השטיפה הסופיים מכל צינור לבקרת יעילות הסטריליזציה.
10. העבר את הזרעים המעוקרים לצלחות פטרי סטריליות או לצינורות סטריליים, בהתאם לשאלה האם יעובדו מיד כזרעים יבשים או ישמשו לנביטה מבוקרת.
    זהירות: לטפל בנתרן היפוכלוריט באמצעות ציוד מגן אישי מתאים ולבצע את כל השלבים בהתאם לנהלים הכימיים המוסדיים.
    הערה: רצף ההיפוכלוריט של אתנול-נתרן ששימש כאן נבחר כתנאי עבודה סטנדרטי לזרעי עגבניות בהתבסס על תהליכי עיקור מאומתים בעבר. השתמש באותם תנאי עיקור לכל הדגימות הכלולות בניסוי השוואתי. אם מעריכים יותר משטר עיקור אחד, עבדו כל טיפול במקביל והערכו את יעילות העיקור באופן עצמאי לכל מצב. מזער את הזמן בין השטיפה הסופית לעיבוד במורד הזרם כדי להפחית שונות בהתאוששות מיקרוביאלית.

4. אימות יעילות הסטריליזציה

1. הכינו דילול סדרתי של 10 פעמים של מי השטיפה הסופיים ב-NaCl סטרילי של 0.45% על ידי העברת 100 מיקרוליטר מים ל-900 מיקרו-ליטר מדלל וחזרה על אותו שלב ברצף עד ^10-4. פלטה של 100 מיקרוליטר מכל דילול על אגר LB באותה שיטת ציפוי המיושמת על הומוגנטות של זרעים יבשים ונבטים.
2. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24–48 שעות.
3. בדקו את הלוחות לגידול מושבות לאחר הדגירה.
4. רשמו את נוכחות או היעדר מושבות עבור כל דילול. אם קיימות מושבות, יש לרשום את רמת הדילול, את מספר המושבות המשוער ואת המורפולוגיה הנראית לעין.
   הערה: השתמש באותו נפח ציפוי ופורמט ציפוי לאורך כל הניסוי כדי לאפשר השוואה ישירה בין בדיקות שטיפה לדגימות ביולוגיות. אם לא זוהו מושבות בלוחות הכביסה הלא מדוללים או בדילול הנמוך ביותר, יש לרשום את הדגימה כללא גידול שניתן לזהות בתנאי התרבית.

5. עיבוד זרעים יבשים (לא נבטים)

1. העבר סטים מאוחדים של 3–5 זרעים יבשים מעוקרים, המתאימים לשכפול ביולוגי אחד, לצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים בנפח 2 מ"ל המכילות 1 מ"ל של 0.45% NaCl סטרילי.
2. הומוגניזציה של הזרעים באמצעות עלי חד-פעמי סטרילי עד שרקמות הזרע מופרעות לעין ולא יישארו מבני זרעים שלמים.
3. מערבולות הומוגננט למשך 30 שניות כדי להחזיר תאים מיקרוביאליים לשתייה אחידה.
4. הכינו דילול סדרתי של 10 פעמים של ההומוגנט ב-NaCl סטרילי של 0.45% על ידי העברת 100 מיקרוליטר של הומוגנט ל-900 מיקרו-ליטר של מדלל לדילול הראשון וחזרה על אותו יחס ברצף עד ^10-6.
5. צלחת 100 מיקרולטר של הדילול הנבחרים על אגר LB באמצעות ציפוי מתפשט.
6. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24–72 שעות.
7. בחרו את הלוחות התואמים לטווח הדילול שמספקים מושבות מבודדות וניתנות לספירה, להערכת CFU במורד הזרם ולשחזור בידוד.
8. רשמו את ספירת המושבות הכוללת, מורפוטיפים נראים לעין, וכל הבדלים בדפוסי הגדילה בין השכפולים.
   הערה: יש לבצע עיבוד זרעים יבשים במקביל לדגימות שתילים שנבטו תוך שימוש באותו מדיום תרבית, שיטת דילול, נפח ציפוי ותנאי דגירה. אגר LB שימש כמדיום סטנדרטי לזרימת העבודה ההשוואתית המתוארת כאן. מדיה נוספת עשויה להשתלב בתהליכי בידוד מורחבים כאשר נדרשת התאוששות רחבה יותר של טקסונים שגדלים לאט.

6. נביטה אקסנית של זרעים מעוקרים

1. הנח זרעים מעוקרים על תמיכת נביטה סטרילית, כגון לוחות אגר Murashige ו-Skoog (MS).
2. פזר זרעים באופן שווה כדי למנוע מגע בין שתילים מתפתחים.
3. לוחות איטום עם סרט אטימה במעבדה או חומר מקביל שמפחית זיהום חיצוני תוך מתן נביטה רגילה.
4. דגרו את הלוחות אופקית בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך.
5. לאפשר לזרעים לנבוט בתנאים סטריליים עד שהיווצרות הרדיולים המוקדמת נראית בבירור; בניסוי המייצג, זה התייחס ל-5 ימי דגירה.
6. בדקו את הלוחות באופן קבוע לסימני זיהום, נביטה לא תקינה או עיבוי מופרז.
   הערה: תנאי הנביטה צריכים להישאר קבועים בין השכפולים. שונות במשך הנביטה או שלב הנביטה עשויה לשנות את התאוששות המיקרוביאלית ללא קשר לאפקט הנחקר. תומכי נביטה סטריליים נוספים, כולל לוחות פיטואגר או נייר סינון לח סטרילי, עשויים לשמש בזרימות עבודה מותאמות, בתנאי שהתמיכה נשארת קבועה בכל ניסוי. ניתן להשתמש בכיווני לוחות חלופיים לדגירה, בהתאם למיכל הנביטה, אך יש לשמור על הכיוון קבוע בתוך הניסוי. (נקודת הפסקה) ניתן להחזיק שתילים שנבטים לזמן קצר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני העיבוד במידת הצורך, אך עדיף עיבוד מיידי ככל האפשר.

7. בידוד מיקרואורגניזמים משתילים שנבטו

1. אסוף שתילים שנבטו באמצעות מלקחיים סטריליים בתוך מכסה זרימה למינרי.
2. העברת חומר מאוגד מ-3–5 שתילים שנבטו, המתאימים לשכפול ביולוגי אחד, לצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים בנפח 2 מ"ל.
3. הוסף 1 מ"ל של NaCl סטרילי 0.45% לכל צינור.
4. הומוגניזציה יסודית של חומר השתיל המצטבר באמצעות עלי חד-פעמי סטרילי, כדי להבטיח שגם השורש הבולט וגם רקמת הזרע שנותרה נלווים כלולים, עד שהרקמות מופרעות לעין.
5. הוורטקס ההומוגנט למשך 30 שניות כדי לשחרר ולהחזיר תאי מיקרוביאלים באופן אחיד.
6. הכינו דילול סדרתי של 10 פעמים של ההומוגנט ב-NaCl סטרילי של 0.45% על ידי העברת 100 מיקרוליטר של הומוגנט ל-900 מיקרו-ליטר של מדלל לדילול הראשון וחזרה על אותו יחס ברצף עד ^10-4.
7. לוח של 100 מיקרוליטר של הדילול הנבחרים על LB אגר באמצעות הסקטור, ציפוי טיפה.
8. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24–72 שעות. רשמו את סך כל המושבות, מורפוטיפים גלויים של מושבות והבדלים ביחס לדגימות זרעים יבשים.
   הערה: הגדר שכפול ביולוגי אחד כחומר מאוגד מ-3–5 שתילים שנבטו ועבד את כל ההשכפולים במקביל תוך שימוש באותו סכמת דילול, נפח ציפוי, מדיום תרבית ותנאי דגירה. כלול גם רקמת זרע שנותרה וגם שורש מתפתח בהומוגננט כדי לשמור על עקביות בין דגימות הנביטה הנבוטות.

8. ספירת מושבות והתאוששות בידוד

1. לאחר הדגירה, בחרו את לוחות הדילול שמניבים מושבות ניתנות לספירה ומופרדות היטב. השתמש בלוחות המכילים 30–300 מושבות להערכת CFU.
2. סופר את המושבות על הלוחות הנבחרים וחשב את ה-CFU לכל שכפול ביולוגי באמצעות הנוסחה הבאה:
   CFU לכל שכפול = (מספר מושבות × מקדם דילול)/נפח מצופה (מיליליטר)
   1. אם משתמשים ביותר מפלטת אחת מאותה דילול, יש לחשב את ספירת המושבות הממוצעת עבור אותה דילול לפני יישום הנוסחה.
3. תיעד מורפולוגיה של מושבה באמצעות תיאורים סטנדרטיים, כולל גודל, צורה, צבע, קצה, גובה ואטימות (עכיפות).
4. בחר מושבות לבידוד במורד הזרם כדי למזער הטיית דגימה. בחר את כל המורפוטיפים הניתנים להבחנה כאשר מספר המושבות נמוך, או בחר באקראי מספר מושבות על פני לוחות כאשר מספר המושבות גבוה.
5. הנח את המושבות הנבחרות על לוחות אגר LB טריים כדי לקבל תרביות טהורות.
6. חזור על החזרה עד שכל איזולוד מראה מורפולוגיה אחידה של מושבה על הלוח.
   הערה: דווח בבירור האם ערכי ה-CFU מבוטאים לפי שכפול ביולוגי, ליחידת ביומסה, או באמצעות שיטת נרמול אחרת. אם מיושמים גישות נרמול נוספות, כולל נרמול מבוסס ביומסה, תאר את שיטת החישוב במפורש בסעיף ניתוח הנתונים.

9. שימור מבודדים מטוהרים

1. החדינו מושבות טהורות לתוך מדיום תרבית נוזלי LB ודגרו עד שמתקבלת צמיחה נראית לעין.
2. מערבבים תרבית (1:1, v:v) עם גליצרול סטרילי 80% לפי הנוהג המיקרוביולוגי הסטנדרטי.
3. אחסנו את הקריוסטאקים בטמפרטורה של -80°C.
4. שמרו תיעוד דיגיטלי לכל בידוד, כולל מקור הדגימה, מספר השכפול, מצב (זרע יבש או שתיל שנבט), טיפול עיקור, תאריך בידוד, מדיום צלחת, מורפולוגיית מושבה ומצב זיהוי במורד הזרם.
   הערה: מטא-דאטה מדויקת של בידוד חיונית אם רוצים לקשר את דפוסי ההעשרה חזרה לשלב הזרע, לטיפול או לשכפול הביולוגי.

10. זיהוי מולקולרי של מבודדים

1. חלץ DNA גנומי מתרביות חיידקים מטוהרות באמצעות ערכת חילוץ DNA חיידקי בהתאם להוראות היצרן.
2. הגבר את גן ה-16S החיידקי rRNA באמצעות אזור ההיפר-משתנה V5-V8 או גן ה-16S rRNA כמעט באורך מלא.
   1. להגברה של אזור V5–V8 (~700 bp), השתמשו בפריימרים 799F (5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′) ו-1392R (5′- ACGGGCGGTGTGTRC-3′).
   2. להגברה של גן 16S rRNA באורך כמעט מלא (~1500 bp), השתמש בפריימרים 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) ו-1492R (5′-GGTTACCTTTACGACTT-3′).
   3. הכינו כל תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בנפח סופי של 25 מיקרוליטר באמצעות תערובת מאסטר PCR, 0.4 מיקרומום מכל פריימר, ו-1 מיקרוליטר DNA תבנית.
   4. הרץ במחזור תרמי בתנאים הבאים: דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 40 מחזורי דנאטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 שניות, אנילינג ב-45 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; ואחריה הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. כלול שליטה ללא תבנית בכל ריצת PCR.
3. אמת את מוצרי PCR באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1% והצג את האמפליקונים באמצעות מערכת אלקטרופורזה והדמיה ג'לית.
4. טהרו את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת ניקוי PCR לפי הוראות היצרן והגישו את המגברים המטוהרים לריצוף סנגר.
5. בדיקת איכות, חיתוך והרכבה של הרצפים המתקבלים במידת הצורך.
   1. השווה כל רצף למסד הנתונים של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI) באמצעות BLASTn (הגדרות מגה-בלסט לרצפים דומים מאוד).
   2. השתמשו במכה הנתמכת ביותר כדי להקצות טקסונומיה. הקצה מבודדים לרמת הסוג כאשר הפגיעה הטובה ביותר מראה כיסוי יישור מספק וזהות רצף של לפחות 94.5%.
   3. השתמשו בהקצאה ראשונית ברמת מין רק כאשר הפגיעה הטובה ביותר מראה לפחות 98.7% זהות רצף, כיסוי שאילתות גבוה, ואין התאמות מובילות סותרות בין מינים קרובים.
   4. אם הגברה חוזרת נכשלת או איכות הרצף אינה מספקת, יש לרשום את הבידוד כלא מזוהה. מכיוון שדמיון ל-16S rRNA לבדו עשוי שלא לפתור מינים חיידקיים קרובים זה לזה, יש להתייחס לכל ההקצאות ברמת המין כזמניות ולאשר אותן באמצעות ניתוחים פילוגנטיים או גנומיים בעת הצורך.
6. דווח על בידוד זהות ברזולוציה הטקסונומית הנתמכת הגבוהה ביותר. השתמשו בזיהויים אלו כדי לאמת קיבוצים מבוססי מורפולוגיה ולתעדף מבודדים מייצגים לניתוחים גנומיים ופונקציונליים במורד הזרם.
   הערה: שלב הזיהוי המולקולרי הזה נועד לתמוך בסיווג מבודדים ובבחירת זן מייצג. אין להשתמש בו כדי להסיק מבנה קהילה או דפוסי שפע כמותיים בין טיפולים.

11. ניתוח נתונים

1. בצע את הניסוי עם לפחות חמישה שכפולים ביולוגיים לכל מצב.
   הערה: בתהליך עבודה זה, כל שכפול ביולוגי מורכב מחומר מאוגד מ-3–5 זרעים יבשים או 3–5 שתילים שנבטו כדגימה אחת.
2. לכל תנאי, כמת: (i) ההתאוששות הכוללת של CFU, (ii) מספר מורפוטיפים של מושבות נראים לעין, (iii) מספר הבודדים המטוהרים, ו-(iv) הרכב טקסונומי של המיקרוביוטה הניתנת לעיבוד שנתפסה ברמת הסוג, וכאשר רלוונטי, ברמת המין.
3. השוו דגימות זרעים יבשים ודגימות של שתילים שנבטו כדי להעריך שינויים תלויים בנביטה בהתאוששות הכוללת ובהרכב הטקסונומי.
4. חשב את הייצוג היחסי של כל טקסון כאחוז ה-CFU הכולל שהתאוששו תחת כל תנאי. חשב שינויים בקיפול באמצעות ערכי CFU מוחלטים.
5. נתח נתונים כמותיים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית מתאימה (למשל, GraphPad Prism [v11.0.2]). דווח על הנתונים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD).
   1. להשוואות זוגיות בין דגימות זרע יבש לדגימות נביטות, השתמשו במבחן t סטודנט דו-זנבי כאשר הנתונים עומדים בהנחות הנורמליות.
   2. כאשר הנחות אלו אינן מתקיימות, יש להשתמש במבחן Mann–Whitney U. שקלו הבדלים מובהקים סטטיסטית ב-p < 0.05.
6. דווח בבירור האם כל ערך המוצג מתאים ל-CFU מוחלט, אחוזים יחסיים שמקורם ב-CFU, או שינויים בקפלים המחושבים מערכי CFU מוחלטים.
   הערה: השתמשו באותם קריטריונים חישוביים לאורך כל המחקר כדי לאפשר השוואה ישירה בין דגימות זרעים יבשים לדגימות נבטים. בעת הצגת הרכב טקסונומי, ציין במפורש האם הערכים מוצגים ברמת הסוג או ברמת המין.

12. נקודות בקרת איכות קריטיות ופתרון תקלות

1. שטיפה סופית סטרילית כשלעצמה אינה מראה שמשטר העיקור הנבחר הוא האופטימלי למטרה הניסויית. להגביל זיהום חיצוני תוך שמירה על התאוששות של מיקרואורגניזמים ניתנים לעיבוד מהחלק הפנימי או הצמוד לזרעים. פירוש תוצאות בקרת שטיפה יחד עם התאוששות מיקרוביאלית מהומוגנטים של זרעים יבשים ונבטים.
2. התאוששות נמוכה מדגימות יבשות ונבוטות עשויה להעיד על עיקור יתר, הומוגניזציה קשה מדי, תנאי תרבית לא מתאימים או עיכוב בעיבוד דגימה. במקרים אלו, יש לוודא שזמני העיקור יושמו באופן עקבי, לאשר כי הפרעות ברקמות היו מספיקות אך לא מופרזות, ולוודא שהדילול, הציפוי והדגירה בוצעו מיד ובתנאים זהים בין הדגימות.
3. זיהום גבוה בבקרות שטיפה, או צמיחה מהירה של מספר קטן של סוגי מושבות, עשויים להעיד על עיקור או זיהום לא מספק שהוכנס במהלך טיפול לאחר העיקור. במקרים אלו, יש לבדוק את תזמון החיטוי, שלבי הכביסה, הטיפול האספטי וארגון החומרים בתוך מכסה הזרימה הלמינרי לפני שחוזרים על הניסוי.
4. פירוש הבדלים ביולוגית בין דגימות יבשות לנבוטות רק כאשר שלב הנביטה, מבנה השכפול הביולוגי, מדיום הגידול, סכמת הדילול, נפח הציפוי ותנאי הדגירה הסטנדרטיים לאורך כל הניסוי.
5. בעבודה עם חומר זרע בעל ביומסה נמוכה, היעדר לכאורה של טקסונים מסוימים במצב מסוים עשוי גם הוא לשקף דגימה חלקית ולא היעדר אמיתי. מסיבה זו, יש לבצע עיבוד שכפול עקבי וזיהוי ברמת בידוד כדי לפרש באופן יציב הזזות הקשורות לנביטה.

13. שמירת דגימות לגישות אחרות

1. לאחר אימות יעילות הסטריליזציה ולפני הציפוי, העבר 200 מיקרולטר אליקוט נוספים מכל הומוגנט של זרע יבש או נבט לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל.
2. סמן כל צינור עם סוג הדגימה, מספר השכפול הביולוגי, מצב הטיפול ותאריך האיסוף.
3. הקפיאו את האליקווטים מיד ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש בניתוחים במורד הזרם.
4. השתמש בחומר ההומוגנט המאוחסן לגישות משלימות כגון ניתוחים מבוססי DNA, בדיקות מבוססות מיקרוסקופיה או ניסויי אישור הדורשים את אותו שכפול ביולוגי התחלתי.
   הערה: שמרו את האליקווטים לפני דילול וציפוי סדרתיים כדי לשמור על הרכב ההומוגני המקורי. הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים על ידי הכנת אליקווטים נפרדים כאשר מתוכננים ניתוחים מרובים במורד הזרם.

תוצאות

ביצוע עיקור פני השטח ושליטה בזיהום חיצוני
עיקור פני השטח באמצעות תנאים סטנדרטיים המבוססים על מתודולוגיות מאומתות בעבר הביא להפחתה יעילה של זיהום מיקרוביאלי חיצוני תוך שמירה על שיקום מיקרואורגניזמים ניתנים לעיבוד מחומרים שמקורם בזרעים. ציפוי מי השטיפה הסופיים לא הראה גידול מושבה שניתן לזיהוי, מה שמעיד על הסרה יעילה של מיקרואורגניזמים הקשורים לפני השטח בתנאים בהם השתמשו.

חשוב לציין כי היעדר גידול מיקרוביאלי בבקרות שטיפה לא לווה באובדן מיקרואו...

דיון

התוצאות המוצגות כאן מראות כי שילוב עיקור פני שטח סטנדרטי עם נביטה מבוקרת של זרעים מספק מסגרת איתנה לבידוד תרבותי של מיקרוביוטה הקשורה לזרע. תוצאה מרכזית של פרוטוקול זה היא היכולת לאזן בין הסרה יעילה של מזהמים חיצוניים לבין שימור אוכלוסיות מיקרואורגניות אנדוגניות. איזון זה קריטי במחקרים מבוססי תרבית, שבהם עיקור מחמיר מדי עלול להפחית את התאוששות המיקרוביאלית, בעוד שעיקור לא מספק עלול לגרום להטיה באמצעות התרבות מיקרואורגניזמים אפיפיטיים ^6,16

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agar	Sigma-Aldrich	01916-500G	מרכיב של מצע LB אגר; 15 גרם/ליטר.
אוטוקלב	Lab1st	SV120H	משמש לעיקור מכשירים/חומרים או לאישור טיפול אספטי.
ערכת חילוץ DNA של חיידקים	Promocell	PK-MB708-206-100	חילוץ DNA
מתקן ספירה/רישום מושבות	OCS	B079Y5W57N	נחוץ לרישום CFU, מורפוטיפים והבדלי צלחות; המאמר אינו מציין מונה/דגם.
בקבוקונים לאחסון בקריו	Sigma-Aldrich	Z359033	מרומז לאחסון מלאי גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס; לא צוין במפורש אך נחוץ לצעד השימור.
מערכת רישום איזולטים דיגיטלית	לא צוין במאמר	לא חל	משמש לרישום מטא נתונים של איזולטים: מקור, שכפול, מצב, טיפול עיקור, תאריך בידוד, מצע צלחת, מורפולוגיה, סטטוס זיהוי.
אתנול	VWR	83813440	משמש להכנת תמיסת אתנול 70% v/v לעיקור משטח זרעים.
נייר סינון	Fisher Scientific	11718772	חלופה אופציונלית לתמיכה בנביטה.
מלקט/פינצטה	Sigma-Aldrich	930229	משמשים להעברת זרעים ואיסוף שתילים מונבטים.
ערכת חילוץ DNA גנומי	PromoCell	PK-MB708-206-100	משמש לחילוץ DNA גנומי מתרביות חיידקים מטוהרות; ערכת/שיטה מדויקת לא צוינה.
גליצרול, סטרילי 80%	VWR	24388364	מעורבב 1:1 v/v עם תרבות נוזלית להכנת מלאי קריו.
הודי זרימה למינרי Bio48	Faster	LAB-CAP-22	נחוץ לטיפול אספטי בזרעים, העברות עיקור והכנת חומרים סטריליים.
מצע LB אגר	VWR	846495000	מצע סטנדרטי המשמש לגידול השוואתי; לליטר: 10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם NaCl, 15 גרם אגר.
צינורות מיקרוצנטריפוגה	Ratiolab	RATI5615000	משמשים לעיקור זרעים ועיבוד דגימות.
מצע MS	Sigma	M0404-10L	מוזכר כתמיכה סטרילית לגידול צירית.
NZYTaq II 2× Master mix	Nzytech	MB35803	תערובת PCR להגברה
Parafilm	Parafilm/Merck	HS234526A	משמש לאיטום צלחות נביטה תוך הפחתת זיהום.
צלחות פטרי	Labbox	PDIP-E9N-500	משמשים להגדרת נביטה, פלטה ונטיפול בזרעים מעוקרים.
Phytoagar	Duchefa Biochemie	9002-18-0	מוזכר כחלופה סטרילית אופציונלית לתמיכה בנביטה.
סט פיפטות וטיפות	Merck	EP3123000918-1EA	משמשים להסרת פתרונות עיקור, שטיפה, דילול ופלטה.
מצע אגר R2A	HI-MEDIA	M1743-500G	מצע נוסף אופציונלי לזרימות תרבות מורחבות.
נתרן כלוריד, NaCl	Fisher Chemical	10040460	משמש להכנת NaCl סטרילי 0.45% להומוגניזציה ודילולים סדרתיים; גם חלק ממצע LB.
נתרן היפוכלוריט	Carlo Erba	370323	משמש להכנת תמיסת נתרן היפוכלוריט 20% v/v לעיקור משטח זרעים. קורוזיבית; דורש ציוד מגן אישי.
פסטלים חד-פעמיים סטריליים	Eppendorf	EP0030120973	משמשים להומוגניזציה של זרעים יבשים ושתילים מונבטים.
מיקסר וורטקס	Fisher Scientific	15901137	משמש לשחרור מחדש של תאים מיקרוביאליים מהומוגנטים.