מאמר שיטה

טכניקת ריסון ידנית מוכוונת-רווחה למתן חומרים ודגימת דם בעכברים

21 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72535

⸱

25 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Oncology, and Tumor Immunology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 2Taskforce Refinement C3R, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 4Julius Wolff Institute for Biomechanics and Musculoskeletal Regeneration, Berlin Institute of Health at Charité – Universitätsmedizin Berlin, 5Research Facilities of Experimental Medicine, Charité – Universitätsmedizin Berlin

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לריסון ידני עבור קיבוע עכברים במהלך הזרקות או דגימת דם, ובכך מפחית את רמת הלחץ ומשפר את רווחתם של בעלי החיים במהלך הפרוצדורות.

תקציר

ניסויים בבעלי חיים נותרים חיוניים במחקר ביו-רפואי, ותורמים באופן משמעותי להבנת מנגנוני מחלות ולהערכת היעילות והבטיחות של תרופות וחומרים כימיים, כאשר מכרסמים הם בין בעלי החיים הנפוצים ביותר במעבדות. בין ההתערבויות השכיחות ביותר בפרקטיקה מעבדתית הן טיפול וקיבוע למניעת תנועה במהלך פרוצדורות כגון הזרקות ודגימות דם, המבוצעות באופן שגרתי בעכברים בהכרה, ללא הרגעה או הרדמה. קיבוע נכון הכרחי כדי להבטיח את בטיחותם של בעל החיים והמטפל כאחד. עם זאת, ידוע כי שיטות קיבוע מסורתיות, כגון קיבוע ידני או צינורות קיבוע, מעוררות תגובות סטרס חריפות בעכברים, ובכך משפיעות לרעה על רווחת בעלי החיים ועשויות להשפיע על תוצאות הניסוי. כדי לקדם שיפור (refinement) במסגרת עקרון ה-3Rs ולשפר את רווחת בעלי החיים, פרוטוקול זה מתאר את השימוש במנהרה יישומית שפותחה לאחרונה לצורך הזרקות ודגימות דם בעכברים. המנהרה מספקת שיטת קיבוע פחות פולשנית אך עדיין בטוחה בהשוואה לטכניקות קונבנציונליות. ניתן ליישם בקלות שיטת קיבוע זו, המכוונת לרווחת בעלי החיים, בפרוצדורות סטנדרטיות, כגון הזרקות תוך-peritoneal ותוך-וריד ודגימות דם, תוך מזעור הסטרס ושיפור תנאי הטיפול בעכברי מעבדה.

מבוא

ניסויים בבעלי חיים ממשיכים למלא תפקיד מרכזי במחקר ביו-רפואי, ותורמים משמעותית להבנת מנגנוני מחלה ולהערכת היעילות והבטיחות של תרופות וחומרים כימיים. מכרסמים הם מיני בעלי החיים הנפוצים ביותר בשימוש במעבדות; באיחוד האירופי, כ-3.5 מיליון עכברים ו-0.5 מיליון חולדות שימשו למטרות מדעיות בשנת 20231. מודעות חברתית גוברת לסבל הנגרם מהליכים ניסויים הובילה לדרישות משפטיות לשיפור רווחת בעלי החיים במחקרי מחקר, בהתאם לעקרון ה-3R2,3. מאחר שהחלפה מלאה של ניסויים בבעלי חיים בשיטות חלופיות אינה אפשרית עדיין, אופטימיזציה של הליכים ניסויים קיימים חשובה במיוחד כדי להקל על סבלם של בעלי החיים. טיפול בבעל החיים, כולל שימוש באמצעי קיבוע במהלך הליכים כגון הזרקות, הוא אחת ההתערבויות הנפוצות ביותר להן נחשפים בעלי חיים במעבדה, הן בטיפול השגרתי והן במהלך ניסויים.

ריסון מסורתי לשם קיבוע עבור הזרקות תוך-פריטוניאליות כולל אחיזה חזקה של העור והפרווה באזור הצוואר באמצעות האגודל והאצבע, קיבוע הזנב והפיכת בעלי החיים כדי לחשוף את הבטן להזרקות. תנוחה זו אינה טבעית ועשויה להוביל לקשיי נשימה, הגורמים לפחד בקרב בעלי החיים4. טכניקות ריסון מעודנות שונות כבר תוארו, כולל, למשל, מה שנקרא שיטת 3 האצבעות, שבה הלחץ על אזור הצוואר מופחת בהשוואה לטכניקות תפיסת צוואר קלאסיות4. שיטה אחרת נמנעת במידה רבה מקיבוע מלא: בשיטה זו, בעלי החיים יכולים להיאחז ברשת מתכת בעוד הזנב והגפיים האחוריות מרוסנים כדי לאפשר גישה לבטן התחתונה לצורך הזרקות5. עם זאת, לשני ההליכים יש מגבלות. בשיטת 3 האצבעות, עדיין יש להרים את בעלי החיים ולהניחם בתנוחה לא טבעית, דבר שעלול לעורר תגובות של סטרס. הטכניקה החלופית, לעומת זאת, אינה מספקת הגנה מספקת מפני נשיכות של בעלי חיים לחוצים או הגנתיים, ועשויה להגביל את הזמן הזמין לביצוע ההזרקות. בנוסף לפציעות נשיכה פוטנציאליות, קיים גם סיכון מוגבר לריסון לא תקין או לפציעות מדקירה מקרית של מחט. קיבוע להזרקות תוך-ורידיות או לדגימת דם מווריד הזנב דורש שימוש במכשירי ריסון המקבעים את בעלי החיים ללא צורך באחיזה ידנית, כך שהידיים פנויות לביצוע הפעולות. מכשירי ריסון הם בדרך כלל צינורות העשויים מאקריליק שקוף, בעלי קצה סגור עם חריצי גישה או חורים למעבר הזנב, וקצה פתוח להחדרת העכברים, שניתן לאבטח באמצעות פקקים מתכווננים. הדבר מחייב הרמה של בעלי החיים מהזנב ומשיכתם אל תוך מכשיר הריסון כאשר החלק האחורי נכנס ראשון, כדי שניתן יהיה להשחיל את הזנב דרך חריצי הגישה. זהו הליך מלחיץ המוחמר בשל הקוטר הצר למדי של מכשירי הריסון, הנחוץ כדי למנוע מהעכברים להסתובב במהלך הפעולות, דבר שעלול להוביל לפציעות6,7.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במנהרה יישומית שפותחה לאחרונה להזרקות ואיסוף דם בעכברים, המאפשרת קיבוע פחות פולשני אך עדיין מאובטח. המנהרה מורכבת ממסגרת חיצונית קשיחה ומבטנה פנימית רכה נשלפת, היוצרת חלל רך וחשוך המדמה מחבוא. בהשוואה למכשירי ריסון קונבנציונליים, המנהרה תוכננה במכוון עם ממדים גדולים יותר כדי להכיל רדיד Vetbed Isobed הגזור לפי מידה, המספק בטנה פנימית רכה ונוחה המשפרת את תחושת הביטחון של בעלי החיים תוך שמירה על ריסון מספיק (איור 1A–B). שני קצותיה של המנהרה פתוחים, כך שעכברים יכולים להיכנס פשוט על ידי הליכה מהחלק הקדמי ולצאת מהחלק האחורי. ברגע שהם בתוך המנהרה, בעלי החיים נמנעים מלהסתובב בזמן שהזנב נשאר נגיש להזרקות תוך-ורידיות או לדגימות דם (איור 1C). להזרקות תוך-פריטוניאליות, ניתן לגשת לאזור הבטני הזנבי על ידי הצבת המנהרה בזווית (איור 1D) והחזקת בסיס הזנב של בעל החיים תוך הפעלת לחץ עדין על אזור העשן (sacral area), ובכך כיפוף חלקו האחורי של העכבר כלפי מעלה (איור 1C). שיטה זו פחות מלחיצה הן עבור העכברים והן עבור הנסיינים, שכן אין צורך בקיבוע ידני.

מחקר קודם הראה כי שימוש במנהרה להזרקות תוך-peritoneum (תוך-צפקית) מפחית באופן עמיד את רמות הלחץ ומשפר את רווחת העכברים, אפילו במודלים ניסויים הכוללים הזרקות תוך-peritoneum תכופות8. במחקר זה, מנהרת היישום נבדקה בהצלחה גם עבור הזרקה תוך-ורידית ודגימת דם מווריד הזנב בעכברים זכרים ונקבות.

פרוטוקול

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה נסקרו ואושרו על ידי הרשות המקומית המוסמכת (המשרד המדינתי לענייני בריאות ועניינים חברתיים של ברלין (LAGeSo); מספר אישור 2022-077-G) ובוצעו בהתאם להנחיות ARRIVE 2.0. כל החומרים ששימשו במחקר זה מפורטים ב- טבלת חומרים.

1. מתן תוך-ורידי

הערה: שיטה זו מתארת גישה של ריסון ידני מוכוון-רווחה לצורך מתן תרופות בווריד בעכברים. הזרקות תוורידיות צריכות להתבצע אך ורק על ידי כוחות מיומנים, בהתאם להנחיות המוסדיות ולנהלי בטיחות והיגיינה מוגדרים.

  1. הכנת בעלי החיים
    אזהרה: יש ללבוש תמיד את ציוד המיגון האישי (PPE) הדרוש בהתאם לדרישות הביו-בטיחות וההיגיינה של המוסד (למשל, חלוקים, כפפות, כובעים, מסכות) בעת עבודה עם בעלי חיים.
    1. הנח את כלוב הבית תחת מנורה אדומה למשך 10–15 min כדי לעודד התרחבות כלי דם ולשפר את הנראות של ורידי הזנב.
  2. הכנת אזור העבודה
    1. נקה את מנהרת היישום ב-70% ethanol. המתן עד שה-ethanol יתאדה לחלוטין למשך כ-5 min.
    2. הנח פיסת ריפוד מגולגלת, שטופה ועקרה באוטוקלאב (גזור Vetbed Isobed לגודל הנדרש) בתוך המנהרה (איור 1B).
    3. בעזרת האצבעות, דחוס בעדינות את הריפוד בפתח המנהרה עד שהפתח שנותר הוא בערך ברוחב של שתי אצבעות סמוכות. אין לדחוס את הריפוד יותר מכך.
    4. מקם את מנהרת היישום על משטח העבודה והנח פיסת ריפוד שטוחה נוספת לפני פתח המנהרה.
    5. הכן מזרק הזרקה מצויד במחט 27G המכיל את תמיסת ההזרקה הרצויה והנח אותו לצד המנהרה. ודא שסמרטוטים ותכשיר התזת חיטוי זמינים באופן מיידי.
  3. ריסון מונחה-רווחה במנהרה
    1. העבר את העכבר מכלוב הבית באמצעות צינור העברה.
    2. אפשר לעכבר להיכנס מרצונו למנהרת היישום על ידי מיקום צינור ההעברה ישירות לפני פתח המנהרה (איור 1C).
      הערה: חלק מהעכברים מעדיפים לדרוך תחילה על הריפוד שהונח לפני מנהרת היישום לפני שהם נכנסים למנהרה מרצונם. ניתן למנוע מהעכברים ללכת עמוק מדי לתוך המנהרה על ידי החזקה עדינה של בסיס הזנב.
    3. ברגע שנכנס, העכבר בדרך כלל נשאר ממוקם בתוך הריפוד המגולגל מבלי להסתובב.
      הערה: אם העכברים אינם נכנסים למנהרה, ייתכן שהפתח קטן מדי; דחוס מעט את הריפוד בפתח המנהרה. אם העכברים קטנים מדי ונוטים להסתובב, הדק את הריפוד המגולגל או הוסף שכבה נוספת (איור 1B).
  4. הזרקה תוורידית
    הערה: ההזרקה התוורידית מבוצעת באמצעות נהלי הזרקה קונבנציונליים מקובלים לווריד הזנב.
    1. יישר בעדינות את הזנב על ידי החזקת הקצה וחטא את נקודת ההזרקה המתוכננת. סובב את הזנב בכ-90° כדי למקם את ורידי הזנב הצידיים בצורה גבית.
    2. התחל את ההזרקה בקצה הדיסטלי של הזנב כדי לאפשר ניסיונות נוספים באתרים פרוקסימליים יותר, במידת הצורך.
      שלב קריטי: הכנס את המחט בזווית של כ-15–20° ביחס לזנב, תוך שמירה על המחט כמעט מקבילה לזנב. התקדם עם המחט רק מעט מעבר לשיפוע (bevel), שכן ורידי הזנב הם שטחיים. מיקום נכון של המחט יתבטא בהתנגדות מינימלית בזמן ההזרקה ובזרימה נראית של התמיסה המוזרקת דרך הווריד. הזרק את הנפח הרצוי בקצב איטי וקבוע (≤5 mL/kg במשך 13 s). לאחר הוצאת המחט, הפעל לחץ עדין על נקודת ההזרקה בעזרת סמרטוט סטרילי כדי למנוע דימום.
      אזהרה: השלך מיד מחטים/מזרקים משומשים למכלי חדים חסיני דקירה ועמידים לדליפה. אין לנסות לסגור מחדש את המזרקים כדי למנוע פגיעות מדקירה של מחט.
  5. שחרור וחיזוק חיובי
    1. החזר את המנהרה המכילה את העכבר לכלוב הבית ואפשר לבעל החיים לצאת מרצונו מהקצה opposite של המנהרה (איור 1C).
    2. ספק חטיפים בכלוב הבית כדי לתמוך בחיזוק חיובי ובהרגלת בעל החיים לפרוצדורה.
  6. ניקוי ותחזוקה
    1. הסר את הריפוד הפנימי ממנהרת היישום. נקה את מנהרת היישום ב-70% ethanol.
    2. אם הריפוד נשאר נקי, ניתן להשתמש בו שוב בניסויים הבאים. אם הוא מזוהם או מלוכלך באופן נראה, שטוף אותו ועקרו באוטוקלאב לפני השימוש החוזר.
      הערה: השתמש בריפוד אחד לכל קבוצה ניסויית. החלף את הריפוד בין ניסויים שונים, בין בעלי חיים זכרים לנקבות, ובכל פעם שהנחיות ההיגיינה המוסדיות דורשות זאת.

2. מתן תוך-peritonium (Intraperitoneal)

הערה: שיטה זו מתארת גישה של ריסון ידני מוכוון-רווחה עבור מתן תרופות בתוך חלל הפריטוניאום בעכברים. יש לבצע הזרקות תוך-פריטוניאליות רק על ידי כוח אדם מיומן, בהתאם להנחיות המוסדיות ובהתאם לנהלי בטיחות והיגיינה מוגדרים. כדי להקל על הגישה לאזור ההזרקה, נעשה שימוש במנהרת יישום בשילוב עם פלטפורמה משופעת (טריז), המרימה את חלקו האחורי של העכבר כלפי מעלה.

  1. הכנת אזור העבודה
    1. נקה את מנהרת ההחלה ואת הטריז באמצעות 70% ethanol. המתן להתאיידות מלאה של ה-ethanol למשך כ-5 min.
    2. מקם פיסת בטנה גלילה, שטופה שעברה עיקור באוטוקלאב (גזור Vetbed Isobed לגודל הדרוש), בתוך המנהרה (איור 1B).
    3. בעזרת האצבעות, דחוס בעדינות את הבטנה בפתח המנהרה עד שהפתח שנותר הוא ברוחב של שתי אצבעות סמיכות בקירוב. אין לדחוס את הבטנה מעבר לכך
    4. מקם את מנהרת ההחלה על גבי הטריז (איור 1D) על משטח העבודה והנח בטנה שטוחה נוספת לפני פתח המנהרה.
    5. הכן מזרק הזרקה מצויד במחט 27G המכיל את תמיסת ההזרקה הרצויה והנח אותו לצד המנהרה.
  2. ריסון מונחה-רווחה במנהרה
    זהירות: לבש תמיד את ציוד המיגון האישי (PPE) הנדרש בהתאם לדרישות הביו-בטיחות וההיגיינה של המוסד (למשל, חלוקים, כפפות, כובעים, מסכות) בעת עבודה עם בעלי חיים.
    1. העבר את העכבר מכלוב הבית באמצעות צינור העברה. אפשר לעכבר להיכנס מרצון למנהרת ההחלה על ידי מיקום צינור ההעברה ישירות לפני פתח המנהרה (איור 1C).
      הערה: חלק מהעכברים מעדיפים לדרוך תחילה על הבטנה המונחת לפני מנהרת ההחלה לפני כניסתם הרצונית למנהרה. במקרה זה, אפשר לעכבר להיכנס למנהרה לפני הנחת המנהרה על הטריז.
    2. ברגע שהעכבר בפנים, החזק בעדינות את בסיס הזנב בין האצבע לאגודל כדי למנוע מהעכבר לנוע רחוק מדי לתוך המנהרה. העכבר בדרך כלל נשאר ממוקם בתוך הבטנה הגלילה מבלי להסתובב.
      הערה: אם העכברים אינם נכנסים למנהרה, ייתכן שהפתח קטן מדי; דחוס מעט את הבטנה בפתח המנהרה. אם העכברים קטנים מדי ונוטים להסתובב, הדק את הבטנה הגלילה או הוסף שכבה נוספת (איור 1B).
  3. הזרקה תוך-peritoneum (Intraperitoneal)
    1. החזק את בסיס הזנב בין האגודל והאצבע של יד אחת (איור 1C). הפעל לחץ עדין על האזור הסקרלי (sacral) באמצעות האצבע האמצעית של אותה יד וסובב מעט את הזנב כלפי מעלה. פעולה זו מייצבת את בעל החיים ומספקת גישה ברורה לאזור הבטני הזנבי (caudal abdominal).
    2. שלב קריטי: בצע את ההזרקה תוך החזקת המזרק במקביל למשטח העבודה והחדרתו לאזור הבטני הזנבי הנראה בבירור.
    3. לאחר ההזרקה, שחרר בעדינות את הלחץ ושחרר את הזנב.
      זהירות: השלך מיד מחטים/מזרקים משומשים למכלים חסיני דקירה ועמידים לדליפה המיועדים לחפצים חדים. אין לנסות לסגור מחדש את מכסי המזרקים כדי למנוע פציעות מדקירה של מחט.
  4. שחרור וחיזוק חיובי
    1. החזר את המנהרה המכילה את העכבר לכלוב הבית ואפשר לבעל החיים לצאת מרצון מהקצה הנגדי של המנהרה (איור 1C).
    2. ספק חטיפים בכלוב הבית כדי לתמוך בחיזוק חיובי ובהתרגלות לפרוצדורה.
  5. ניקוי ותחזוקה
    1. הסר את הבטנה הפנימית ממנהרת ההחלה. נקה את מנהרת ההחלה והטריז באמצעות 70% ethanol.
    2. אם הבטנה נשארה נקייה, ניתן להשתמש בה שוב בניסויים הבאים. אם היא מזוהמת או מלוכלכת באופן נראה לעין, יש לשטוף ולעקר באוטוקלאב לפני השימוש החוזר.
      הערה: השתמש בבטנה אחת לכל קבוצה ניסויית. החלף את הבטנה בין ניסויים שונים, בין בעלי חיים זכרים לנקבות, ובכל פעם שנדרש על פי הנחיות ההיגיינה של המוסד.

3. דגימת דם מווריד הזנב

הערה: שיטה זו מתארת גישה של ריסון ידני מוכוון רווחה לצורך דגימת דם מווריד הזנב בעכברים. יש לבצע את כל ההליכים על ידי כוח אדם מיומן, בהתאם להנחיות המוסדיות ולפרוטוקולי בטיחות והיגיינה מוגדרים.

  1. הכנת אזור העבודה
    1. נקה את מנהרת היישום עם 70% ethanol. אפשר ל-ethanol להתאדות לחלוטין למשך כ-5 min.
    2. הנח פיסת ביטול מגולגלת, שטופה ומעוקרת באוטוקלאב (גזור Vetbed Isobed לגודל הנדרש) בתוך המנהרה (איור 1B).
    3. בעזרת האצבעות, דחוס בעדינות את הביטול בכניסה למנהרה עד שהפתח שנותר הוא ברוחב של שתי אצבעות סמוכות בקירוב. אין לדחוס את הביטול מעבר לכך.
    4. מקם את מנהרת היישום על משטח העבודה והנח ביטול שטוח נוסף לפני פתח המנהרה.
    5. ודא שלנצטים, מיקרו-מבחנות לאיסוף דם, מטבורי צמרגב וספריי חיטוי זמינים באופן מיידי.
  2. ריסון מכוון רווחה בתוך מנהרה
    זהירות: לבש תמיד את ציוד המיגון האישי (PPE) הנדרש בהתאם לדרישות הביו-בטיחות וההיגיינה של המוסד (למשל, חלוקים, כפפות, כובעים, מסכות) בעת עבודה עם בעלי חיים.
    1. העבר את העכבר מהכלוב הביתי באמצעות צינור העברה. אפשר לעכבר להיכנס מרצונו למנהרת היישום על ידי מיקום צינור ההעברה ישירות מול פתח המנהרה (איור 1C).
      הערה: חלק מהעכברים מעדיפים לדרוך תחילה על הביטול המונח לפני מנהרת היישום לפני שהם נכנסים למנהרה מרצונם. ניתן למנוע מהעכברים ללכת עמוק מדי לתוך המנהרה על ידי החזקה עדינה של בסיס הזנב.
    2. ברגע שנכנס, העכבר בדרך כלל נשאר ממוקם בתוך הביטול המגולגל מבלי להסתובב.
      הערה: אם עכברים אינם נכנסים למנהרה, ייתכן שהפתח קטן מדי; דחוס מעט את הביטול בכניסה למנהרה. אם העכברים קטנים מדי ונוטים להסתובב, הדק את הביטול המגולגל או הוסף שכבה נוספת (איור 1B).
  3. דגימת דם
    1. יישר בעדינות את הזנב על ידי החזקת הקצה, וחטא את אתר הדגימה המיועד. סובב את הזנב בכ-90° כדי למקם את ורידי הזנב הצדיים בצורה גבית (dorsally).
    2. שלב קריטי: פנקר את הווריד הצדי באמצעות לנצט. אסוף טיפות דם באמצעות מיקרו-מבחנה או קפילרה.
      זהירות: השלף מיד לנצטים משומשים למכלי חדים עמידים לדליפות וחסינים מפני פגיעות דקירה. אין לנסות לסגור מחדש את מכסי הלנצטים כדי למנוע פגיעות מדקירה.
    3. לאחר הדגימה, הפעל לחץ עדין על אתר הפניקטור בעזרת מטבור צמרגב סטרילי כדי לשלוט בדימום.
  4. שחרור וחיזוק חיובי
    1. החזר את המנהרה המכילה את העכבר לכלוב הביתי ואפשר לבעל החיים לצאת מרצונו מהקצה הנגדי של המנהרה (איור 1C).
    2. ספק חטיפים בכלוב הביתי כדי לתמוך בחיזוק חיובי ובהתרגול לסימון הפרוצדורה.
  5. ניקוי ותחזוקה
    1. הסר את הביטול הפנימי ממנהרת היישום. נקה את מנהרת היישום עם 70% ethanol.
    2. אם הביטול נשאר נקי, ניתן להשתמש בו שוב לניסויים הבאים. אם הוא מזוהם או מלוכלך באופן נראה לעין, יש לשטוף ולעקר באוטוקלאב לפני השימוש החוזר.
      הערה: השתמש בביטול אחד לכל קבוצה ניסויית. החלף את הביטול בין ניסויים שונים, בין בעלי חיים זכרים לנקבות, ובכל פעם שנדרש על פי הנחיות ההיגיינה המוסדיות.

תוצאות

כדי להעריך את השפעת טכניקת הריסון החדשה על רווחת העכברים, בוצעו דגימת דם מווריד הזנב והזרקות תוך-ורידיות בהתאם לפרוטוקול המתואר. עכברי C57BL/6 מסוג wildtype, זכרים ונקבות, הוכפפו להליכים אלו או בתוך מנהרת היישום או באמצעות רסן קונבנציונלי, ונבחנו לאיתור סימני כאב ומתח. סולם הבעות הפנים של העכבר (MGS) שימש לקביעת רמת המתח של העכברים לאחר דגימת דם מווריד הזנב. ה-MGS הוא מערכת ניקוד נפוצה, המנתחת את ביטויי שרירי הפנים כתגובה לכאב או להליכים גורמי מתח9,10. כדי לקבוע את הציונים, צולמו תמונות מיד לאחר שחרור העכברים מהרסן או מהמנהרה (תמונות מייצגות מוצגות ב-איור 2). שני צופים מנוסים בהערכת התנהגות עכברים העריכו שלושה פרמטרים של הבעות פנים (ניתן לראותם בשרטוטים הסכמטיים ב-איור 2C): כיווץ מסביב לעין (סגירת עפעפי העין והצרת האזור האורביטלי; קמט עשוי להופיע מסביב לעין), בליטת אף (בליטה על גשר האף וקמטים אנכיים בצדי האף עשויים להופיע), ומיקום האוזניים (האוזניים מסתובבות החוצה ו/או אחורה, הרחק מהפנים, ועשויות להתקפל לצורה 'מחודדת'; המרווח בין האוזניים גדל). מיקום השפם ובליטת הלחיים לא הוערכו מכיוון שצבע הפרווה הכהה של העכברים הקשה על ביצוע הערכה מהימנה. כל פרמטר קיבל ציון לפי סולם של שלוש נקודות הנע בין 0 ל-2 (0 = לא קיים, 1 = קיים במידה מתונה, 2 = קיים באופן ברור), ושלושת פרמטרי הפנים חושבו כממוצע כדי לקבל ציון MGS ממוצע אחד לכל בעל חיים. כדי להבטיח מהימנות, כל בעל חיים קיבל ציון משני הצופים באופן בלתי תלוי ובסמיות, ושני ציוני ה-MGS חושבו לאחר מכן כממוצע כדי להפיק ציון MGS סופי לכל בעל חיים. הן עכברים נקבות והן עכברים זכרים הראו הפחתה משמעותית בציון ה-MGS כאשר דגימת הדם בוצעה במנהרת היישום בהשוואה לרסן הקונבנציונלי (איור 2A–B).

קבוצה נפרדת של עכברים עברה הזרקה תוורידית של 100 µL של 0.9% נתרן כלוריד (NaCl), ונרשמו מקרים של קולקולציה נשמעת וניסיונות להסתובב בתוך מכשיר הריסון. עכברים משמיעים ציוצים נשמעים כסימן למצוקה חמורה, במיוחד כאשר הם חווים כאב או פחד ובמהלך התנהגות הגנתית11,12,13. בנוסף, עכברים מגיבים באופן טבעי לריסון פיזי בבהלה, הגורמת לתגובת בריחה כדי להימלט מהמרחב הסגור. לכן, ניסיונות להסתובב ב-180 מעלות בתוך מכשיר הריסון נחשבו לסימני פחד. הן בעכברים נקבות והן בעכברים זכרים, ניתן היה להבחין בשכיחות גבוהה יותר של קולקולציות נשמעות וניסיונות הסתובבות כאשר ההזרקות התוורידיות בוצעו בתוך מרסן בהשוואה למנהרה הייעודית להזרקה (איור 3).

figure-results-1
איור 1: מנהרה חדשנית ליישום. (A) תמונות מייצגות המדגימות את הפרש הגדלים בין מחזיק קבוע (restrainer) קונבנציונלי לבין המנהרה החדשנית ליישום. (B) הדיפון הפנימי של המנהרה עשוי מחתיכה גזוזה של Vetbed מגולגל המספקת סביבה רכה, תומכת וחשוכה. אם העכברים קטנים מדי ונוטים להסתובב, ניתן להדק את הדיפון המגולגל כדי לצמצם את השטח הפנוי. (C) שלבים שונים של טיפול בתוך מנהרת היישום, כולל כניסה ויציאה, קיבוע בטוח ונוח, וגישה לבטן ולזנב. (D) טריס נוסף לביצוע הזרקות תוך-peritoneum (intraperitoneal) בתוך המנהרה. הטריס מגביר את זווית המנהרה ביחס למטפל, מה שמקל על הגישה לאזור הבטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.

figure-results-2
איור 2: סולם הבעת פנים (grimace scale) בעכברים לאחר דגימת דם מווריד הזנב. עכברים זכרים או נקבות הועמדו לדגימת דם בתוך מנהרת יישום או בתוך רסן (restrainer) קונבנציונלי. תמונות להערכת סולם הבעת הפנים של העכבר צולמו מיד לאחר יציאת בעלי החיים מהרסן או מהמנהרה, ודורגו מאוחר יותר באופן עצמאי על ידי שני חוקרים מנוסים, שהיו עיוורים להקצאת הקבוצות של העכברים, והעריכו את מידת כיווץ העפעפיים (orbital tightening), בליטת האף (nose bulge) ומנח האוזניים. ציון ממוצע חושב עבור כל חיה על בסיס שני הדירוגים. (A) עכברים נקבות (מנהרה n = 5; רסן n = 8). (B) עכברים זכרים (מנהרה n = 11; רסן n = 11). גרף זה הותאם מתוך Schlutt et al., 2026, PLOS ONE. הנתונים המקוריים, שפורסמו כגרף עמודות תחת רישיון CC BY 4.0, שונו ושורטטו מחדש כאן כתרשים קופסה ושפם (box-and-whisker plot). (C) איור סכמטי של יחידות פעולה פנימיות (facial action units) שנוצר באמצעות הנחיית טקסט שפיתח המחבר באמצעות ChatGPT Image 2 (OpenAI; זמין בכתובת https://chatgpt.com/); התמונה הסופית נבדקה ואושרה על ידי המחברים לצורך דיוק מדעי. נתונים מוצגים כתרשימי קופסה ושפם (מינימום למקסימום); הקו מציין את הממוצע. מבחן Mann-Whitney, ערכי p < 0.05 נחשבו למשמעותיים. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: קולקולציות נשמעות וניסיונות להסתובב לאחר הזרקה תוורידית. עכברים זכרים או נקבות הזרקו תוורידית 100 µL של 0.9% NaCl, בין אם בתוך מנהרת היישום ובין אם במכשיר קיבוע קונבנציונלי. מקרי קולקולציות נשמעות וניסיונות להסתובב בתוך מכשיר הקיבוע נרשמו במהלך הפרוצדורה (כן/לא). בכל הקבוצות n = 10. הנתונים מוצגים כתרשימי עמודות מצטברים של טבלת שכיחות. מבחן Fisher's exact, ערכי p < 0.05 נחשבו למשמעותיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: הזרקה תוך-peritoneal בחולדות באמצעות גרסה גדולה יותר של מנהרת היישום. מנהרת יישום בקוטר 15 cm שימשה להזרקה תוך-peritoneal בחולדות. הפרוצדורה בוצעה בהתאם לאותו פרוטוקול שתואר עבור עכברים. אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

טכניקת ריסון זו פותחה לצורך מתן חומרים ודגימת דם כדי לתמוך בגישה של פרקטיקה מיטבית לרווחת בעלי החיים. חלק מהקהילות המדעיות עדיין נרתעות מאימוץ שיטות טיפול וריסון מעודנות השונות מהליכים סטנדרטיים מבוססים, במיוחד כאשר הן עשויות לדרוש זמן ומאמץ נוספים. עם זאת, הפחתת הלחץ בבעלי חיים במעבדה אינה רצויה רק מנקודת מבט של רווחת בעלי חיים, אלא תורמת באופן משמעותי להצלחת הניסוי על ידי הפחתת השונות בנתונים, מזעור שינויים פיזיולוגיים המושרים על ידי סטרס, והפחתת ניסיונות כושלים ונשירה של בעלי חיים. פרוטוקול זה מציג שיטה קלה ליישום המשפרת משמעותית את רווחת בעלי החיים, תוך שהיא מספקת ריסון מאובטח וגישה ללא שימוש בידיים עבור הליכי יישום ודגימה בטוחים.

שלב קריטי בפרוטוקול הוא הבטחת כניסה מוצלחת ומיקום יציב בתוך מנהרת היישום. לכניסה מרצון, מומלצות שתי גישות אפשריות: כניסה ישירה מצינור ההעברה אל המנהרה, או הנחת העכברים תחילה מצינור ההעברה על לבישת המצע הרכה שמוצבת מראש, ממנה הם יכולים להיכנס למנהרה. הגישה האופטימלית תלויה בהתנהגות בעלי החיים, ויש להעריך את שתי השיטות. הגרסה המועדפת היא זו שבה העכברים נכנסים במהירות הגבוהה ביותר ובפחות רתיעה. אם עכברים מהססים להיכנס למנהרה, יש לשקול מספר גורמים: (1) פתח הכניסה עשוי להיות צר מדי, ובמקרה זה ניתן לדחוס מעט את הלבישה כדי להרחיב את הפתח; (2) רמזי ריח מהלבישה הפנימית עשויים להשפיע על הקבלה, לכן רצוי שהלבישות ישמרו על ריח מוכר מהכלוב, תוך הבטחת הפרדה בין קבוצות ניסוי, כלובים ומינים, והחלפת חומר מלוכלך כדי למנוע ריחות מבלבלים; (3) הוכח כי עכברים מרגישים בטוחים יותר על משטחים בצבעים דומים לצבע הפרווה שלהם14, לכן התאמת צבע הלבישה לצבע פרוות בעלי החיים עשויה להועיל; ו-(4) מיקום פתח המנהרה לכיוון דופן הכלוב עשוי לעודד כניסה מכיוון שהעכברים עדיין יכולים לראות את כלוב הבית ואת חבריהם לכלוב. מגבלה פוטנציאלית של מנהרת היישום היא שהיא מסתמכת על כניסה מרצון של בעל החיים, מה שעלול להיתפס כהחדרה של עיכוב קצר לפני הטיפול או הדגימה. עם זאת, במחקר זה, עכברים נכנסו למנהרה במהירות ובעקביות, בדרך כלל בתוך 2–10 s, מה שאפשר ביצוע של הפרוצדורות בתוך חלון זמן צר וניתן לשחזור. למרות שגישה זו עשויה לדרוש מעט יותר זמן מאשר קיבוע קונבנציונלי של העורף (scruff restraint), יש לשקול את העלייה המתונה בזמן הטיפול אל מול השיפור המשמעותי ברווחת בעלי החיים שמושג על ידי הפחתת הלחץ הנלווה לטיפול. יתרה מכך, הכנסה למכשירי קיבוע קונבנציונליים קשורה גם היא לזמן טיפול, שכן עכברים מתנגדים לעיתים קרובות להצבה, מה שמוביל לכך שאין הבדל רלוונטי. בפחות מ-5% מהמקרים, עכברים לא נכנסו למנהרה מרצונם. בעוד שהצעדים המתוארים לעיל היו בדרך כלל מספיקים כדי לעודד כניסה, ניתן היה גם לסייע בעדינות לבעלי החיים להיכנס למנהרה במידת הצורך. גם במקרים אלו, לבישת המצע הפנימית הרכה מספקת יתרון ברווחה על פני מכשירי קיבוע קונבנציונליים.

ברגע שהם נמצאים בתוך המנהרה, העכברים מסוגלים לאחוז בבטחה בדיפון הפנימי. דבר זה חיובי מאוד מבחינת רווחת בעלי החיים, שכן הוכח שעכברים בריסון מראים רמות סטרס נמוכות יותר כאשר הם רשאים לאחוז במשטח במהלך הטיפול4. במקביל, המטפל יכול להחזיק בבטחה את בסיס הזנב מבלי שהעכבר ינסה להסתובב. חיוני שהדיפון הפנימי יקיף את בעל החיים בצורה הדוקה. אם העכברים קטנים מדי ונוטים להסתובב בתוך המנהרה, ניתן לבצע התאמות מהירות על ידי הידוק הדיפון הגלגול או הוספת שכבה נוספת. עבור ניסויים הכוללים בעלי חיים בגדלים שונים (למשל, עקב גיל, מין או תזונה שונים), ניתן להשתמש גם במנהרות בקטרים משתנים (ראו תבניות להדפסה8).

הזרקות ודגימות דם חייבות להתבצע תמיד על ידי כוח אדם מיומן. עם זאת, מנהרת היישום הוכחה כיעילה הן עבור כוח אדם מנוסה מאוד והן עבור משתמשים עם פחות ניסיון. בפרט, כוח אדם לא מנוסה דיווח על פחות ניסיונות שלא הצליחו, ובכך הופחתו הטיפולים החוזרים והפרוצדורות הממושכות. המשתמשים דיווחו גם על תחושת נוחות וביטחון רבה יותר בעת קיבוע עכברים בתוך המנהרה בהשוואה ללמידה של טכניקות קיבוע ידניות קונבנציונליות. הדבר מהווה יתרון ניכר עבור מעבדות עם תחלופה גבוהה של כוח אדם, שכן השיטה קלה לאימוץ ומיטיבה הן עם בעלי החיים והן עם הנסיין. תצפיות אלו עולות בקנה אחד עם שיפורים שדווחו בעבר בנוגע לנוחות הטיפול ובביטחון הטכנאי, הקשורים לטכניקות טיפול מעודנות כגון טיפול באמצעות מנהרה וכוס15.

חשוב לציין כי השיטה המתוארת כאן יעילה גם בעכברים שלא עברו אימון, וכל התוצאות המוצגות התקבלו באמצעות בעלי חיים ללא הרגלה מוקדמת. מחקרים קודמים הראו כי הרגלה ואימון רפואי של בעלי החיים עשויים להפחית תגובות לחץ בעכברים על ידי היכרותם עם הפרוצדורות המתוכננות16,17. לפיכך, פרוטוקול אימון הכולל את מנהרת היישום עשוי להפחית עוד יותר את רמות הלחץ, במיוחד כאשר נדרשות התערבויות תכופות, שעלולות אחרת להוביל להקשרים שליליים עם המנהרה. תוכנית אימון כזו יושמה בהצלחה במחקר קודם, שאפשר לנו להשתמש במנהרה להזרקות תוך-peritoneum חוזרות לאורך שבועות רבים8. במיוחד במחקרים הדורשים הזרקות חוזרות, המנהרה עשויה להוות שיפור משמעותי (refinement). טכניקות טיפול משופרות המשתמשות בצינורות העברה ובצמצום הריסון הוכחו כמשמרות השפעות חיוביות גם לאחר ריסון חוזר של העורף או הזרקות תוך-peritoneum, כולל נכונות מוגברת לאינטראקציה עם המטפלים והפחתה בהתנהגות דמוית-חרדה במבחנים התנהגותיים סטנדרטיים18,19. בדומה לכך, הזרקות חוזרות שבוצעו בתוך המנהרה לא העלו פרמטרים הקשורים ללחץ בעכברים8.

בדומה לכך, הוכח כי תגמולים של מזון מקלים על ההרגלתו של בעל החיים באמצעות חיזוק חיובי, עיקרון מבוסס באימון בעלי חיים. לכן, מומלץ להגיש פינוק קטן בסיום כל סשן של טיפול כגמול. בעת בדיקת המנהרה, כמויות קטנות מאוד, כגון גרגיר שיבולת שועל בודד, היו מספיקות וסביר שאינן יפריעו לתזונה הרגילה של בעלי החיים. אם צריכת המזון מהווה בעיה, לדוגמה במחקרים מטבוליים, קיימים גם פינוקים בטעמים התואמים תזונות מיוחדות (למשל, תזונות קטוגניות). חשוב לציין כי יש לראות בפינוקים אמצעי שיפור נוסף המגביר את ההרגלתו של בעל החיים, ולא כדרישה מוקדמת לשימוש מוצלח במנהרת היישום. לאחר שהבינו את המערכת, עכברים נכנסו למנהרת היישום שוב ושוב באופן וולונטרי גם ללא קבלת תגמול של מזון.

לשיטה המתוארת כאן יש מגבלות מסוימות ביחס לגישה לאזורי גוף ספציפיים. בעוד שניתן לגשת לזנב בקלות ובבטחה לצורך הזרקות תוך-ורידיות ודגימת דם, ואזור הבטן הזנבי מתאים להזרקות תוך-צפריתית, הגישה לאזורי הגוף הצדיים ליישומים תת-עוריים היא מוגבלת. יש לשקול בזהירות גם מתן תרופות דרך הפה. הזנה פומית קונבנציונלית (gavage) אינה תואמת למערכת זו כיוון שלא ניתן להשיג את מתיחת הצוואר הנדרשת. עם זאת, שיטות מתקדמות יותר למתן דרך הפה, שבהן עכברים צורכים מרצונם חומרים מקצה של פ pipette (למשל, בערבוב עם חלב מרוכז)20, עשויות להיות ישימות דרך הצד הפתוח של המנהרה. במקרים כאלה, יש לוודא שהראש נשאר גלוי בבירור ושהעכבר אינו ממוקם עמוק מדי בתוך הריפוד או המנהרה כדי לאשר בליעה מלאה של החומר.

בהשוואה למנהרות ריסון קיימות, מנהרת ההגשה המתוארת כאן מציעה יתרונות ברורים לרווחת בעלי החיים. למרות שריסון נחוץ לעיתים קרובות לצורך ביצוע בטוח של הליכי הגשה ודגימה, הוא מוכר גם כאחד הגורמים המשמעותיים ביותר למתח (stress) שחולדה ועכברים חווים במהלך הליכים ניסיוניים7,21,22. מחקרים קודמים כבר הדגימו כי החלפת הטיפול המסורתי בזנב והריסון בשיטות מעודנות, כגון טיפול באמצעות מנהרה או כוס, משפרת משמעותית את רווחת בעלי החיים. עכברים שטופלו בגישות מעודנות אלו הראו רמות חרדה נמוכות יותר ונכונות רבה יותר לקיים אינטראקציה עם המטפלים מאשר עכברים שהורמו מהזנב23,24. השימוש במנהרת ההגשה, אליה נכנסים העכברים מרצונם, מהווה הרחבה עקבית של שיטת הטיפול באמצעות מנהרה. סולם הבעות הפנים (grimace scale) של עכברים היוצאים ממנהרת ההגשה מעיד על כך שהבעלי החיים אינם מרגישים מרוסנים או לכודים. למרות ששיטת ההזרקה התוך-peritoneal כאשר העכברים נאחזים בסורגי הכלוב דומה להרמה באחיזה של אזור האגן המתוארת5, השיטה הראשונה מבוססת על מאבקה של בעלי החיים להימלט. על סורגים, עכברים נאחזים בכפות רגליהם ומושכים קדימה, הרחק מאחיזת המטפלים, מה שמוביל לריסון ולכן למצוקה. בנוסף, סוג זה של ריסון מגביר את מתח שרירי הבטן, מה שמוביל להגברת הכאב בעקבות דקירת המחט. לעומת זאת, מנהרת ההגשה מייצגת שיטת ריסון מעודנת, והתוצאות מצביעות על הפחתה במדדים הקשורים למתח, כולל ציוני הבעות פנים נמוכים יותר, פחות קולות שמיעים ושמירה על הנכונות לקיים אינטראקציה עם המטפלים811,12,13. למרות שקולות אולטרסוניים (USVs) מוכרים יותר ויותר כאותות תקשורת רלוונטיים מבחינה אתולוגית, השימוש בהם כסממנים למתח בעכברים בוגרים עדיין נמצא תחת מחקר, שכן USVs תלויים מאוד בהקשר ומופיעים גם במהלך התנהגויות פיזיולוגיות נורמליות25.

עם זאת, ראיות מהזמן האחרון מצביעות על כך שהקלטת USV עשויה להוות גישה מבטיחה, לא פולשנית וניתנת לשחזור להערכת תגובות התנהגותיות לריסון26. לפיכך, שילוב הקלטות USV במחקרים עתידיים עשוי לספק מדד אובייקטיבי נוסף לאפיון מעמיק יותר של תגובות לחץ ותגובות רגשיות. יחד, ממצאים אלה מעידים כי מנהרת היישום מאפשרת הליך ריסון בטוח ופחות מלחיץ ליישומים שגרתיים ולדגימה בהשוואה למגבילים קונבנציונליים. חשוב לציין כי בניגוד למגבילים מאקרילי שקוף, הדיפון הפנימי הרך מאפשר לעכברים לאחוז במשטח בצורה בטוחה, דבר שנחשב לשיפור משמעותי ברווחת בעלי החיים על פי המלצות NC3Rs27. נצפו פחות ניסיונות משמעותית להסתובב בתוך המנהרה, דבר ששיפר הן את הרווחה והן את בטיחות הטיפול. במגבילי פלסטיק קונבנציונליים, ניסיונות להסתובב נקשרים לעיתים קרובות להטבת שתן, והפרווה הרטובה כתוצאה מכך פוגעת עוד יותר בנוחות. בעיה זו נפתרה במידה רבה באמצעות מנהרת היישום.

היישומים הפוטנציאליים של שיטה זו הם נרחבים. ראוי לציין כי שיטת הריסון המשופרת אינה מוגבלת לעכברים אלא יכולה להיות מיושמת גם בחולדות בעת שימוש במנהרה בעלת קוטר גדול יותר (Supplementary Figure 1). מכרסמים הם מיני בעלי החיים הנפוצים ביותר למחקר במעבדות לאורך דיסציפלינות מדעיות שונות, וריסון לצורך מתן חומרים ודגימה הוא הליך שגרתי במעבדות רבות. עם זאת, הוכח כי סטרס הנובע מריסון אינו פוגע רק ברווחת בעלי החיים, אלא משפיע באופן משמעותי גם על תוצאות מדעיות, כולל תגובות התנהגותיות28,29 ומנגנונים פיזיולוגיים כגון תפקוד חיסוני30. לפיכך, מזעור השונות הקשורה לסטרס הוא חיוני הן עבור התקפות המדעית והן מטעמים אתיים בניסויים בבעלי חיים. על ידי הפחתת הסטרס הנלווה לריסון תוך שמירה על טיפול בטוח ומעשי, מנהרת היישום עשויה לשפר באופן משמעותי את איכות הניסוי ואת השחזוריות שלו, ובמקביל לשפר את רווחת בעלי החיים.

גילויים

A.S., J.K.U., ו-L.H. מחזיקים במודל תועלת עבור מנהרת ההזרקה בגרמניה (מספר רישום 20 2024 100 448). שאר המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

אנו מודים לצוות מתקן בעלי החיים של Charité ולקציני רווחת בעלי החיים, ובמיוחד לד"ר André Dülsner, על תמיכתם; ל-Charité 3R על התמיכה הכספית להפצת מנהרת היישום; ולכל חברי כוח המשימה לשיפור (Refinement) של Charité 3R על דיונים מועילים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
לנסטים לבדיקת אלרגיה, סטרילייםHeinz Herenz Medizinalbedarf GmbH, המבורג, גרמניה1110106
מנהרת יישום עם טריס אופציונלימנהרה בהדפסת תלת-ממד פנימיתתבניות להדפסה זמינות בכתובת https://osf.io/vsjnb.
מבחנות לאיסוף דם: Microvette 100 EDTA K3E, 100 µL SARSTEDT AG & Co. KG, Nüמברכט, גרמניה20.1278.100
מבחנה שקופה לטיפול במדגמיםDatesand Group, סטוקפורט, בריטניהGZCHTUBE-100גודל: 50 x 3 x 100 מ"מ
אתנול, ≥70%Carl Roth GmbH + Co. KG, קרלסרוהה, גרמניהT913.1
מזרק מינון מדויק לשימוש חד-פעמי Inject-F בנפח 1 מ"ל B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, מלסונגן, גרמניה9166017V
שיבולת שועלSchapfen Mühle GmbH Co.KG, Ulm, גרמניהW100197עוקר בסטריליזטור (או: שעבר עיקור באוטוקלאב)
מנורת אינפרא-אדום Sanitas SIL 06Beurer Europe GmbH, Ulm, גרמניה61424
בטנה פנימית רכה: Original Vetbed Isobed SLVetbed Deutschland, מודרסבאך, גרמניה1999981חתוך לגדלים הנדרשים
ספריי חיטוי Softasept ISO 70%B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, מלסונגן, גרמניה19905
Sterican 27 G x ¾ מחטים תת-עוריות סטריליות לשימוש חד-פעמיB.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, מלסונגן, גרמניה4657705Bגודל: 0.40 מ"מ x 20 מ"מ
מ swabs: אפליקטורים רפואיים של אפליקציית FIWAפינק & Walter GmbH, Merchweiler, גרמניה329012

מקורות

  1. Joint Research Center (JRC-ISPRA). Summary report on statistical information on the use of animals for scientific purposes in the Member States of the European Union and Norway in 2023. Luxembourg: Publications Office of the European Union; 2026.
  2. European Parliament and Council of the European Union. Directive 2010/63/EU of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Off J Eur Union. 2010;L276:33–79.
  3. Russell WMS, Burch RL. The principles of humane experimental technique. London: Methuen & Co. Ltd.; 1959.
  4. Labitt RN, Oxford EM, Davis AK, Butler SD, Daugherity EK. A validated smartphone-based electrocardiogram reveals severe bradyarrhythmias during immobilizing restraint in mice of both sexes and four strains. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2021;60(2):201–12.
  5. Baek JM, Kwak SC, Kim JY, Ahn SJ, Jun HY, Yoon KH, et al. Evaluation of a novel technique for intraperitoneal injections in mice. Lab Anim (NY). 2015;44(11):440–4.
  6. Turner PV, Pekow C, Vasbinder MA, Brabb T. Administration of substances to laboratory animals: equipment considerations, vehicle selection, and solute preparation. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2011;50(5):614–27.
  7. Meijer MK, Spruijt BM, van Zutphen LF, Baumans V. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 2006;40(4):382–91.
  8. Schlutt A, Riesner K, Kochan M, Mess AK, Jahn D, Lurje I, et al. A novel application tunnel in combination with medical training reduces stress induced by frequent intraperitoneal injections and blood draws in mice. PLoS One. 2026;21(5):e0341404.
  9. Onuma K, Watanabe M, Sasaki N. The grimace scale: a useful tool for assessing pain in laboratory animals. Exp Anim. 2024;73(3):234–45.
  10. Whittaker AL, Liu Y, Barker TH. Methods used and application of the mouse grimace scale in biomedical research 10 years on: a scoping review. Animals (Basel). 2021;11(3).
  11. Ruat J, Genewsky AJ, Heinz DE, Kaltwasser SF, Canteras NS, Czisch M, et al. Why do mice squeak. Toward a better understanding of defensive vocalization. iScience. 2022;25(7):104657.
  12. Ehret G. Schallsignale der Hausmaus (Mus musculus). Behaviour. 1974;52(1-2):38–56.
  13. Blanchard RJ, Hebert MA, Ferrari PF, Palanza P, Figueira R, Blanchard DC, et al. Defensive behaviors in wild and laboratory (Swiss) mice: the Mouse Defense Test Battery. Physiol Behav. 1998;65(2):201–9.
  14. Kawakami K, Xiao B, Ohno R, Ferdaus MZ, Tongu M, Yamada K, et al. Color preferences of laboratory mice for bedding materials: evaluation using radiotelemetry. Exp Anim. 2012;61(2):109–17.
  15. Davies JR, Purawijaya DA, Bartlett JM, Robinson ESJ. Impact of refinements to handling and restraint methods in mice. Animals (Basel). 2022;12(17).
  16. Leussis MP, Bolivar VJ. Habituation in rodents: a review of behavior, neurobiology, and genetics. Neurosci Biobehav Rev. 2006;30(7):1045–64.
  17. Ahlström T. Handling and training mice and rats: low stress procedures. London: National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs); 2023.
  18. Henderson LJ, Dani B, Serrano EMN, Smulders TV, Roughan JV. Benefits of tunnel handling persist after repeated restraint, injection, and anesthesia. Sci Rep. 2020;10(1):14562.
  19. Gouveia K, Hurst JL. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Sci Rep. 2019;9(1):20305.
  20. Krzyzaniak O, Steiner S, Nilsson FAM, Dietrich M, Kampfen L, Johansen P, et al. Applicability of the micropipette-guided drug administration (MDA) method for assessing reward-related behaviors in mice. Physiol Behav. 2025;299:114967.
  21. Cinelli P, Rettich A, Seifert B, Burki K, Arras M. Comparative analysis and physiological impact of different tissue biopsy methodologies used for the genotyping of laboratory mice. Lab Anim. 2007;41(2):174–84.
  22. Pare WP, Glavin GB. Restraint stress in biomedical research: a review. Neurosci Biobehav Rev. 1986;10(3):339–70.
  23. Hurst JL, West RS. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Methods. 2010;7(10):825–6.
  24. Gouveia K, Hurst JL. Reducing mouse anxiety during handling: effect of experience with handling tunnels. PLoS One. 2013;8(6):e66401.
  25. Faure A, Pittaras E, Nosjean A, Chabout J, Cressant A, Granon S. Social behaviors and acoustic vocalizations in different strains of mice. Behav Brain Res. 2017;320:383–90.
  26. Yamauchi T, Yoshioka T, Yamada D, Hamano T, Ohashi M, Matsumoto M, et al. Cold-restraint stress-induced ultrasonic vocalization as a novel tool to measure anxiety in mice. Biol Pharm Bull. 2022;45(3):268–75.
  27. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs). Handling and restraint: General principles. London: NC3Rs; https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/handling-and-restraint
  28. Lee EH, Park JY, Kwon HJ, Han PL. Repeated exposure to short-term behavioral stress resolves pre-existing stress-induced depressive-like behavior in mice. Nat Commun. 2021;12(1):6682.
  29. Mink D, Horvath D, Basler M. Protocol to study social transmission of stress in group-housed mice using restraint stress. STAR Protoc. 2025;6(4):104224.
  30. Ding JX, Rudak PT, Inoue W, Haeryfar SMM. Physical restraint of mouse models to assess immune responses under stress with or without habituation. STAR Protoc. 2021;2(4):100838.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

3Rs
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים