מאמר שיטה

נתיחה של Aedes albopictus והפקה של RNA כולל מרקמות לאחר נתיחה

19 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72811

⸱

30 באוקטובר 2026

 ,  , 
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 3National Health Commission Key Laboratory on Parasitic Disease Prevention and Control, Jiangsu Provincial Key Laboratory on Parasites and Vector Control Technology, Jiangsu Institute of Parasitic Diseases

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן מוצג פרוטוקול לניתוח המעי האמצעי, השחלות ובלוטות הרוק של Aedes albopictus, ולאחריו הפקת RNA כולל לאפיון מולקולרי של רקמות וקטור במחקרי העברה של נגיפים המועברים על ידי יתושים.

תקציר

ביולי 2025, התרחשה התפרצות של דנגו וצ'יקונגוניה בפושאן, מחוז גואנגדונג, סין. Ae. albopictus הוא וקטור מרכזי לווירוסים אלו. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וסטנדרטית לדיסקציה של המעי האמצעי, בלוטות הרוק והשחלות של Ae. albopictus, ולהפקת RNA כולל מהרקמות שהופרדו. נקבות יתוש בנות שלושה ימים שלא ניזונות מדם הורדמו על ידי הקפאה ב-−20 °C למשך 2 min, ולאחר מכן בוצעה דיסקציה של רקמות המטרה. RNA כולל הופק באמצעות ערכה להפקת RNA מרקמה, נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר למיקרו-נפחים, ושימש לניתוח תגובת שרשרת פולימראז במכסה בזמן אמת (RT-qPCR). התוצאות מראות כי שיטת הדיסקציה מפרידה את הרקמות במהירות ובשלמות, וכי RNA מהרקמות המופרדות יכול להגיע לרמת טוהר גבוהה יחסית. RT-qPCR הדגים את דפוסי הביטוי והיציבות היחסית של שלושה גנים של ייחוס (GAPDH, β-actin, ו-RPS6). השיטה פשוטה, מתוקפת ומספקת תמיכה טכנית סטנדרטית למחקרים הקשורים ל-Ae. albopictus.

מבוא

Aedes albopictus (Ae. albopictus) הוא וקטור עבור מספר פתוגנים, כולל נגיף הדנגי (DENV) ונגיף הצ'יקונגוניה (CHIKV)1,2,3. הוא נפוץ באופן רחב וגרם להתפרצויות של מחלות המועברות על ידי יתושים באזורים רבים4,5. היכולת של Ae. albopictus להעביר פתוגנים, המכונה כשירות וקטורית (vector competence), משתנה בין אוכלוסיות וקשורה לביטוי גנים ספציפי במעי האמצעי, בשחלות ובבלוטות הרוק6. הבנת המבנה של רקמות אלו והפקת RNA באיכות גבוהה הן קריטיות להבנת השכפול, ההפצה וההעברה של נגיפים המועברים על ידי וקטורים7.

הזיהוי של ביטוי גנים יחסי באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (RT-qPCR) תלוי בדיסקציה מדויקת של רקמות Ae. albopictus ובמיצוי של RNA באיכות גבוהה8,9. נכון להיום, פרוטוקולי וידאו שפורסמו לדיסקציה של המעי האמצעי, השחלות ובלוטות הרוק התמקדו בעיקר ב-Aedes aegypti10. לכן, פרוטוקול זה מדגים את הדיסקציה של המעי האמצעי, השחלות ובלוטות הרוק מ-Ae. albopictus, שבה הרקמות המודסקしたもの מושמות ישירות בתוך מבחנות טחינה המכילות תמיסה לשימור RNA, ובכך נמנעים משלבי העברה של רקמות וממזערים את אובדן החומר בעת ההעברה. RNA כולל מומצא מהרקמות המודסקしたもの באמצעות שיטה מבוססת עמודה, הדורשת פחות שלבי טיפול ופחות זמן מאשר שיטת TRIzol הקונבנציונלית11. מיצוי זה מניב בדרך כלל 0.1–0.3 µg של RNA כולל מבלוטות הרוק של חמישה Ae. albopictus, עם יחסי A260/A280 של 1.8–2.0, העומדים בדרישות הניקיון עבור RT-qPCR בהמשך. RT-qPCR מבוצע כדי למדוד את הביטוי של שלושה גנים של ייחוס ברקמות של Ae. albopictus, ובכך להעריך את איכות ה-RNA שהומצא מכל רקמה.

יש לציין כי פרוטוקול זה תוקף רק עבור המעי האמצעי, השחלות ובלוטות הרוק של נקבות Ae. albopictus בנות 3 ימים שלא ניזונות מדם, והוא אינו מתאים להפקת RNA מגוף השומן. השגת רקמות שלמות ובודדות היא הבסיס לניתוחים הבאים. באמצעות דיסקציה סיסטמטית של רקמות Ae. albopictus והפקת RNA באיכות גבוהה, פרוטוקול זה מספק תמיכה טכנית לזיהוי ביטוי גנים בהמשך, להערכת כשירות וקטורית ברמת האוכלוסייה ולבקרת העברה של ארבּו-וירוסים.

פרוטוקול

במחקר זה נעשה שימוש אך ורק בבעלי חיים שגודלו במעבדה *Ae. albopictus* יתושים. בהתאם לכך, לא נדרש אישור אתי מוסדי למחקר זה. ה- *Ae. albopictus* הזן ששימש בניסוי זה סופק על ידי המעבדה המרכזית לבקרת מחלות טפיליות ומניעתן של הוועדה הלאומית לבריאות של סין (ג'יאנגסו). מושבה זו נאספה במקור מהעיר ווקסי בשנות ה-80 ואוחסנה במדגרה ב- המכון למחלות טפיליות של ג'יאנגסו בתנאים סטנדרטיים. מושבת היתושים הוחזקה בתא אקלים מלאכותי ב- 25 °C ± 1 °C, 75% ± לחות יחסית של 5%, עם פוטו-תקופה (photoperiod) של 10 שעות אור ו-14 שעות חשיכה. הזחלים גודלו במים טהורים מאוד (ultrapure water) והוזנו בתערובת של אבקת כבד חזיר ותמצית שמרים (Shanghai Brewery) ביחס של 2:1. יתושרי בוגר הוחזקו על תמיסת גלוקוז בריכוז של 5%. הרכיבים והציוד ששימשו את הניסוי מפורטים ב- טבלת חומרים.

1. הכנת החומרים

  1. הכנת תמיסות
    1. הכנת באפר 1x PBS: שקלו 8.0 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, ו-0.24 g KH2PO4. המיסו ב-800 mL מים אולטרה-טהורים תוך כדי ערבוב. התאימו את ה-pH ל-7.4. השלימו את הנפח הסופי ל-1 L. בצעו עיקור באוטוקלבה ב-121 °C למשך 20 min.
    2. הכנת תמיסת DEPC: הוסיפו 1 mL מתמיסת מלאי של DEPC ל-1 L מים אולטרה-טהורים. ערבבו בעוצמה באמצעות בוחש מגנטי למשך 12–16 h. בצעו עיקור באוטוקלבה ב-121 °C למשך 20 min.
      זהירות: DEPC הוא רעיל מאוד ומסרטן. יש להשתמש בכפפות ובמשקפי מגן ולעבוד תחת מנדף עשן.
      הערה: כסו את הכוס בנייר אלומיניום במהלך הערבוב העוצמתי. חלקו את תמיסת ה-DEPC לאליקוטים ואחסנו ב-20 °C- למשך עד 6 חודשים.
  2. הכנת חומרים מתכלים
    1. עיקור כלי ניתוח: הניחו מחטי ניתוח של 1 mm ופינצטות בעלות חוד דק בתוך מיכל אלומיניום ועקרו באוטוקלבה ב-121 °C למשך 20 min.
    2. הכינו מבחנות טחינה של 2 mL המכילות חרוזי סיליקה של 0.5–1.0 mm. הניחו אותן במיכל אלומיניום ועקרו באוטוקלבה ב-121 °C למשך 20 min.
    3. הוסיפו 200 µL מתמיסת שימור RNA המצורפת לערכה לכל מבחנת טחינה.
      הערה: איכות ה-RNA ברקמות יורדת משמעותית בתוך 1 min לאחר הוצאתן מהאורגניזם. הכינו את מבחנות הטחינה עם תמיסת השימור מראש.

2. איסוף של Ae. albopictus

הערה: יש ללבוש חלוקי מעבדה לבנים וכפפות. אין ללבוש בגדים כהים, שכן צבעים כהים מושכים יתושים.

  1. סגרו את כל הדלתות, החלונות ומערכות האוורור בחדר שבו נמצא כלוב היתושים כדי למנוע בריחה של Ae. albopictus.
  2. הפעילו את השואב החשמלי והכניסו אותו לתוך כלוב היתושים. כוון את השואב לעבר Ae. albopictus הנחים על הדפנות הפנימיות של הכלוב ואספו את היתושים.
  3. השאירו את השואב פועל תוך כדי הוצאתו האיטית מהכלוב. אטמו את הכלוב מיד וסגרו את מכסה השואב.
  4. הוציאו את תא האיסוף והניחו אותו בטמפרטורה של -20 °C למשך 2 min לצורךהקפאה (cold immobilization) של Ae. albopictus.
  5. הניחו צלחת זכוכית בקוטר 10 cm על קרח לצורך קירור מקדים. העבירו את ה-Ae. albopictus המוקפאים מתא האיסוף אל צלחת הזכוכית.
    הערה: הקפידו על בקרה קפדנית של זמן ההקפאה כדי למנוע נזק לרקמות.

3. זיהוי נקבות Ae. albopictus לפני נתיחה

  1. בחרו Ae. albopictus שלמים מבחינה מורפולוגית, שהורדמו בקור, מהצלחת הזכוכית והעבירו אותם לעל זכוכית. בחנו אותם תחת מיקרוסקופ סטריאומסקופי בהגדלה של 80x.
  2. זהו את הפס הלבן האורכי על המזונוטום (mesonotum).
  3. אשרו את הפסים הלבנים בבסיס מקטעי הטרסוס (tarsal segments) ובבסיס טרגיטים II-VI של הבטן12.
  4. בחנו את המחושים בהגדלה של 80x. הבדילו בין מחושים חוטתיים (נקבות) למחושים נוצתיים (זכרים) כדי לזהות את הנקבות.

4. דיסקציה של בטן Ae. albopictus

  1. הניחו שלוש טיפות של 1x PBS סטרילי משמאל לימין על תclearRect זכוכית שעבר עיקור, כאשר כל טיפה היא בנפח של כ-20 µL ובמרחק של כ-5 mm אחת מהשנייה.
    הערה: טיפות ה-PBS צריכות להיות גדולות מספיק כדי להטביע את ה-Ae. albopictus כולו.
  2. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לתפוס את כנפי ה-Ae. albopictus והניחו את היתוש בטיפת ה-PBS השמאלית ביותר.
  3. כוון את ה-Ae. albopictus כך שהצד הגחוני (ventral) פונה כלפי מעלה. השתמשו ביד שמאל כדי להחזיק מחט דיסקציה ולחץ על מקטע הבטן השני כדי לקבע את ה-Ae. albopictus.
  4. השתמשו ביד ימין כדי להחדיר מחט דיסקציה של 1 mm למרכז מקטע הבטן השישי. בצעו חתך רוחבי וחציוני כדי לפתוח את חלל הבטן.
  5. הזיזו את מחט הדיסקציה המוחזקת ביד ימין כ-2 mm אחורנית ולחצו על האזור המרכזי של מקטעי הבטן VI–VIII כדי לקבע את הבטן.
    הערה: השחלות ממוקמות בצד הגבי (dorsally) בתוך מקטעי הבטן II-VI. אין להזיז את המחט באופן אקראי בעת הלחיצה על מקטעים VI-VIII כדי למנוע פגיעה במורפולוגיה של השחלות.
  6. השתמשו ביד שמאל כדי לתפוס את מקטע הבטן השני בעזרת מחט הדיסקציה ומשכו בעדינות החוצה כדי להפריד את הבטן במקטע השישי. במהלך ההפרדה, המעי הקדמי, המעי הג운데 וצינורות המלפיגי יהיו חשופים לחלוטין.
    הערה: צינורות המלפיגי הם לבנים ודקים. המעי הג운데 הוא חצי שקוף ובעל צורה של כישוף (fusiform).
  7. הפרידו את המעי הג운데 מהמעי הקדמי ומהמעי האחורי. שטפו את המעי הג운데 בטיפת ה-PBS המרכזית פעמיים.
  8. העבירו אותו לתוך מבחנה ריסוק המכילה 200 µL של תמיסה לשימור RNA המסופקת בערכה המסחרית להפקת RNA.
  9. לחצו על מרכז מקטע הבטן השמיני בעזרת מחט הדיסקציה כדי לחשוף את השחלות הזוגיות משני הצדדים. הסירו את השחלות, שטפו אותן בטיפת ה-PBS המרכזית פעמיים, והעבירו אותן למבחנת ריסוק המכילה 200 µL תמיסה לשימור RNA.
    הערה: השחלות הזוגיות הן סימטריות, בצורת גרגירי אורז ולבנות-חלביות. יש לטפל בהן בזהירות כדי להבטיח את השלמות המבנית של השחלות במהלך השליפה.

5. דיסקציה של בלוטות הרוק של Ae. albopictus

  1. הגדילו את הגדלת המיקרוסקופ ל-400x. העבירו את Ae. albopictus שחלק הבטן שלו הוסר לטיפת ה-PBS הימנית ביותר.
  2. הפעילו לחץ עדין על המזותורקס (mesothorax) בעזרת מחט דיסקציה ביד שמאל, עד שהראש מורם מעט.
  3. השתמשו ביד ימין כדי להרים את הראש באזור הצוואר בעזרת מחט הדיסקציה ומשכו אותו לאט כלפי חוץ. צפו בבלוטות הרוק (מבנה בעל שלוש פאות) בעודן נפרדות מהטורקס יחד עם הראש.
    הערה: בלוטות הרוק ממוקמות בחלק הקדמי של הטורקס ומחוברות לראש via צינור הרוק. הפעלת לחץ עקבי על הטורקס מונעת קרע של צינור הרוק ומאפשרת לבלוטות הרוק להיפרד מהטורקס כשהן שלמות יחד עם הראש. שליטה בכוח בשלב זה דורשת תרגול חוזר.
  4. הפרידו את בלוטות הרוק מהראש. שטפו אותן פעמיים בטיפת ה-PBS המרכזית והעבירו אותן לתוך מבחנה לדחיסה (grinding tube) מוכנה.
    הערה: בלוטות הרוק הן בגודל של כ-1 mm. העבירו אותן למבחנת דחיסה המכילה 200 µL של תמיסה לשימור RNA ובדקו אותן מול מקור אור לבן כדי לאשר את נוכחותן של נקודות לבנות קטנות הצפות בתמיסה.

6. מיצוי RNA מ-Ae. albopictus ומבלוטות הרוק, השחלות והמעי האמצעי שלו

הערה: כל שלבי מיצוי ה-RNA בוצעו על פי הוראות היצרן של הערכה המסחרית למיצוי RNA מרקמה, ללא שינויים.

  1. קררו מראש את טחנת הרקמות ל-4 °C. הגדירו את הפרמטרים ל-30 Hz, זמן טחינה של 30 s, 10 מחזורים וזמן הפסקה של 8 s.
  2. הכניסו את מבחנות הטחינה המכילות את דגימות הרקמה לתוך הטחנה והפעילו את התוכנית.
    הערה: לאחר הטחינה, בדקו האם הרקמה התפזרה באופן מלא בתמיסת שימור ה-RNA. אם הטחינה אינה מלאה, הפעילו 5 מחזורים נוספים.
  3. העבירו את ההומוגנאט למבחנת צנטריפוגה סטרילית של 1.5 mL. צנטריפוגו במהירות 12,000 x g בטמפרטורה של 4 °C למשך 5 min.
  4. העבירו את הסופרנאט למבחנת צנטריפוגה סטרילית חדשה של 1.5 mL. הוסיפו 30 µL כלורופורם.
    זהירות: כלורופורם הוא רעיל ומסרטן. יש להשתמש בכפפות ובמשקפי מגן ולעבוד תחת מנדף פירמידה.
  5. ערבבו ב-Vortex בעוצמה למשך 20 s. הדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15 min, ולאחר מכן צנטריפוגו במהירות 12,000 x g בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 min.
    הערה: שאבו בזהירות את הפאזה המימית העליונה, תוך הימנעות מהשכבה הלבנה האמצעית כדי למנוע זיהום בחלבונים.
  6. העבירו את הפאזה המימית העליונה למבחנת צנטריפוגה סטרילית חדשה של 1.5 mL. הוסיפו 75 µL איסופרופנול.
  7. ערבבו על ידי הפיכה והעבירו את כל התערובת לעמודת סיליקה (silica spin column). צנטריפוגו במהירות 12,000 x g למשך 1 min.
  8. הוסיפו 600 µL באפר שטיפה לעמודה. צנטריפוגו במהירות 12,000 x g למשך 30 s. השליכו את הנוזל שעבר (flow-through).
  9. הוסיפו 600 µL אתנול 80% לעמודה. צנטריפוגו במהירות 12,000 x g למשך 30 s. השליכו את הנוזל שעבר. חזרו על שלב שטיפה זה פעם נוספת, לסה"כ שני שטיפות.
  10. הוסיפו 30 µL מי DEPC למרכז ממבנה העמודה. הדגירו בטמפרטורת החדר למשך 1 min.
  11. הכניסו את העמודה למבחנת צנטריפוגה סטרילית של 1.5 mL. צנטריפוגו במהירות 12,000 x g למשך 1 min כדי לבצע אלוציה של ה-RNA.
  12. קחו 1 µL מה-RNA שהופק ומדדו את הריכוז והטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר של מיקרו-נפחים.

7. שעתוק חוזר של RNA

  1. הכנת מערכת התגובה
    1. המיסו על קרח את תערובת ה-4x reverse transcription master mix, מים נקיים מנוקלאז (nuclease-free water) ותבנית ה-RNA.
    2. במבחורת PCR בנפח 200 µL, הכינו מערכת תגובה של 20 µL על ידי הוספה של 5 µL של 4x reverse transcription master mix, 10 µL של תבנית RNA כוללת, ו-5 µL של מים נקיים מנוקלאז.
    3. סובבו במערכת צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-1,000 x g כדי לרכז את תערובת התגובה בתחתית המבחנה.
    4. הניחו את מבחורת ה-PCR בטרמוסייקלר והריצו את תוכנית השעתוק ההפוך: 50 °C למשך 5 min; 85 °C למשך 5 s.
      הערה: יש לדלל את תוצר השעתוק ההפוך פי 20 לפני השימוש כדי להפחית את השפעת מעכבים פוטנציאליים על ה-RT-qPCR.

8. PCR כמותי בזמן אמת (RT-qPCR)

  1. הכנת מערכת תגובת RT-qPCR
    1. הפשיר על קרח 2x SYBR Green qPCR master mix, תבנית cDNA ופריימרים קדמיים ואחוריים בריכוז 10 µM, תוך הגנה מאור לאורך כל התהליך.
    2. בפלטת PCR של 96 בארות, הכן מערכת תגובה של 20 µL לכל בארה על ידי הוספת 10 µL של 2x SYBR Green qPCR master mix, 0.8 µL מכל אחד מהפריימרים הקדמיים והאחוריים בריכוז 10 µM (ריכוז סופי 400 nM), 2 µL של תבנית cDNA מדוללת פי 20, ו-6.4 µL של מים נקיים מנוקלאז.
    3. אטום את פלטת 96 הבארות באמצעות סרט דביק אופטי, וודא שכל הבארות אטומות לחלוטין.
    4. סבב בצנטריפוגה במהירות 1,000 x g למשך 1 min כדי לרכז את תערובת התגובה בתחתית הבארות.
    5. הנח את פלטת ה-PCR במערכת גילוי real-time PCR והפעל את תוכנית המחזורי התרמיים.
      הערה: תוכנית המחזורי התרמיים: דנטורציה מקדימה ב-95 °C למשך 30 s (מחזור 1); הגברה: 95 °C למשך 30 s, 60 °C למשך 30 s (40 מחזורים); ניתוח עקומת המסת: 95 °C למשך 15 s, 60 °C למשך 1 min, עלייה ל-95 °C בקצב של 0.15 °C/s. כל דגימת RNA מרקמה נבדקת ב-qPCR בארבע חזרות טכניות. כל דגימה של רקמה מורכבת מרקמות מאוחדות של 5 Ae. albopictus. רצפי הפריימרים ששימשו ל-RT-qPCR מפורטים ב-Table 1.
  2. ניתוח נתונים
    1. בדוק את עקומת ההמסה עבור כל זוג פריימרים כדי לאשר שיא דיסוציאציה בודד ומוגדר היטב.
    2. ייצא את ערכי ה-Ct מתוכנת המכשיר. הגרף וניתוח הנתונים מבוצעים באמצעות תוכנה סטטיסטית ותוכנה לשרטוט גרפים.
שם הפריימריםרצפי פריימרים (5''-3')
*Ae. albopictus* βפריימר קדמי ל-actin GGAGAAGATCTGGCATCACA
*Ae. albopictus* βפריימר הפוך ל-actinTGTCATCTTCTCGCGGTTAG
*Ae. albopictus* פריימר קדמי ל-GAPDHCTGCCAAGGCTGTCGGTAA
*Ae. albopictus* פריימר הפוך ל-GAPDHTCATAGGAGGCAGGCTTGGA
*Ae. albopictus* פריימר קדמי ל-RPS6ACAAGCTGCGTCACTTCTACGACA
*Ae. albopictus* פריימר הפוך ל-RPS6CTTGTCGTTTCCACCGGCAATCTT

טבלה 1: רצפי פריימרים של Ae. albopictus ששימשו ב-RT-qPCR.

תוצאות

מחקר זה מורכב משני חלקים: נתיחה של Ae. albopictus והפקת RNA מרקמות לאחר הנתיחה. זרימת העבודה הכללית מוצגת באיור 1, כאשר איור 1A ממחיש את הנתיחה של Ae. albopictus ואיור 1B ממחיש את הפקת ה-RNA והגילוי העוקב של רמות ביטוי של גנים ייחוס.

figure-results-1
איור 1: תרשים של נתיח Ae. albopictus והפקת RNA כולל מרקמות לאחר הנתיחה. (A) איסוף, הרדמה ונתיחה של Ae. albopictus. (B) הפקת RNA מרקמות לאחר הנתיחה, זיהוי טוהר וזיהוי רמות ביטוי של גן ייחוס. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

חמישה שגודלו במעבדה *Ae. albopictus* נוסחו כדי לבודד את המעי האמצעי, בלוטות הרוק והשחלות. בהגדלה של 80×, המעי הקדמי, המעי האמצעי והמעי האחורי השקופים של ה- *Ae. albopictus* היו גלויים לעין בבירור, כאשר השחלאות דמויות הגרגרים ממוקמות משני הצדדים ומכוסות על ידי צינורות המלפיגי הלבנים (איור 2A). כאשר השדה הותאם ל-400×, בלוטות הרוק השקופות של *Ae. albopictus* הפכו לנצפים בבירור (איור 2B). איור 2C,D להמחיש המעי האמצעי ורקמות השחלה המבודדים. התוצאות הצביעו על כך שהרקמות שבודדו באמצעות שיטה זו של ניתוח שימרו את שלמותן המבנית, דבר החיוני להפקה עוקבת של RNA כולל מהדגימות לאחר הניתוח.

figure-results-2
איור 2: ניתוח לאחר נתיחה של רקמות Ae. albopictus. (A) בידוד רקמות מבטנו של Ae. albopictus. (B) בלוטות רוק שקופות בעלות שלושה אונויות של Ae. albopictus. (C) מעי קדמי ומעי אמצעי של Ae. albopictus. (D) שחלות זוגיות בצורת גרעין אורז של Ae. albopictus. I: מעי קדמי; II: מעי אמצעי; III: מעי אחורי; IV: צינורות מלפיגי (Malpighian tubules); V: שחלות. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

RNA כולל הוצק מרקמות מופרדות של Ae. albopictus. דגימות הרקמה (בלוטות הרוק, המעי האמצעי והשחלות) נטחנו באופן מלא לפני ההוצאה. ריכוזי ה-RNA השתנו בהתאם לסוג הרקמה: בבלוטות הרוק הריכוז היה 7.8 ng/µL, בעוד שבמעי האמצעי, בשחלות ובהומוגנאטים של גוף שלם של נקבות Ae. albopictus הריכוזים היו 55.3, 45.7 ו-42.7 ng/µL, בהתאמה. כל הדגימות הראו טהרה גבוהה, עם יחסי A260/A280 של 1.87–2.10 ויחסי A260/A230 של 1.73–2.13 (טבלה 2). רמות הביטוי של שלושה גנים של מועמדים כגנים של ייחוס (GAPDH, β-actin, ו-RPS6) נבדקו באמצעות RT-qPCR בכל הרקמות. למרות שהביטוי שלהם השתנה במקצת בהתאם לריכוז ה-RNA, כל שלושת הגנים נותרו יציבים יחסית בין סוגי הרקמות השונים (איור 3). GAPDH, β-actin, ו-RPS6 מתאימים כגני ייחוס יציבים לנורמליזציה של ביטוי גנים ברקמות שונות של Ae. albopictus.

רקמהמספר הדגימותריכוז RNA (נג/μL)A260/A280A260/A230
בלוטת רוק57.81.871.73
מעי אמצעי555.31.941.98
שחלה545.72.102.13
נקבה142.72.041.92

טבלה 2: ריכוז וטוהר של RNA שהוצא מרקמות של Ae. albopictus.

figure-results-3
איור 3: ערכי Ct של גנים של ייחוס (GAPDH, β-actin, ו-RPS6) שזוהו באמצעות RT-qPCR. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

Ae. albopictus נפוץ באופן רחב באזורים ממוזגים, סובטרופיים וטרופיים בכל היבשות למעט אנטארקטיקה13,14. כווקטור חשוב לארבו-וירוסים כגון נגיף הדנגה (DENV), נגיף זיקה (ZIKV) ונגיף הצ'יקונגוניה (CHIKV), הוא גרם שוב ושוב להתפרצויות של מחלות המועברות על ידי יתוש בגואנגדונג, סין15.

כדי לסייע במחקר על נגיפים הקשורים ל-Ae. albopictus ולהעברתם, פיתחנו שיטה פשוטה לניתוח רקמות של Ae. albopictus. בפרוטוקולי ניתוח קונבנציונליים, כאשר הראש מופרד מהחזה במהלך ניתוח בלוטות הרוק, בלוטות הרוק עשויות להישאר מחוברות לחזה או לראש, תלוי בעוצמת הכוח המופעל; מכיוון שבלוטות הרוק הן בגודל של כ-1 mm בלבד, איתורן בתוך החזה הופך לקשה16. שיטה זו מתבססת על פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד איברים של יתושים ומבצעת אופטימיזציה להפרדה של בלוטות הרוק הממוקמות מתחת לסטרניטים הפרוסטרנליים והמזוסטרנליים, אותן יש לבחון תחת הגדלה של 400×17. לצורך הניתוח, יש ללחוץ בעדינות על המזוטורקס באמצעות מחט אחת, ובמקביל להשתמש במחט שנייה כדי ליצור לחץ המפריד את הראש, מה שמאפשר לבלוטות הרוק להיפרד כשהן שלמות. גישה זו מונעת את הצורך בחיפוש אחר בלוטות הרוק בתוך החזה, מונעת זיהום ונזק לבלוטות ומקצרת את זמן הניתוח הכולל. השחלות ממוקמות בקרבת מקטעי הבטן VI–VIII ונשמרות על ידי תחילת הניתוח מהמקטע הבטני השישי וחילוץ זהיר של המעי האמצעי, צינורות המלפיגי והשחלות מהבטן18. שיטה זו מניבה בלוטות רוק שלמות, צורות שחלה טיפוסיות ללא הידבקויות, ומעי אמצעי רציף (Figure 2). טכניקת ניתוח זו מספקת הדרכה בעלת ערך למחקרים על Ae. albopictus ועל השכפול, ההפצה וההעברה של נגיפים המועברים על ידי וקטורים.

מיצוי RNA מרקמות של Ae. albopictus הוא חיוני לזיהוי וירוסים המועברים על ידי פשיריות. שיטת ה-TRIzol הקונבנציונלית היא ארוכה ודורשת מיומנות טכנית גבוהה, אך היא מספקת בדרך כלל תנובת RNA גבוהה ויכולה להניב RNA באיכות גבוהה כאשר היא מבוצעת כהלכה. לעומת זאת, השיטה המבוססת על עמודות מציעה הדירות טובה יותר וקלה יותר לביצוע, אך עשויה להוביל להשבה נמוכה יותר של RNA ומתפקדת באופן לא יעיל כאשר היא מיושמת על הגוף השומני19,20. במחקר זה, רקמות מבודדות נשמרו במהירות במייצב חומצות גרעיים, נטחנו ביסודיות ועובדו באמצעות שיטת עמודי הסבוב (spin column) כדי למצות RNA לצורך סינתזת cDNA21. כדי להבטיח נורמליזציה מדויקת של נתוני RT-qPCR למרות שינויים באיכות ה-cDNA, נדרשים גנים של ייחוס יציבים22. בעוד שגני ייחוס נקבעו עבור שלבי התפתחות שונים של Ae. albopictus, גני ייחוס ספציפיים לרקמות דורשים תיקוף נוסף23,24. ניתוח RT-qPCR של RNA שעבר שעתוק הפוך מכל הרקמות המבודדות הניב הגברה עקבית של GAPDH, β-actin, ו-RPS6, מה שמאשר כי איכות ה-RNA שהושגה באמצעות פרוטוקול בידוד זה מספיקה כדי לתמוך במחקרי ביטוי גנים ספציפיים לרקמה ב-Ae. albopictus.

במהלך נתיחה של רקמות Ae. albopictus לפי פרוטוקול זה, עלולות להתרחש לעיתים מקרים שבהם בלוטות הרוק אינן ניתקות יחד עם הראש. דבר זה נובע בדרך כלל מלחץ לא מספיק שהופעל על החזה בשילוב עם הפרדה מהירה מדי של הראש. כדי לפתור זאת, יש להפעיל לחץ עקבי על המזותורקס (mesothorax) ולמשוך את הראש לאט החוצה, כדי לאפשר לבלוטות הרוק להינתק בשלמותן יחד עם הראש. בעת העברת בלוטות הרוק למבחנה לריסוק המכילה תמיסה לשימור RNA, יש לבחון בזהירות את התמיסה אל מול מקור אור כדי לאתר נקודות לבנות קטנות הצפות בה. אם לא ניתן לאתר את בלוטות הרוק במבחנה, יש לבדוק מיד אם הן נותרו דבוקות למחט הנתיחה. במהלך מיצוי ה-RNA, יש לפעול בקפידה לפי הפרוטוקול של יצרן הקיט. אם ריכוז ה-RNA שהתקבל נמוך, ניתן לבצע אלוציה (elution) שנייה עם באפר האלוציה. ב-RT-qPCR, עלולים להופיע מספר שיאים בעקומת ההמסה (melt curve); במקרה זה, יש לאמת תחילה את ספציפיות הפריימרים. אם ערכי ה-Ct גבוהים, יש להתאים את טמפרטורת ההישומה (annealing temperature) של התוכנית בהתאם לטמפרטורת ההמסה של הפריימרים. באופן כללי, יש להגדיר את טמפרטורת ההישומה בתוכנית ב-1–2 °C מתחת לטמפרטורת ההמסה של הפריימרים25.

למחקר זה יש מספר מגבלות. היקף הדגימות צר יחסית, וממוקד רק במעי האמצעי, בבלוטות הרוק וברקמות השחלה, ללא חקירה של רקמות אחרות כגון צינורות מלפיגי וגוף השומן26. בנוסף, הניתוח הוגבל ליתושי נקבה בני 3 ימים שגודלו במעבדה, כאשר פרטים שהוזנו בדם או שהודבקו בנגיף הוצאו מהמחקר27. שיפורים עתידיים צריכים לכלול הרחבה של היקף הדגימות כך שיכללו רקמות כמו צינורות מלפיגי, ובחינה של פרטים של Ae. albopictus במצבים פיזיולוגיים שונים.

לסיכום, נתיחה של המעי האמצעי, השחלות ובלוטות הרוק מ-Ae. albopictus, ולאחריה מיצוי RNA כולל, מספקת תשתית טכנית להערכות עוקבות של כשירות הווקטור ומחקרי העברה של ארבו-וירוסים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פיפטת פסטור ארוכה במיוחד, 3 מ"לWHBWHB-S43 מ"ל
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711-02500 תגובות
ערכה של HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCRVazymeR433-01100 תגובות
ערכה למיצוי RNA כולל במיקרוטכנולוגיה רפואיתMDT-CFR07100T/קופסה
מיקרופיפטות 0.5-10μLEppendorf4043444
זכוכיות מיקרוסקופCITOTEST80302-210475 מ"מ×25 מ"מ
מיקרו-ספקטרופוטומטרKAIAOK5600C
בופר למיצוי חומצות גרעיןטכנולוגיה רפואיתMDT-TP01100 מ"ל
PBS Phosphate Buffered Saline (סטרילי)ServicebioG4202500 מ"ל
מעגל תרמי ל-PCREppendorfMastercycler X50s
מערכת QuantStudio™ 7 Pro ל-PCR בזמן אמתApplied BiosystemsEN61326-1
סט מיקרוסקופ למעבדה Stemi 305ZEISS435063-9010-000

מקורות

  1. Hafsia S et al. Vector competence of Aedes albopictus and Aedes aegypti from the islands of the Southwestern Indian Ocean for epidemic Zika, dengue, and chikungunya viruses. Parasit Vectors. 2025;19(1):34.
  2. Zhang W, Wang J, Liu Q, Gong Z. A review of pathogens transmitted by the container-inhabiting mosquitoes, Aedes albopictus, a global public health threat. China CDC Wkly. 2023;5(44):984-990.
  3. Kraemer MUG et al. Past and future spread of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus. Nat Microbiol. 2019;4(5):854-863.
  4. Zhang M et al. Epidemiological characteristics and transmission dynamics of the early stage Chikungunya fever outbreak in Foshan City, Guangdong Province, China in 2025. Infect Dis Poverty. 2025;14(1):93.
  5. Meyer AD, Guerrero SM, Dean NE, Anderson KB, Stoddard ST, Perkins TA. Predictability of infectious disease outbreak severity: Chikungunya as a case study. Sci Adv. 2025;11(40):eadt5419.
  6. Wu Y et al. The making of a dangerous vector: factors shaping the vector competence of Aedes mosquitoes. Front Cell Infect Microbiol. 2025;15:1718737.
  7. Zhu C et al. Transcriptome analysis of Aedes aegypti midgut and salivary gland post-Zika virus infection. Curr Res Parasitol Vector Borne Dis. 2025;7:100251.
  8. Liu X, Yang S, Yao Y, Wu S, Wu P, Zhai Z. Opsin1 regulates light-evoked avoidance behavior in Aedes albopictus. BMC Biol. 2022;20(1):110.
  9. Zhang Y et al. Rapid differential detection of Japanese encephalitis virus and Getah virus in pigs or mosquitos by a duplex TaqMan real-time RT-PCR assay. Front Vet Sci. 2022;9:839443.
  10. Coleman J, Juhn J, James AA. Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes. J Vis Exp. 2007;4(5):228.
  11. Tesena P, Korchunjit W, Taylor J, Wongtawan T. Comparison of commercial RNA extraction kits and qPCR master mixes for studying gene expression in small biopsy tissue samples from the equine gastric epithelium. J Equine Sci. 2017;28(4):135-141.
  12. Ramdini C et al. First report of Aedes albopictus in Saint Barthélemy (French West Indies) confirmed by morphological, molecular and MALDI-TOF mass spectrometry approaches. Parasit Vectors. 2025;18(1):258.
  13. Battaglia V et al. The worldwide spread of Aedes albopictus: new insights from mitogenomes. Front Genet. 2022;13:931163.
  14. Laporta GZ, Potter AM, Oliveira JFA, Bourke BP, Pecor DB, Linton YM. Global distribution of Aedes aegypti and Aedes albopictus in a climate change scenario of regional rivalry. Insects. 2023;14(1):49.
  15. Yip SSW, Charm CYC, Ng KS, Lam SC. Chikungunya fever: a re-emerging mosquito-borne threat demanding proactive prevention strategies in Asia. Front Public Health. 2026;14:1745145.
  16. Tutagata J, Pocquet N, Trouche B, Reveillaud J. Dissection of mosquito ovaries, midgut, and salivary glands for microbiome analyses at the organ level. J Vis Exp. 2024;(212):67128.
  17. Schmid MA, Kauffman E, Payne A, Harris E, Kramer LD. Preparation of mosquito salivary gland extract and intradermal inoculation of mice. Bio Protoc. 2017;7(14):e2407.
  18. Airs PM, Nazarchyk MJ, Tucker BJ, Bartholomay LC. Characterizing oogenesis and programmed cell death in the eastern tree hole mosquito Aedes (Protomacleaya) triseriatus. Front Insect Sci. 2022;2:1073308.
  19. Chomczynski P, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006;1(2):581-585.
  20. De Azevedo N, Lozano A, Parsons RE, Martin TC. Optimized protocols to extract total transcripts and proteins from lipid-rich tissues. Methods Protoc. 2026;9(2):65.
  21. García-Longoria L, Ahrén D, Berthomieu A, Kalbskopf V, Rivero A, Hellgren O. Immune gene expression in the mosquito vector Culex quinquefasciatus during an avian malaria infection. Mol Ecol. 2023;32(4):904-919.
  22. Lü J, Yang C, Zhang Y, Pan H. Selection of reference genes for the normalization of RT-qPCR data in gene expression studies in insects: a systematic review. Front Physiol. 2018;9:1560.
  23. Dzaki N, Azzam G. Assessment of Aedes albopictus reference genes for quantitative PCR at different stages of development. PLoS One. 2018;13(3):e0194664.
  24. Vedururu RK et al. RNASeq analysis of Aedes albopictus mosquito midguts after chikungunya virus infection. Viruses. 2019;11(6):513.
  25. Bustin SA et al. MIQE 2.0: revision of the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments guidelines. Clin Chem. 2025;71(6):634-651.
  26. Skowronek P, Wójcik Ł, Strachecka A. Fat body-multifunctional insect tissue. Insects. 2021;12(6):547.
  27. Goldman OV et al. A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult Aedes aegypti mosquito. Cell. 2025;188(25):7267-90.e26.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ניתוח יתושניתוח המעיกลางניתוח בלוטות הרוקניתוח השחלהאנליזת RT-qPCRביטוי גנים של ייחוסטוהר RNA מרקמה
נתיחה של Aedes albopictus והפקה של RNA כולל מרקמות לאחר נתיחה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.