נויטרופילים בידוד פרוטוקול

Summary

נויטרופילים הם בין התאים הראשונים להגיע באתר של התגובה החיסונית דלקתיות, ואת תפקידיהם מנגנוני נחקרו רבות במבחנה. אנו מדגימים תקן צפיפות שיפוע ההפרדה שיטה לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות כלי התקשורת ההפרדה זמינים מסחרית.

Abstract

גרנולוציטים polymorphonuclear נויטרופילים (PMN) הם leukocytes הנפוץ ביותר בבני אדם בין התאים הראשונים להגיע באתר של תגובה חיסונית דלקתית. בשל תפקיד המפתח שלהם דלקת, נויטרופילים פונקציות כגון תנועה, ייצור ציטוקינים, phagocytosis, ולחימה תאים סרטניים נלמדים בהרחבה. כדי לאפיין את פונקציות ספציפיות של נויטרופילים, שיטה נקי, מהיר, אמין הפרדתם כדוריות דם אחרים רצוי במבחנה, במיוחד מאז נויטרופילים הם קצרי חיים ויש להשתמש בהם תוך 2-4 שעות של האוסף. כאן, אנו מדגימים צפיפות תקן שיפוע ההפרדה שיטה לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות כלי התקשורת ההפרדה זמינים מסחרית כי הוא תערובת של נתרן metrizoate ו dextran 500. ההליך מורכב דם על כל שכבות המדיום צפיפות שיפוע, צנטריפוגה, הפרדה של שכבת נויטרופילים, ו תמוגה של אריתרוציטים שיורית. תאים נשטפים אז, נספר, ועל resuspended במאגר לריכוז הרצוי. כאשר מבוצע כהלכה, שיטה זו הוכח תשואה דגימות של> 95% נויטרופילים עם הכדאיות> 95%.

Protocol

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

1. תביאו את כל ריאגנטים לטמפרטורת החדר.
2. איסוף 5.0 מ"ל של התקשורת נויטרופילים בידוד צינור צנטריפוגות. בזהירות שכבה 5.0 מ"ל של דם על התקשורת ההפרדה. בצע שלב זה לאט ובזהירות, ועם קצה פיפטה קרוב לפני השטח של התקשורת, כדי למנוע ערבוב הדם בכלי התקשורת.
3. צנטריפוגה ב RCF 500 דקות 35 ב 20-25 ° C. הדם צריך להפריד החוצה 6 להקות שונות: פלזמה, מונוציטים, מדיה בידוד, נויטרופילים, מדיה בידוד יותר, תא דם אדום גלולה (איור 1). אם להקות אלה אינם ברורים, את תהליך ההפרדה לא היה נקי יהיה צורך לחזור.
4. מוציאים בזהירות את החלק העליון שלוש שכבות (פלסמה, מונוציטים, התקשורת בידוד) באמצעות פיפטה. השלך את השכבות הללו.
5. פיפטה בזהירות את השכבה של נויטרופילים וכל מדיה הבידוד מתחת נויטרופילים. מניחים את הפתרון לתוך צינור צנטריפוגות נקי.
6. לדלל את הפתרון נויטרופילים עד 10 מ"ל עם HBSS ללא Ca ² + / Mg ² +. הפוך את הצינור כמה פעמים להשעות את התאים.
7. צנטריפוגה הפתרון נויטרופילים ב RCF 350 במשך 10 דקות. גלולה אדומה צריכים להיות נוכחים בחלק התחתון של הצינור, המכילה נויטרופילים שיורית בתאי הדם האדומים (RBCs). הסר את supernatant עם טפטפת בקפידה כך גלולה אינה מופרעת.
8. כדי lyse RBCs שיורית, להוסיף 2 מ"ל הצפת האדום תמוגה תא אל הצינור. כדי resuspend, גלולה מערבולת את הבקבוקון על ההגדרה של 3-4. הימנע להגדיל את ההגדרה מערבולת מעל 4, שכן זה עלול לגרום נויטרופילים כדי להפעיל. זה עשוי להיות נחוץ כדי מערבולת למשך מספר שניות, או "דופק" מערבולת לפזר את גלולה.
9. צנטריפוגה התחתית RCF 250 דקות 5. הסר את supernatant עם פיפטה. חזור על התהליך lysing אם נדרש.
10. הוסף 500 μl HBSS ללא Ca ² + / ² + Mg כדי צינור אחד. שוב, אל מערבולת resuspend גלולה בהגדרה של 3-4. מדולל ל 10 מ"ל עם HBSS ללא Ca ² + / Mg ² +.
11. צנטריפוגה הצינורות בבית RCF 250 דקות 5. לשאוב supernatant וזורקים.
12. Resuspend גלולה ב 250 HBSS μl / פתרון HSA (2% HSA). תאים עשויים אז ייספרו והותאמו הריכוז הרצוי.

Discussion

שיפוע צפיפות שיטת ההפרדה משמש כדי לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות תערובת של נתרן metrizoate ו dextran 500. שיטה זו מבוססת על שיטת ההפרדה mononuclear ליקוציט ידי Boyum (1968) אשר שונה להפרדה נויטרופילים ידי פראנטה Thong (1980).

לאחר איסוף מתורם דם, כולו עשוי להיות anticoagulated עם EDTA, ציטרט או הפרין. מאז הם קצרי חיים, נויטרופילים יש להשתמש תוך 2-4 שעות של האוסף. ההליך מורכב דם על כל שכבות המדיום צפיפות שיפוע, צנטריפוגה, הפרדה של שכבת נויטרופ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ריאגנט לימפוציטים Poly(R)	Reagent	Cedarlane Labs		PolymorphprepTM יכול לשמש כחלופה
Hank' s תמיסת מלח מאוזנת ללא סידן כלוריד	ריאגנט	Invitrogen
סרום אנושי אלבומין	ריאגנט	ZLB ביופלזמה
תאים אדומים ליזה	ריאגנט	רוש קבוצת
צנטריפוגה	כלי
מערבולת	כלי
פסטר פיפטות ונורה	מגיב
כלי PolymorphprepTM	ריאגנט	ציר-מגן		מגיב חלופי למסנן מזרק לימפוציטים-פולי (R)
	אחר	EMD Millipore	SLGV033RS	Millex-GV, 0.22 μ m, PVDF, 33 מ"מ, Hank' הניתן לעיקור גמא
s תמיסת מלח איזון עם סידן כלוריד	ריאגנט	Invitrogen