נויטרופילים הם בין התאים הראשונים להגיע באתר של התגובה החיסונית דלקתיות, ואת תפקידיהם מנגנוני נחקרו רבות במבחנה. אנו מדגימים תקן צפיפות שיפוע ההפרדה שיטה לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות כלי התקשורת ההפרדה זמינים מסחרית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
גרנולוציטים polymorphonuclear נויטרופילים (PMN) הם leukocytes הנפוץ ביותר בבני אדם בין התאים הראשונים להגיע באתר של תגובה חיסונית דלקתית. בשל תפקיד המפתח שלהם דלקת, נויטרופילים פונקציות כגון תנועה, ייצור ציטוקינים, phagocytosis, ולחימה תאים סרטניים נלמדים בהרחבה. כדי לאפיין את פונקציות ספציפיות של נויטרופילים, שיטה נקי, מהיר, אמין הפרדתם כדוריות דם אחרים רצוי במבחנה, במיוחד מאז נויטרופילים הם קצרי חיים ויש להשתמש בהם תוך 2-4 שעות של האוסף. כאן, אנו מדגימים צפיפות תקן שיפוע ההפרדה שיטה לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות כלי התקשורת ההפרדה זמינים מסחרית כי הוא תערובת של נתרן metrizoate ו dextran 500. ההליך מורכב דם על כל שכבות המדיום צפיפות שיפוע, צנטריפוגה, הפרדה של שכבת נויטרופילים, ו תמוגה של אריתרוציטים שיורית. תאים נשטפים אז, נספר, ועל resuspended במאגר לריכוז הרצוי. כאשר מבוצע כהלכה, שיטה זו הוכח תשואה דגימות של> 95% נויטרופילים עם הכדאיות> 95%.
פרוטוקול
נויטרופילים בידוד פרוטוקול
- תביאו את כל ריאגנטים לטמפרטורת החדר.
- איסוף 5.0 מ"ל של התקשורת נויטרופילים בידוד צינור צנטריפוגות. בזהירות שכבה 5.0 מ"ל של דם על התקשורת ההפרדה. בצע שלב זה לאט ובזהירות, ועם קצה פיפטה קרוב לפני השטח של התקשורת, כדי למנוע ערבוב הדם בכלי התקשורת.
- צנטריפוגה ב RCF 500 דקות 35 ב 20-25 ° C. הדם צריך להפריד החוצה 6 להקות שונות: פלזמה, מונוציטים, מדיה בידוד, נויטרופילים, מדיה בידוד יותר, תא דם אדום גלולה (איור 1). אם להקות אלה אינם ברורים, את תהליך ההפרדה לא היה נקי יהיה צורך לחזור.
- מוציאים בזהירות את החלק העליון שלוש שכבות (פלסמה, מונוציטים, התקשורת בידוד) באמצעות פיפטה. השלך את השכבות הללו.
- פיפטה בזהירות את השכבה של נויטרופילים וכל מדיה הבידוד מתחת נויטרופילים. מניחים את הפתרון לתוך צינור צנטריפוגות נקי.
- לדלל את הפתרון נויטרופילים עד 10 מ"ל עם HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 +. הפוך את הצינור כמה פעמים להשעות את התאים.
- צנטריפוגה הפתרון נויטרופילים ב RCF 350 במשך 10 דקות. גלולה אדומה צריכים להיות נוכחים בחלק התחתון של הצינור, המכילה נויטרופילים שיורית בתאי הדם האדומים (RBCs). הסר את supernatant עם טפטפת בקפידה כך גלולה אינה מופרעת.
- כדי lyse RBCs שיורית, להוסיף 2 מ"ל הצפת האדום תמוגה תא אל הצינור. כדי resuspend, גלולה מערבולת את הבקבוקון על ההגדרה של 3-4. הימנע להגדיל את ההגדרה מערבולת מעל 4, שכן זה עלול לגרום נויטרופילים כדי להפעיל. זה עשוי להיות נחוץ כדי מערבולת למשך מספר שניות, או "דופק" מערבולת לפזר את גלולה.
- צנטריפוגה התחתית RCF 250 דקות 5. הסר את supernatant עם פיפטה. חזור על התהליך lysing אם נדרש.
- הוסף 500 μl HBSS ללא Ca 2 + / 2 + Mg כדי צינור אחד. שוב, אל מערבולת resuspend גלולה בהגדרה של 3-4. מדולל ל 10 מ"ל עם HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 +.
- צנטריפוגה הצינורות בבית RCF 250 דקות 5. לשאוב supernatant וזורקים.
- Resuspend גלולה ב 250 HBSS μl / פתרון HSA (2% HSA). תאים עשויים אז ייספרו והותאמו הריכוז הרצוי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיפוע צפיפות שיטת ההפרדה משמש כדי לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות תערובת של נתרן metrizoate ו dextran 500. שיטה זו מבוססת על שיטת ההפרדה mononuclear ליקוציט ידי Boyum (1968) אשר שונה להפרדה נויטרופילים ידי פראנטה Thong (1980).
לאחר איסוף מתורם דם, כולו עשוי להיות anticoagulated עם EDTA, ציטרט או הפרין. מאז הם קצרי חיים, נויטרופילים יש להשתמש תוך 2-4 שעות של האוסף. ההליך מורכב דם על כל שכבות המדיום צפיפות שיפוע, צנטריפוגה, הפרדה של שכבת נויטרופ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
מימון NIH R01 HL56621.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| Lymphocyte Poly(R) | ריאגנט | Cedarlane Labs | ניתן להשתמש ב-PolymorphprepTM כחלופה | |
| הנק’תמיסת מלחים מאוזנת ללא סידן כלורי | ריאגנט | Invitrogen | ||
| אלבומין מסרום אנושי | ריאגנט | ZLB Bioplasma | ||
| בופר לליזיס של תאי דם אדומים | ריאגנט | קבוצת Roche | ||
| צנטריפוגה | כלי | |||
| מערבל וורטקס (Vortexer) | כלי | |||
| פיפטות פסטור ונבובית שאיבה | כלי | |||
| PolymorphprepTM | ריאגנט | Axis-Shield | ריאגנט חלופי ל-Lymphocyte-Poly (R) | |
| מסנן מזרק | אחר | EMD Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μמ', PVDF, 33 מ"מ, ניתן לסטריליזציה בקרני גמא |
| הנק (Hank)’תמיסת מלחים מאזנת עם סידן כלוריד | ריאגנט | Invitrogen |
מקורות
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
