בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

סיכום

סרט הווידאו הזה מראה כיצד מיקרו לנתח את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור מעוברים ולהשתמש cytometry זרימה למיין בתאי גזע hematopoietic.

תקציר

בעובר העכבר, hematopoiesis מוקדם מתרחש בו זמנית באיברים רבים, הכוללת את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור. אזורים אלה הם מכריעים בהקמת מערכת הדם העוברים מוביל התנועה בסופו של דבר לתאי גזע לתוך הכבד העוברי ולאחר מכן פיתוח בתאי גזע בוגרים ב bonemarrow. מוקדם בתאי גזע hematopoietic יכול להיות מבודד איברים אלה באמצעות microdissection העובר ואחריו מיון תזרים cytometric להשיג האוכלוסייה טהור יותר. עדיין לא ברור כיצד אוכלוסיות אלה תא גזע לתרום הבריכה עוברית בתאי גזע בוגרים. כמו כן, חוקר במעבדה שלנו איך בתאי גזע מוקדם תפקודית שונה העובר מבוגר בתאי גזע hematopoietic. יתר על כן, מיני במעבדה שלנו אוכלוסיות שונות של בתאי גזע hematopoietic ולבדוק תפקיד פונקציונלי שלהם בהקשר של מגוון רחב של מודלים גנטיים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ההליך מיקרו לנתיחה שאנחנו בדרך כלל להשתמש גם מראים את התוצאות של plotfter FACS טיפוסי בידוד אוכלוסיות אלה נדירים, ניתן לבצע מגוון של מבחני תפקודי כולל: מבחני המושבה השתלת מח עצם.

פרוטוקול

Dissection ובידוד מוקדם של בתאי גזע hematopoietic מ Murine שק החלמון ואת אבי העורקים באזור, בלוטת המין, כלית בינים

1. לפני שמתחילים, חשוב לקבל את כל ריאגנטים הכלים הדרושים ההליך:
   
   • מספרים
   • מלקחיים, בגודל 4 ו כירורגית כיתה כפוף שקצהו מלקחיים, גודל 5 / 45 (אופציונלי)
   • 30 מד מחטים עם מזרק
   • צלחות פטרי 35mm ו 100mm
   • PBS עם 10% ו 20% בסרום שור העובר
   • ולבסוף, collagenase
2. כדי להתחיל את הנתיחה, אנחנו צריכים לקצור את קרני הרחם מתוך נקבה בהריון תפיסה ימים 10.5 פוסט.
3. בעלי חיים מומתים על פי הנהלים שאושרו. אנו משתמשים פחמן דו חמצני מחנק, ואחריו נקע בצוואר הרחם.
4. הבטן של הנקבה רטוב עם אתנול את העור נפתח עם מספריים.
5. מחזיק את העור עם מלקחיים, חתכים נוספים מבוצעים כדי לפתוח את הצפק.
6. הבטן היא פתחה את צופרי הרחם ניתן דמיינו. בעזרת מלקחיים להחזיק בקרנות הרחם, לחתוך כל סוף דיסטלי למרכז כדי הבלו הן קרניים.
7. קרניים הרחם ממוקמות אז בצלחת פטרי המכילות קר PBS עם 10% FBS להסיר רקמות הרחם.
8. בעזרת מלקחיים 4 גודל ועבודה תחת מיקרוסקופ, בעדינות להסיר את רקמת רירית הרחם מרחבי conceptus כל העובר, נזהרים שלא לנקב את השליה.
9. הוסר לאחר, עוברים ממוקמים צלחת מתוקים עם קר PBS ו -10% FBS.
10. הסר בזהירות את רקמת השליה לחשוף העובר עטוף שק החלמון באמצעות מלקחיים לחתוך את העובר, עטוף שק החלמון מן השליה בצומת שלהם. שק חלמון המכיל העורקים vitelline, וחלק של חבל הטבור, ניתן התגרו בעדינות מן העובר ומניחים בצד על קרח דיסוציאציה.
11. העובר הוא עבר צלחת פטרי קטנה עם רמות מינימלי של PBS עם FBS 10% - בדיוק מספיק כדי להרטיב את העובר אבל לא יותר מדי. רמות אופטימליות לשמור על העובר נייח בעוד צלחת הוא נסער לאט, תוך שמירה על העובר בבטחה במקום במהלך לנתיחה.
12. החלף ל 30 מחטים מד, אשר משמשים כדי להסיר את החלק העליון והתחתון של העובר על ידי חיתוך forelimbs מעל ומתחת hindlimbs. היכרות עם שימוש במחטים ככלי חיתוך עשוי לקחת חלק באימון. שיטת באמצעות חתכים קטנים חוזרות ונשנות של המעבר מחטים יהיה לנתח את הרקמה, עם המחט מוחזק ביד הדומיננטית לפעול כמדריך חיתוך המחט אשר מוחזק ביד הלא דומיננטית.
13. הסר את החלק הגבי של העובר. זוהי רקמה המכילה את somites. בעדינות לחתוך את הרקמה הגבי ביותר תוך שמירה על מרחק מספיק מן האאורטה (קו אדום) כדי למנוע כל ניקס. חיתוך אבי העורקים היה לגרום לאובדן דם וחוסר היכולת לחזות בקלות את מיקומו. שוב, ביצוע חתכים קטנים עם המחטים היא חיונית לשמירה על מיקום חיתוך מדויק.
14. דחוף את הרקמה הנוספת הרחק מחוץ לתצוגה ולהפוך את העובר סביב לחתוך את רקמת הגחון, שוב קיצוץ קרוב האאורטה ככל האפשר מבלי knicking זה. הקיצוץ עשוי רחוק מדי מהמיקום האופטימלי תביא רקמות הבטן להיות נוכח, אשר ניתן להסירו לאחר AGM מבודד.
15. מקם את העובר עם הצד הגבי שלה למטה או גבו נגד הצלחת. בעדינות ללכסן את העובר לפתוח על ידי לחיצה על הצדדים למטה לדמיין את מיקומו של רכסי האשכים. אלה ממוקמים מעט מחוץ למרכז כמו צינור מבנים דמויי צידיו של האאורטה.
16. השלם את לנתיחה על ידי הסרת רקמות בצד עודף שימוש בטכניקות חיתוך כמו קודם. לאחר רקמה בצד של העובר מוסר, אז העובר מתהפך כדי להסיר את הרקמה בצד הנותרים.
17. בשלב זה, AGM הוא נבדק על רקמות עודף כי ניתן להסיר בקלות עם מחטים ללא פגיעה באבי העורקים או בלוטות המין. כמו הסרת עודפי כמה תוצאות אפשריות בידוד טוב יותר של האוכלוסייה בתאי גזע מאז אנחנו סומכים רק על פני השטח כמה סמנים תא לטיהור.
18. השימוש כפוף שקצהו מלקחיים, בעדינות לגרוף את כל AGM ומקום בקור PBS עם FBS 10% עד מוכן דיסוציאציה.

דיסוציאציה ו FACS ניתוח

1. כדי לנתק את רקמות, מלכתחילה שקי חלמון ו AGMs צינורות נפרדים.
2. ספין בקצרה לרקמות גלולה ולסלק PBS עם 10% FBS.
3. Resuspend רקמות collagenase 0.25% ב-PBS עם FBS 20%, עם נפח מספיק כדי לכסות כראוי ברקמות.
4. דגירה הרקמות ב 37 מעלות. 25-30mins עבור AGMs ו 35-40mins עבור שקי חלמון.
5. בסוף הדגירה, בעדינות פיפטה הרקמות מעלה ומטה כדי ניתוק השעיות לתוך תא בודד.
6. שוטפים את הרקמות עם עודף PBS wi10% ה FBS, גלולה את התאים resuspend ב PBS סטרילי טרי עם 10% FBS.
7. לניתוח FACS, התאים הם מוכתמים על פי המלצות היצרן. אנו משתמשים FACSAria מ BD Biosciences לבצע cytometry הזרימה. בשל גודלו ואת שבריריותם של תאים עובריים, הצמצם מיון מותאם עבור בקוטר גדול יותר של תאים hematopoietic מבוגרים, אשר אנו גם מחקר במעבדה. כמו כן, הלחץ הוא מותאם להיות פחות מאשר את התנאים הנדרשים על ידי תאים hematopoietic מבוגר. לדוגמה, מיון על FACSAria, גודל נחיר יהיה 100 מיקרון והלחץ סוג יהיה 30 psi.
8. עבור ניתוחים בתאי גזע, תאים חיובי משולש המבטא את cKit סמנים, CD34, CD41 ו מבודדות מיון של שק החלמון ושקופיות כפול (cKit, CD34) מבודדים מן AGM באמצעות FACS. עלילה טיפוסית תיראה כך: תאים חיובי cKit מנותחים עבור CD34 ו CD41 בו זמנית או בנפרד. בדרך כלל תאים להציג הדרגתיות של חיוביות עבור הסמן כל עם האוכלוסייה בתאי גזע כפי שנמצאו משנה של האוכלוסיות חיובית. חלקות אלו מראים לנו כי השגנו תשואה טובה עם תא 100-300 תאים לכל שק החלמון ואת לכל AGM.