בסרטון הזה, אנו מראים כיצד תווית בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) מנגן עם כלוריד (MnCl 2) אשר יכול להיכנס לתאים באמצעות מתח מגודרת ערוצי סידן כאשר התאים הם פעילים ביולוגית. בנוסף, אנו מציגים את השימוש MnCl 2 כסוכן הסלולר לעומת MRI כדי לקבוע את הכדאיות במבחנה של hESC.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ב סימון במבחנה של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור דימות תהודה מגנטית
במאמר זה
סיכום
תקציר
בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הדגימו את היכולת לשקם את שריר הלב הפגוע. דימות תהודה מגנטית (MRI) התפתחה כאחד שיטות הדמיה משתלט על מנת להעריך את שיקום שריר הלב הפגוע. יתר על כן, לשעבר vivo סוכנים תיוג, כגון תחמוצת ברזל חלקיקים, להיות מועסק לעקוב בתרגום בתאי גזע המושתלים. עם זאת, שיטה זו אינה לפקח על נכס מהותי ביולוגיה תאית לגבי הכדאיות של התאים המושתלים. זה כבר ידוע כי כלוריד ומגנזיום (MnCl 2) נכנס לתאים באמצעות סידן מתח מגודרת (Ca 2 +) תעלות כאשר התאים הם פעילים ביולוגית, ומצטברים intracellularly לייצר T 1 אפקט התקצרות. לכן, אנו ממליצים מנגן מונחה MRI יכול להיות שימושי כדי לפקח על כדאיות התא לאחר ההשתלה של hESC לתוך שריר הלב.
בסרטון הזה, אנו מראים כיצד תווית hESC עם MnCl 2 ואיך תאים אלה ניתן לראות בבירור באמצעות MRI במבחנה. במקביל, הפעילות הביולוגית של Ca 2 + ערוצים תהיה מווסתת ניצול הן Ca 2 + ערוץ אגוניסט אנטגוניסט וגם כדי להעריך את השינויים אותות במקביל.
פרוטוקול
תיוג מנגן של בתאי גזע עובריים אנושיים
- Trypsinize נובעת עובריים אנושיים אשר היו בתרבית מזין ללא תנאי למשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת אמצעי התקשורת והתרבות.
- ספין את התאים על ידי centrifuging בסל"ד 800 במשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מחדש השעיית תא גלולה, לספור את מספר התאים על ידי מכתים trypan כחול. בהתבסס על ספירת התאים המתקבלים, לחלק את התאים לארבע aliquots של 3 מיליון תאים לתוך צינורות חרוטי. גלולה התאים שוב על ידי צנטריפוגה.
- בדיוק לפני תחילת תיוג מנגן, מנגן כלורי מתמוססים טרי עם פתרון 0.9% נתרן כלוריד לעשות פתרון 0.1mm כלוריד ומגנזיום.
- על מנת לצפות בערוץ פעילות סידן, ארבע דגימות היו מוכנים. הדוגמה הראשונה היא השליטה שלנו המכיל תאים מודגרות ב 0.9% נתרן כלוריד לבד. המדגם השני מכיל תאים מודגרות מ"מ 0.1 MnCl 2. לדוגמה 3 ו 4 מכילים תאים מודגרות ב 0.1 מ"מ MnCl עם 2 או 5 מיקרומטר של Ca 2 + ערוץ אגוניסט, (ים )-(-)- מפרץ K8644, או 250 מיקרומטר של Ca 2, ערוץ + אנטגוניסט verapamil. דגירה ארבע דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 30 דקות.
- לאחר 30 דקות, לסובב את התאים ב 800 סל"ד במשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. ואז לשאוב supernatant לשטוף את התאים שכותרתו פעמיים עם PBS. לאחר כביסה, מחדש להשעות כל גלולה עם 200 PBS μL ולהעביר לתוך צינורות PCR. כדורי אלה הם בדרך כלל לבן.
הברזל תיוג של בתאי גזע עובריים אנושיים
- מערבבים קליני כיתה סולפט protamine עם מים מזוקקים כדי לקבל 1 מ"ג / מ"ל פתרון המניות.
- בתוך שפופרת המכילה אדם בתאי גזע עובריים מדיה, תרבות, להוסיף ferumoxides על 100 מיקרוגרם / מ"ל ואחריו תוספת של 12 מיקרוגרם / סולפט protamine מ"ל. מערבבים את הפתרון נמרצות במשך חמש דקות.
- הוסף פתרון מעורב לסכום השווה של התקשורת בתרבות התא כדי להשיג ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל של ferumoxides ו 6 מיקרוגרם / מ"ל של סולפט protamine לתאי התווית. דגירה תאים בפתרון זה למשך 12 שעות.
- לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, עם לשטוף האחרון המכילה הפרין 10U/ml לפזר את מורכבות תאי ferumoxides-protamine סולפט. לאחר כביסה, trypsinize תאים כדי לקבל השעיה תא בודד.
- ספירת התאים aliquot למספר הנדרש של דגימות. לאחר כביסה, מחדש להשעות כל גלולה עם 200 PBS μL ולהעביר לתוך צינורות PCR. כדורי אלה צריכים להיות כתום כהה בצבע חום.
ביצוע תהודה מגנטית נייד
- הפוך רפאים כדי לייצב את צינורות המכילים את כדורי תא וגם כדי למנוע חפצים מהאוויר שמסביב במהלך סריקה. כדי לעשות זאת, תערובת של אגר 0.8% ו -1% של נחושת גופרתית במים מזוקקים ולהביא לרתיחה על ידי במיקרוגל במשך 5-7 דקות. מצננים את התערובת למשך שעה לפחות לפני 1 של סריקה להשיג ג'ל.
- צינורות המכילים את כדורי תא שכותרתו ממוקמים הפנטום לסריקה. במבחנה הסלולר MRI מבוצעת Signa HDX 3T MRI (GE Medical Systems) באמצעות סליל הברך קליניים.
- סרוק את התאים שכותרתו מנגן על כל אחד משלושת הדגימות באמצעות הד ספין רצף: TR: זמן החזרה = 800 msec. TE; זמן אקו = מינימום, FOV, שדה הראיה = 12 x 12 ס"מ; מטריצה = 256x256, NEX 1.
- סרוק את התאים ברזל שכותרתו באמצעות רצף הדרגתי-echo. אנו משתמשים בפרמטרים הבאים עבור הדמיה זו: TR = 100 msec; TE = 10 msec, FA, זווית להעיף = 30 °; FOV = 12 x 12 ס"מ; מטריצה = 256 x 256, NEX 1.
ניתוח תוצאות ה-MRI
- ניתוח תמונות של MRI בסריקה מתוך 4 מדגמים שונים של תאים מנגן שכותרתו:
- דוגמה מס '1 היא השליטה שלנו המכיל תאים מודגרות ב 0.9% נתרן כלוריד לבד.
- דוגמה מס '2 מכיל תאים מודגרות מ"מ 0.1 MnCl 2.
- לדוגמא # 3 מכיל תאים מודגרות ב 0.1 מ"מ MnCl 2 עם 5 מיקרומטר של Ca 2 + ערוץ אגוניסט, (ים )-(-)- מפרץ K8644.
- לדוגמא # 4 מכיל תאים מודגרות ב 0.1 מ"מ MnCl 2 עם 250 מיקרומטר של Ca 2, ערוץ + אנטגוניסט verapamil.
- כצפוי, ההבדלים בעוצמות אות מתאי שכותרתו מנגן גלויים. בהשוואה לתאי שכותרתו טהורה עם מנגן, את עוצמת האות בצורה ברורה עליות בנוכחות אגוניסט ערוץ הסידן פוחתת בנוכחות של אנטגוניסט תעלות סידן. האזור שבו עוצמת האות גדלה עבור תאים שכותרתו מנגן נמדדים באמצעות תמונה J (NIH, Bethesda, MD, ארצות הברית). התוכנה אותה משמש לניתוח שטח של האות מחוץ תהודה כהה מתאי שכותרתו ברזל. גודל האות האפל של ברזל שכותרתו התאים תלוי במספר התאים או את מספר חלקיקי ברזל הכיל ידי התאים. במקרה זה, 1,000,000 תאים מראה שטח קטן יותר של האות האפל לעומת האות מ 3,000,000 תאים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תוצאות אלו מצביעות כי אינו מנגן להיכנס דרך ערוץ מתח מגודרת סידן, מנגן יכול לשמש חומר ניגוד MRI, אשר יכול גם להציג את כדאיות התא. לכן, אנו ממליצים מנגן מונחה MRI יכול להיות שימושי כדי לפקח על כדאיות התא לאחר ההשתלה של בתאי גזע עובריים אנושיים לתוך שריר הלב.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| מנגנז כלוריד טטרהידרט | ריאגנט | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| (S)-(-)-Bay K8644 | ריאגנט | Sigma-Aldrich | B133 | |
| (+)-Verapamil hydrochloride, תיטור מינימלי 99.0% | ריאגנט | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| נתרן כלוריד 0.85-0.90% W/V | ריאגנט | VWR international | VW 3257-1 | |
| Feridex I.V. | ריאגנט | Berlex Laboratories | NDC 59338-7035-5 | תמיסת ferumoxides להזרקה 11.2mg ברזל/mL |
| פרוטמין סולפט | ריאגנט | American Pharmaceutical Partners | NDC 63323-229-05 | 50 mg (10 mg/mL) |
| Knockout SR (תחליף סרום לתאי ES) | ריאגנט | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | |
| DMEM/F12 (1:1) | ריאגנט | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | |
| 2- mercapt–thanol 98+% | ריאגנט | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | ריאגנט | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| פניצילין-סטרפטומייצין 10,000 units/ml | ריאגנט | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM חומצות אמינו לא חיוניות, תמיסה 100x | ריאגנט | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Signa HDx 3T MRI | כלי | GE Healthcare | ||
| סליל ברך קליני | כלי | GE Healthcare | ||
| DPBS | ריאגנט | GIBCO, by Life Technologies | 14190 |
מקורות
- Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts. Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).
- Aoki, I., et al. Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride. NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Arbab, A. S., Frank, J. A. Cellular MRI and its role in stem cell therapy. Regen Med. 3, 199-215 (2008).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
