לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

סיכום

כאן אנו מתארים נהלים לחקר שינויים בביטוי גנים phagocytosis המושרה עם גישה בלוציפראז מבוסס כתב הגן באמצעות מערכת כפולה GloTM Assay בלוציפראז מ Promega.

תקציר

כדי לחקור את התיאום של מסלולים שונים סינתזה השומנים במהלך biogenesis קרום כדאי לעבוד עם מערכת ניסיונית שבה biogenesis הממברנה מתרחשת במהירות ובאופן ועין מתנהלת. מצאנו כי phagocytosis חרוזים לטקס היא מעשית למטרות אלה כמו תאים במהירות לסנתז שומנים קרום לחדש בריכות קרום לאיבוד כמו גלישת החומר במהלך היבלעות החלקיקים. כאן אנו מתארים נהלים לחקר שינויים בביטוי גנים phagocytosis המושרה עם גישה בלוציפראז מבוסס כתב הגן באמצעות מערכת Dual-Glo Assay בלוציפראז מ Promega.

פרוטוקול

תא תרבות

1. תרבויות במלאי של כליה עובריים אנושיים 293 (HEK293) התאים גדלים 10 ס"מ מנות התרבות "בינוני", המורכב בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת קוקטייל של אנטיביוטיקה (100 יחידות מ"ל של פניצילין 100 מיקרוגרם לכל מ"ל של סולפט סטרפטומיצין) ו -10% העובר בסרום שור (FBS).
2. כדי להגדיר את התאים לניסוי, המדיום הוא נשאב משם, התאים נשטפים פעמיים עם 5 מ"ל של בופר פוספט תמיסת מלח (PBS).
3. PBS מוסר אז והוחלפו 0.6 מ"ל של פתרון המכיל טריפסין 0.25%.
4. המנה מודגרות ב 37 ˚ C עבור 2 דקות בערך עד שהתאים החלו לנתק.
5. 5.5 מ"ל של מדיום נוסף על מנת לנטרל את טריפסין והתאים נספרים עם hemocytometer.
6. תאים הם מדולל ל 320,000 תאים לכל מ"ל ו לוותר על 0.1 מ"ל לכל גם לתוך צלחת polylysine מצופה-96 גם תרבות.
7. מניחים את תבשיל לתוך תרבות רקמות החממה ב 37 ˚ C עם אווירה המכיל CO2 8.8% ולגדול במשך 24 שעות.

Transfections

1. בהכנות transfections, זה צריך להיחשב כמה משכפל הם להתבצע לפי תנאי הניסוי ומה הסכומים של הפלסמיד יהיה transfected. אנו שגרתי לבצע את כל התנאים בשלושה עותקים transfect סך של ng 50-100 של ה-DNA פלסמיד לכל טוב. תערובות פלסמיד צריכה לכלול לפחות עיתונאי לבנות להביע גחלילית בלוציפראז ולשלוט פלסמיד המבטא Renilla בלוציפראז מן מקדם מכוננת.
2. פתרונות פלסמיד הם pipetted לתוך 1.5-מ"ל צינורות microcentrifuge שיושלם עם μl 10 לדגימה של DMEM סרום נטול אנטיביוטיקה בחינם. לדוגמה, אם 20 בארות הם כל להיות transfected עם DNA 50 מיקרוגרם, להוסיף 200 DMEM μl ל-DNA 1 מיקרוגרם.
3. כדי פתרון DMEM / הדנ"א להוסיף 3 μl '293 Transit מגיב "(Mirus) לכל DNA מיקרוגרם. מערבבים על ידי pipetting למעלה & למטה ולתת דגימות לעמוד בטמפרטורת החדר למשך לפחות 10 דקות.
4. במהלך תקופה זו, הסר את המדיה מהצלחת-96 גם תרבות ולהחליף μl 90 א בינוני טרי
5. כדי להוסיף גם כל 10 μl של התערובת 293 DMEM / DNA / המעבר.
6. מניחים את תבשיל לתוך תרבות רקמות החממה ב 37 ˚ C עם אווירה המכיל CO2 8.8% ולגדול במשך 24 שעות.

Phagocytosis

1. הכן השעיות המכיל B בינוני (תערובת של 01:01 DMEM ו F12 של חם בינוני פלוס אנטיביוטיקה FBS 10%) בתוספת 0.75-מיקרומטר חרוזים לטקס בבית מ"ג אפס 1 לכל מ"ל.
2. הסר את המדיה מהצלחת-96 גם בתרבות להחליף עם 0.1 מ"ל של המתלים חרוז ב בינוני
3. ספין את הצלחת 2 דקות ב 1000 x ז
4. התאים בתרבית אז 37 ˚ C במשך 6 עד 16 שעות. בהתאם לתנאי לבין האמרגן להשתמש בכונן בלוציפראז, ביטוי מוגבר גן הכתב ניתן להבחין לאחר 1-3 שעות.
5. במקרים אותו זה עשוי להיות נחוץ כדי לדגור התאים עם חרוזים למשך 30 דקות עד 60, ואז לעשות 2 שוטף עם PBS להסיר חרוזים מאוגדים, ולהוסיף התקשורת טרי לפני דוגרים התאים לתקופות נוספות של זמן.

Dual-GloTM בלוציפראז Assay

1. הערה: פרוטוקול שלנו באמצעות ערכת שונה במובנים מסוימים מזה המומלץ על ידי היצרן. זה כבר שונה כדי להפחית את כמות ריאגנטים הנדרש לדגימה.
2. הכן תמיסה של 1 M DTT, מתחלקים aliquots קטנים מרובים חנות ב -20 ˚ C.
3. הכן חיץ תמוגה המכיל 20 מ"מ טריס-HCl (pH 7.8), 10% (v / v) גליצרול, ו -0.5% (v / v) טריטון X-100. לפני השימוש, aliquot הסכום הדרוש לצורך הניסוי ולהוסיף 1 מ"ל לכל μl של 1 M DTT פלוס מעכבי פרוטאז קוקטייל לריכוז סופי של 0.5 ל 1x. אין לעשות שימוש חוזר פתרון DTT שאריות.
4. בעת השימוש בערכה כפולה GloTM בפעם הראשונה, להכין את מגיב (גחלילית) בלוציפראז ידי העברת כל תכולת הבקבוק אחד הצפת Dual-GloTM בלוציפראז (מסופק עם הערכה) על בקבוק אחד של המצע Dual-GloTM בלוציפראז (בתנאי עם הערכה). מחלקים את מגיב בלוציפראז בשימוש לתוך 10 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 ˚ C.
5. הסר את צלחת 96-היטב את התרבות רקמות חממה ולמקם אותו על הקרח. הסר את התקשורת על ידי שאיפה, הוסף 40 μl לכל היטב חיץ תמוגה ולאחר מכן לעזוב את הצלחת על קרח למשך 30 דקות.
6. ב לבן, אטום 96-היטב צלחת (OptiplateTM-96, פרקין אלמר מספר קטלוג 6005290) aliquot 15 μl לכל מגיב היטב בלוציפראז, ולאחר מכן להוסיף 15 μl של lysate התא.
7. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולאחר מכן קרא את הארה בקורא microplate.
8. מיד לפני השימוש, להכין כמות מתאימה של תמיסת המצע Renilla בלוציפראז ידי הוספת 1 חלק Dual-GloTM Stop & Glo ®; מגיב (מסופק עם הערכה) עד 100 חלקים Dual-GloTM Stop & Glo ® חוצץ (מסופק עם הערכה).
9. כדי להוסיף גם כל 15 μl של פתרון טוב לכל המצע Renilla בלוציפראז, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולאחר מכן למדוד את הארה שוב.