זהו מדריך כדי לשנות את הצורה של micropipettes זכוכית. באופן ספציפי, באמצעות חום ולחץ אוויר להתחדד הוא התרחב מבלי להגדיל את פתיחת קצה, המוביל פיפטה התנגדות נמוכה יותר. זה קריטי כדי להשיג הקלטות רעש נמוך של תאים קטנים אך שימושית ביישומים רבים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים
במאמר זה
סיכום
תקציר
לחץ לליטוש היא שיטה לעיצוב pipettes זכוכית הקלטה תיקון-clamp. אנחנו הראשונים שפותחו בשיטה זו בודה pipettes מתאים הקלטה מ (<3 מ '), גופים קטנים תאים עצביים. מנהל בסיסי דומה ניפוח זכוכית, והוא משלב לחץ אוויר וחום לשנות את הצורה של pipettes תיקון שהוכן על ידי חולץ micropipette קונבנציונאלי. זה יכול להיות מיושם רך שנקרא (סודה לימון) וקשה (בורוסיליקט) משקפיים. ככלל, ליטוש הלחץ יכול להפחית התנגדות פיפטה של 25% ללא ירידה בקוטר של פתיחת קצה (גודמן Lockery, 2000). זה יכול להיות מיושם כמעט כל סוג של זכוכית דורש רק תוספת של שסתום לחץ גבוה ו הולם microforge. טכניקה זו היא חיונית עבור הקלטת מתאי ultrasmall (<5 מ ') יכול גם לשפר את ההקלטה יחיד הערוץ על ידי צמצום התנגדות פיפטה. הצורה הבוטה שימושית גם עבור הקלטה מחורר, מהדק מאז תיקון זה צורה תוצאות הטיפ בועה קרום יותר עבור ניקוב.
פרוטוקול
משיכת pipettes
בעזרת חוט כזה חולץ כמו סאטר P-97 Flaming פולר microelectrode / בראון, למשוך קבוצה של כ 10-20 pipettes.
- בחר זכוכית שלך. אנו משתמשים בורוסיליקט (BF150-86-10, OD = 1.5 מ"מ, ID = 0.86 מ"מ). אחסן את הכוס בזהירות כך הוא נשאר נקי אבק חינם.
- תוכנית עיצוב מושך. המטרה העיקרית היא קצה הפתיחה בערך בגודל הרצוי, אשר יהיה תלוי ביישום. P-97 של סאטר Cookbook פיפטה 2 היא הפניה מצוינת.
- שימו לב pipettes שלך תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע בקוטר הפתיחה החלקות. בטל מחוספס, טיפים אחידה, או לא סדיר. להקלטת תיקון תקן מלחציים, פתח טיפ כי הוא 2-4 מיקרומטר לרוחב היא הטובה ביותר. טיפ בוטה מוביל התנגדות נמוכה יותר עבור קוטר הפתיחה זהה, אשר העדיפה. הצורה והגודל ניתן לשנות במהלך ליטוש, להלן.
ליטוש לחץ pipettes
- צרף בעל פיפטה אל קו נקי, אוויר דחוס. באמצעות הרגולטור, להגדיר את קו אוויר דחוס בלחץ ~ 40 PSI. חבר את קו אוויר דחוס שסתום 4-way שליטה שתאפשר את הלחץ בעל פיפטה להיות מופעלת לסירוגין. חבר בעל פיפטה אל שסתום הבקרה עם אורך של ⅛ ב Tygon ® צינורות.
- השתמש במתקן ליטוש (microforge) עם בעל בלחץ גבוה פיפטה, סליל ליטוש נשלט על ידי דוושת רגל, מיקרוסקופ המצויד בהגדלה נמוכה גבוהה, זמן עבודה מרחוק (באופן אידיאלי, 10x ו 100x) האוויר מטרות. זה קריטי כדי להיות מסוגל לראות את פתיחת פיפטה במהלך הפרוטוקול.
- אופציונלי: מעיל עם פיפטה מבודדת הידרופובי להקטין קיבוליות ולשפר את המאפיינים רעש (ראה "pipettes משיכת" עבור בטכניקה זו).
- בדוק את שסתום הלחץ נמצא במצב כבוי. מניחים טפטפת לתוך מחזיק פיפטה והדק את הולם האצבע חזק.
הערה בטיחות: אם פיפטה מוחזק בחוזקה לתוך מחזיק פיפטה, את לחץ האוויר תגרום פיפטה להיות נפלט מבעל פיפטה. - מניחים את פיפטה ומחזיק ב microforge. מיקום פיפטה בעל לבמה מיקרוסקופ כך הן קצה ואת סליל ליטוש גלויים בהספק (10x) נמוך microforge. תביאו את קצה ~ 75 מיקרון מן החוט. זכור כי החוט תרחיב כאשר מחומם.
- מעבר אל המטרה גבוה כוח (100x). גם את קצה פיפטה ואת סליל ליטוש צריך להיות בפוקוס בתחום התצוגה. אם לא, להתאים את גובה של הסליל ליטוש. (עמדת פיפטה לא יכול להיות מותאמים). קצה פיפטה ו סליל ליטוש צריכה להיות קרובה צדי בתחום התצוגה. הימנע מיצוב סליל קרוב מדי לקצה פיפטה כי תרחיב כפי מחממת ולהיתקל פיפטה שלך.
- סובבו את שסתום להפנות אוויר דחוס לתוך פיפטה, והחום קצה פיפטה עד להתחדד מאחורי קצה מתחיל בלון החוצה.
- עצור חימום לפני קצה בלונים גם בהרחבה. ניסויים נדרשת כדי לקבוע את המרחק חום מתאים, וזמן עבור הצורה הרצויה.
- אופציונלי: הקטנת קוטר הפתח טיפ על ידי ליטוש קצה בהעדר לחץ. שלבים 7 ו -8 ניתן חזר כדי לכוונן גם את הצורה ואת הממדים של קצה פיפטה.
- כבה את הלחץ תוך הצבעה על קצה פיפטה בכיוון בטוח, להסיר את פיפטה ולמקם אותו בתוך קופסת האחסון נקי איפה זה יהיה מוגן מפני אבק.
הערה בטיחות: אם לחץ האוויר לא מבוטלת, פיפטה יכול להפלט מבעל פיפטה במהלך ההסרה.
הערות על microforge
אנו משתמשים microforge התאספו מעל המדף, חלקים זמינים מסחרית. (ניתן גם לקנות ערכת הלחץ ליטוש של מספר חברות, כגון: ALA המדע, GlassWorx). ללא קשר microforge, חיוני לקיים אופטיקה כי הם טובים מספיק כדי לראות את פתיחת קצה, אשר לעיתים קרובות רק כמה מיקרומטר קוטר. אנו משתמשים בעדשה ארוכת עובד מרחק 100x למטרה זו. כמו כן, המעיל סליל ליטוש עם כוס גבוהה נמס בטמפרטורה כדי למזער את הפקדת מתכת מתאדה על pipettes.
חלק 3: התוצאות החזויות
ליטוש לחץ מתונה יכולה להפחית את עמידות של טפטפת ללא שינוי ניכר בפתיחת קוטר. אם תרצה, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להפוך pipettes עם תת מיקרון פתחים התנגדויות בין 5-10MΩ.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנחנו במקור פיתחו שיטה להפוך pipettes שימושי הקלטה תיקון-clamp 2-3 מיקרומטר נוירונים ב C. elegans 1. זה נמצא בשימוש שגרתי במעבדה גודמן. אנחנו בלחץ פולנית pipettes לא רק הקלטה מ ג זעיר נוירונים elegans, אלא גם לקבלת macropatch חד ערוצים הקלטות של תעלות יונים לידי ביטוי ביציות Xenopus. עבור בקוטר טיפ הפתיחה נתון, את הצורה הבוטה מייצרת פיפטה נמוך התנגדות. התנגדות פיפטה התחתון מוביל התנגדות סדרה נמוך יותר רעש הקלטות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
הטכניקה הלחץ ליטוש פותחה בשיתוף פעולה עם Lockery SR.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| קפילריות זכוכית | חומר מתכלה | Sutter Instrument Co. | BF150-85-10 (או דומה) | השיטה עובדת עם כל סוג של קפילריה למעט כאלו העשויות קוורץ. עם זאת, אנו ממליצים להשתמש בקפילריות בעלות פילמנט. |
| מיקרוסקופ הפוך | מיקרוסקופ | Leica Microsystems | DM IL (או דומה) | כל מיקרוסקופ הפוך פשוט יספיק. עם זאת, חיוני שתהיה הגדלה מספקת כדי לראות את הפפטים במהלך הליטוש. למטרה זו אנו משתמשים בעדשה מטלורגית של 100x עם מרחק עבודה ארוך. |
| ערכת Microforge | כלי | ALA Science | CPM-2 | מספקת סליל ליטוש, בקר ודוושה. |
| מקור לחץ אוויר | כלי | ALA Science | PR-60 | אביזר לאספקת לחץ גבוה, כולל שסתום מתאים. לחלופין, ניתן להשתמש באוויר דחוס מהבניין יחד עם פילטר/רגולטור (המכוון ל-40 PSI) ושסתום 4 דרכים (ראו להלן). |
| שסתום 4 דרכים | כלי | Cole-Parmer | A-98150-01 | יידרשו מחברים לחיבור השסתום לצינורית. |
| מחזיק פפטה עם מחבר Luer | כלי | World Precision Instruments, Inc. | MPH-6S20 | השתמש במחבר Luer-to-barb זכר כדי לחבר את מחזיק הפפטה לצינורית בלחץ גבוה. |
| צינורית Tygon® | כלי | Cole-Parmer | 06408-62 | השתמש בצינורית זו כדי לחבר את מחזיק הפפטה לשסתום 4 הדרכים. |
מקורות
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. . J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).
- Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
