$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
תגובת שרשרת פולימראז, או PCR, היא טכניקה ביולוגית בסיסית המיושמת באופן נרחב לאיתור וזיהוי מיקרואורגניזמים הקיימים באדמה, מים ודגימות סביבתיות אחרות.
באופן קלאסי, מיקרואורגניזמים מתורבתים במעבדות באמצעות אמצעי גידול מיוחדים. עם זאת, מיקרובים רבים בסביבה הטבעית הם "לא ניתנים לתרבית" - או בגלל שיש להם פעילות מטבולית נמוכה מאוד או קצב גדילה נמוכים מאוד, או בגלל שיש להם דרישות גדילה מחמירות מאוד שאולי לא ניתן לשכפל בצלחת תרבית. ההבדלים ביכולת התרבות בין מיקרובים פירושם גם שכאשר מיקרואורגניזמים מדגימה סביבתית מתורבתים, השפע היחסי שלהם בתרבית עשוי שלא לשקף את הרמות האמיתיות שלהם בסביבה.
הופעתו של PCR, שיכול להגביר באופן ספציפי אפילו כמויות קטנות של DNA הקיימות בדגימה מעורבת, מאפשרת לזהות ולזהות במהירות חיידקים ספציפיים מעניינים, אפילו כאלה שאינם ניתנים לתרבית, בתוך המבחר המורכב של אורגניזמים הקיימים בדגימה סביבתית.
סרטון זה יציג את עקרונות ה-PCR. לאחר מכן הוא ידון בפרוטוקול כללי לביצוע PCR על DNA שבודד מדגימה סביבתית על מנת לזהות נוכחות של אורגניזם מעניין. לבסוף, ייבחנו מספר יישומים של זיהוי חיידקים מבוסס PCR.
הנחת היסוד של PCR היא להשתמש במחזורים חוזרים ונשנים של שינויי טמפרטורה עוקבים כדי להשיג הגברה אקספוננציאלית של DNA, בדרך כלל עם מכונה המכונה תרמו-סייקלר כדי לעבור אוטומטית בין הטמפרטורות השונות. סינתזת ה- DNA מתבצעת על ידי אנזימי DNA פולימראז המתקבלים מחיידקים החיים במעיינות חמים, כגון Thermus aquaticus או "Taq". פולימראזים אלה יציבים בחום, ומאפשרים להם לעמוד בטמפרטורות הגבוהות המשמשות במהלך PCR.
רצף המטרה, המכונה אמפליקון, מוגבר מתבנית ה-DNA באמצעות שתי רצועות קצרות של נוקלאוטידים הידועים בשם "פריימרים". בגלל הספציפיות הגבוהה של קשירת חומצות גרעין משלימות, הפריימרים מאפשרים הגברה ממוקדת של רצפים ספציפיים מאוד מעניינים. על ידי תכנון פריימרים שרק יגבירו רצף ייחודי, או שילוב ייחודי של רצפים, מאורגניזם מעניין, ניתן להשתמש ב-PCR כדי לזהות באופן דיפרנציאלי את נוכחות ה-DNA של אותו אורגניזם בין כל החומרים הגנטיים הקיימים בדגימה סביבתית מורכבת.
כל מחזור PCR מחולק לשלושה שלבים. הראשון, המכונה "דנטורציה", מוגדר בדרך כלל מעל 92 ? C ונמשך כ -30 שניות. דנטורציה משמשת לפירוק מולקולות DNA לגדילים בודדים, כדי לאפשר לתגובת ההגברה להתקדם.
השלב השני, "חישול", מוגדר 2 עד 3? C מתחת לטמפרטורת ההיתוך הנמוכה של שני הפריימרים, בדרך כלל בין 50 ל-65? C, וגם נמשך כ -30 שניות. טמפרטורת התכה היא הטמפרטורה שבה 50% ממולקולות ה-DNA הדו-גדיליות נפרדו לגדילים בודדים, וכך שלב החישול מאפשר לפריימרים להיקשר לאתרי היעד שלהם בתבנית ה-DNA.
השלב השלישי של מחזור PCR הוא "התארכות" או "הארכה", כאשר ה-DNA פולימראז נקשר לדופלקס תבנית הפריימר ומזרז סינתזה של הגדילים החדשים. נקבע על 72 ? C עבור פולימראז PCR הנפוץ ביותר, Taq, משך שלב זה תלוי באורך המגבר, בדרך כלל 30 שניות לכל 500 זוגות בסיסים. לאחר כל מחזור, ה-DNA המוגבר עובר שוב דנטורציה ומשמש כתבנית חדשה, מה שמוביל לעלייה אקספוננציאלית בכמות מוצרי ה-PCR.
לאחר השלמת התגובה, ניתן לפתור את תוצרי ה-PCR לפי גודל על "ג'ל" העשוי בדרך כלל מפולימר אגרוז, תהליך המכונה אלקטרופורזה. שדה חשמלי מופעל על פני הג'ל, והמטענים השליליים בעמוד השדרה של מולקולות ה-DNA גורמים להן לנדוד לעבר הקצה החיובי של השדה. באופן כללי, למולקולות DNA ליניאריות גדולות יותר ייקח זמן רב יותר לעבור דרך מטריצת הג'ל.
כעת, לאחר שהבנתם כיצד PCR עובד, בואו נסתכל כיצד ניתן להשתמש בתגובה לזיהוי מיקרואורגניזמים בדגימה סביבתית.
כדי להתחיל, חשב את הנפח של כל מגיב הדרוש על סמך מספר הדגימות שיש לעבד, בתוספת 10% נוספים כדי לקחת בחשבון שגיאות פיפטינג. יש לכלול תבנית בקרה חיובית - המכילה את אזור היעד - כדי להבטיח שהתגובה עובדת; כמו גם בקרה שלילית שבה לא כלולה תבנית DNA, על מנת לשלול זיהום בכל אחד ממרכיבי התגובה. שמור את האנזים Taq פולימראז על קרח, והפשיר את שאר הריאגנטים ודגימות ה-DNA בטמפרטורת החדר במכסה זרימה למינרי ייעודי כדי למנוע זיהום.
לאחר שכל הריאגנטים הופשרו, היוו את "תערובת המאסטר" של המגיב על ידי הוספת הנפח המחושב של כל מגיב לתוך צינור מיקרופוגה בעל קשירה נמוכה, מה שממזער פערים בכמויות הריאגנטים עקב ספיחה של מולקולות למשטח הצינור. מערבולת וצנטריפוגה בעדינות כל מגיב לפני ההוספה. לאחר הכנת תערובת המאסטר, מערבולת לערבב ולאסוף על ידי צנטריפוגה.
סמן רצועת PCR בעלת 8 צינורות כדי לייעד צינור אחד לכל דגימה, כולל הפקדים. יש להוציא את הכמות המתאימה של תערובת מאסטר PCR לכל צינור של הרצועה. לאחר מכן, הוסף כל דגימת DNA לצינור המתאים.
הנח את מכסה הרצועה היטב על צינור הרצועה, וצנטריפוגה לזמן קצר במיני צנטריפוגה עם מתאם רצועה. לאחר מכן, הכנס את הצינור לתוך התרמו-סייקלר והפעל את התגובה בהתאם לתוכנית ה-PCR המתאימה.
בזמן הפעלת ה-PCR, הכינו ג'ל אגרוז לאלקטרופורזה של מוצרי ה-PCR. שקלו כמות מתאימה של אבקת אגרוז לג'ל בריכוז שיכול לפתור את מוצרי ה-PCR על סמך הגדלים הצפויים שלהם. מוסיפים את האגרוז לבקבוק של 125 מ"ל, ואז מוסיפים את הנפח המתאים של מאגר ג'ל לתוך הבקבוק, בהתבסס על נפח יציקת הג'ל, ומערבבים לערבוב. מיקרוגל את תמיסת האגרוז בעוצמה גבוהה למשך דקה. בסיום, ודא שהאגרוז התמוסס לחלוטין על ידי סיבוב הבקבוק, וחזור על המיקרוגל במרווחים של 30 שניות במידת הצורך.
מהדקים היטב את המכסה על הבקבוק, ומצננים את תמיסת האגרוז ל -50? C על ידי סיבוב הבקבוק מתחת למים קרים זורמים. לאחר שהתקרר, הוסף 1 ? L של אתידיום ברומיד לאגרוז. מכיוון שאתידיום ברומיד עלול להיות מסרטן, הקפידו ללבוש ציוד מגן אישי כגון משקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות עמידות לאתידיום ברומיד.
יוצקים את תמיסת האגרוז למגש יציקת ג'ל אלקטרופורזה, ומוודאים שלא נלכדות בועות אוויר בתוך האגרוז. הניחו מסרק עם מספר הבארות הנדרש לתמיסה. השאירו את הג'ל בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות להתמצקות. לאחר התייצבות הג'ל, הסר בזהירות את המסרק, הקפד לא לקרוע את הג'ל בתהליך.
הנח את הג'ל המוצק בתא האלקטרופורזה. הוסף מאגר LB לתא עד שהג'ל פשוט שקוע. על פיסת Parafilm, פיפטה "נקודה" של סולם DNA בטווח מתאים לגודל הצפוי של מוצרי ה-PCR. אחזר את צינורות ה-PCR עם התגובות שהושלמו מהתרמו-סייקלר אוספים עיבוי בצינורות ה-PCR על ידי צנטריפוגה קצרה, ומוסיפים 8 ? L של כל דגימה על הפרפילם. הוסף 2 ? L של 10x טעינת צבע לכל נקודה של תוצר PCR, כך שהריכוז הסופי של הצבע הוא פי 2.
טען את הדגימות והסולם לבארות המיועדות בג'ל האגרוז, היזהר לא לחטט דרך הג'ל. לאחר השלמת הטעינה, הניחו את המכסה לתא האלקטרופורזה, וחברו את האלקטרודות לאספקת החשמל. מכיוון שה-DNA טעון שלילית ונודד לכיוון האלקטרודה החיובית, ודא שהבארות נמצאות בצד הקרוב יותר לאלקטרודה השלילית. הפעל את ספק הכוח והגדר אותו למתח המתאים לגודל תא האלקטרופורזה ולמערכת החיץ שבה נעשה שימוש. הגדר את האלקטרופורזה ל"הפעלה". בועות קטנות הנעות במעלה צידי החדר ייצפו אם האלקטרופורזה מתקדמת כראוי.
לאחר שחזית הצבע התקדמה מספיק במורד הג'ל, כבה את אספקת החשמל. העבירו בזהירות את הג'ל להדמיית ג'ל כדי לדמיין את המוצרים האלקטרופוריזים. בעזרת מגן מגן, הפעל את אור ה-UV ודמיין את רצועות ה-DNA על הג'ל. נתח את מיקום הרצועות כדי לראות אם הוא תואם את הדפוס הצפוי המעיד על נוכחות המינים המעניינים בדגימה הסביבתית.
כעת, לאחר שראיתם כיצד מבוצע PCR, בואו נסתכל על דרכים שונות בהן הוא מיושם לאיתור מיקרואורגניזמים מעניינים בסביבה.
אחד השימושים בזיהוי מיקרוביאלי סביבתי מבוסס PCR הוא זיהוי אורגניזמים גורמי מחלות כמו "אמבה אוכלת מוח" Naegleria fowleri, אורגניזם חד-תאי המצוי בגופי מים מתוקים ובבריכות ללא כלור שיכול לתקוף את מערכת העצבים האנושית, לעתים קרובות קטלנית. ניתן לבדוק את נוכחותו של חיידק קטלני זה בדגימות מים או בנוזל המוח של חולים חשודים על ידי ביצוע PCR באמצעות פריימרים המכוונים לרצפי DNA ייחודיים בגנום האמבה.
יישום נוסף לזיהוי מיקרוביאלי מבוסס PCR הוא בדיקת נוכחות חיידקים פתוגניים בזבובים שנתפסו בקרבת מפעלי מזון, כחלק מניטור בריאות הציבור וחקירות התפרצויות מחלות.
כאן, החוקרים חיפשו את נוכחותם של חיידקים פתוגניים כמו סלמונלה וליסטריה, על ידי בידוד חיידקים הן מפני השטח של הגוף והן מתעלת העיכול של זבובים, ולאחר מכן שימוש בתנאי גידול ספציפיים למין כדי להעשיר את המינים המעניינים האלה. לאחר חילוץ DNA מכל חיידק שתורבת, נעשה שימוש בערכות PCR לזיהוי ספציפי למין כדי לבדוק את זהותם.
לבסוף, ניתן לזהות ולהבדיל זנים שונים של חיידקים פתוגניים עמידים לאנטיביוטיקה כגון Staphylococcus aureus, המהווים חששות גדולים לבריאות הציבור, באמצעות PCR.
בדוגמה זו, החוקרים בודדו ותרבו S. aureus מדגימות קליניות, ואז חילצו DNA ממושבות החיידקים וביצעו PCR. תגובות ההגברה כאן היו "מרובבות", כלומר ערכות פריימר מרובות המכוונות לאזורים ייחודיים שונים בגנום החיידקי שולבו לאותה תגובה. ערכות פריימר בודדות תוכננו כך שתוצרי PCR נובעים מ-DNA של זנים מסוימים בלבד אך לא של אחרים, כך שבשילוב נצפו דפוסי פס מוצרים ייחודיים לכל זן.
זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על זיהוי מיקרואורגניזמים מבוססי PCR. בדקנו את העקרונות מאחורי תגובת שרשרת פולימראז; פרוטוקול לביצוע PCR על DNA המופק ממיקרואורגניזמים סביבתיים; ולבסוף, מספר יישומים ספציפיים של טכניקה זו לבדיקת אורגניזמים מעניינים בסוגים שונים של דגימות סביבתיות או קליניות. תודה שצפית!
