Why is PCR better than culturing for detecting microorganisms in environmental samples?

PCR can detect non-culturable microorganisms that have low metabolic activity or stringent growth requirements impossible to replicate in labs. Unlike culturing, which may not reflect actual environmental abundance, PCR amplifies even small amounts of DNA from mixed samples, enabling rapid identification of specific microbes regardless of their viability or culturability status.

What are the three temperature phases in a PCR cycle and what happens at each?

Denaturation above 92°C breaks DNA into single strands. Annealing at 50-65°C allows primers to bind target sites on the template. Extension at 72°C enables Taq polymerase to synthesize new DNA strands. After each cycle, the amplified DNA serves as new template, causing exponential product increase.

How do primers enable specific detection of target organisms in PCR?

Primers are short nucleotide sequences designed to bind only to unique DNA sequences of the organism of interest. Their high specificity for complementary nucleic acid binding allows targeted amplification of specific sequences from complex environmental samples. By designing primers for unique or combination sequences, PCR differentially detects target organism DNA among all genetic material present.

What is the role of gel electrophoresis in PCR-based microorganism detection?

Gel electrophoresis resolves PCR products by size using an agarose gel matrix. An electric field causes negatively charged DNA molecules to migrate toward the positive electrode, with larger linear DNA traveling slower through the gel. Band positions are analyzed to confirm whether the expected amplicon size matches the target organism, indicating its presence in the environmental sample.

How can multiplexed PCR differentiate between bacterial strains?

Multiplexed PCR combines multiple primer sets targeting different unique genome regions in a single reaction. Individual primer sets are designed to produce products from only specific strains. Unique band patterns result from each strain, allowing researchers to differentiate antibiotic-resistant bacterial strains like Staphylococcus aureus and identify which strains are present in clinical or environmental samples.

What controls should be included when performing PCR on environmental samples?

Include a positive control template containing the target DNA region to verify the reaction works properly. Include a negative control with no DNA template to rule out contamination in reaction components. These controls ensure reliable results and help identify potential issues with reagents or technique during PCR amplification of environmental DNA.

What practical applications does PCR have for detecting pathogens in environmental and clinical settings?

PCR detects disease-causing organisms like Naegleria fowleri in water samples and cerebrospinal fluid. It identifies pathogenic bacteria such as Salmonella and Listeria in flies near food establishments for public health monitoring. PCR also identifies antibiotic-resistant strains in clinical samples, supporting outbreak investigations and disease surveillance across environmental and clinical contexts.

זיהוי מיקרואורגניזמים סביבתיים עם תגובת שרשרת פולימראז ואלקטרופורזה ג'ל

0 צפיות13:34 דק׳

1. איסוף דוגמאות

לאסוף אדמה באמצעות אוגר או את חפירה עד לעומק נחוש. אם אוספים אדמה מהקרניזון (האזור הצר של האדמה המקיפה ומושפעת משורשי הצמח והמיקרואורגניזמים הקשורים אליהן), אוספים ישירות מסביב לשורשים הצמחיים רק על ידי פגיעה בקרקע לחבית איסוף.
לאסוף דגימת מים על ידי טבילת בקבוק פלסטיק סטרילי לתוך המים תוך החזקת הקצה של מקל הטבילה.

2. מיצוי והכנה של חומצות גרעין

לאסוף אורגניזמים ווירוסים מהדגימה, ולחלץ דנ"א ורנ"א מהם. לפרטים, אנא עיינו בסרטון החינוך המדעי JoVE על מיצוי חומצת גרעין קהילתית.
אחסן את הדנ"א שחולץ בצינורות מיקרופוגה מסומנים. אם ה- DNA צריך להיות מאוחסן בלילה או לתקופות זמן ארוכות יותר, להקפיא אותו ב -20 °C (70 °F), ולהפשיר את הצינורות בטמפרטורת החדר כאשר מוכן לשימוש.
אם החומר הגנטי שיש להתבצע הוא RNA (בין אם זה הגנום של וירוסי RNA, או ה- RNA המתומלל של אורגניזמים תאיים), בצע שעתוק הפוך (RT) על המדגם כדי ליצור DNA משלים (cDNA) לפני שתמשיך ל- PCR. לפרטים, אנא עיינו בסרטון החינוך המדעי של JoVE ב- RT-PCR.

3. תגובת שרשרת פולימראז

מניחים את האנזים PCR(למשל, טאק פולימראז) על קרח ומפשירים את ריאגנטים אחרים (חיץ PCR, dNTPs, פריימרים) בתוך מכסה המנוע "נקי" המיועד בטמפרטורת החדר. האנזים מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס אך לעולם אינו קופא. הוא רגיש לטמפרטורה, ולכן יש לשמור על קור רוח ועל חשיפתו לטמפרטורת הסביבה ממוזערת
חשב את הנפח של כל ריאגנט הדרוש כדי ליצור "תערובת ראשית" של כל הריאגנטים הקבועים בין כל התגובות (טבלה 1). הקפד להסביר פקדים חיוביים(לדוגמה,תבנית הידועה כמכילה את אזור היעד) ושלילי(לדוגמה,ללא תבנית) בחישובים. הוסף 10% נוספים לאמצעי האחסון הסופי כדי להסביר שגיאת צנרת. כרכים פריימר תלויים בדיקות עבור אורגניזמים ספציפיים; עיין בספרות שפורסמה עבור הערכים המתאימים.
באמצעות צינור מיקרו-קשירה נמוך, הממזער את ההידבקות של מולקולות ריאגנט לקירות הפלסטיק, מוסיפים את הנפחים המחושבים של כל ריאגנט כדי להרכיב את תערובת האב. מערבולת בעדינות וצנטריפוגות כל ריאגנט לפני הוספת. לאחר תערובת המאסטר מוכן, מערבולת לערבב ולאסוף על ידי צנטריפוגה
הכן רצועות PCR 8-tube. ייעד צינור לכל דגימה, כולל פקדים חיוביים ושליליים
מחלקים את הנפח המתאים של תערובת PCR לכל שפופרת של הרצועה
הוסף את הנפח המתאים של תבנית DNA מן הדגימות, כמו גם 5 μL של התבנית החיובית ו 5 μL של מים כיתה מולקולרית כמו שליטה שלילית, לתוך צינורות PCR בהתאמה.
מניחים את המכסה בבטחה על רצועת 8 הצינורות וצנטריפוגה למשך מספר שניות באמצעות מיני צנטריפוגה
מניחים את רצועת 8 הצינורות בתרמוסקלר
הגדר את תוכנית ה- PCR המתאימה לפעול על התרמו-מחזור. תוכנית טיפוסית מורכבת מהפעולות הבאות
1. דנטורציה ב 94 °C (55 °F) במשך 3 דקות.
2. 30-40 מחזורים של הגברה: denaturation ב 94 °C (30 °F) עבור 30 s, חישול בטמפרטורה ספציפית פריימר (בדרך כלל בין 50-60 °C (50 °F) עבור 30 °C (30 °F), והרחבה ב 72 °C (72 °F) עבור 30 ° C / 500 bp.
3. הארכה סופית ב 72 °C (7-10 דקות).

4. הכנת ג'ל אגרוז

בהתבסס על נפח הג'ל הרצוי וריכוז הג'ל (טבלה 2), לשקול את הכמות המתאימה של אבקת אגרוז לתוך בקבוק ארלנמאייר 125 מ"ל.
מוסיפים את הנפח המתאים של מאגר ג'ל לבקבוקון, ומערבבים את הבקבוק ביד.
מחממים את תערובת האגרוז במיקרוגל בעוצמה גבוהה במשך דקה אחת.
מוציאים את הבקבוקון מהמיקרוגל ומערבבים ביד כדי לוודא שכל האגרוז נמס. אם האגרוז לא נמס לחלוטין, מיקרוגל חוזר במרווחים של 30-s.
לאחר אבטחה הדוקה של המכסה על הבקבוקון, לקרר אותו ל 50 °C (50 °F) על ידי סיבוב תחת מים קרים זורמים.
הוסף 1 μL של אתידיום ברומיד (EtBr) לתערובת אגרוז באמצעות מיקרופיפט המיועד EtBr. EtBr הוא צבע הקושר חומצות גרעין כפולות נטושות פלואורסים כתומים כאשר הוא מואר באור UV. שים לב כי EtBr הוא פוטנציאל מסרטן, כך ציוד מגן אישי (משקפי מגן, חלוק מעבדה, כפפות עמידות EtBr) חייב להיות משוחק.
יוצקים את הג'ל המותך לתוך מגש יציקה של ג'ל אלקטרופורזה. ודא כי אין בועות לכודות בתוך agarose. מניחים מסרק לתוך הג'ל ומהדקים בבטחה. המתן כ 20-30 דקות עד שהג'ל יתמצה.
לאחר הג'ל התגבש, להסיר את המסרק בזהירות מבלי לגרום לדמעות בג'ל. המסרק יוצר בארות בג'ל לטעינת הדגימות.

5. אלקטרופורזה ג'ל

מניחים את ג'ל אגרוז מוצק לתוך תא אלקטרופורזה.
מוסיפים את מאגר הריצה המתאים לתא עד שהג'ל בקושי שקוע.
על חתיכת Parafilm, כתמי פיפטה של תרכיז צבע טעינה. כלול גם סולם DNA של מגוון מתאים לגדלים הצפויים של מוצרי PCR. לחלופין, השתמש קבוצה חדשה של צינורות microfuge, אחד עבור כל מדגם.
לאחר ה- PCR, יש לאחזר את רצועת 8 הצינורות מהתרמוסקלר, ובקצרה צנטריפוגה כדי לאסוף עיבויים. הוסיפו נפח מתאים של מוצר DNA לצבע הטעינה והפפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. לדוגמה, 2 μL של צבע טעינה 10x מעורבב עם 8 μL של מדגם כדי לתת נפח סופי של 10 μL, עם הצבע ב 1x.
פיפטה כל תערובת דגימת צבע לתוך בארות המיועדות בג'ל אגרוז, נזהר לא לנקב את בארות.
חבר את האלקטרודות לתא האלקטרופורזה. הדנ"א טעון לרעה, כך שהוא "רץ" לעבר האלקטרודה החיובית. לכן, לחבר את האלקטרודה החיובית לצד הנגדי של התא, שם בארות היו טעונות. הגדר את ספק הכוח למתח המתאים למערכת החיץ ולגודל תא הג'ל, והגדר אותו לפעול. בועות קטנות צריכות להיות גלויות נעות במעלה צידי התא אם האלקטרופורזה מתקדמת כראוי.
ברגע שחזית הצבע התקדמה מספיק במורד הג'ל, כבה את אספקת החשמל. בזהירות להעביר את הג'ל לתוך transilluminator או הדמיה חזותית ולהדליק את אור UV כדי לדמיין את רצועות ה- DNA על הג'ל.
לנתח את גודל הרצועה ואת המיקום על הג'ל. השווה את מיקומי הרצועה של הדגימות לשליטה החיובית כדי לקבוע אם DNA מהאורגניזם מעניין נמצא במדגם (איור 1).

רכיב	נפח לכל צינור (μL)	נפח עבור 5 צינורות (μL)	ריכוז סופי
10x חוצץ אקס טאק	5.0	25	1x
2.5 מ"מ של dNTPs	4.0	20	0.2 מ"מ
פריימר קדמי*	2.0	10	400 ננומטר
פריימר הפוך*	2.0	10	400 ננומטר
מולקולרית H₂O	31.75	158.75	-
אקס טאק	0.25	1.25	2.5 U
תערובת PCR	45	225

טבלה 1. אמצעי אחסון ריאגנט עבור תערובת מאסטר PCR. *נפחי הפריימר משתנים בהתאם לאי-ההסתעפות של האורגניזם. התאם את נפח המים המולקולריים כדי להפוך את הנפח הסופי 45 μL. אמצעי אחסון של רכיבים אחרים אינם אמורים להשתנות.

% מומלץ של אגרוז	רזולוציה אופטימלית עבור שברי DNA ליניאריים (זוגות בסיס)
0.5	1,000-30,000
0.7	800-12,000
1.0	500-10,000
1.2	400-7,000
1.5	200-3,000
2.0	50-2,00