ניתוח של הרולינג E-selectin בתיווך פיזיולוגי ליקוציט על כלי הדם האנדותל
February 11th, 2009
דוח זה מספק תיאור ויזואלי של ניתוח מקבילות צלחת קאמרית תזרים לחקר אינטראקציות אנדותל ליקוציט תחת לחץ גזירה פיזיולוגי. שיטה זו שימושית במיוחד עבור חוקרים את התפקיד של E-selectin ligands האנדותל (E) ו-selectin ליקוציט כי ליקוציט ההדק מתגלגל על משטחים תא האנדותל.
סרטון זה מדגים ניתוח תא זרימת צלחת מקביל לבחינת הגורמים המעוררים גלגול לויקוציטים על משטחי תאי אנדותל. חד-שכבות של תאי אנדותל מגורים עם הציטוקין הפרו-דלקתי IL one beta כדי לווסת את ביטוי S selectin. לאחר מכן ממוקם תא זרימת הצלחת המקביל מעל תאי האנדותל ולויקוציטים חיוביים של S סלקטין מוזרקים מעל השכבה החד-שכבתית.
האינטראקציות התאיות בתא מועברות אפוא במתח מוחלט הדומה לזה של הידבקות לויקוציטים פוסט-נימיים. אירועים מתגלגלים נלכדים ונספרים באמצעות רכיבי NIS ובדיקה לעצמאות E בחירה. היי, אני ג'ורג' וייס במעבדה של ד"ר צ'ארלס דה ניטרו במחלקה לדרמטולוגיה בבית החולים לנשים בריגמן, בית הספר לרפואה של הרווארד.
היום נראה לך נוהל לניתוח תפקידם של e selectin, E selectin ligands בהידבקות של לויקוציטים אנושיים לתאי אנדותל מח עצם אנושיים בתנאי זרימת דם פיזיולוגיים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את תפקידן של מולקולות פני התא היוזמות הידבקות של תאי דם לבנים או תאי סרטן גרורתיים לתאי אנדותל, המרפדים את פני השטח הפנימיים של כלי הדם. אירוע הדבקה זה מאופיין בהתנהגות גלגול כמו כדור באולינג המתגלגל במורד מסלול.
אז בואו נתחיל. השלב הראשון בהליך זה הוא הכנת תאי האנדותל שירפדו את תא הזרימה. פרוטוקול זה משתמש בתאי H-B-M-E-C 60 שמקורם במח עצם אנושי.
יש לצבוע מראש כלי תרבית מיקרו-וסקולטוריים בפיברונקטין כדי להכין כלי תרבית רקמה של 35 מיליליטר עם PBS המכילים 20 מיקרוגרם למיל פיברונקטין. ניתן לדגור אותם למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או במשך שלוש שעות ב-37 מעלות צלזיוס. השעו 60 תאי H-B-M-E-C במדיום 1 99 וזרעו ב-10 עד 5 תאים למנה, הגדילו את התרביות למעל 90% מפגש.
זה ייקח כיומיים לווסת את הבחירה והביטוי, לשאוב את מצע הגידול ולהוסיף מדיום טרי עם 50 ננוגרם למיל IL, דגירה אחת של בטא למשך ארבע עד שש שעות. חד-שכבות תאים מוכנות כעת לבדיקת תא הזרימה. ניתן לגרות צלחות נוספות של תאי H-B-M-E-C 60 עם IL one beta ולטפל בנוגדנים מנטרלים אנטי-אנושיים e סלקטין ב-20 מיקרוגרם למיל למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס.
זה ישלוט על הביטוי הפונקציונלי של e selectin. לאחר מכן, הכן את הלויקוציטים החיוביים e selectin. אלה הם KG אחד, תאי אב המטופויאטיים אנושיים.
אלה גדלים בתרחיף למפגש או נוטים לששת התאים למיל ב-RPMI 1640. ניתן להוציא את תאי ה-KG One A ישירות מהתרבית ולספור אותם על ציטומטר המו. Resus משהה את התאים ב-10 עד שישה תאים למיליל ב-HBSS עם 10 מילי-מולרי hep או מאגר HH המכיל שני מילי-מולרי סידן כלורי.
אחסן את התאים על קרח עד לבדיקה. השלבים הבאים כוללים הכנת המיקרוסקופ, תא זרימת הצלחת המקביל ומשאבת המזרק. לצורך הבדיקה, הפעל את המיקרוסקופ ואת משאבת המזרק.
בחר את המטרה פי 10 במיקרוסקופ. הנח צינור חרוטי של 50 מיליליטר במחזיק ומלא אותו במאגר HH עם שני סידן כלורי מילי-מולרי. לאחר מכן הנח חמש מבחנות פלסטיק של מיליליטר במחזיק למטה.
לאחר מכן, הכניסו מזרק של 60 מיליליטר למשאבת המזרק. ודא שגם הבוכנה וגם גוף המזרק מאובטחים. חבר זין עצירה תלת-כיווני לקצה המזרק של 60 מיל ולאחר מכן מזרק של חמישה מיל לזין העצירה התלת-כיווני.
הנח את מנגנון תא הזרימה המקביל על המיקרוסקופ stage עם צינור הקלט בצינור הפלט הימני משמאל וצינור הוואקום מאחור. לאחר חיבור הצינור לוואקום, פתח את שסתום האוויר כדי לאפשר למנגנון הצלחת המקבילה להיצמד לבמה. זה יבדוק אם חצאית הוואקום בתא הזרימה אטומה.
כאשר האיטום מאושר, כבה את שסתום האוויר. כעת חבר את קו צינור הפלט לזין העצירה התלת-כיווני שכבר מחובר למזרק. המנגנון מוכן כעת להצבה מעל תאי H-B-M-E-C 60.
הפעל את הוואקום, הורד בעדינות את מנגנון תא הזרימה על הצלחת ואפשר למנגנון לשאוב כלפי מטה. לא אמורים להישמע קולות של בריחת אוויר ובשלב זה ייתכן שתצטרך להפעיל לחץ על התא כדי לדחוס את אטם הגומי. לאחר הקמת הוואקום, הנח את צינור הכניסה לתוך הצינור החרוטי של 50 מיליליטר.
פתח את זין העצירה התלת-כיווני למזרק של 60 מיל והנח את המשאבה במצב משאבה כדי להוציא אוויר מהקווים מבלי להרים את התאים בצלחת. השתמש במשאבת המזרק המוגדרת על שני מיל לדקה כדי למלא את צינור היניקה. ואז הגדר במהירות ל 0.5 מיל לדקה.
רגע לפני שהנוזל מגיע למנגנון, חשוב לקדם את ההתקנה בזהירות ולהימנע מבועות אוויר, שירימו את החד-שכבתי מהצלחת. ברגע שהנוזל עובר למזרק של 60 מיל, תא הזרימה ומשאבת המזרק מוכנים. כעת, אבטח את הזרימה בתא לבמה עם פיסת סרט מעל כל אחד מקווי הכניסה, הפלט והוואקום.
זה מבטיח ששדה הראייה יישאר קבוע בעת הדמיה ואיסוף הנתונים. תא הזרימה מוכן כעת לשימוש. יש לחזור על שלבים אלה עבור כל הפעלת קלט תא ועבור כל צלחת חדשה.
כדי ללכוד אירועי גלגול באתר לוקאס, פתח את רכיבי NIS בשולחן העבודה, לחץ על סמל ההפעלה לתמונה חיה. חשיפה אוטומטית תאפשר לך לראות את הצלחת ולמקד את התמונה. ודא שהמיקרוסקופ ממוקד כראוי בחד-שכבת התא על ידי התאמת המיקוד באופן ידני במיקרוסקופ.
לאחר שהתמונה ממוקדת, אפס את החשיפה לפריים אחד לשנייה והתאם את האור במיקרוסקופ. התמונה אמורה להופיע במחשב ולא אמורה להיות גלויה יותר במיקרוסקופ. לאחר מכן ניתן לכוונן את היסטוגרמה של האור כדי להסיר את חשיפת הרקע או כדי לשפר את בהירות התא, לחץ על סל שניים על שניים או סל חי כדי לקבל תמונה אידיאלית לצילום סרטים.
לחץ על מאקרו בשורת התפריטים ובחר ימינה ליציאה, בחר יציאה שלוש ופתח. זה פותח את היציאה לתיאום עם משאבת המזרק. תא הזרימה מוכן כעת להחדרה עם פיפטה של תאי KG אחד A מיל אחד של מתלה KG אחד A S לתוך מבחנה של חמישה מיל ליד קו צינור הכניסה.
לאחר מכן הנח את קו הקלט בתחתית המבחנה. עבור לשורת התפריטים ולחץ על לכידה ורכישת זמן-lapse. בחר את הפרוטוקול שנמשך 210 שניות.
זהו אורך התוכנית לגלגול על תאי H-B-M-E-C 60. כל שלב מתוכנת לצלם תמונה בכל שנייה למשך פרוטוקול המשאבה. הוא מוגדר גם לשלוח פקודה דרך יציאת התקשורת שלוש כדי להפעיל את המשאבה.
הגדר את משאבת המזרק למצב תכנות, המאפשר תכנות ידני של קצבי זרימה ספציפיים. זה יקבע את רמות המתח המוחלטות בתוך החדר ויכתיב אינטראקציות של תאי KG אחד A על פני תאי H-B-M-E-C 60. ההגדרות עבור אינטראקציות אלה הן 4.2 סעודות לסנטימטר בריבוע למשך 45 שניות.
נקודה שלוש סועדת בסנטימטר בריבוע למשך 60 שניות והתרחקות עולה כל 15 שניות למקסימום של 4.2 סנטימטרים לסנטימטר בריבוע. המיקרוסקופ והמחשב מוכנים כעת לצלם צילום דולג זמן. לחץ על התחל הפעלה במחשב כדי להתחיל לאסוף נתונים תוך כדי הפעלת התוכנית.
הקפד להוסיף מדיה לצינור המכיל תאי KG אחד A על מנת לשמור על צינור פלט הקלט מלא במדיום וכדי למנוע כניסת בועות אוויר למערכת. אם הזמן מופרע, המשאבה לא תיעצר מעצמה ויש לאפס אותה. לחץ על ביטול כדי לחזור לתמונה החיה.
חד-שכבת תאי אנדותל לא מגורה משמשת כבקרה שלילית לניסוי זה. לשם כך יש להחדיר לויקוציטים KG 1 A לתוך תא הזרימה מעל תאי H-B-M-E-C 60 לא מטופלים כדי לשלוט בעצמאות הבחירה, לעורר את שכבת המונו של תאי האנדותל עם IL אחד בטא ולהחדיר את הלויקוציטים על תאים אלה כדי לשלוט עוד יותר על עצמאות eect. טפל בתאי H-B-M-E-C 60 עם IL בטא אחד ולאחר מכן עם נוגדן סלקטין S אנטי אנושי.
לאחר מכן נתח אירועי גלגול לויקוציטים על תאים אלה. גלגול תאים נקבע לא רק על ידי S סלקטין, אלא גם על ידי שאריות חומצה פרוסה על פני תא הלויקוציטים. כדי להראות זאת, עכל את תאי ה-KG 1 A עם 0.1 יחידות למיל נויראמינידאז למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן נתח את האירועים המתגלגלים על פני תאי H-B-M-E-C 60 מגורים. גליקופרוטאינים על פני הלויקוציטים חשובים גם לגלגול תאים. ניתן להדגים זאת על ידי טיפול בתאי KG 1 A עם 0.2 יחידות לנתיב מיל ברומה למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן החדרתם לתא הזרימה.
לאחר רכישת רצף הזמן, הנתונים מוכנים לניתוח. שמור את הנתונים ועבור ללשונית המדידה בשורת התפריטים ובחר סף מוגדר. הזז את הסורגים כך שהתאים הרצויים יהיו צבועים באדום, בחר את כל התמונות ואז בסדר, כעת יש לשנות את כל רצף ה-Time-lapse עם תאים מתגלגלים אדומים גלויים.
עבור אל מדידה ובחר הגבלות. פעולה זו מאפשרת למשתמש לא לכלול אובייקטי סף שאינם מייצגים תאים מתגלגלים. אלה הם בעיקר רקע שנוצר על ידי אזור הבחירה החד-שכבתי H-B-M-E-C 60 וערכי מינימום ומקסימום קלט, שהם אידיאליים עבור הלויקוציטים המתגלגלים.
חזור על שלב זה עבור התארכות ומעגליות בחר מידה ולאחר מכן בחר צור הגבלות בינאריות באמצעות הגבלות. אותם ערכי הגבלה, שנקבעו בשלב הקודם, ישמשו כעת לאופטימיזציה של תוכנת רכיבי NIS לזיהוי לויקוציטים מתגלגלים על חד-שכבת תא האנדותל. חזור למדידה, בחר נתוני שדה ולאחר מכן בחר איפוס נתונים.
סגור את התפריט, חזור למדוד ובחר שדה סריקה, פתח נתוני שדה מדידה ובחר מספר או אובייקטים. לאחר מכן בחר את כל השדות וייצא את הנתונים ל- Microsoft Excel. לבסוף, בחר נקה נתונים.
רכיבי NIS מוכנים כעת לאיסוף נתונים נוספים. נתונים מייצגים אלה מראים כיצד אינטראקציות של תאי אנדותל לויקוציטים מגיבות למתח פיזיולוגי מוחלט, ובודקים במיוחד את תפקידו של ליגנד הדבק. E selectin.
גלגול לויקוציטים חזק מתרחש כאשר תאי אנדותל מגורים מראש עם IL one beta. כאשר משווים תוצאה זו לבקרה הלא מגורה, ברור שגלגול תאים תלוי בגירוי ציטוקינים. על ידי טיפול בתאי H-B-M-E-C 60 עם IL one beta ולאחר מכן עם נוגדן סלקטין E אנטי-אנושי, מתברר שגלגול התאים תלוי ספציפית ב-e selectin.
ניתן להשתמש בבדיקה זו גם לבדיקת פרמטרים אחרים. לדוגמה, כאשר מטפלים בתאים מגורים עם Sase או עם ברולין, התוצאות פחות חזקות. נתונים אלה מדגישים את החשיבות של שאריות חומצה פרוסה סופית כמו גם גליקופרוטאינים על פני התא.
עבור פעילות ליגנד S selectin, זה עתה הראינו לך כיצד לנתח אינטראקציות דבק מבוססות e סלקטין בין לויקוציטים לתאי אנדותל בתנאים המחקים כוחות הקיימים בווריד פוסט-נימי, האזור של מערכת הדם שבו לויקוציטים עוזבים את הדם ונכנסים לרקמות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בנוגדנים החוסמים המתאימים או בבקרת הטיפול האנזימטי כדי לאמת את נחיצותו של הסלקטין המתאים והליגנד שלו במערכת בדיקה זו. אז זהו.
תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה
דו"ח זה מספק תיאור חזותי של ניתוח תא זרימה של לוחות מקבילים לחקר אינטראקציות בין לויקוציטים לאנדותל תחת לחץ גזירה פיזיולוגי. שיטה זו מועילה במיוחד לחקר תפקיד הסלקטין האנדותלי (E) וליגנדי הסלקטין E של לויקוציטים הגורמים לגלגול לויקוציטים על משטחי תאים אנדותליים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- אימונולוגיה
רקע
- גלגול לויקוציטים הוא שלב קריטי בתגובה החיסונית.
- תאים אנדותליים ממלאים תפקיד מרכזי בתיווך הדבקת לויקוציטים.
- הבנת אינטראקציות אלו יכולה לספק תובנות לגבי מחלות דלקתיות.
- תאי זרימה של לוחות מקבילים מדמים תנאים פיזיולוגיים לחקר תהליכים אלו.
מטרת המחקר
- לנתח את תפקיד הסלקטין E בהדבקת לויקוציטים.
- לחקור את האינטראקציות בין לויקוציטים לתאים אנדותליים תחת לחץ גזירה.
- לספק פרוטוקול מפורט לביצוע בדיקות תאי זרימה של לוחות מקבילים.
שיטות ששימשו
- הכנת מונו-שכבות של תאי אנדותל באמצעות תאי H-B-M-E-C 60.
- גירוי של תאים עם IL-1 beta להעלאת ביטוי הסלקטין E.
- החדרת לויקוציטים חיוביים לסלקטין E לתא הזרימה.
- לכידה וספירה של אירועי גלגול באמצעות תוכנת הדמיה.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של גלגול לויקוציטים על תאים אנדותליים.
- הדגמה של השפעת הסלקטין E על הדבקת לויקוציטים.
- ביסוס שיטה אמינה לחקר אינטראקציות לויקוציט-אנדותל.
- תובנות לגבי מנגנוני הגלגול של לויקוציטים בתנאים פיזיולוגיים.
מסקנות
- תא הזרימה של לוחות מקבילים הוא כלי יעיל לחקר דינמיקת לויקוציטים.
- לסלקטין E יש תפקיד משמעותי בתיווך גלגול לויקוציטים.
- שיטה זו יכולה לשמש למחקר נוסף בתחום הדלקת והתגובה החיסונית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding E-selectin-mediated leukocyte rolling provides mechanistic insight into early inflammatory processes, supporting target validation for anti-inflammatory therapeutic development. This physiologic flow-based assay enables quantitative assessment of endothelial-leukocyte interactions under controlled shear stress, improving predictive confidence in target engagement and pathway modulation. The method supports preclinical de-risking by isolating the contribution of specific adhesion molecules in a disease-relevant microvascular context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the functional role of E-selectin in leukocyte recruitment, enabling hypothesis testing of inflammatory pathway involvement.
- Operational Value: Provides a reproducible system to validate target specificity using blocking antibodies or enzymatic treatments.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by quantifying rolling frequency and shear resistance as functional readouts of target modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable outputs including rolling events per field and tethering efficiency under defined shear stress conditions.
- Reproducibility: Uses NIS-Elements software to define thresholds and restrict analysis to rolling leukocytes, minimizing subjectivity in data capture.
- Scalability: Enables repeated runs across cell lines and treatment conditions with consistent priming and vacuum sealing protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models leukocyte trafficking in cutaneous, bone, and inflamed tissues where E-selectin is constitutively or inducibly expressed.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes E-selectin-dependent from independent rolling using IL-1β stimulation and anti-E-selectin antibody controls.
- Translational Continuity: Links in vitro rolling behavior to in vivo extravasation, supporting biomarker alignment for leukocyte-endothelial adhesion pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, providing mechanistic insight into leukocyte-endothelial interactions that inform lead optimization and safety profiling.
- Discovery Biology: Tests the necessity of E-selectin and its ligands in leukocyte adhesion under physiologic shear, clarifying target function in inflammatory cascades.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts (rolling frequency, binding efficiency) that enable comparison across genetic or pharmacological perturbations.
- Analytics: Exports data to Excel for statistical analysis of shear-resistant adhesion, supporting dose-response and inhibitor profiling.
- Translational Research: Uses human bone marrow endothelial cells and hematopoietic progenitor cells to model clinically relevant leukocyte-endothelial interactions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying selectin-mediated adhesion across inflammation, immuno-oncology, and vascular biology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating E-selectin’s contribution to leukocyte rolling through controlled stimulation and inhibition.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized chamber preparation, shear stress profiling, and automated image analysis with NIS-Elements.
- Strategic Value: Improves target confidence by providing direct functional evidence of target-leukocyte interaction under near-physiologic conditions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-adhesion therapeutics based on quantitative inhibition of rolling under defined hemodynamic forces.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, cytokine stimulation, and microfluidic flow dynamics to maintain monolayer integrity and consistent shear stress.
- Depends on specialized instrumentation including parallel-plate flow chamber, syringe pump, and inverted microscope with video capture capability.
- Necessitates cross-team standardization of image analysis parameters (threshold, elongation, circularity) to ensure consistent rolling event quantification.
- Requires adaptation of leukocyte and endothelial cell models to reflect tissue-specific inflammation contexts (e.g., dermal vs. bone microvasculature).
- Limited to analyzing initial adhesion events; does not capture downstream processes like firm adhesion or transmigration without complementary assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:48
Introduction
1:36
Preparation of hBMEC Monolayer on Petri Dishes
3:03
Preparation of Human Hematopoietic Progenitor KG1a Cells
3:44
Preparation of Microscope, Parallel-Plate Flow Chamber and Syringe Pump
6:26
Capturing Leukocyte Rolling Events using NIS Elements
9:21
Dependence of Terminal Sialylation and Surface Glycoprotein for E-selectin-Mediated KG1a Cell Rolling
10:43
Analysis of NIS-Elements-Captured KG1a Cells and Graphing of KG1a Cell Rolling Data
12:27
Representative Results
13:35
Conclusion
