ניתוח של הרולינג E-selectin בתיווך פיזיולוגי ליקוציט על כלי הדם האנדותל

סרטון זה מדגים ניתוח באמצעות תא זרימה בעל לוחיות מקבילות (parallel plate flow chamber) לבחינת הגורמים המעוררים גלגול של לוקוציטים על פני שטח של תאי אנדותל. שכבות מונו-שכבה של תאי אנדותל מעוררות באמצעות הציטוקין הפרו-דלקתי IL-1β כדי להגביר את ביטוי ה-S-selectin. לאחר מכן, תא הזרימה בעל הלוחיות המקבילות מונח מעל תאי האנדותל, ולוקוציטים חיוביים ל-S-selectin מוזרמים מעל המונו-שכבה.

האינטראקציות התאיות בתא חשופות למתח גזירה (shear stress) הדומה לזה המתרחש בהיצמדות לוקוציטים לקפילריות פוסט-קפילריות. אירועי גלגול (rolling) נלכדים ונספרים באמצעות רכיבי NIS ובדיקה לתלות ב-E selectin. שלום, אני ג'ורג' וייס מהמעבדה של ד"ר צ'ארלס דה ניטרו במחלקה לדרמטולוגיה בבית החולים בריג'אם אנד וימנז, בית הספר לרפואה של הרווארד.

היום נדגים לכם פרוצדורה לניתוח התפקיד של e selectin וליגנדים של E selectin בהיצמדות של לוקוציטים אנושיים לתאי אנדותל של מח עצם אנושי בתנאים של זרימת דם פיזיולוגית. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את תפקידם של מולקולות על פני השטח של התא המאתחלות את היצמדותם של תאי דם לבנים או תאי סרטן גרורתיים לתאי אנדותל, המצפים את פני השטח הפנימיים של כלי הדם. אירוע היצמדות זה מאופיין בהתנהגות של גלגול, בדומה לכדור באולינג המתגלגל במסלול.

אם כן, נתחיל. השלב הראשון בהליך זה הוא הכנת התאי האנדותל שיצפו את תא הזרימה. פרוטוקול זה משתמש בתאי H-B-M-E-C 60 המופקים ממוח עצם אנושי.

יש לצפות מראש את צלחות גידול המיקרו-וסקולטורה בפיברונקטין; כדי להכינן אותן, יש להדגיר צלחות לתרבית רקמה של 35 מיליליטר עם PBS המכיל 20 micrograms per mil של פיברונקטין. ניתן להדגירן למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C או למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 °C. יש להשהות תאי H-B-M-E-C 60 בתוך medium 1 99 ולזרוע בריכוז של 10⁵ תאים לצלחת, ולגדל את התרביות עד להגעה למעל ל-90% confluence.

תהליך זה יימשך כיומיים כדי להעלות את הביטוי של e select. שאבו את מצע הגידול והוסיפו מצע טרי עם 50 nanograms per mil של IL one beta; הדגירו למשך ארבע עד שש שעות. שכבות התאים החד-שכבתיות מוכנות כעת לבדיקת תא הזרם (flow chamber assay). ניתן לגרות פלטות נוספות של תאי H-B-M-E-C 60 באמצעות IL one beta ולטפל בהן בנוגדן neutralizing anti-human e selectin בריכוז 20 micrograms per mil למשך שעה אחת ב-37 degrees Celsius.

פעולה זו תשמש כביקורת לביטוי תפקודי של e selectin. לאחר מכן, הכינו את הלוקוציטים החיוביים ל-e selectin. אלו הם תאי KG one, תאי אב המטופויטיים אנושיים.

אלו גדלים בתרחיף עד להגעה למצב של confluence או בריכוז של 10⁶ תאים למ"ל ב-RPMI 1640. ניתן להעביר את תאי KG-1A בפיפט ישירות מהתרבית ולספור אותם באמצעות המוציטומטר. השהה מחדש את התאים בריכוז של 10⁶ תאים למ"ל ב-HBSS עם 10 mM HEPES או בבופר HH המכיל 2 mM calcium chloride.

יש לשמור את התאים על קרח עד לביצוע הבדיקה. השלבים הבאים כוללים את הכנת המיקרוסקופ, תא זרימה בעל לוחות מקבילים (parallel plate flow chamber) ומשאבת מזריקה. לצורך הבדיקה, הפעל את המיקרוסקופ ואת משאבת המזריקה.

בחר בעדשה עם הגדלה של 10x במיקרוסקופ. הנח מבחנה קונית של 50 milliliter במחזיק ומלא אותה בבפר HH עם 2 millimolar של calcium chloride. לאחר מכן, הנח מבחנות פלסטיק של 5 milliliter במחזיק שמתחת.

בשלב הבא, הכניסו מזרק של 60 milliliter למשאבת המזרקים. ודאו שגם הבוכנה וגם גוף המזרק מאובטחים. חברו ברז תלת-דרכי לקצה המזרק של 60 mil, ולאחר מכן חברו מזרק של five mil לברז התלת-דרכי.

הנח את מכשיר תא הזרימה המקבילי על במת המיקרוסקופ, כאשר צינור הכניסה מצד ימין, צינור היציאה מצד שמאל וצינור הוואקום מאחור. לאחר חיבור הצינורות לוואקום, פתח את שסתום האוויר כדי לאפשר למכשיר הפלטות המקבילי להיצמד לבמה. פעולה זו תבחן אם אטם הוואקום של תא הזרימה אטום לאוויר.

לאחר שאישור האיטום הושג, סגרו את שסתום האוויר. כעת חברו את קו צינור המוצא לברז הסטופר התלת-כיווני שכבר מחובר למזרק. המכשיר מוכן כעת להנחה מעל תאי ה-H-B-M-E-C 60.

הפעל את הוואקום והנח בעדינות את מכשיר תא הזרימה על הפלטה, ואפשר למכשיר להיצמד באמצעות השאיבה. לא אמורים להישמע קולות של דליפת אוויר, ובשלב זה ייתכן שתצטרך להפעיל לחץ על התא כדי לדחוס את אטם הגומי. לאחר שהוואקום נוצר, הכנס את צינור הכניסה לתוך מבחנה קונית של 50 milliliter.

פתחו את ברז המעבר התלת-כיווני למזרק ה-60 mil והעבירו את המשאבה למצב pump כדי להוציא אוויר מהקוים מבלי להרים את התאים בצלחית. השתמשו במשאבת מזרקים המכוונת ל-two mils לדקה כדי למלא את צינור הכניסה. לאחר מכן, העבירו במהירות ל-0.5 mils לדקה.

ממש לפני שהנוזל מגיע למכשיר, קריטי לבצע הטרייה (prime) זהירה של המערכת ולהימנע מבועות אוויר, אשר ירימו את השכבה החד-שכבתית (monolayer) מהפלטה. ברגע שהנוזל זורם אל תוך המזרק בנפח 60 mil, תא הזרימה ומשאבת המזרקים נחשבים למוטרים. כעת, קבעו את תא הזרימה לבמה באמצעות סרט הדבקה מעל כל אחד מקווי הכניסה, היציאה והוואקום.

דבר זה מבטיח ששדה הראייה יישאר קבוע בעת הדמיון ואיסוף הנתונים. תא הזרימה מוכן כעת לשימוש. יש לחזור על שלבים אלה עבור כל הרצה של הזנת תאים ועבור כל פלטה חדשה.

כדי לתעד אירועי גלגול באתר Lucas, פתחו את NIS elements בשולחן העבודה ולחצו על סמל הניגון (play) לצפייה בתמונה חיה. חשיפה אוטומטית תאפשר לכם לראות את הפלטה ולמקד את התמונה. ודאו שהמיקרוסקופ ממוקד כראוי בשכבת התאים המונו-שכבתית (monolayer) על ידי כיוון המיקוד באופן ידני במיקרוסקופ.

ברגע שהתמונה ממוקדת, הגדירו מחדש את החשיפה לפריים אחד לשנייה וכווננו את התאורה במיקרוסקופ. התמונה צריכה להופיע במחשב ולא להיות נראית עוד במיקרוסקופ. לאחר מכן ניתן להתאים את היסטוגרמת האור כדי להסיר חשיפת רקע או כדי לשפר את בהירות התאים; לחצו על two by two bin או live bin כדי לקבל תמונה האידיאלית להקלטת סרטון.

לחצו על macro בשורת התפריט ובחרו ב-right to port, בחרו בפורט com three ולחצו על open. פעולה זו פותחת את הפורט לצורך סנכרון עם משאבת המזרקים. תא הזרימה מוכן כעת להזרקה של תאי KG1A; העבירו בפיפט 1 mL של תרחיף תאי KG1A לתוך מבחנה של 5 mL הנמצאת סמוך לקו צינור הכניסה.

לאחר מכן, הניחו את קו הכניסה בתחתית מבחנת הבדיקה. עברו לסרגל התפריטים ולחצו על capture ו-time lapse acquisition. בחרו בפרוטוקול שנמשך 210 שניות.

זהו אורך התוכנית עבור גלגול על תאי H-B-M-E-C 60. כל שלב מתוכנת לצלם תמונה בכל שנייה לאורך משך פרוטוקול המשאבה. התוכנית מוגדרת גם לשלוח פקודה דרך יציאת comm three כדי להפעיל את המשאבה.

הגדירו את משאבת המזרקים למצב תכנות, המאפשר תכנות ידני של קצבי זרימה ספציפיים. פעולה זו תקבע את רמות מאמץ הגזירה בתוך התא ותכתיב את האינטראקציות של תאי KG one A על תאי H-B-M-E-C 60. ההגדרות לאינטראקציות אלו הן 4.2 dines per centimeter squared למשך 45 seconds.

3 dines לסנטימטר רבוע למשך 60 שניות, כאשר כל מדרגה עולה מדי 15 שניות עד למקסימום של 4.2 dines לסנטימטר רבוע. המיקרוסקופ והמחשב מוכנים כעת לצילום Time-lapse. לחץ על Start Run במחשב כדי להתחיל באיסוף נתונים תוך כדי הרצת התוכנה.

יש לוודא שמוסיפים מצע למבחנה המכילה תאי KG one A כדי לשמור על צינורות הכניסה והיציאה מלאים במצע ולמנוע חדירת בועות אוויר למערכת. אם צילום ה-time lapse נקטע, המשאבה לא תעצור מעצמה ויש לאתחל אותה. לחצו על cancel כדי לחזור לתמונה חיה.

שכבה אחת (monolayer) של תאי אנדותל ללא גירוי משמשת כביקורת שלילית לניסוי זה. לשם כך, יש להזרים לוקוציטים מסוג KG-1A אל תוך תא הזרימה מעל תאי HBMEC-60 שלא טופלו, כדי לשמש כביקורת לתלות ב-E-selectin; לאחר מכן, יש לגרות את שכבת תאי האנדותל באמצעות IL-1β ולהזרים את הלוקוציטים מעל תאים אלו כדי להוות ביקורת נוספת לתלות ב-E-selectin. יש לטפל בתאי HBMEC-60 באמצעות IL-1β ולאחר מכן בנוגדן anti-human S-selectin.

לאחר מכן, נתח את אירועי הגלגול של לוקוציטים על תאים אלו. גלגול תאים אינו נקבע רק על ידי S selectin, אלא גם על ידי שאריות slic acid על פני תא הלוקוצייט. כדי להדגים זאת, בצע עיכול של תאי KG one A עם 0.1 units per mil של neuraminidase למשך שעה אחת ב-37 °C.

לאחר מכן, נתח את אירועי הגלגול מעל תאי H-B-M-E-C 60 שעברו גרייה. גליקופרוטאינים על פני השטח של הלוקוציטים חשובים אף הם עבור גלגול תאים. ניתן להדגים זאת על ידי טיפול בתאי KG one A ב-0.2 units per mil broma lane למשך שעה אחת ב-37 °C, ולאחר מכן הזרקתם לתא הזרימה.

לאחר רכישת רצף הזמנים, הנתונים מוכנים לניתוח. שמרו את הנתונים, עברו ללשונית measure בשורת התפריט ובחרו ב-defined threshold. הזיזו את הסרגים כך שהתאים הרצויים יצבעו באדום, בחרו ב-all images ולאחר מכן ב-okay; כעת כל רצף ה-time-lapse אמור להיות מעודכן עם תאים מתגלגלים אדומים הנראים לעין.

עברו ללשונית מדידה (measure) ובחרו בהגבלות (restrictions). פעולה זו מאפשרת למשתמש להחריג אובייקטים שעוברים את סף הסינון ושאינם מייצגים תאים מתגלגלים. אלו הם בעיקר רעשי רקע שנוצרו על ידי שכבת ה-H-B-M-E-C 60 בבחירת השטח; הזינו ערכי מינימום ומקסימום, המהווים את הטווח האידיאלי עבור לוקוציטים מתגלגלים.

חזור על שלב זה עבור התארכות (elongation) ועגוליות (circularity). בחר ב-measure ואז בחר ב-create binary using restrictions. ערכי ההגבלה (restriction values) שהוגדרו בשלב הקודם ישמשו כעת לאופטימיזציה של תוכנת ה-NIS elements לצורך זיהוי לוקוציטים מתגלגלים על שכבת המונו-לייר של התאים האנדותלייאליים. חזור ל-measure, בחר ב-field data ואז בחר ב-reset data.

סגור את התפריט, חזור למדידה ובחר שדה סריקה, פתח את נתוני שדה המדידה ובחר מספר אובייקטים. לאחר מכן, בחר את כל השדות וייצא את הנתונים ל-Microsoft Excel. לבסוף, בחר בניקוי נתונים.

רכיבי ה-NIS מוכנים כעת לאיסוף נתונים נוסף. נתונים מייצגים אלו מראים כיצד אינטראקציות בין לוקוציטים לתאי אנדותל מגיבות למאמץ גזירה פיזיולוגי, ובמיוחד בוחנות את תפקידו של הליגנד הדביק E selectin.

גלגול לוקוציטים חסון מתרחש כאשר תאי אנדותל עוברים סטימולציה מוקדמת באמצעות IL-1β. כאשר משווים תוצאה זו לבקרת הביקורת ללא סטימולציה, ניכר כי גלגול התאים תלוי בסטימולציה של ציטוקינים. על ידי טיפול בתאי HBMEC-60 ב-IL-1β ולאחר מכן בנוגדן anti-human E-selectin, מתברר כי גלגול התאים תלוי ספציפית ב-E-selectin.

ניתן להשתמש בבדיקה זו לבחינת פרמטרים נוספים. לדוגמה, כאשר תאים שעברו גרייה טופלו מראש ב-sase או ב-brolin, התוצאות היו פחות עקביות. נתונים אלה מדגישים את חשיבותם של שאריות slic acid טרמינליות וכן של גליקופרוטאינים על פני השטח של התא.

עבור פעילות של ליגנד של S selectin, הרגע הדגמנו כיצד לנתח אינטראקציות הדבקה המבוססות על e selectin בין לוקוציטים לתאי אנדותל בתנאים המדמים כוחות הקיימים בווריד פוסט-קפילרי, אזור במערכת הדם שבו לוקוציטים עוזבים את הדם ונכנסים לרקמות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בנוגדן חוסם מתאים או בביקורת של טיפול אנזימטי כדי לתקף את הנחיצות של ה-selectin הרלוונטי והליגנד שלו במערכת בדיקה זו. זהו כל התהליך.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.