ניהול מתחם III
מקור: קיי סטיוארט, RVT, RLATG, CMAR; ואלרי א. שרודר, אר.די.ג'י, אר-אל-ג'י. אוניברסיטת נוטרדאם, IN
ישנם מסלולים נפוצים רבים לניהול מורכב בעכברים במעבדה…
1. ניהול תוך-עורי
- רוב זריקות תוך עוריות הן תרכובות מבוססות מימיות. הפתרונות חייבים להיות חוצצים פיזיולוגית כדי לקבל pH נייטרלי, על מנת למנוע נמק רקמה באתר ההזרקה.
- טווח גודל המחט הוא 25-30 מד, הקטן ביותר האפשרי.
- טווח המינון לכל אתר הזרקה הוא 50-100 μL. הזרקת נפחים מוגזמים עלולה לגרום לנמק באתר ההזרקה או לדליפת המתחם מהאתר עקב לחץ.
- עבור מיקום מדויק של המחט לתוך החלל התוך עורי, יש צורך למרדים הן עכברים והן חולדות. הרדמה שאיפה מאפשרת אינדוקציה מהירה והתאוששות; עם זאת, הרדמה להזרקה יש את היתרון של מתן מספיק זמן להכנת האזור וביצוע הזריקה. 1
- הסר את השיער באתר ההזרקה באמצעות קרם depilatory או על ידי גילוח האזור.
- יש להסיר ביסודיות כל שאריות של קרם דפילטרי או פסולת שיער.
- החל חיטוי אקטואלי, כגון פתרון יוד, פתרון כלורהקסידין, או אלכוהול.
- נהלי ניהול
- מתחו את העור מתוח בין האגודל לאצבע המורה. זה מספק יציבות לעור בעת מיקום המחט.
- מניחים את המחט משופעת על העור.
- הכנס בעדינות את המחט לתוך העור בין האפידרמיס והדרמיס. לקדם את המחט ממש מעבר שיכול.
- הזריקו את החומר לאט. הזרקת המתחם תיצור bleb, או שלפוחית קטנה, בעור.
- השהה לאחר ההזרקה כדי לאפשר לעור למתוח ולהתאים לפני משיכת המחט.
- אמצעי זהירות
- אין צורך לסגת בבוקעת.
- אם המחט מוכנסת לחלל התת עורי, לא נוצר bleb. הזרקת עמוק מדי גורמת לזריקה תת עורית.
- הימנע נפיחות או ניגוב האזור, כמו זה יכול לגרום המתחם לדלוף מאתר ההזרקה.
- בעת ביצוע זריקות מרובות, רווח אותם כך blebs לא חופפים.
איור 1. הזרקה תוך עורית בעכברים.
2. ניהול תוך-נאואלי
- ציוד
- השתמש בצינור יחידת מיקרו-פיקפיק שניתן לכייל כדי לספק נפח מדויק.
- יש להשתמש בטיפים חד פעמיים לפיפטה כדי למנוע זיהום צולב. מזרקי שחפת, מחטים קהות וצינורות גמישים יכולים לשמש גם למינום.
- נפחי הזרקה הכולל עבור חולדות לא יעלה על 40-100 μL, ויש לתת 6-10 טיפות μL. עבור עכברים, הנפח הכולל המרבי הוא 24 μL, נתון 3-4 טיפות μL.
- ניהול בבעלי חיים מודעים
- איפוק ידני בבעלי חיים מודעים דורש כי הראש להיות יחסית חסר תנועה, כך קצה פיפטה או מחט קהה ניתן להציב קרוב מספיק nares כדי לספק את המתחם, אבל לא כל כך קרוב כמו לתקוע או לקרוע את רקמת האף.
- לרסן את החיה ולהחזיק אותו במצב אנכי.
- מניחים טיפה קטנה של תרכובת נוזלית בפתח האף. החיה צריכה לשאוף את הטיפה.
- נהל אמצעי אחסון נוסף, ערך נלווה לסירוגין עד להינתן אמצעי האחסון כולו.
- בעת מתן כרכים גדולים יותר, חשוב לא לכווץ את החזה במהלך איפוק. דחיסת חזה פוגעת ביכולתו של בעל החיים לנשום נשימות עמוקות מספיק כדי למשוך את הנוזל לתוך הסימפונות והריאות.
איור 2. ניהול תוך-נאוי בעכברים מודעים.
- ניהול בבעלי חיים חסרי הכרה
- שימוש בהרדמה משאיפת אלכוהול מאפשר בעל חיים משותק במהלך הגישה והלידה של המתחם. זה מבטל את האפשרות של החיה לנשוך את ציוד מנון, אובדן המתחם עקב jerking של הראש, ופגיעה ברקמת האף של החיה, עיניים, או עור הפנים. החיה גם פחות סביר להסניף ולרסס את המתחם מן nares על הממשל.
- מניחים את החיה בתנוחה השופית. מיקום הראש משפיע על מיקום הפתרון ב nares. הוכח כי המיקום האידיאלי עבור משלוח מערכת החולים הוא עם supine בעלי חיים; זה מאפשר ספיגה טובה יותר. 2
- לנהל מחצית המתחם ישירות לתוך צד אחד של פתח האף, תזמון זה עם שאיפה. ואז, להפוך את החיה מעל.
- כאמור, נהל את החצי השני של הנפח לתוך פתח האף האחר.
איור 3. ניהול תוך-נאוי בעכברים מחוסרי הכרה.
3. ניהול תוך גולגולתי בעכברים וחולדות יילודים
- עכברים או חולדות חייבים להיות מרדים לזריקות תוך גולגולתיות.
| עכבר | חולדה | ||
| גיל (ימים) | מד מחט (גרם) | גיל (ימים) | מד מחט (גרם) |
| 0-7 | 29-30 | 0-5 | 27-29 |
| 7-14 | 27 | 5-10 | 25-27 |
| 14-28 | 25 | 10-14 | 25 |
| גיל (ימים) | אורך המחט (מ"מ) | גיל (ימים) | אורך המחט (מ"מ) |
| 0-7 | 2 | 0-4 | 2-3 |
| 7-14 | 3 | 4-7 | 3 |
| 14-21 | 4 | 7-10 | 4 |
| 21-28 | 5 | 10-14 | 5 |
| גיל (ימים) | אמצעי אחסון (μL) | גיל (ימים) | אמצעי אחסון (μL) |
| 0-5 | <20 | 1-3 | <20 |
| 6-20 | <60 | 4-10 | <60 |
| 20-28 | <100 | 11-14 | <100 |
טבלה 1. מד מחט, אורך מחט ונפח מרבי של ניהול תוך גולגולתי לפי גיל העכברים והחולדות. 4
- ציוד
- קבע את מד המחט הנכון ואת נפח הניהול המרבי לפי טבלה 1.
- הכן שומר מחט לפני שהוא מרדים את החיה.
הערה: עומק ההזרקה של המחט נשלט באמצעות שומר שנוצר עם מכסה המחט.- כדי ליצור את השומר, מחט נמדדת כנגד מכסה המחט, וסימן ממוקם על הכובע כדי לציין היכן לחתוך. החתך צריך להיעשות כך 2 עד 5 מ"מ של המחט חשופים כאשר המכסה מוחלף על המחט.
- אורך המחט החשופה חייב להיות ארוך מספיק כדי לחדור את העור והגולגולת, ולהגיע לעומק הרצוי במוח.
- אורכי המחט הדרושים לעכברים וחולדות מפורטים בטבלה 1.
- מקור חימום נדרש כדי למנוע היפותרמיה אצל הגורים. ישנם מספר סוגים: כרית חימום חשמלית על נמוך, שמיכת מים במחזור, או כיס חום תגובה כימית רב שימוש חוזר.
- איפוק
- עכבר וגורי חולדה 10 ימים ומטה אינם דורשים הרדמה עבור הליך זה. לרסן אותם באופן ידני על ידי החזקתם ממש מאחורי הראש ומשיכת העור בקהילות כדי להפעיל לחץ קל על הכתפיים.
- גורים מרדים מעל גיל 10 ימים עם שאיפת איזופלוראן. חברו תא אינדוקציה לאידוי מדויק או לצנצנת פעמון עם כדור כותנה ספוג באיזופלוראן. ברגע שהגור משותק, ההרדמה יעילה למשך כ -40 שניות, מה שמספק מספיק זמן להזרקה.
- טכניקת הזרקה
- צייר את החומר לתוך המזרק ומניחים את מדריך הכובע / המחט מעל המחט.
- נפח ההזרקה המומלץ כמו נפח המרבי לכל עכבר יילודים או חולדה הוא 100 μL, וכי עבור גגמול או עכברים מבוגרים הוא עד 300 μL.
- כדי להזריק לתוך קליפת המוח של יילודים, להכניס את המחט 5 מ"מ מאחורי העין, כ 3 מ"מ את קו האמצע של הגולגולת.
- אתר הזרקת העכבר הגומלי נמצא בערך באמצע הדרך בין העין לאוזן, ממש ליד קו האמצע.
איור 4. ניהול תוך גולגולתי בגור עכבר.
לעיתים, גישות ניסיוניות שונות מחייבות שימוש בדרכים פחות נפוצות של מתן תרכובות במכרסמים. תוך עורי, תוך-אף ותוך גולגולת הם שלושה מסלולים חלופיים כאלה שבהם משתמשים החוקרים הביו-רפואיים במעבדות כיום.
כפי ששמם מרמז, תוך-עורי מעביר תרכובות לשכבות החיצוניות של הדרמיס. תוך-אף מניח את התמיסה בעורפי החיה. ותוך גולגולת כרוכה בהחדרת המחט ישירות למוח המכרסם.
הכשרה מיוחדת חיונית לביצוע הליכים אלה בהצלחה. כאן, נדגים תחילה את השיקולים עבור כל אחת מהשיטות הללו ולאחר מכן נדגים את הטכניקות שיעזרו לך ללמוד את הנהלים תוך הבטחת בטיחות החיה והצלחת הניסוי.
נתחיל בדיון מתי משתמשים בדרך כלל בדרכים אלה ודברים שצריך לזכור לפני שמתחילים לבצע את טכניקות הניהול המיוחדות הללו.
ההזרקות התוך-עוריות משמשות להעברת חפץ לחלל שבין האפידרמיס לדרמיס מסלול זה שמור בדרך כלל להערכת דלקת, אבחון זרימת דם עורית או תגובות אלרגניות לאנטיגן. בדומה למסלולים אחרים, יש להכין גם את הפתרון התוך-עורי בטכניקה הסטרילית. וזה חייב להיות חוצץ פיזיולוגית כדי שיהיה לו pH ניטרלי על מנת למנוע נמק רקמות באתר ההזרקה. מערכת ללא רכזת עם מחט בגודל 25-30 משמשת לעתים קרובות להזרקה זו. מערכת זו מסייעת בשמירה על נפח הניהול, הנמצא בטווח של 50-100 מיקרוליטר לאתר הזרקה. הזרקת עודף עלולה לגרום לנמק או לדליפה לא רצויה של תרכובות עקב לחץ.
נתיב תוך-אף נבחר לעתים קרובות לאספקה מקומית של חיסונים או תרסיס נוגד גודש וכן להעברה מערכתית ומערכת העצבים המרכזית. הרירית המצפה את חלל האף היא בעלת אספקה עשירה של כלי דם ועצבים המאפשרים ספיגה מערכתית מהירה ומיקוד ישיר למערכת העצבים המרכזית. מדובר בשיטה לא פולשנית הדורשת הכשרה ומיומנות מינימלית, וציוד פשוט - מיקרופיפטה מכוילת וכמה טיפים חד פעמיים. נפחי הניהול לחולדות לא יעלו על 40-100 מיקרוליטר הניתנים בטיפות של 6-10 מיקרוליטר. ועבור עכברים, הנפח הכולל המרבי הוא 24 מיקרוליטר הניתן ב-3-4 טיפות מיקרוליטר.
למרות שהרדמה אינה נדרשת להליך זה, יש לה כמה יתרונות על פני מתן תוך-אף בבעלי חיים בהכרה 1) היא מקלה על מיקום נכון של התרכובת בעורפים, ומבטיחה מינון מדויק 2) מבטלת את האפשרות שהחיה תנשוך את ציוד המינון 3) מבטיחה שאין פגיעה ברקמת האף של החיה, בעיניים, או עור פנים עקב טלטול של הראש, ו-4) בעל חיים נוטה פחות לנחור ולרסס את התרכובת מהנארס בעת מתן התרופה.
זריקות תוך גולגולתיות בעכברים וחולדות בוגרים משתמשות בציוד סטריאוטקסי, המתואר בסרטון באוסף "יסודות מדעי המוח". הציוד מבטיח מיקום נכון ועומק הזרקה נכון. כאן, נתמקד בלידה תוך גולגולתית בעכברים וחולדות יילודים שהגולגולת בהם דקה מספיק כדי להזריק ישירות דרכה, ועשויה להיות שבירה מכדי לתמוך במכשיר הסטריאוטקסי. המטרות העיקריות של טכניקה זו הן להעביר חומרים פרמקולוגיים של מערכת העצבים המרכזית ישירות למערכת העצבים המרכזית, ולהימנע מההשפעות שנתקלים בהן בכל דרך מערכתית. מד המחט, אורך ונפח המתן נקבעים על סמך המין וגיל הגורים. שימו לב שככל שגיל החיה עולה, מספר המד יורד, אורך המחט הנדרש גדל, ונפח המתן המרבי המומלץ גדל גם הוא.
עם מידע רקע זה בחשבון, בואו נתעמק בהליכים של שיטות הזרקה אלה. ראשית היא טכניקת הניהול התוך-עורי. הליך זה צריך להתבצע בבעלי חיים מורדמים. עיין בסרטון נוסף באוסף זה כדי להבין את ההליכים לאינדוקציה ותחזוקה של הרדמה.
לאחר הרדמת החיה יש לגלח את מקום ההזרקה באמצעות סכין גילוח חשמלי או קרם אפילציה. בעזרת גזה לחה במים, הסר היטב את השיער המתמשך מהאתר. לאחר מכן, בעזרת כרית גזה נוספת, מרחו תמיסת חיטוי מקומית על האזור המגולח. לצורך מתן יש לייצב תחילה את העור במקום ההזרקה על ידי מתיחתו בין האגודל לאצבע המורה.
כעת הניחו את שיפוע המחט על העור והכניסו אותה בעדינות ממש מעבר לשיפוע כך שהפתח יהיה בין האפידרמיס לשכבות הדרמיס. לאחר מכן יש להזריק לאט ולשים לב שזה יוצר כתם בעור. אם המחט מוחדרת עמוק מדי אז לא ייווצר בלב. לאחר ההזרקה, עצור כדי לאפשר לעור להימתח ולהסתגל, ולאחר מכן משוך את המחט לאט. אל תמשוך לאחור את הבוכנה בכל עת, מכיוון שהיית מושך את הרקמה וגורם לטראומה במקום ההזרקה. כמו כן, אין לנגב או למחוק את מקום ההזרקה, מכיוון שהדבר עלול לגרום לדליפת החומר המוזרק. בעת ביצוע זריקות מרובות, הקפד לרווח אותם זה מזה מספיק כדי שהבלבים לא יחפפו זה לזה.
לאחר מכן, בואו נלמד את הליך המתן התוך-אף בבעלי חיים מודעים ומורדמים.
עבור בעלי חיים ערים, רסנו אותם על ידי קשקוש העור בעורף ואז החזיקו את החיה במצב אנכי כשראשה משותק. היזהר לא לכווץ את החזה מכיוון שהדבר עלול לפגוע ביכולתו של בעל החיים לנשום נשימות עמוקות מספיק כדי לשאוב את הנוזל לריאות. בעזרת מיקרופיפטה, יש לתת חלק מהתמיסה על ידי הנחת טיפה קטנה של נוזל בפתח האף. החיה תשאף את הטיפה. חזור על תהליך זה, לסירוגין בין שני פתחי האף עד לקבלת כל הנפח שיש לתת. זכור - נפח המתן הכולל לא יעלה על 24 ליטר ו-100 ליטר בעכברים וחולדות, בהתאמה.
עבור עכברים וחולדות מורדמים, הנח את החיה בתנוחת שכיבה גבית. עמדה זו אידיאלית להעברת מערכת העצבים המרכזית מכיוון שהיא מאפשרת ספיגה טובה יותר של התרכובת. סובבו את ראש החיה והעבירו מחצית מהתרכובת ישירות לצד אחד של פתח האף, ותזמנו אותה בשאיפה. לאחר מכן, סובב את ראש החיה למקומו למתן הבא. לאחר 2 נשימות בערך, יש להעביר את הנפח הנותר לפתח האף השני. לאחר מתן מלא, החזירו את החיה לכלוב שלה.
לאחר מכן, בואו נסקור את הליך המתן התוך גולגולתי עבור עכברים וחולדות יילודים. לפני תחילת ההליך, הנח את הכלוב עם הגורים והסכר על כרית חימום חשמלית המכוונת לנמוכה. ודא שחלק מהכלוב נמצא מחוץ לכרית החימום. זאת כדי למנוע היפותרמיה ובמקביל לאפשר לסכר להתרחק מהחום אם היא רוצה. לאחר מכן, בחר מד מחט המתאים לגיל החיה. כזכור, מד המחט; אורך המחט, המשמש לשליטה בעומק המחט במהלך ההזרקה התוך גולגולתית; והיקף האדמיניסטרציה... כולם משתנים בהתאם לגיל ולמין של בעל החיים.
האורך מותאם באמצעות שומר. כדי להכין את המגן הזה, מדוד את המחט הנכונה כנגד הכובע שלה ועשה סימן. לאחר מכן, הניחו סימן שני על הכובע כדי לציין היכן הוא ייחתך. המרחק בין שני הסימנים הוא אורך המחט הרצוי. לאחר מכן, חותכים את הכובע בעזרת סכין גילוח. אל תשתמש במספריים מכיוון שהם ימעכו את הכובע ולא ייצרו חתך ברמה נקייה. זהו "מגן המחט". השלך את המחט המשמשת ליצירת המגן, מכיוון שהיא כבר לא סטרילית, ובמקום זאת הכנס מחט חדשה לתוך המגן וודא שהאורך הנכון חשוף. לאחר מכן, בעזרת מחט אחרת המחוברת למזרק המתאים, צייר את חומר ההזרקה. לשם כך משתמשים במחט אחרת, מכיוון שמיקום בפקק יקהה משמעותית את מחטי המד העדינות הללו, שאינן אידיאליות למתן תוך גולגולתי. לאחר מכן, הנח את המזרק המלא על המחט עם המגן. כעת המערכת מוכנה להזרקה.
לגורים מעל גיל 10 ימים, יש לתת הרדמה באינהלציה. גורים מתחת לגיל 10 ימים אינם צריכים להיות מורדמים. כדי לבצע את ההזרקה, יש לאתר תחילה את המקום, שנמצא 5 מ"מ מאחורי העין וכ-3 מ"מ מקו האמצע של הגולגולת. לאחר מכן, הכנס את המחט לעומק המותר על ידי מגן המחט. לאחר מכן, הזריק בצורה איטית ויציבה כדי למנוע טראומה למוח. הסר את המחט מיד ובזהירות רבה כדי למנוע פגיעה ברקמת המוח. לבסוף, החזירו את החיה לסכר כדי לאפשר התאוששות נאותה.
עכשיו בואו נסקור כמה ניסויים שנערכים במעבדות כיום המשתמשים בדרכי המתן הלא שגרתיות הללו.
זריקה תוך עורית משמשת לעתים קרובות לחקר תגובה דלקתית בעור. בניסוי זה, החוקרים השתמשו בשיטה זו כדי להזריק אלרגן לאוזן אחת וחומר ניטרלי לאוזן הנגדית של עכבר רגיש מראש. לאחר מכן, הם העבירו צבע כחול למערכת הדם של החיה כדי לבחון את השינויים בחדירות כלי הדם עקב הזרקת אלרגנים.
כפי שהוזכר קודם לכן, אחד היישומים של מתן תוך-אף הוא מתן חיסונים. כאן, מדענים השתמשו בנתיב זה כדי להעביר חיסון שפעת חי מוחלש מהונדס גנטית לעכברים מהונדסים ועכברים מהונדסים וחקרו חסינות רירית באמצעות ייצור סוג מסוים של תאי T.
לבסוף, מחקרים ביו-רפואיים אלה השתמשו במתן תוך גולגולתי כדי להשתיל תאים סרטניים בעכברים מדוכאי חיסון, על מנת ליצור מודל גידול מוח אנושי. לאחר מכן נותחה יעילות ההזרקה באמצעות מערכת הדמיה in vivo.
צפיתם בסרטון של JoVE על כמה מהשיטות המיוחדות למתן תרכובות בעכברי מעבדה וחולדות. כעת עליך להבין מתי נהלים אלה מועילים, את השיקולים שעליך לזכור לפני ובזמן ביצוע טכניקות אלה, ואת הצעדים הפרוצדורליים החיוניים כדי להבטיח שלמתן תהיה השפעה מינימלית על בריאות בעל החיים ועל נתוני הניסוי שייאספו. כמו תמיד, תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: When is intradermal injection used in rodent research?
Intradermal injection delivers compounds into the space between the epidermis and dermis layers. This route is typically used to assess inflammation, measure cutaneous blood flow, or evaluate allergenic reactions to antigens. The procedure requires anesthesia and specialized training to ensure accurate placement and minimize tissue damage at the injection site.
Q2: What are the key advantages of intranasal administration in laboratory animals?
Intranasal administration is non-invasive and requires minimal training and simple equipment like a calibrated micropipette. The nasal mucosa's rich blood vessel and nerve supply enables rapid systemic absorption and direct central nervous system targeting. This route is commonly used for vaccine delivery and local decongestant applications in rodents.
Q3: Why is anesthesia recommended for intranasal dosing in conscious rodents?
Anesthesia during intranasal administration ensures proper compound placement at the nares for accurate dosing, prevents animals from biting equipment, and eliminates head jerking that could injure nasal tissue or eyes. Anesthesia also reduces the likelihood of the animal snorting and spraying the compound from the nares upon administration.
Q4: What volume limits apply to intranasal administration in different rodent species?
For rats, intranasal administration should not exceed 50 microliters per administration. For mice, the maximum total volume is less than 20 microliters. These volume restrictions prevent complications and ensure compliance with institutional guidelines and IACUC-approved protocols for safe compound delivery.
Q5: How is needle depth controlled during neonatal intracranial injection?
A needle guard is created by measuring the correct needle against its cap, marking the desired length, and cutting the cap with a razor blade to produce a clean, level cut. This custom depth-control device is prepared aseptically and ensures the needle penetrates only to the validated depth appropriate for the target brain structure and animal age.
Q6: What preparation steps are essential before intradermal injection in rodents?
The injection site must be shaved using an electric razor or depilatory cream, then thoroughly cleaned with water-dampened gauze to remove lingering hair. A topical antiseptic solution is applied to the shaved area. The skin is stabilized by stretching it between thumb and index finger before needle insertion to ensure accurate bleb formation.
Q7: Why is a separate needle used to draw test articles for intracranial injection?
A separate needle is used to draw the test article because insertion into the stopper significantly dulls fine-gauge needles, which compromises injection quality. Using a fresh needle for intracranial administration preserves needle sharpness and ensures precise, trauma-free delivery directly into the neonatal rodent brain.