גידול גבישים לניתוח עקיפה של קרני רנטגן
1. הכנת צינור הבדולח והמסנן
- מניחים צינור NMR בבקבוק ארלנמייר.
- הכן מסנן פיפטה.
- בנו את המסנן על ידי הנחת חתיכת מגבון ללא מוך (1 אינץ' על 1 אינץ') בפיפטה, ולאחר מכן השתמשו במוט כדי לתקוע בחוזקה את המגבון בחלק צוואר הבקבוק של הפיפטה(איור 1).
- הפוך שני מסנני פיפטה לכל צינור גביש צורך.
2. הוספת הדגימה לצינור הקריסטל
- ממיסים את התרכובת (טטרפנילפורפירין, 10 מ"ג) ב-0.75 מ"ל של ממס (דיכלורומתאן).
- עם פיפטה, מוסיפים בעדינות את התערובת לחלק העליון של הצינור, על ידי העברתו דרך המסנן.
- החלקיקים מסוננים כדי למנוע יצירת אתרי התגרענות, אשר יכול להוביל גבישים מרובים קטנים במקום גבישים יחיד גדול יותר הרצוי.
- לאחר המדגם הונח בצינור הגביש, לאט ובעדינות רבה, להוסיף את אנטי ממס (1.5 מ"ל של מתנול) לצינור באמצעות pipette מסנן חדש. אפשרו לאנטי-ממס לשכב באיטיות על הפתרון שנוסף בעבר (איור 2). אין להשתמש בנורה כדי לדחוף את הממס דרך הפיפטה, במקום זאת לאפשר לממס לזרום דרך המסנן בפני עצמו.
- ודא כי ממס של צפיפות גבוהה יותר מתווסף צינור הגביש הראשון.
- בדוק כי שני הממסים הם miscible אחד עם השני. זה נעשה לפני הוספת הממס.
- לאטום את הצינור עם כובע NMR.
3. צמיחת קריסטל
- מבלי לגרום לשני הממיסים להתערבב, מניחים את צינורות הקריסטל בארון שבו הם לא יופרעו.
- זמן ההתגבשות ישתנה עם כל תרכובת - בדרך כלל צינורות הקריסטל צריכים להישאר ללא הפרעה במשך שבוע.
- לאחר שבוע, לבדוק את הצינורות לצמיחת גביש.
- צמיחת גביש מתרחשת בדרך כלל בממשק של שני הממיסים.
- בדוק חזותית את הצינורות לראיות לצמיחת גביש. היזהר לא להקל על ערבוב של הממסים, במקרה המתחם דורש זמן נוסף להיווצרות קריסטל.
- אם נראה כי צמיחת הגביש התרחשה, בדוק עוד יותר את הצינורות באמצעות מיקרוסקופ.
4. בחירת קריסטל
- גבישי עקיפה של קרני רנטגן צריכים להיות פנים מוגדרות היטב.
- יש להימנע מגבישים שהתקבצו יחד במידת האפשר.
- השאירו את הגבישים בצינור הגביש עד שיהיו מוכנים לקצור את הגביש, מיד לפני הנחת הגביש על הדיפרקטומטר.
- שמירה על הגבישים בצינור תבטיח שהגבישים יישארו פתים. טיהור יכול לגרום גבישים להיסדק, ולעכב את עקיפה של הגביש.
איור 1. תמונה של מסנן הפיפטה. חתיכה קטנה של מגבון ללא מוך נתקעה בחוזקה על צוואר הבקבוק של הפיפטה. הפתרונות מועברים למרות מסנני פיפטה אלה לפני שהוצגו לצינור הגביש.
איור 2. ברגע הפתרון המכיל תרכובת ממוקדת ממוקם בצינור הגביש, האנטי ממס הוא שכבה איטית על גבי על ידי העברת אותו דרך מסנן פיפטה חדש.
מקור: המעבדה של ד"ר ג'ימי פרנקו - מכללת מרימק
קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן היא שיטה המשמשת בדרך כלל לקביעת הסידור המרחבי של אטומים במוצק גבישי, המאפשר קביעת הצורה התלת ממדית של מולקולה או קומפלקס. קביעת המבנה התלת מימדי של תרכובת היא בעלת חשיבות מיוחדת, שכן המבנה והתפקוד של המתחם קשורים קשר הדוק. מידע על המבנה של המתחם משמש לעתים קרובות כדי להסביר את ההתנהגות שלה או תגובתיות. זוהי אחת הטכניקות השימושיות ביותר לפתרון המבנה התלת מימדי של מתחם או מורכב, ובמקרים מסוימים זו עשויה להיות השיטה היחידה בת קיימא לקביעת המבנה. גידול גבישים באיכות קרני רנטגן הוא המרכיב העיקרי בקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. גודלו ואיכותו של הגביש תלויים לעתים קרובות מאוד בהרכב המתחם הנבדק על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. בדרך כלל תרכובות המכילות אטומים כבדים יותר לייצר דפוס עקיפה גדול יותר, ובכך דורשים גבישים קטנים יותר. בדרך כלל, גבישים בודדים עם פרצופים מוגדרים היטב הם אופטימליים, ובדרך כלל עבור תרכובות אורגניות, הגבישים צריכים להיות גדולים יותר מאלה המכילים אטומים כבדים. ללא גבישים מעשיים, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן אינה ריאלית. חלק מהמולקולות הן גבישיות יותר מטבען מאחרות, ולכן הקושי להשיג גבישים באיכות קרני רנטגן יכול להשתנות בין תרכובות. הצמיחה של גבישי רנטגן דומה לתהליך של recrystallization המשמש בדרך כלל לטיהור תרכובות, אבל עם דגש על ייצור גבישים באיכות גבוהה יותר. לעתים קרובות, גבישים באיכות גבוהה יותר ניתן להשיג על ידי מתן אפשרות לתהליך התגבשות להמשיך לאט, אשר עלול להתרחש במהלך יום או חודשים.
1. הכנת צינור הבדולח והמסנן
- מניחים צינור NMR בבקבוק ארלנמייר.
- הכן מסנן פיפטה.
- בנו את המסנן על ידי הנחת חתיכת מגבון ללא מוך (1 אינץ' על 1 אינץ') בפיפטה, ולאחר מכן השתמשו במוט כדי לתקוע בחוזקה את המגבון בחלק צוואר הבקבוק של הפיפטה(איור 1).
- הפוך שני מסנני פיפטה לכל צינור גביש צורך.
2. הוספת הדגימה לצינור הקריסטל
- ממיסים את התרכובת (טטרפנילפורפירין, 10 מ"ג) ב-0.75 מ"ל של ממס (דיכלורומתאן).
- עם פיפטה, מוסיפים בעדינות את התערובת לחלק העליון של הצינור, על ידי העברתו דרך המסנן.
- החלקיקים מסוננים כדי למנוע יצירת אתרי התגרענות, אשר יכול להוביל גבישים מרובים קטנים במקום גבישים יחיד גדול יותר הרצוי.
- לאחר המדגם הונח בצינור הגביש, לאט ובעדינות רבה, להוסיף את אנטי ממס (1.5 מ"ל של מתנול) לצינור באמצעות pipette מסנן חדש. אפשרו לאנטי-ממס לשכב באיטיות על הפתרון שנוסף בעבר (איור 2). אין להשתמש בנורה כדי לדחוף את הממס דרך הפיפטה, במקום זאת לאפשר לממס לזרום דרך המסנן בפני עצמו.
- ודא כי ממס של צפיפות גבוהה יותר מתווסף צינור הגביש הראשון.
- בדוק כי שני הממסים הם miscible אחד עם השני. זה נעשה לפני הוספת הממס.
- לאטום את הצינור עם כובע NMR.
3. צמיחת קריסטל
- מבלי לגרום לשני הממיסים להתערבב, מניחים את צינורות הקריסטל בארון שבו הם לא יופרעו.
- זמן ההתגבשות ישתנה עם כל תרכובת - בדרך כלל צינורות הקריסטל צריכים להישאר ללא הפרעה במשך שבוע.
- לאחר שבוע, לבדוק את הצינורות לצמיחת גביש.
- צמיחת גביש מתרחשת בדרך כלל בממשק של שני הממיסים.
- בדוק חזותית את הצינורות לראיות לצמיחת גביש. היזהר לא להקל על ערבוב של הממסים, במקרה המתחם דורש זמן נוסף להיווצרות קריסטל.
- אם נראה כי צמיחת הגביש התרחשה, בדוק עוד יותר את הצינורות באמצעות מיקרוסקופ.
4. בחירת קריסטל
- גבישי עקיפה של קרני רנטגן צריכים להיות פנים מוגדרות היטב.
- יש להימנע מגבישים שהתקבצו יחד במידת האפשר.
- השאירו את הגבישים בצינור הגביש עד שיהיו מוכנים לקצור את הגביש, מיד לפני הנחת הגביש על הדיפרקטומטר.
- שמירה על הגבישים בצינור תבטיח שהגבישים יישארו פתים. טיהור יכול לגרום גבישים להיסדק, ולעכב את עקיפה של הגביש.
איור 1. תמונה של מסנן הפיפטה. חתיכה קטנה של מגבון ללא מוך נתקעה בחוזקה על צוואר הבקבוק של הפיפטה. הפתרונות מועברים למרות מסנני פיפטה אלה לפני שהוצגו לצינור הגביש.
איור 2. ברגע הפתרון המכיל תרכובת ממוקדת ממוקם בצינור הגביש, האנטי ממס הוא שכבה איטית על גבי על ידי העברת אותו דרך מסנן פיפטה חדש.
נדרש גביש יחיד לקביעת מבנהו. איכות הגביש משפיעה מאוד על איכות ודיוק הקביעה המבנית.
גביש בודד הוא מוצק שבו סידור המולקולות חוזר על עצמו בכל שלושת הממדים. ניתן לקבוע את הסידור המרחבי של האטומים בתוך המוצק הגבישי באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. בטכניקה זו, דגימה גבישית טהורה עטופה בקרן קרני רנטגן. הגביש מפזר את קרני הרנטגן בדפוס ייחודי הקשור למבנה הגבישים ולהרכב המולקולרי. אם גביש נוצר מהר מדי, המולקולות עלולות להיות לא מסודרות, זיהומים עשויים להיות משולבים בגביש, או ששני גבישים או יותר מאוחים עשויים להיווצר במקום גביש בודד. לכן, יש צורך בשיטות מיוחדות עם דגש על צמיחה איטית כדי לייצר גבישים באיכות מספקת לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן.
סרטון זה ימחיש את המאפיינים הרצויים של גבישים באיכות רנטגן, ידגים הליך לגידולם, ויציג מספר יישומים של טכניקה זו בכימיה.
אלקטרונים מפזרים קרני רנטגן על ידי פליטת גל רנטגן כדורי בעת פגיעה. אם האטומים נמצאים בסידור מסודר, התאבכות בונה בין הגלים מייצרת דפוס עקיפה אופייני בגלאי רנטגן. הגביש מסובב בתוך הקורה כדי לאסוף דפוסי עקיפה מזוויות מרובות. עם דפוסי עקיפה מספיקים, ניתן לגזור את המבנה המולקולרי.
גבישים באיכות רנטגן יוצרים בדרך כלל צורות סימטריות ויש להם פנים חלקות ומחזירות אור. כאשר מסתכלים עליהם במיקרוסקופ מקטב, הם יהיו שקופים, אך רובם אמורים להיות כהים כאשר הם מסובבים 90?. זה מצביע על מבנה מסודר מאוד. כדי לגדל גבישים אלה, משתמשים לעתים קרובות בדיפוזיה נוזלית-נוזלית. זה משתמש בשני ממיסים הניתנים לערבוב: ממס בצפיפות נמוכה, או משקע, שבו התרכובת שיש להתגבש מחדש אינה מסיסה; וממס בצפיפות גבוהה שבו התרכובת מסיסה. בדרך כלל, היחס הנפחי בין משקעים לממס הוא 2:1.
המשקע בצפיפות נמוכה מונח על תמיסה מרוכזת של התרכובת בממס בצפיפות גבוהה. עם הזמן התרכובת הופכת פחות מסיסה ככל שהמשקע מתערבב עם התמיסה. ממשק ממס קטן יותר מביא לקצב דיפוזיה איטי יותר, ובכך מניב גבישים גדולים וטהורים יותר. כעת, לאחר שהבנתם את העקרונות של גידול גבישים באיכות רנטגן, בואו נעבור על הליך גידולם על ידי דיפוזיה נוזלית-נוזלית.
כדי להתחיל, השג את הציוד הדרוש שנמצא בפרוטוקול הטקסט. רכשו ממס לתרכובת ומשקעים פחות צפופים.
להכנת מסנן פיפטה, הנח חתיכה קטנה של Kimwipe בחלק העליון של פיפטה מזכוכית ולחץ בעדינות את הנייר כלפי מטה לתחתית גוף הפיפטה באמצעות מוט או גבעול של פיפטה אחרת, היזהר לא לנקב את הנייר. הכן שני מסנני פיפטה. הנח אחד בצינור ה-NMR. במידת הצורך, אבטח את המכלול עם מהדק מעבדה ומעמד טבעת. ממיסים כ -10 מ"ג מהתרכובת להתגבש מחדש ב -0.75 מ"ל ממס.
כעת, הוסף בזהירות את תמיסת הדגימה למסנן הפיפטה. הצמד נורה למעלה וסחט לאט כדי להעביר את התמיסה לתוך צינור ה-NMR כדי להסיר זיהומים מוצקים. אל תאפשר לנורה להתרחב מחדש בזמן שהיא מחוברת, מכיוון שהיניקה תעקור את נייר המסנן.
לאחר מכן, הסר את מסנן הפיפטה המשומש והנח את המסנן השני לתוך צינור ה-NMR. פיפטה כ -1.5 מ"ל של משקעים לתוך הצינור. אפשר לממס לעבור דרך המסנן על ידי כוח הכבידה. מעתה ואילך, הקפד לא להפריע לפילטר במהלך מניפולציות כלשהן. לאחר שכל המשקעים הסתננו לתוך הצינור, הסר את המסנן ומכסה את הצינור. הנח אותו בארון או במקום אחר שנבדק בקלות בו הוא לא יתרגש.
לאחר יום אחד לפחות, בדוק את הצינורות לצמיחת גבישים.? אם אין גבישים או שהגבישים קטנים מאוד, השאר את צינור הדגימה ללא הפרעה. אם גבישים נראים לעין, בדוק את גודלם וצורתם מבלי להפריע לשכבות הממס.
אם הגבישים גדולים, מוגדרים היטב ואינם מקובצים יחד, בדוק את הגבישים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא את הפוטנציאל שלהם להיות באיכות קרני רנטגן. אל תסיר את הגבישים מהצינור עד שהדיפרקטומטר מוכן להתחיל בסריקה. אם מולקולות ממס משולבות במבנה הגביש, מתן אפשרות לגביש להתייבש יפגע בגביש. באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, המבנה המולקולרי של גבישים אדמדמים-סגולים כהים אלה אומת כטטרפנילפורפירין.
קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן היא כלי אנליטי חיוני בכימיה ובביוכימיה.
שיטות התגבשות מחדש כוללות חימום וקירור, דיפוזיה נוזלית-נוזלית, דיפוזיה של אדים ואידוי איטי. באידוי איטי של מערכת ממס יחידה, התרכובת מומסת בכמות קטנה של ממס ומניחה במיכל עם חור קטן במכסה. כאשר הממס מתאדה, הריכוז עולה עד שהתרכובת מתחילה להתגבש.
הפונקציונליות של חלבונים קשורה לרוב למבנה שלהם. עם זאת, חלבונים יכולים להיות קשים מאוד להתגבש. יש לפתח טכניקות מיוחדות לגידול גבישי חלבונים באיכות רנטגן. כאן, טיפת תמיסת חלבון מעורבבת עם טיפת משקעים ותערובת זו אטומה בתא עם משקעים טהורים. כאשר אדי הממס מתפזרים מהטיפה, מסיסות החלבון בטיפה פוחתת, והחלבון מתגבש לאט. טכניקה נוספת מערבבת את תמיסת החלבון והמשקעים מתחת לשמן מינרלי. באמצעות טכניקות אלה, ניתן לגבש מגוון חלבונים לניתוח.
בעקיפה של אבקה, כל אוריינטציה מרחבית אפשרית מיוצגת בדגימה בו זמנית. עקיפה של אבקה אינה אינפורמטיבית על מבנה כמו עקיפה של קרני רנטגן גבישיות בודדות בגלל אובדן נתוני מבנה תלת מימדיים. במקום זאת, עקיפה של אבקה מצטיינת בניתוח תערובות של מוצקים גבישיים ובהערכת הגבישיות של מבנים אמורפיים.
זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE לגידול גבישים לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. כעת עליכם להכיר את תכונותיהם של גבישים באיכות רנטגן, הליך לגידולם, וכמה יישומים של טכניקה זו בכימיה.
תודה שצפית!
הטכניקה של דיפוזיה נוזלית-נוזלית שימשה ליצירת גבישים באיכות קרני רנטגן של טטרפנילפורפירין. באמצעות dichloromethane כמו ממס מתנול כמו אנטי ממס, הנוזלים הורשו מפוזרים לאט במשך שבוע מבלי להיות מופרע. גבישים סגולים-אדמדמים גדולים, מוגדרים היטב, נוצרו בממשק של שני הממיסים (איור 3). הצמיחה של הגבישים ניתן לראות חזותית. הגבישים גדלו עם פרצופים מוגדרים היטב, אשר ניתן לראות עם מיקרוסקופ.
גבישים באיכות קרני רנטגן יכולים לגדול על ידי דיפוזיה נוזלית נוזלית. דיפוזיה איטית של מערכת הממס הבינארית מאפשרת יצירת גבישים המתאימים לעקיפת קרני רנטגן. שיטה זו מאפשרת לסריג הגביש להיווצר לאט, ולעתים קרובות מובילה גבישים גדולים ומוגדרים יותר. השימוש בצינורות NMR מקל על דיפוזיה איטית של הממסים, ומאפשר צמיחת גביש אופטימלית. תהליך זה יכול להימשך בין כמה ימים למספר חודשים. לעתים קרובות במהלך תהליך התגבשות מולקולות ממס משולבים לתוך סריג הגביש. לכן חשוב להימנע מלאפשר גבישים "להתייבש". לכן, אחד היתרונות של דיפוזיה נוזלית-נוזלית...
Chapters in this video
0:00
Overview
1:23
Principles of Growth for X-ray Crystallography
3:04
Sample Preparation
3:57
Liquid-Liquid Diffusion
4:57
Crystal Selection and Results
5:49
Applications
7:34
Summary
Videos from this collection: