הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

הליך זה מתחיל בקציר העכבר, עצם הירך והשוקה. לאחר הסרת מפרקי הירך, הברך והקרסול, מח העצם מבודד באמצעות הזרקת מדיום RPMI לקצה הפתוח של העצם. לאחר השגת תרחיף של תא בודד, תאי מח העצם מתמיינים לתאי פיטום, נטענים לתוך 96 לוחות אלקטרופורציה של בארות, ולאחר מכן עוברים טרנספקציה.

שימוש בפולס הגן או במערכת האלקטרופורציה של תאי MX. באמצעות פרוטוקולי פולסים של גל מרובע, ניתן להשיג יעילות טרנספקציה של כ-30%. השלב הראשון בהליך הוא קצירת מח עצם מעצם הירך ועין השוקה של עכבר בן שישה עד 12 שבועות.

כדי להתחיל בהמתת חסד של העכבר על ידי שאיפת CO2, קצרו את עצם הירך ועין השוקה מהרגליים האחוריות של כל עכבר. לאחר מכן בעזרת סכין הגילוח, חותכים כל קצה של עצם הירך כדי להסיר את מפרקי הירך והברכיים ולחשוף את המח בצורה דומה. חותכים כל קצה של עין השוקה כדי להסיר את האזורים הסמוכים לברך ולקרסול ולחשוף את המח.

לאחר מכן, קחו מזרק עם מחט בגודל 26 וחצי וזרקו RPMI בתוספת 10% FBS, פניצילין, סטרפטומיצין, בימר, אתנול קפיטה ו-L-גלוטמין. בעזרת פינצטה, החזק את העצם מעל צלחת פטרי המכילה מדיה RPMI. הכנס את מחט המזרק לקצה אחד של העצם ולחץ על הבוכנה כדי לשטוף את מח העצם.

ניתן להזיז את מחט המזרק למעלה ולמטה בתוך העצם כדי לשטוף את שאריות המח. חזור על ההליך עבור כל העצמות ואז המשך בהקמת התרבויות כדי להקים את צינור תרביות מח העצם. הימר על מח העצם הסמוק למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפרק את הרקמה לתרחיף תאים.

לאחר מכן הניחו מסנן של 70 מיקרון על גבי צינור חרוטי של 50 מיליליטר והוסיפו את מתלה התא למסנן. לאחר מכן, שטפו את צלחת הפטרי פעם אחת עם RPMI. לאחר מכן הוסיפו את השטיפה למסנן 70 מיקרון באמצעות קצה הגומי של בוכנת מזרק מיליליטר טוחנים את חלקי מח העצם שנותרו על גבי מסנן 70 מיקרון.

שטפו את המסנן פעם אחת עם RPMI לאחר שטיפת המסנן. צנטריפוגה את מתלה התא ב -1200 סל"ד למשך חמש דקות. שטפו את כדור התא על ידי השעיית Resus ב-PBS.

ספרו את התאים באמצעות ציטומטר המו. בדרך כלל אנו משיגים כ-90 מיליון תאים מעצמות של עכבר אחד, שתי עצם ירך ועוד שתי טיביה. לאחר ספירת התאים, צנטריפוגה אותם שוב ב-1200 סל"ד למשך חמש דקות.

השעו מחדש את התאים בכמות קטנה של RPMI והכניסו אותם לצלוחיות תרבית רקמה, המכילות מספיק RPMI כך שהריכוז הסופי הוא מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן הוסף ציטוקינים כדי לקדם את התפתחות סוג התא המעניין שלך. במקרה זה, הציטוקין אינטרלוקין 3 מתווסף כדי לקדם את התפתחותם של בזופילים ותאי פיטום כדי לרכוש בזופילים דוגרים במשך 10 ימים עבור תאי פיטום דוגרים במשך חמישה שבועות בעת יצירת תאי פיטום.

יש להחליף את המדיה ואת IL 3 פעם בשבוע. הנה מבט על איך תאי מח עצם צריכים להופיע מיד לאחר הציפוי. תמונה זו מדגימה את ההתמיינות של תאי מח עצם לבזופילים ותאי פיטום 10 ימים לאחר הוספת אינטרלוקין 3.

לאחר קבלת סוג התא הרצוי, המשך בשלב האלקטרופורציה. כדי להתחיל את שלב האלקטרופורציה, קבע את מספר התאים בתרבית. תאי בקבוק עוברים בדרך כלל אלקטרופוטציה בצפיפות של 10 מיליון למיליליטר.

אז העבירו את מספר התא הנדרש לצינורות חרוטיים וצנטריפוגה את הצינורות ב-1200 סל"ד למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה יש לשאוב את המדיה, לשטוף את התאים עם XPBS אחד וצנטריפוגה שוב ב -1200 סל"ד למשך חמש דקות. לאחר מכן שאפו את ה-PBS והוסיפו מאגר אלקטרופורציה של פולסר של הגן BioRad כדי ליצור תרחיף תאים של 10 מיליון תאים למיליליטר.

לאחר החייאת התאים, הוסף את ה-DNA של הפלסמיד הרצוי בריכוז סופי של 10 עד 20 מיקרוגרם למיליליטר. מערבבים בעדינות את תמיסת התא אקווה 150 מיקרוליטר של תרחיף התאים לבארות לבחירתך על צלחת אלקטרופורציה של 96 בארות. לאחר מכן, הכניסו את לוחית האלקטרופורציה לתא צלחת ה-MXL וסגרו את המכסה לפני טרנספקציה של תאי מח עצם ואלקטרופורציה.

יש לתכנת את הפרוטוקול לתוך ה-MXL אלא אם כן משתמשים בפרוטוקול מוגדר מראש או מאוחסן באמצעות ניסויי אופטימיזציה, גילינו שיעילות הטרנספקציה הגבוהה ביותר של תאי מח עצם מתרחשת באמצעות פרוטוקולי דופק גל מרובע. אנו נשנה את תנאי האלקטרופורציה על הצלחת כדי לספק פולסים של גל מרובע ב-2000 מיקרו-phs באלף אוהם. לאחר הגדרת הפרוטוקול והעמסה על המכשיר, לחץ על הדופק כדי לאכול את התאים לאחר השלמת האלקטרופורציה, והעביר את התאים לצלחת תרבית רקמה.

בדרך כלל אנו מעבירים כל דגימת אלקטרופורציה של 150 מיקרוליטר לבאר בצלחת תרבית רקמה של 48 בארות המכילה 300 מיקרוליטר RPMI עם 10 ננוגרם למיליליטר. אינטרלוקין שלושה תאים מודגרים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ואז נבדקים 24 שעות לאחר מכן לביטוי ודיכוי. זוהי תמונת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של התאים.

לאחר אלקטרופורציה מוצלחת באמצעות 20 מיקרוגרם לפלסמיד GFP מיליליטר, באמצעות מערכת האלקטרופורציה של תאי MX, ניתן להשיג יעילות טרנספקציה של כ-30%. המערכת מאפשרת לך לשנות את התנאים כדי למקסם את יעילות הטרנספקציה שלך תוך שמירה על כדאיות התא. מערכת תאי ה-MX שימושית במיוחד עבור תאי יונקים ראשוניים כגון תאים המטופויאטיים של עכברים אלה.

זה עתה הראינו לכם כיצד לבודד תאי מח עצם מעכברים ולהעביר תאי פיטום מובחנים באמצעות מערכת אלקטרופורציה של תאי MX. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.