Name: Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר ציק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: למדו אינדוקציה עצבית בעוברי צ'יק באמצעות שתילת Hensen's node מסומן בצבע פלואורסצנטי. השיטה כוללת תרבית של 24 שעות, חמצון פוטוכימי וכימות in-situ עם סמן עצבי לזיהוי גורל עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DP הוא חתן פרס רות Kirschstein DA021977 1F32-01A1 מן המכון הלאומי האמריקני לשימוש בסמים. עבודה זו נתמכה על ידי מ &#39;מרגרט Alkek קרן אל RHF.

<html> I. סקירה סכמטית: <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_2/Figure1.png" alt="איור 1" width="460" height="384" /> סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים assay לזירוז העצבית בעובר האפרוח. ראשית, העובר המארח explanted בתרבות חדשות [NI1]. לאחר מכן, הוא עובר donnor explanted ב מליחים הצומת של Hensen (להלן: &quot;המארגן&quot; של חומוס) מסומן עם פלורסנט DiI לצבוע [NI2]. הצומת של Hensen הוא נכרת מן העובר donnor [NI3] ו המושתלים לעובר לארח [NI4, NI5]. העובר המארח הוא תרבותי אז עד 22 שעות, לאחר תקופת רקמות donnor יש המושרה ציר חוץ רחמי באזור המארח opaca [NI6]. בעקבות התרבות, העובר מארח קבוע ומעובד photooxidation בנוכחות DAB: לפי התגובה הכימית, תאים donnor הנגזרים, אשר מופיעים תחת אדום פלואורסצנטי FITC לפני photooxidation [NI7], להיות עם חום התגובה הבאה DAB [NI8]. העובר מעובד ואז ב הכלאה באתרו בטוש עצביים [NI8]; רקמות מארח נגזר יצרה רקמה עצבית בנוכחות השתל donnor. רקמה זו מופיעה כחול. 1: הכנת העובר מארח לתרבות חדש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה פרוטוקול עצביים assay אינדוקציה מתחיל עם ביצים, כי כבר מודגרות כדי המבורגר &amp; שלב המילטון 3 + (או HH3 +). ביצים אלה היו מודגרות הניח בצד שלהם בתוך חממה ולח במשך 13 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את העובר מארח לתרבות החדשה (3.1 צעדים. ל 5.5 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את פני השטח של העובר לארח עם מלח 200 μl. זה יקל על העברת מאוחר יותר והמיקום של השתל donnor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לכסות את הרכבה עם צלחת הפוכה פלקון 35 מ&quot;מ תרבות. </li></ol> 2: Explanting העובר donnor ב מלוחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הביצה על ידי הקשה על הקליפה עם מלקחיים והסרת חתיכות של הקליפה, סביב הקליפה. הסרת החלק העליון של הקליפה וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אלבומין עבה עם מלקחיים, ו להטות את שק החלמון עם מלקחיים גס כל כך עובר את פניהם כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים בסדר, לחתוך ריבוע של שק חלמון סביב העובר. מוציאים את העובר מן החלמון עם כפית, ומניחים צלחת ובה PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לנתק את העובר donnor מאזור pellucida. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת donnor עובר לצלחת מכוסה Sylgard המכיל PBS. </li></ol> 3: תיוג, גוזמות ואת השתלת שתל donnor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת חולץ microelectrode, למשוך 50 pipettes זכוכית μl microcapillary. מתחת למיקרוסקופ, לחתוך את קצה micropipette באמצעות מלקחיים בסדר. Micropipette מקום בצלחת פטרי מרופדת עם סרט של הפלסטלינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון צבע אשר ישמש את התווית לפני השתלת שתל: carbocyanine לצבוע DiI (1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3 &quot;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט): ראשית, להכין מלאי של DiI ב 1ml אתנול מוחלט על 0.5%. מלאי זה יכול להיות מאוחסן על 20C-בחושך. באמבט מים נקבע על 42 ° C, prewarmed לערבב 40 μl מניות DiI כדי סוכרוז 0.3M 360μl. טמפרטורת המים באמבטיה הוא הכרחי על מנת למנוע משקעים של DiI היווצרות של גבישים לא מסיסים. בקצרה ספין פתרון spectrafuge מיני (שניות 50-10). הפתרון DiI עכשיו הוא מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סיכות חרקים, לאבטח את העובר donnor בתחתית צלחת מכוסה Sylgard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גב למלא את micropipette עם DiI. על ידי הפעלת לחץ עדין באמצעות הרכבה צינור aspirator, להחיל בולוס קטן DiI לצומת של Hensen. ודא את הצומת כולו של Hensen מסומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה microcapillary או סכין microdissecting, לחתוך הצומת של Hensen (&quot;מארגן&quot;, שתל donnor). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את הצד הגחוני ולסיים האחורי של השתל עם ארגמן. פעולה זו תבטיח כי השתל ממוקם עם אוריינטציה dorso-הגחון ראוי בשלב 4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש 200μl Gilson פיפטה, העברת שתל לעובר המארח. </li></ol> 4: אבטחת שוחד culturing העובר מארח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מלוחים מעובר המארח, מוודא שתל נשאר מיקומו בסמיכות עם האתר המארח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה microcapillary או סכין microdissecting, לעשות חתך קטן (80-100μm) באזור pellucida / אזור אזור opaca הגבול, ברמה של הצומת של Hensen של העובר המארח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה microcapillary או microdissecting, מיקום הסכין, כך שתל בצד הגחון פנים כלפיכם, ואת הקצה האחורי מקביל לאזור המקבילה העובר המארח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מלוחים הנותרים, והתהליך העובר מארח לתרבות חדשה עבור שעות 81-22 (6.1-6.6 צעדים 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר מארח קבוע אז לילה ב 4 ° C (7.1-7.7 צעדים 9). </li></ol>דואר &quot;&gt; 5: Photooxidise השתל מתחת פלואורסצנציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע קטר, להכין פתרון DAB עובד טריס חיץ: ממיסים מצע DAB (3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride) ב טריס חיץ (100mm טריס-HCl, pH 7.4) בשעה 500μg/ml; לשמור על פתרון בחושך, על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העובר פעמיים PBS עבור 5 mn כל פעם טריס חיץ במשך 5 mn. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העובר לשקופית זכוכית חלל המכיל 1 חיץ מ&quot;ל טריס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הפתרון למאגר טריס עם פתרון DAB 1.5 מ&quot;ל. השלך Eppendorf קצה בדלי המכיל פתרון אקונומיקה 10% על מנת לטהר DAB. מניחים coverslip על גבי השקופית חלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת פלואורסצנטי (isothiocyanate והעמסת) FITC, למקד את המטרה של המיקרוסקופ על השתל (תאים donnor יופיעו אדום ניאון) ולחשוף את הקרינה FITC עד שכל התאים האדומים פלורסנט הפכו חום (זה קורה כתוצאה של DiI fluorochrome להיות photoconverted כדי גבישים חומים מסיסים, על ידי חשיפה גל עירור FITC (488nm) בנוכחות DAB. תהליך זה לוקח בין 20 mn ו 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת התגובה photooxidation, להסיר את coverslip באמצעות מלקחיים בסדר. העברת העובר על זכוכית בקבוקון המכיל 20 מ&quot;ל scintillation PBTw (או PBS עם 0.1% Tween-20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל DAB מ coverslip והחלק זכוכית חלל על ידי דוגרים בפתרון אקונומיקה 10%. </li></ol> 6: תהליך העובר על בצילום באתרו הכלאה, וכן חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ב הכלאה באתרו (3.7-6.5 צעדים 9), דוגרים העובר רק DIG בדיקה שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לצלם (שלב 8.2 9) חתך (צעדים 8.3 ו 8.4 9). </li></ol> נציג תוצאות בדוגמה הבאה של assay השראה עצבית, השתל donnor מוצג להשרות את הביטוי של חסרי זנב את הסמן מן הרקמה העצבית מארח נגזר. בדוגמה זו בפרט, אנו העריכו את רכישת יכולת גרימת העצבית של אזורים עובריים אשר בדרך כלל אין את היכולות &quot;מארגן&quot;: השתל donnor שמקורו בעובר שבו האזור &quot;מארגן&quot; הוסר בניתוח בשלב מן העובר donnor 3 +. בעקבות אבלציה, העובר donnor מותר לפתח תרבות חדשה, עד החור הגליד ואת מבנה הדומה הצומת של Hensen יצרה. מבנה זה מסומן אז עם DiI, נכרת מן העובר donnor ו מורכבים לגבול pellucida / אזור אזור opaca של העובר שורה. בעקבות התרבות החדשה, ציר מיניאטורי נוצר העובר בסמוך המארח: זה ציר מיניאטורי כולל מוט של תאים אדומים (donnor נגזר) ומבנה הראש כמו (המארח נגזר): ב (א), donnor הנגזרות DiI שכותרתו תאים מוצגים לפני קיבוע תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי FITC. אלה donnor הנגזרות התאים התרבו כדי ליצור notochord מיניאטורי, המופיע כמו מוט של תאים אדומים. (ב) בעקבות photoconversion של DiI, אלה donnor הנגזרות תאים להופיע חום. שתל donnor יש המושרה היווצרות של רקמה עצבית מהמחשב המארח: רקמה זו מורכבת מבשרי עבור המוח, כפי שמתגלה למטרות הבאות סמן חסרי זנב של הכלאה באתרו על ידי הביטוי שלהם [נדפס מתוך 6]. <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_3/Figure 2.png" alt="דמות 2" width="230" height="154" /> הערה: הליך זה, השתמשנו בתאי DiI שכותרתו כדי לבדל עצביים וגורם donnor רקמות (אדום / חום) של המחשב המארח נגזר רקמות &quot;עצבית&quot; (כחול). במקום להשתמש חומוס נגזר, DiI שכותרתו שתל donnor, חלק מחברי להשתמש גם רקמות donnor שמקורם בעוברים שליו במקום חומוס [למשל 6]. זו שיטה חלופית גם מאפשר לבדל donnor מרקמות המארח. במקרה זה, את השתל (רקמה donnor) מקורו ביצי שליו במקום ביצי תרנגולת. בעקבות צעד 4.5, המארח מעובד עבור אימונוהיסטוכימיה הר שלם עם נוגדן ספציפי שליו רקמות (QCP1) וצעדים 3.1-3.4 ו 5.1-5.7 מושמטות מן הפרוטוקול. דוגמה של הליך זה אלטרנטיבה מוצג להלן: במקרה זה, השתמשנו בהליך ניסיוני זהה A, B, אבל השתמשנו שליו שמקורם ברקמה donnor (כפי שמוצג על ידי ביטוי של נוגדן QCPN [חום]): מחדש צומת שמקורם בעובר שליו מושרה יש את הביטוי של פאן עצביים סמן Sox2 ב לארח את [נדפס מתוך 6]: <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_4/Figure 3.png" alt="איור 3" width="154" height="230" />

<ol><li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+development+of+chick+and+duck+embryos%2C+cultivated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B%22%5BJournal%5D)">Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro.</a> Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).</li>
<li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+by+the+primitive+streak+and+its+derivatives+in+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick.</a> J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+et+transplantation+des+diff%26eacute%3Brentes+r%26eacute%3Bgions+de+la+ligne+primitive+chez+le+poulet%5BTitle%5D)+AND+%22C.+R.+Ass.+Anat%22%5BJournal%5D)">Excision et transplantation des diff&eacute;rentes r&eacute;gions de la ligne primitive chez le poulet.</a> C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+induction+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Morph.+9%22%5BJournal%5D)">Primary induction in birds.</a> Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+neural+crest+cell+migration+in+the+mouse+embryo+as+revealed+by+vital+dye+labeling.+Development+108%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108.</a> , 605-612 (1990).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo.+Development+122%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122.</a> , 3263-3273 (1996).</li>
<li>Joubin, K., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+continuously+define+the+organizer+during+the+cell+movements+of+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation.</a> Cell. 98, 559-571 (1999).</li>
<li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. , 406-474 (2000).</li>
<li>Psychoyos, D., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Culture+of+Early+Chick+Embryos+ex+vivo+%28New+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture.</a> JoVE. 20, 10-3791 (2008).</li>
</ol>

סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים בביצוע assay לזירוז עצביים; זה assay משמש בעיקרו על אפיון של המשוערת מולקולות גרימת עצבית חומוס, וכך ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים, החל micromanipulations העוברית 1-4; 6 אל מפלי נפרמים חדש איתות 7,8, כולם במטרה להבין את השלב הראשוני במבנה של המוח ומערכת העצבים הנותרים.

<table><tbody><tr><td>ביציות</td><td>בעל חיים</td><td>Charles River Laboratories</td><td>פורטיל פרימיום (Premium Fertile)</td><td>מופרית, HH3+ (14 שעות)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאוסקופי</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5 או דומה לו</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור להכלאה (היברידיזציה)</td><td>ציוד</td><td>Robbins Scientific, SciGene</td><td>M1000</td><td>יש להשתמש עם צלח Pyrex הפוך ו-500 מ"ל ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;כוס כימית</td></tr><tr><td>מדגרה אוטומטית של Marsh</td><td>ציוד</td><td>ליון</td><td>מרשם</td><td></td></tr><tr><td>כלי Pyrex </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שען&amp;rsquo;זכוכית 50 מ"מ</td><td>כלי</td><td>VWR international</td><td>66112-060</td><td></td></tr><tr><td>טבעות זכוכית</td><td>כלי</td><td>מתקן התשתיות הפיזיות</td><td></td><td>חתוך מקטעים בעובי 4 מ"מ של צינור זכוכית (קוטר חיצוני 27 מ"מ, קוטר פנימי 25 מ"מ). אין לבצע ליטוש עדין.</td></tr><tr><td>פינצטה קמורה (1)</td><td>כלי</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה (2)</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td>הקצבה באמצעות אבן השחזה ו-100ul שמן מינרלי</td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>כלי פלסטיק למעבדה</td><td>כלי</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>נורית גומי</td><td>כלי</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>מכלול צינור שאיבה</td><td>כלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו&amp;#8211;מושך אלקטרודות</td><td>ציוד</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>מיקרופיפט להבקה/שריפה P-97 מבית Sutter Instruments</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת קפילרית מסוג פסטור</td><td>כלי</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>70950-12</td><td>עיגול הקצוות תחת להבה</td></tr><tr><td>תא תרבית</td><td>כלי</td><td>Pioneer Plastics</td><td>030C</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרו-קפילרי</td><td>כלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1049-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>סכין למיקרו-דיסקציה</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>השתמש כדי לנקב חללים לפני היברידיזציה במקום (in situ hybridization)</td></tr><tr><td>פינים דקיקים בקוטר 0.2 מ"מ</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>ערבב חלק אחד של חומר מקשה (Curing Agent) עם 9 חלקים של בסיס (Base); השאר למשך הלילה ב-37°C</td></tr><tr><td>דיאתילפירוקרבונט (depc)</td><td>ריאגנט</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>חומר השקשור ובסיס של אלסטומר סיליקון Sylgard 184</td><td></td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>ערבב חלק אחד של חומר עיקור (Curing Agent) עם 9 חלקים של בסיס (Base); השאר למשך הלילה ב-37°C</td></tr><tr><td>דיאתילפירוקרבונט (depc)</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>10025025</td><td>הוסף 1 מ"ל DEPC ל-1 ליטר PBS; נער; בצע סטריליזציה באוטוקלאב</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td></td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>15710</td><td></td></tr></tbody></table>

assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ&#39;יק

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

עובר אפרוח הוא כלי רב ערך במחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. שקיפות, שלה נגישות וקלות מניפולציה, ולהפוך אותו כלי אידיאלי לחקר היווצרות דפוסים הראשונית של מערכת העצבים. סרט הווידאו הזה מדגים כיצד רקמה מארגן השתל לתוך לארח, שיטה שבאמצעותה הצומת s Hensen (מארגן בעובר האפרוח) היא מורכבים כדי האאקטודרם מארח המוסמכות. שתל מארגן מורה שמעל na יש רקמת לאמץ גורל אותות עצביים באמצעות גרימת עצביים. מנגנון זה נקרא אינדוקציה עצביים, ומהווה את השלב הראשוני להיווצרות של המוח וחוט השדרה ב אמניוטים. שיטה זו משמשת בעיקר לאפיון המשוערת של מולקולות גרימת עצבית חומוס. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים assay לזירוז עצביים; ראשית, העובר donnor הוא explanted והצמיד על צלחת. ואז, העובר מארח מוכן תרבות חדשה. השתל הוא נכרת ו להשתיל את השוליים באזור המארח pellucida. המארח הוא תרבותי עבור 18-22 שעות. הרכבה הוא קבוע מעובד עבור יישומים נוספים (למשל הכלאה באתרו). שיטה זו פותחה במקור על ידי וודינגטון<sup&gt; 1,2</sup&gt; ו Gallera<sup&gt; 3,4</sup&gt;.

אינדוקציה עצבית היא הצעד הראשון ביצירת המוח. זהו המנגנון שבאמצעותו הצומת של Hensen (מארגן), מורה רקמות סמוכות לאמץ גורל עצביים, כלומר להצמיח מערכת העצבים. וידאו זה מדגים assay לזירוז העצבית בעובר האפרוח.

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ&#39;יק

עובר האפרוהו הוא כלי בעל ערך בחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. השקיפות שלו, הנגישות והקלות שבה ניתן לבצע בו מניפולציות, הופכות אותו ל...

סרטון זה מדגים את השלבים השונים בבדיקה להשראה עצבית בעובר אפרוח. ראשית, העובר המארח מועבר לתרבית חדשה, והעובר התורם מועבר לתמיסת סלין, כאשר קשרי הרנסון (Henson's node) מסומנים בצבע פלואורסצנטי. קשרי הרנסון מוצאים מהעובר התורם ומושתלים בעובר המארח.את עובר המאכסן מתרבלים למשך 24 שעות, מקבעים ומעבדים לחמצון פוטו-כימי תחת פלואורסצנציה. עם dab. העובר מעובד להיברידיזציה במקום (in-situ hybridization) עם סמן עצבי.שלום, אני דלפין ממעבדת פנל (Fennell) במרכז לרפואה סביבתית וגנומית באוניברסיטת טקסס A&M ביוסטון. היום נראה לכם הליך לביצוע בדיקות השראה עצבית בעובר של חולדה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי לחקור את ההשפעות של תרופות אנטי-אפילפטיות על תכונות ההשראה העצבית של צומת הנזן (Hensen's node).כעת נתחיל. עבור בדיקת ההשראה העצבית, יש להכין את הביצים. יש להדגיר ביצים אלו כשהן מונחות על צדן באינקובטור לח למשך 13 שעות, עד לשלב hamburger and Hamilton stage three plus או HH three plus.בשלב הבא, הכין את עובר המארח באמצעות שיטת התרבית החדשה, אשר הודגמה בעבר. ב-JoVE, כסה את פני השטח של עובר המארח ב-200 µL סליין. פעולה זו תקל על ההעברה והמיקום של הש Transplant מהתורם בשלב מאוחר יותר.לבסוף, כסו את המערכת באמצעות צלחת תרבית של Falcon בגודל 35 מילימטר הפוכה. כדי להוציא את העובר התורם, פתחו את הביצה על ידי הקשה על הקליפה באמצעות פינצטה. הסירו את חלקו העליון של הקליפה והשליכו אותו.הסיר את האלבומין העבה בעזרת פינצטה והטה את שק החלמון בעזרת פינצטה גסה כך שהעובר פונה כלפי מעלה. לאחר הסרת האלבומין, השתמש במספריים עדינים כדי לגזור ריבוע משק החלמון מסביב לעובר. הוצא את העובר מהחלמון בעזרת כפית והנח אותו בפיפטה המכילה PBS.בשלב הבא, השתמשו בפינצטה כדי לנתק את העובר התורם מהחלמון ומה-area lucida. לאחר הניתוק, העבירו את העובר התורם לצלחית מכוסה ב-SIL guard המכילה PBS לצורך סימון והשתלה של הש Transplant. השתמשו במכשיר למשיכת מיקרו-אלקטרודות כדי למשוך פיפטות מיקרו-קפילריות מזכוכית בנפח 50 µL תחת המיקרוסקופ.גזרו את קצה המיקרו-פיפט בעזרת פינצטה עדינה. הניחו את המיקרו-פיפט בתוך צלחת פטרי המרופדת ברצועת חימר פיסולי. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הצבע, שתשמש לסימון הש Transplant לפני ההשתלה.ראשית, הכין תמיסת מלאי של dye eye בריכוז 0.5% במיליליטר אחד של אתנול מוחלט. ניתן לאחסן תמיסת מלאי זו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס בחושך. לאחר מכן, בבלוק חימום המכוון ל-45 מעלות צלזיוס, ערבב 10 µL של תמיסת מלאי dai שחוממה מראש עם 90 µL של סוכרוז בריכוז 0.3 M. טמפרטורה זו נחוצה כדי למנוע שקיעה של dai והיווצרות של גבישים בלתי מסיסים.סובב את התמיסה קצרות בנספנריג'ה (mini SPECT fuge) למשך 5 עד 10 שניות. תמיסת ה-DAI מוכנה כעת לשימוש; השתמש בסיכות קיבוע לחרקים כדי לקבע את העובר התורם לתחתית של צלח sill guard כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. לאחר קיבוע העובר, מלא מחדש את המיקרו-פיפט עם D eye על ידי הפעלת לחץ עדין.באמצעות מערכת צינורות שאיבה, יש להחיל בולוס קטן של dai על קשר הנסון (henson's node). חזור על הפעולה, וודא שכל קשר הנסון מסומן כעת.באמצעות פיפטת מיקרו-קפילרית או סכין מיקרו-דיסקציה, חתכו את קשריו של הנסיך (henson's node). ניתן להבחין בין הצד הגבי (דורסלי) של הקשר לצד הבטני (ונטרלי) מכיוון שהצד הגבי יוצר חריץ, בעוד שהצד הבטני של הקשר הוא שטוח. במידת הצורך, סמנו את הצד הגבי של הש Transplant באמצעות אבקת קרמין. פעולה זו תבטיח שהשתל ימוקם באוריינטציית גב-בטן נכונה.באמצעות פפיטה גילסון של 10 µL, העבירו את השתל לעובר המארח באמצעות פפיטת מיקרו-קפילרית. קרבו את השתל לאזור ה-area lucida, אזור הגבול העכור בגובה ה-henson's node של עובר המארח. לאחר מכן, השתמשו בפפיטת מיקרו-קפילרית או בסכין מיקרו-דיסקציה כדי לבצע חתך קטן של 80 עד 100 µm באזור זה.גבול עמום של אזור לוסיטה בגובהו של קשר הנסון (henson's node) של עובר המארח. באמצעות פיפטה קפילרית מיקרוסקופית או סכין מיקרו-דיסקציה. מקמו את הש Transplant כך שהצד הוונטרלי פונה אליכם והקצה הפוסטריורי מקביל לאזור המקביל בעובר המארח O. לאחר המיקום, הסירו את הסליין מעובר המארח, תוך הבטחה שהש Transplant יישאר במיקום סמוך לאתר המארח, והעבירו את עובר המארח לתרבית חדשה למשך 18 עד 22 שעות כפי שמתואר בהגשה הקודמת שלנו.לאחר 24 שעות של תרבית, מוציאים את העובר מהאינקובטור ומקבעים אותו בנעצים בתוך צלחת סיגר. את ה-PBS מסירים ומחליפים ב-4% paraformaldehyde. לאחר מכן, מקבעים את העובר למשך 24 שעות.השליכו את המקבע למכל פסולת מסוכנת מתאים והוסיפו PBS לכלי הקיבוע. הסירו את סיכות החרקים בעזרת פינצטה לאחר שהסיכות הוצאו. השתמשו בפיפטה בעלת קצה קהה כדי להעביר את העובר למבחורת סינליגציה המכילה PBS.שטפו את העובר פעמיים ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם ופעם אחת בבופר twist למשך חמש דקות. לאחר השטיפה, העבירו את העובר לשקופית עם תא זכוכית המכילה 0.1 milliliters של בופר Tris. החליפו את תמיסת בופר ה-tris ב-0.1 milliliter של תמיסת DAB. השליכו את טיפ ה-einor לדלי המכיל תמיסת הלבנה.על מנת לבצע דקונטמינציה של DAB, הנח כיסית זכוכית מעל שקופית בעלת חלל תחת מיקוד פלואורסצנציה של FEI fluorescein isothiocyanate. העדשה של המיקרוסקופ המכוונת לתאי תורם השתלה תופיע באדום פלואורסצנטי; המשך את החשיפה לפלואורסצנציית FEI עד שכל התאים האדומים הפלואורסצנטיים יהפכו לחומים. תהליך זה קורה כתוצאה מהמרה פוטוכימית של הפלואורוכרום לגבישים חומים בלתי מסיסים עקב חשיפה לאורך גל העירור של FEI.4 88 nanometers בנוכחות dab. תהליך זה נמשך בין 20 דקות לשעתיים. עם השלמת תגובת הפוטו-חמצון, הסר את כיסוי הזכוכית באמצעות פינצטה עדינה.העבר את העובר לבקבוק סינצילציה של 20 milliliters המכיל PBTW או PBS עם 0.1%tween 20. לבסוף, בטל את פעילות ה-DAB מהכיסוי, מהזכוכית והחלל. החלק את הזכוכית על ידי דגירה בתמיסת הלבנה כדי לעבד את העובר לצורך ויזואליזציה.המשיכו בביצוע היברידיזציה במקום (in-situ hybridization), כאשר מדגרי אתו העובר עבור הגשוש המסומן ב-DIG בלבד. לאחר מכן, התחילו בצילום ובחיתוך כפי שמתואר בסרטון Jo השני. להלן דוגמה לבדיקת השראה עצבית.בתחילה, השתל ממוקם בגבול שבין ה-area lucita ל-area alpaca של עובר המארח. הן עובר התורם והן עובר המארח נמצאים בשלב three plus. לאחר תשע שעות בתרבית, השתל מתחיל להבדיל ולהשרות מבנה הנראה כראש מיניאטורי בשלב eight minus.לאחר 24 שעות בתרבית, האינדוקציה העצבית הושלמה בעקבות קיבוע. העובר עובר עיבוד להחמצנה פוטוכימית. בתחילה, ניתן לראות כי תאים המסומנים בצבע מהתורם התרבו כדי ליצור נוירומרקטוריזציה מיניאטורית, כפי שמוצג כאן בצבע אדום.לאחר חמצון פוטוכימי, תאים אלו נראים חומים. העובר מעובד לאחר מכן בשיטת whole mount in situ hybridization עבור הסמן העצבי Otx2 שפותח במעבדתו של ד"ר Bonelli.השת Transplant של התורם הראה כי הוא מעורר את הביטוי של OTX two מרקמה שמקורה במארח. הרגע הדגמנו כיצד לבצע בדיקת השראה עצבית בעובר של חולדה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להסיר את כל הנוזלים באזור שסביב השת Transplant לאחר ההשתלה באמצעות פיפטה.פעולה זו תבטיח שהשתל ימוקם בצורה מאובטחת ושלא יזוז מהעובר המארח במהלך התרבית. זהו כל התהליך. תודה. צפייה מהנה ובהצלחה בניסיונות שלכם.

assay-for-neural-induction-in-the-chick-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

קיים מגוון של גורמי גדילה וחלבונים אינטראקציה לגרום לתאים לקחת על גורלות תאים שונים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מדגימים את השימוש כהכנה אובו לכתובת האינטראקציות האפשריות בין חלבונים שונים בהתפתחות ידי הצבת חרוזים על E2.5 עוברי אפרוח.

הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם

וידאו זה מדגים כיצד לדמיין מסלולי axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים בחוט השדרה ניצול חומוס...

פענוח מסלולים axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים התחתית צ&#39;יק עצבית ניצול ב אובו Electroporation

גישה לנתח את ההגירה של תאים (תאי explanted רכס עצביים גזע) הוא תאר. שיטה זו היא זולה, עדינה, ומסוגלת להבחין chemotaxis משני chemokinesis והשפעות אחרות על קוטביות נדידה כגון אלה נגזרים מאינטראקציות תא תא בתוך התרבות העיקרית הגזע עצבי פסגת התא.

ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי

הגישה לניתוח הגירה גורלו הסופי של העופות לפסגה תאים עצביים שליו, חומוס עוברים chimeric מתואר. שיטה זו היא טכניקה פשוטה וישירה לאיתור תאים עצביים לפסגה במהלך הגירה והבחנה שקשה אחרת להבחין בתוך העובר גוזל unmanipulated.

ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה...

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

סרטון זה מדגים שיטה לבודד תאי עצב מהמוח הקדמי של עובר אפרוח בשלב מוקדם ולתרבית אותם במערך מיקרואלקטרודות ליצירת רשת עצבית.

בידוד וטיפוח תאי עצב עובריים של אפרוחים במערך מרובה אלקטרודות

איך רשתות עצביות נוצרות במוח העוברי היא שאלה בסיסית בנוירוביולוגיה התפתחותית. כאן אנו בשילוב טכניקת electroporation עם כלים גנטיים חדשים, כגון מערכת טרנספוזיציה DNA PiggyBac בתיווך במוח האחורי העופות לתייג interneurons גב ולעקוב אחר תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבי התפתחות שונים Cre / קס-פלסמידים ו.

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

כאן אנו מדווחים על תיוג כפול של תאי ציצה עצביים וכלי דם באמצעות השתלת צינור עצביGFP אפרוחים בשילוב עם הזרקת DiI תוך וסקולרית. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לנו לדמיין וללמוד בו זמנית את ההתפתחות של מערכת העצבים (האנטרית) הנגזרת מ- NCC ומערכת כלי הדם, במהלך אורגנוגנזה.

תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine

פרוטוקול רב-תכליתי זה מתאר את הבידוד של תאי פסגה עצבית קדם-מיגרטיבית (NCCs) באמצעות כריתה של קפלים עצביים גולגולתיים מעוברי אפרוחים. עם הציפוי והדגירה, NCCs נודדים מגיחים מתוך קצוות עצביים, מה שמאפשר הערכה של מורפולוגיה של תאים ונדידה בסביבה דו-ממדית פשוטה.

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

פרוטוקול זה פותח כדי לנטר לאורך זמן את התכונות המכניות של רקמת הצלחת העצבית במהלך נוירולציה של עובר אפרוח. הוא מבוסס על שילוב של מיקרוסקופ ברילואין ומערכת דגירה על הבמה, המאפשרת הדמיה מכנית חיה של רקמת לוחית עצבית בעוברי אפרוחים בתרבית לשעבר .

מעקב אחר האבולוציה המכנית של רקמה במהלך סגירת הצינור העצבי של עובר אפרוח

למדו אינדוקציה עצבית בעוברי צ'יק באמצעות שתילת Hensen's node מסומן בצבע פלואורסצנטי. השיטה כוללת תרבית של 24 שעות, חמצון פוטוכימי וכימות in-situ עם סמן עצבי לזיהוי גורל עצבי.

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ'יק

גלה סרטונים נוספים