Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ'יק
13 בפברואר 2009
אינדוקציה עצבית היא הצעד הראשון ביצירת המוח. זהו המנגנון שבאמצעותו הצומת של Hensen (מארגן), מורה רקמות סמוכות לאמץ גורל עצביים, כלומר להצמיח מערכת העצבים. וידאו זה מדגים assay לזירוז העצבית בעובר האפרוח.
סרטון זה מדגים את השלבים השונים בבדיקה להשראה עצבית בעובר אפרוח. ראשית, העובר המארח מועבר לתרבית חדשה, והעובר התורם מועבר לתמיסת סלין, כאשר קשרי הרנסון (Henson's node) מסומנים בצבע פלואורסצנטי. קשרי הרנסון מוצאים מהעובר התורם ומושתלים בעובר המארח.
את עובר המאכסן מתרבלים למשך 24 שעות, מקבעים ומעבדים לחמצון פוטו-כימי תחת פלואורסצנציה. עם dab. העובר מעובד להיברידיזציה במקום (in-situ hybridization) עם סמן עצבי.
שלום, אני דלפין ממעבדת פנל (Fennell) במרכז לרפואה סביבתית וגנומית באוניברסיטת טקסס A&M ביוסטון. היום נראה לכם הליך לביצוע בדיקות השראה עצבית בעובר של חולדה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי לחקור את ההשפעות של תרופות אנטי-אפילפטיות על תכונות ההשראה העצבית של צומת הנזן (Hensen's node).
כעת נתחיל. עבור בדיקת ההשראה העצבית, יש להכין את הביצים. יש להדגיר ביצים אלו כשהן מונחות על צדן באינקובטור לח למשך 13 שעות, עד לשלב hamburger and Hamilton stage three plus או HH three plus.
בשלב הבא, הכין את עובר המארח באמצעות שיטת התרבית החדשה, אשר הודגמה בעבר. ב-JoVE, כסה את פני השטח של עובר המארח ב-200 µL סליין. פעולה זו תקל על ההעברה והמיקום של הש Transplant מהתורם בשלב מאוחר יותר.
לבסוף, כסו את המערכת באמצעות צלחת תרבית של Falcon בגודל 35 מילימטר הפוכה. כדי להוציא את העובר התורם, פתחו את הביצה על ידי הקשה על הקליפה באמצעות פינצטה. הסירו את חלקו העליון של הקליפה והשליכו אותו.
הסיר את האלבומין העבה בעזרת פינצטה והטה את שק החלמון בעזרת פינצטה גסה כך שהעובר פונה כלפי מעלה. לאחר הסרת האלבומין, השתמש במספריים עדינים כדי לגזור ריבוע משק החלמון מסביב לעובר. הוצא את העובר מהחלמון בעזרת כפית והנח אותו בפיפטה המכילה PBS.
בשלב הבא, השתמשו בפינצטה כדי לנתק את העובר התורם מהחלמון ומה-area lucida. לאחר הניתוק, העבירו את העובר התורם לצלחית מכוסה ב-SIL guard המכילה PBS לצורך סימון והשתלה של הש Transplant. השתמשו במכשיר למשיכת מיקרו-אלקטרודות כדי למשוך פיפטות מיקרו-קפילריות מזכוכית בנפח 50 µL תחת המיקרוסקופ.
גזרו את קצה המיקרו-פיפט בעזרת פינצטה עדינה. הניחו את המיקרו-פיפט בתוך צלחת פטרי המרופדת ברצועת חימר פיסולי. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הצבע, שתשמש לסימון הש Transplant לפני ההשתלה.
ראשית, הכין תמיסת מלאי של dye eye בריכוז 0.5% במיליליטר אחד של אתנול מוחלט. ניתן לאחסן תמיסת מלאי זו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס בחושך. לאחר מכן, בבלוק חימום המכוון ל-45 מעלות צלזיוס, ערבב 10 µL של תמיסת מלאי dai שחוממה מראש עם 90 µL של סוכרוז בריכוז 0.3 M. טמפרטורה זו נחוצה כדי למנוע שקיעה של dai והיווצרות של גבישים בלתי מסיסים.
סובב את התמיסה קצרות בנספנריג'ה (mini SPECT fuge) למשך 5 עד 10 שניות. תמיסת ה-DAI מוכנה כעת לשימוש; השתמש בסיכות קיבוע לחרקים כדי לקבע את העובר התורם לתחתית של צלח sill guard כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. לאחר קיבוע העובר, מלא מחדש את המיקרו-פיפט עם D eye על ידי הפעלת לחץ עדין.
באמצעות מערכת צינורות שאיבה, יש להחיל בולוס קטן של dai על קשר הנסון (henson's node). חזור על הפעולה, וודא שכל קשר הנסון מסומן כעת.
באמצעות פיפטת מיקרו-קפילרית או סכין מיקרו-דיסקציה, חתכו את קשריו של הנסיך (henson's node). ניתן להבחין בין הצד הגבי (דורסלי) של הקשר לצד הבטני (ונטרלי) מכיוון שהצד הגבי יוצר חריץ, בעוד שהצד הבטני של הקשר הוא שטוח. במידת הצורך, סמנו את הצד הגבי של הש Transplant באמצעות אבקת קרמין. פעולה זו תבטיח שהשתל ימוקם באוריינטציית גב-בטן נכונה.
באמצעות פפיטה גילסון של 10 µL, העבירו את השתל לעובר המארח באמצעות פפיטת מיקרו-קפילרית. קרבו את השתל לאזור ה-area lucida, אזור הגבול העכור בגובה ה-henson's node של עובר המארח. לאחר מכן, השתמשו בפפיטת מיקרו-קפילרית או בסכין מיקרו-דיסקציה כדי לבצע חתך קטן של 80 עד 100 µm באזור זה.
גבול עמום של אזור לוסיטה בגובהו של קשר הנסון (henson's node) של עובר המארח. באמצעות פיפטה קפילרית מיקרוסקופית או סכין מיקרו-דיסקציה. מקמו את הש Transplant כך שהצד הוונטרלי פונה אליכם והקצה הפוסטריורי מקביל לאזור המקביל בעובר המארח O. לאחר המיקום, הסירו את הסליין מעובר המארח, תוך הבטחה שהש Transplant יישאר במיקום סמוך לאתר המארח, והעבירו את עובר המארח לתרבית חדשה למשך 18 עד 22 שעות כפי שמתואר בהגשה הקודמת שלנו.
לאחר 24 שעות של תרבית, מוציאים את העובר מהאינקובטור ומקבעים אותו בנעצים בתוך צלחת סיגר. את ה-PBS מסירים ומחליפים ב-4% paraformaldehyde. לאחר מכן, מקבעים את העובר למשך 24 שעות.
השליכו את המקבע למכל פסולת מסוכנת מתאים והוסיפו PBS לכלי הקיבוע. הסירו את סיכות החרקים בעזרת פינצטה לאחר שהסיכות הוצאו. השתמשו בפיפטה בעלת קצה קהה כדי להעביר את העובר למבחורת סינליגציה המכילה PBS.
שטפו את העובר פעמיים ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם ופעם אחת בבופר twist למשך חמש דקות. לאחר השטיפה, העבירו את העובר לשקופית עם תא זכוכית המכילה 0.1 milliliters של בופר Tris. החליפו את תמיסת בופר ה-tris ב-0.1 milliliter של תמיסת DAB. השליכו את טיפ ה-einor לדלי המכיל תמיסת הלבנה.
על מנת לבצע דקונטמינציה של DAB, הנח כיסית זכוכית מעל שקופית בעלת חלל תחת מיקוד פלואורסצנציה של FEI fluorescein isothiocyanate. העדשה של המיקרוסקופ המכוונת לתאי תורם השתלה תופיע באדום פלואורסצנטי; המשך את החשיפה לפלואורסצנציית FEI עד שכל התאים האדומים הפלואורסצנטיים יהפכו לחומים. תהליך זה קורה כתוצאה מהמרה פוטוכימית של הפלואורוכרום לגבישים חומים בלתי מסיסים עקב חשיפה לאורך גל העירור של FEI.
4 88 nanometers בנוכחות dab. תהליך זה נמשך בין 20 דקות לשעתיים. עם השלמת תגובת הפוטו-חמצון, הסר את כיסוי הזכוכית באמצעות פינצטה עדינה.
העבר את העובר לבקבוק סינצילציה של 20 milliliters המכיל PBTW או PBS עם 0.1%tween 20. לבסוף, בטל את פעילות ה-DAB מהכיסוי, מהזכוכית והחלל. החלק את הזכוכית על ידי דגירה בתמיסת הלבנה כדי לעבד את העובר לצורך ויזואליזציה.
המשיכו בביצוע היברידיזציה במקום (in-situ hybridization), כאשר מדגרי אתו העובר עבור הגשוש המסומן ב-DIG בלבד. לאחר מכן, התחילו בצילום ובחיתוך כפי שמתואר בסרטון Jo השני. להלן דוגמה לבדיקת השראה עצבית.
בתחילה, השתל ממוקם בגבול שבין ה-area lucita ל-area alpaca של עובר המארח. הן עובר התורם והן עובר המארח נמצאים בשלב three plus. לאחר תשע שעות בתרבית, השתל מתחיל להבדיל ולהשרות מבנה הנראה כראש מיניאטורי בשלב eight minus.
לאחר 24 שעות בתרבית, האינדוקציה העצבית הושלמה בעקבות קיבוע. העובר עובר עיבוד להחמצנה פוטוכימית. בתחילה, ניתן לראות כי תאים המסומנים בצבע מהתורם התרבו כדי ליצור נוירומרקטוריזציה מיניאטורית, כפי שמוצג כאן בצבע אדום.
לאחר חמצון פוטוכימי, תאים אלו נראים חומים. העובר מעובד לאחר מכן בשיטת whole mount in situ hybridization עבור הסמן העצבי Otx2 שפותח במעבדתו של ד"ר Bonelli.
השת Transplant של התורם הראה כי הוא מעורר את הביטוי של OTX two מרקמה שמקורה במארח. הרגע הדגמנו כיצד לבצע בדיקת השראה עצבית בעובר של חולדה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להסיר את כל הנוזלים באזור שסביב השת Transplant לאחר ההשתלה באמצעות פיפטה.
פעולה זו תבטיח שהשתל ימוקם בצורה מאובטחת ושלא יזוז מהעובר המארח במהלך התרבית. זהו כל התהליך. תודה. צפייה מהנה ובהצלחה בניסיונות שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים בדיקה לאינדוקציה עצבית בעוברים של אפרוח, המציגה את התהליך שבו צומת הנסן (Hensen's node) מנחה רקמה סמוכה לאמץ גורל עצבי. השלבים הכרוכים בכך כוללים הוצאה של עוברי המארח והתורם, סימון של צומת הנסן וביצוע היברידיזציה באתר (in-situ hybridization) באמצעות סמן עצבי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- המבריולוגיה
רקע
- השראה עצבית (Neural induction) היא קריטית להיווצרות המוח.
- קשרי הנסן (Hensen's node) משמש כמרכז ארגון במהלך ההתפתחות העוברית.
- הבנת האינדוקציה העצבית יכולה לספק תובנות לגבי היווצרות מערכת העצבים.
- בדיקה זו משתמשת בעוברים של אפרוחים כאורגניזם מודל.
מטרת המחקר
- להדגמת תהליך ההשראה העצבית (neural induction).
- להמחשת תפקידו של צומת הנסן (Hensen's node) בקביעת הגורל העצבי.
- לספק מדריך ויזואלי לביצוע הבדיקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הוצאה (Explantation) של עוברי מאכסן ותורם.
- סימון של מנחן הנסן (Hensen's node) בצבע פלואורסצנטי.
- השתלה של מנחן הנסן אל עוברי המאכסן.
- היברידיזציה באתר (In-situ hybridization) עם סמן עצבי לאחר תרבית.
תוצאות עיקריות
- סימון והשתלה מוצלחים של ה-Hensen's node.
- הדגמה של ביטוי סממנים עצביים בעוובר המארח.
- אישור חזותי של תהליכי השראה עצבית.
- תובנות לגבי המנגנונים של קביעת גורל עצבי.
מסקנות
- הבדיקה מדגימה ביעילות השראה עצבית בעוברים של אפרוח.
- צומת הנסן (Hensen's node) ממלא תפקיד מרכזי בהכוונת הגורל העצבי.
- ניתן להשתמש בשיטה זו למחקרי המשך במדעי העצבים ההתפתחותיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מספקת מסגרת מכניסטית להערכת פעילות השראת עצבים של תרכובות מועמדות במודל של חולייתן, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות בשלב מוקדם של גילוי טיפולים נוירולוגיים. על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה של קביעת גורל עצבי באמצעות השתלת מארגנים, היא מסייעת בהפחתת סיכונים לגבי מנגנוני הפעולה של תרכובות המכוונות למסלולי התפתחות נוירולוגית. הסתמכות הבדיקה על קריאות כמותיות, כגון ביטוי סמנים, תומכת בביטחון ניבוי בשלבי זיהוי תרכובות מובילות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי בדיקה האם מולקולה מועמדת יכולה לחקות או לעכב אותות השראה עצבית המופקים מהארגנייזר (organizer).
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות המעורבות בקביעת גורל עצבי באמצעות מערכי gain-of-function או loss-of-function.
- ערך ניבוי: תומך בסינון תיקי תרופות על ידי קישור השפעות של תרכובות לתוצאות התפתחותיות עצביות מוקדמות במערכת הרלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר תוצרים סטנדרטיים וכמותיים באמצעות היברידיזציה-במקום (in-situ hybridization) לסמנים עצביים, המאפשרים הערכה של תגובה למנה.
- ערך תפעולי: מקים פלטפורמה הניתנת לשחזור לסריקת ספריות תרכובות לצורך זיהוי פעילות השראתית או מעכבת של תאי עצב.
- ניתנות להרחבה: תומך בהתאמה לפורמטים של מספר בארות לצורך הערכה בסביבת סריקה בינונית של מולקולות ביואקטיביות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות תרגומית: מקשר בין המנגנון בשלב הגילוי למודלים פרה-קליניים על ידי תיקוף השפעות על נתיבי השראה עצבית שמורים.
- הפחתת סיכון מנגנונית: מבהיר האם הפנוטיפים שנצפו נובעים ממודולציה של משרים עצביים כשהם במטרה (on-target) או מרעילות שאינה ספציפית למטרה (off-target).
- המשכיות חזויה: תומך בהחלטות על קידום השלב הבא על ידי הדגמת מעורבות המטרה בהקשר עוברי פיזיולוגי.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ומסייעת בזיהוי מובילים (leads) באמצעות אספקת תוצאות תפקודיות על מודולציה של מסלולים עצביים לפני ההשקעה בשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: בוחנת היפותזות מכניסטיות לגבי משרים עצביים ומודולציה של מסלולים בעובר של חומרי גב.
- סריקה: מספקת נתונים כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית על ביטוי של סממנים עצביים לצורך השוואת השפעות של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת תוצאים מדידים (למשל, גודל תחום הסממן, עוצמה) התומכים בהשוואה סטטיסטית בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: קובעת סבירות ביולוגית להשפעות על התפתחות עצבית שנצפו in vitro.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה לשימוש חוזר להערכת מחלקות תרכובות מגוונות המשפיעות על השראה עצבית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בסריקת תרכובות נוירו-אקטיביות על ידי קישור הפנוטיפ למנגנון התפתחותי.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות שלבים מוגדרים של השתלה, תרבית וזיהוי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) על ידי זיהוי מוקדם של תרכובות בעלות פעילות נוירו-התפתחותית בלתי רצויה.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון על ידי סימון מולקולות המשנות השראה עצבית כבעיות בטיחות פוטנציאליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באמבריולוגיה של עופים ובטכניקות מיקרו-כירורגיות לטיפול בעוברים ולהשתקת רקמות.
- תלוי במערכות דגירה סטריליות, בכלי מיקרו-כירורגיה ובפלטפורמות זיהוי פלואורסצנטיות או כרומוגניות.
- מחייב שלבי התאמה סטנדרטיים בין המארח לתורם וכיוון השתקה כדי להבטיח הדירות בין משתמשים שונים.
- התאמה למודלים שאינם של עופים עשויה לדרוש תיקוף של שקילות המארגן (organizer) ושימור של סממנים עצביים.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בין עוברים ואת הצורך בביצוע מיומן כדי לשמור על חיוניות השתקה ומיקומה.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Introduction
1:15
Preparing the Host Embryo for New Culture
2:01
Explanting the Donor Embryo in Saline
3:00
Labeling, Excising and Transplanting the Donor Graft
5:29
Securing the Graft and Culturing the Host Embryo
6:56
Photooxidise the Graft Under Fluorescence and Follow with Embryo Processing
9:21
Representative Results/Outcome
10:35
Conclusion
